CN105021761A - 一种检测葡萄汁中多种有机酸的含量及其真伪的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定葡萄汁中多种有机酸含量的方法，它是将待测样品提取后用高效液相色谱仪进行检测，所述高效液相色谱仪含有DAD检测器，所述DAD检测器的设定检测波长为210nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为反相柱，流动相是甲醇和pH为2.8的磷酸二氢铵缓冲溶液，所述甲醇与磷酸二氢铵缓冲溶液的体积比为1∶99，所述反相柱的柱温为30℃，流速为0.8mL/min。本发明还公开了一种葡萄汁真伪鉴定方法。本发明采用能同时测出葡萄汁中八种有机酸的含量，检测准确度高、精密度好、误差小，葡萄汁的真伪鉴别正确率达90％以上。

Description

一种检测葡萄汁中多种有机酸的含量及其真伪的方法

技术领域

本发明属于分析化学和食品鉴伪领域，具体涉及葡萄汁中多种有机酸的含量测定方法以及葡萄汁真伪鉴定方法。

背景技术

葡萄营养价值很高，除含有多种有机酸、矿物质、维生素和人体必需氨基酸外，还含白藜芦醇、原花青素、花青素、儿茶素和黄酮类化合物等多种生物活性物质，具有清除自由基和抗氧化活性、保护心脏、提高免疫力等多种生理功能，因此，近年来葡萄汁及葡萄汁制品已成为国际上流行的饮品。在巨大的市场需求刺激下，掺入其他果汁的葡萄汁冒充纯葡萄汁的现象时有发现，因此，如何快速准确鉴别纯葡萄汁的真伪是消费者、生产者和质检管理机构的迫切需求。

有机酸是水果生长过程中次生代谢的产物，其组成和含量是不同种类纯果汁固有的品质属性，利用纯果汁中有机酸的种类和含量的差异性，可以建立纯果汁有机酸成分的指纹图谱，结合化学计量学方法对掺假样品进行分析和判定。目前对有机酸的检测方法主要有包括反相液相色谱(RP-HPLC)法、离子交换色谱(IEC)、毛细管电泳(HPCE)和气相色谱。其中离子交换色谱法具有前处理简单、同时分析多种有机酸的优点，但有时出现分析结果重现性不稳定的问题，需要通过多检测器联用的方法解决。毛细管电泳存在由于小分子有机酸紫外吸收极低，常规紫外检测(UV)的灵敏度不高。而气相色谱测定有机酸时前处理过程较复杂。反相高效液相色谱法(RP-HPLC)具有快速、灵敏、适用性广等优点被广泛配置和使用。有机酸易溶于水，能被RP-HPLC较好分析和鉴定，目前在水果、果汁及果酒中有机酸的检测中RP-HPLC被广泛应用。但同时测定葡萄汁中多种有机酸的含量，并以此为基础鉴定葡萄汁真伪的方法尚未见文献报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种同时测定葡萄汁中多种有机酸含量的HPLC方法，本发明的另一个目的是提供一种葡萄汁的真伪鉴别方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种同时测定葡萄汁中多种有机酸含量的方法，它是将待测样品提取后用高效液相色谱仪同时检测酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、富马酸、琥珀酸的含量，所述高效液相色谱仪含有DAD检测器，所述DAD检测器的设定检测波长为210nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为反相柱，流动相是甲醇和pH为2.8的磷酸二氢铵缓冲溶液，所述甲醇与磷酸二氢铵缓冲溶液的体积比为1∶99，所述反相柱的柱温为30℃，流速为0.8mL/min。

优选地，所述方法包括以下步骤：

1)精密称取干燥至恒重的酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、富马酸及琥珀酸对照品各10mg，用超纯水溶解后定容至10mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照品溶液；

2)取待测样品5mL，加甲醇和pH为2.8的磷酸二氢铵缓冲溶液稀释至25mL，所述甲醇与磷酸二氢铵缓冲溶液的体积比为1∶99，超声混匀后，离心，取上清液1mL经0.22μm微孔滤膜过滤，作为样品溶液；

3)色谱条件与系统适应性：色谱柱为反相柱，固定相为极性包埋C18键合硅胶；甲醇和pH为2.8的磷酸二氢铵缓冲溶液为流动相，甲醇与磷酸二氢铵缓冲溶液的体积比为1∶99；DAD检测器，检测波长为210nm；柱温30℃；流速为0.8mL/min；

4)分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。

一种葡萄汁真伪鉴定方法，它包括以下步骤：

1)按照上述方法测定葡萄汁中多种有机酸的含量；

2)选择真葡萄汁中测定出的七种有机酸(酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸)的含量为建模指标，采用Logistic回归方法对建模指标进行处理，将真葡萄汁的π值记做1，伪葡萄汁的π值记做0，可以得到Logistic模型的参数拟合：

$\mathrm{\π}=\frac{\exp \left(2.612+29.815x_1+3.255x_2-121.056x_3-2.822x_4-14.899x_5-63.457x_6+1.252x_7\right)}{1+\exp \left(2.612+29.815x_1+3.255x_2-121.056x_3-2.822x_4-14.899x_5-63.457x_6+1.252x_7\right)}$

将步骤1)测得的七种有机酸(酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸)的含量代入上式，计算π值，π值为1的是真葡萄汁，π值为0的是伪葡萄汁，式中，x₁、x₂、x₃、x₄、x₅、x₆、x₇分别代表酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸的含量，单位为mg/mL。

本发明的有益效果是：

1)本发明采用反相高效液相色谱法测定葡萄汁中有机酸的含量，能同时测出八种有机酸的含量，检测准确度高、精密度好、误差小，适用于葡萄汁中有机酸的快速定性和定量分析。

2)本发明采用七种有机酸的含量为建模指标，采用Logistic回归方法得到Logistic模型的参数拟合，通过该模型和测得的有机酸含量，能准确地鉴别出葡萄汁的真伪，真伪鉴别的正确率达90％以上。

附图说明

图1为对照品溶液的HPLC检测图谱，图中：1.酒石酸；2.苹果酸；3.抗坏血酸；4.乳酸；5.乙酸；6.柠檬酸；7.富马酸；8.琥珀酸。

图2为样品溶液的HPLC检测图谱，图中：1.酒石酸；2.苹果酸；3.抗坏血酸；4.乳酸；5.柠檬酸；6.富马酸；7.琥珀酸。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1

1.同时检测葡萄汁中多种有机酸的含量

a、精密称取减压干燥至恒质量的酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、富马酸及琥珀酸对照品各10.0mg，用超纯水溶解后定容于10mL容量瓶中，用0.22μm微孔滤膜过滤。

b、取葡萄汁样品5mL加流动相稀释至25mL，超声混匀后，离心(9000rpm/min,10min)，取上清液1mL经0.22μm微孔滤膜过滤得到样品。

c、将a、b制得的样品在如下条件下分析：Thermo Hypersil Gold aQ C18柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇∶磷酸二氢铵缓冲溶液(0.02mol/L，pH为2.8)＝1∶99(V/V)；进样量：10μL；流速：0.8mL/min；色谱柱温度：30℃；检测器：DAD；检测波长：210nm。采用等梯度洗脱。

得对应到峰面积，按下列公式计算有机酸含量：

含量(cx)＝cr×Ax/Ar

式中：

cx----样品浓度mg/mL；

cr----对照浓度mg/mL；

Ax----样品峰面积；

Ar----对照峰面积。

对照品溶液(含八种有机酸标准品)的检测图谱见图1。

样品溶液的检测图谱见图2。

2.方法学考察

2.1回归分析、检出限。结果见表1。

表1 8种有机酸的回归分析、检出限

2.2回收率

取同一纯葡萄汁样品两份，其中一份作为空白，另一份添加一定量的标准有机酸混合对照品溶液，在确定的色谱条件下进行RP-HPLC-DAD分析，重复操作3次，计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表2。

表2 8种有机酸的回收率、相对标准偏差(n＝3)

8种有机酸的回收率为95.60％-104.48％，回收率高，且相对标准偏差均小于5％，满足葡萄汁样品中有机酸化合物分析的要求。

2.3精密度

在确定的液相色谱条件下对8种有机酸混合对照品溶液进行RP-HPLC分析，平行连续测定6次，测定其保留时间与峰面积，进行统计分析，计算相对标准偏差，以考察精密度。结果见表3。

表3 8种有机酸的精密度(n＝6)

8种有机酸对照品的保留时间和峰面积积分的RSD值均小于5％，结果无明显变化，表明样品精密度良好，适用于定量分析。

上述结果表明所建立的RP-HPLC-DAD分析方法快速、准确、灵敏，适用于葡萄汁中有机酸的定性和定量分析。

实施例2

1.葡萄汁鉴伪模型的建立

将纯葡萄汁中存在的有机酸含量分别记为X1、X2、X3…Xn，则Logistic回归函数为：

$\mathrm{\π}=P(Y=1|X_1=x_1,\mathrm{...}{X}_n=x_n)=\frac{\exp ({\mathrm{\β}}_0+{\mathrm{\β}}_1{x}_1+\mathrm{...}+{\mathrm{\β}}_n{x}_n)}{1+\exp ({\mathrm{\β}}_0+{\mathrm{\β}}_1{x}_1+\mathrm{...}+{\mathrm{\β}}_n{x}_n)},$ 将纯葡萄汁的π值记做1，非预包装纯葡萄汁的π值记做0，得到Logistic模型的参数拟合： $\mathrm{\π}=\frac{\exp (2.612+29.815x_1+3.255x_2-121.056x_3-2.822x_4-14.899x_5-63.457x_6+1.252x_7)}{1+\exp (2.612+29.815x_1+3.255x_2-121.056x_3-2.822x_4-14.899x_5-63.457x_6+1.252x_7)},$ 其中，x₁、x₂、x₃、x₄、x₅、x₆、x₇分别代表酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸的含量(单位：mg/mL)。

2.Logistic模型的验证

以市场随机购买的10份盲样(包含纯葡萄汁和葡萄汁饮料)和自制掺入不同体积比(低、中、高)苹果汁的葡萄汁作为验证样，对其中有机酸进行HPLC检测后得到相关数据，以计算其π值，来对Logistic模型进行验证。

对13个验证样品随机编号。纯葡萄汁和葡萄汁饮料盲样以及自制掺假样编号为59-71。其中纯葡萄汁盲样为59、64、68、70、71，预包装葡萄汁饮料盲样为60、61、63、66、67，掺入不同体积比(低、中、高)苹果汁的葡萄汁样品编号为62、65、69。通过HPLC分析得出样品中酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸的含量，带入上述方程，计算其π值，对模型初步检验，结果见表4。结果表明，除68号样品的结果错误外，其余12个样品的鉴别结果均正确，采用本方法判别葡萄汁真伪的正确率为92.31％。

表4 13个样品中七种有机酸的含量检测数据及模型检测表

编号	x1	x2	x3	x4	x5	x6	x7	π值
									59	1.01	2.57	0.05	0.76	0.41	0.03	2.66	1.00
60	0.98	1.87	0.38	1.17	0.22	0.28	1.17	0.00
									61	0.61	1.97	0.24	0.12	0.51	0.71	0.05	0.00
62	0.97	1.69	0.28	0.29	0.20	0.29	0.04	0.00
									63	0	0.34	0.05	0	1.29	0	0.27	0.00
64	0.99	2.41	0.09	1.05	0.66	0.18	0.73	1.00
									65	0.82	1.76	0.29	0.18	0.29	0.41	0.12	0.00
66	0.64	0.65	0.54	0.02	1.20	0.04	0.12	0.00
									67	0.49	0.69	0.65	0.08	2.60	0.05	0.02	0.00
68	1.36	0.35	0.14	0.01	2.50	0.01	0.10	0.00
									69	0.59	1.85	0.30	0.23	0.32	0.24	0.06	0.00
70	1.61	1.47	0.14	0.12	0.61	0.21	0.05	1.00
									71	0.77	2.52	0.05	0.77	0.36	0.02	0.15	1.00

Claims (3)

1.一种同时测定葡萄汁中多种有机酸含量的方法，其特征在于它是将待测样品提取后用高效液相色谱仪同时检测酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、富马酸、琥珀酸的含量，所述高效液相色谱仪含有DAD检测器，所述DAD检测器的设定检测波长为210nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为反相柱，流动相是甲醇和pH为2.8的磷酸二氢铵缓冲溶液，所述甲醇与磷酸二氢铵缓冲溶液的体积比为1∶99，所述反相柱的柱温为30℃，流速为0.8mL/min。

2.如权利要求1所述同时测定葡萄汁中多种有机酸含量的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)精密称取干燥至恒重的酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、富马酸及琥珀酸对照品各10mg，用超纯水溶解后定容至10mL，用0.22μm微孔滤膜过滤，作为对照品溶液；

2)取待测样品5mL，加甲醇和pH为2.8的磷酸二氢铵缓冲溶液稀释至25mL，所述甲醇与磷酸二氢铵缓冲溶液的体积比为1∶99，超声混匀后，离心，取上清液1mL经0.22μm微孔滤膜过滤，作为样品溶液；

3)色谱条件与系统适应性：色谱柱为反相柱，固定相为极性包埋C18键合硅胶；甲醇和pH为2.8的磷酸二氢铵缓冲溶液为流动相，甲醇与磷酸二氢铵缓冲溶液的体积比为1∶99；DAD检测器，检测波长为210nm；柱温30℃；流速为0.8mL/min；

4)分别精密吸取对照品溶液与样品溶液各10μl注入液相色谱仪进行检测。

3.一种葡萄汁真伪鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

1)按照权利要求1或2所述的方法测定葡萄汁中多种有机酸的含量；

2)以真葡萄汁中测定出的七种有机酸含量为建模指标，采用Logistic回归方法对建模指标进行处理，将真葡萄汁的π值记做1，伪葡萄汁的π值记做0，可以得到Logistic模型的参数拟合：

$\mathrm{\π}=\frac{\exp (2.612+29.815x_1+3.255x_2-121.056x_3-2.822x_4-14.899x_5-63.457x_6+1.252x_7)}{1+\exp (2.612+29.815x_1+3.255x_2-121.056x_3-2.822x_4-14.899x_5-63.457x_6+1.252x_7)}$

将步骤1)测得的七种有机酸的含量代入上式，计算π值，π值为1的是真葡萄汁，π值为0的是伪葡萄汁，式中，x₁、x₂、x₃、x₄、x₅、x₆、x₇分别代表酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、富马酸、琥珀酸的含量，单位为mg/mL。