CN105007928B

CN105007928B - 用于治疗心力衰竭的合成线性apelin模拟物

Info

Publication number: CN105007928B
Application number: CN201380070626.3A
Authority: CN
Inventors: F·泽克里; 八十岛华杨; P·格罗舍; J·袁; H·赵
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2018-03-20
Anticipated expiration: 2033-11-19
Also published as: WO2014081702A2; US20150284446A1; TW201425339A; EP2922559B1; EP2922559A2; AR093559A1; CN105007928A; JP2016501851A; JP2018172410A; US10005829B2; ES2705323T3; UY35144A; JP6444882B2; WO2014081702A3; WO2014081702A4

Abstract

本发明涉及新的组合物，其包含修饰的apelin‑13肽序列，将其设计成可治疗它们所施用的受试者的心血管疾病，且其显示出比其野生型复本更大的抵抗降解性和等效或更大的生物活性。本发明还涉及制备所述组合物的方法和使用所述组合物作为药物活性剂治疗心血管疾病的方法。X1‑X2‑X3‑R‑X5‑X6‑X7‑X8‑X9‑X10‑X11‑X12‑X13 I。

Description

用于治疗心力衰竭的合成线性APELIN模拟物

序列表

本申请包含已经电子递交的ASCII码形式的序列表并将其整体引入本文作为参考。所述的ASCII拷贝于2014年2月21日创建并命名为PAT055326-WO SL.txt，其大小为117407比特。

发明领域：

本发明涉及新的组合物，其包含修饰的肽和多肽序列，将其设计成可治疗它们所施用的受试者的心血管疾病，且所述修饰的肽和多肽序列显示出比其野生型复本更大的抵抗降解性和等效或更大的生物活性。本发明还涉及制备所述组合物的方法和使用所述组合物作为药物活性剂治疗心血管疾病的方法。

发明背景：

在西方世界中心力衰竭的发病率约占65岁以上成年人的1/100。最常见的病理现象是心肌收缩力和由此的心输出量慢性缺陷，心输出量即心室随时间射出的有效血量，具有慢性心力衰竭的患者可以具有急性代偿失调发作，即维持足够血液循环的心脏衰竭，其中心肌收缩力进一步衰减。仅在美国，每年就有～500K因“急性代偿失调性心力衰竭”(ADHF)而住院。

ADHF的最新疗法包括利尿药、血管舒张药和正性肌力药，它们直接增加心肌收缩力。目前静脉用正性肌力药(多巴酚丁胺、多巴胺、米力农、左西孟旦)用于急诊环境，不过，它们涉及不良反应，例如心律失常和长期死亡率增加。这些倾向性阻止了它们应用于慢性心力衰竭。地高辛是口服正性肌力药，但受限于窄的治疗指数、增加的致心律失常可能性和在肾功能不全中的禁忌征。

增加心肌收缩力、而没有致心律失常性或死亡倾向性的心力衰竭疗法是ADHF迫切需求的，但在慢性心力衰竭中还存在大量未满足的医学需求。

Apelin是用于在先的孤独G蛋白偶联受体(GPCR)、APJ也称作apelin受体、血管紧张素(angiotension)-样-1受体、血管紧张素II-样-1受体等的的内源性配体。apelin/APJ途径广泛在心血管系统中表达，且apelin已经在临床前模型中显示主要有益的心血管作用。在人体中紧急apelin施用导致外周和冠状血管扩张，并且增加心输出量(Circulation.2010；121：1818-1827)。作为结果，APJ激动作用作为具有心力衰竭的患者的重要治疗靶标出现。认为活化apelin受体APJ增加心肌收缩力并且提供心脏保护，没有目前疗法的倾向性。然而，天然apelins显示极短的半衰期和体内作用期限。公认极短半衰期是递送这样的治疗内源性肽类的主要困难，这归因于快速血清清除率和通过肽酶作用发生蛋白水解降解。

目前用于克服这一缺陷的一种方式在于将大剂量的所关注的治疗肽施用于患者，使得尽管一些治疗肽被降解，但是仍然保留治疗有效性。然而，该方法对于患者有不适感。由于大部分治疗肽类不能口服施用，所以治疗肽必须通过静脉内注射频繁地恒定输注，或通过不便利的皮下注射途径频繁地施用。频繁施用的要求也导致许多潜在的肽治疗剂具有不可接受的高度突出的治疗成本。大量降解的肽的存在也可能产生不期望的副作用。

施用中的不适感和高成本是为何具有富有吸引力的生物活性特性的大部分治疗肽无法开发成药物候选物的两个原因。

因此，延长肽类半衰期的一种方法在于修饰治疗肽类，按照这样的方式，其降解被减慢，同时仍然维持生物活性。

因此，期望鉴定模拟apelin功能、但具有增进的半衰期并且显示与天然存在的apelin等效或高于它的生物活性的肽类和多肽类。此外，期望鉴定apelin类似物肽类和多肽类，其显示增加的构象约束，即实现和维持活性构象状态的能力，使得肽类和多肽类可以与其受体和/或其它途径靶标发生相互作用，无需添加的折叠或复位。另外的方法包括通过使所述肽类与防止其通过肾消除的分子缀合降低清除率。

因此，对于具有增加的半衰期的修饰的治疗肽类存在需求，以便提供在体内更长的作用期限，同时维持低毒性，仍然保持修饰肽类的治疗优势。

发明概述：

本发明涉及通过修饰所关注的治疗肽或多肽即APJ激动剂克服肽在体内降解的问题。

本发明的目的在于提供新的肽类和多肽类或其生物缀合物，其用作APJ激动剂并且还具有如下超过野生型apelin和其它公知apelin类似物的改进的至少一个：半衰期增加；施用和/或溶解时对降解的更大免疫性；和增加的构象约束，而均显示与野生型apelin相同或大于它的生物活性。本发明的肽类和多肽类或其生物缀合物由此特别地用于治疗或预防心血管疾病，例如心力衰竭、与心力衰竭相关的障碍和病症和对活化APJ受体活性有响应的障碍和病症。

在一个实施方案中，本发明的肽类和多肽类或其生物缀合物特别地用于治疗或预防与心力衰竭相关的障碍或病症和对活化(或激动)APJ受体活性有响应的障碍。在另一个实施方案，本发明的肽类和多肽类或其生物缀合物用于治疗急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水分潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂脑缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化、烧伤(包括晒伤)和先兆子痫。

本发明涉及如本文所述的肽类和多肽类或其生物缀合物、药物组合物集及其制备方法和用途。本发明的肽类和多肽类的实例包括式I-IV的任意一种的肽类和多肽类或其酰胺、酯、盐和生物缀合物以及本文特别地列出的肽类或多肽类及其生物缀合物，包括、但不限于实验例。

本发明由此提供肽或多肽式(I)：

X1-X2-X3-R-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13

I

其中：

X1是所述多肽的N-末端和不存在、为Q、A或pE；

X2是R或r；

X3是P或4-PhP；

X5是L、Cha、D-L、F、Y、Y(Bzl)、3，4-Cl2-F或NaI；

X6是D-氨基酸、S或A；

X7是D-氨基酸、L、H或Aib；且X6和X7的至少一个是D-氨基酸或Aib；

X8是K、k、Q或E；

X9是G或D；

X10是P或哌可酸；

X11是D-Nle、Nle、f或D-Nva；

X12不存在、P或D-氨基酸；

X13是C-末端和不存在、为F或D-氨基酸；且X11、X12和X13的至少一个是D-氨基酸；

其中：

Nle是L-正亮氨酸；

D-Nle是D-正亮氨酸；

Nal是L-(萘基)丙氨酸；

D-Nva是D-正缬氨酸；

Aib是α-氨基异丁酸；

Cha是(S)-β-环己基丙氨酸；

D-Tic是D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酸；

pE是L-焦谷氨酸；

3，4-Cl2-F是(S)-3，4-二氯苯基丙氨酸；

Y是L-酪氨酸；且

Y(Bzl)是L-苄基-酪氨酸；

或所述多肽的酰胺、酯或盐；或基本上与之等效的多肽。

正如本文进一步解释的，公认的3个字母或1个字母缩写用于表示构成本发明肽类和多肽类的氨基酸残基。除外“D”位于之间，氨基酸是L-氨基酸。当1个字母是大写字母时，它是指L-氨基酸。当1个字母缩写是小写字母的情况时，它是指D-氨基酸。

式I的任意上述举出的氨基酸残基或本文所述的其相关式例如式I-IV可以以保守方式被取代，条件是本发明的肽或多肽仍然保持功能活性和结构特性(例如半衰期延长、防止降解、构象约束)。允许的保守氨基酸取代的原理和实例进一步在本文中解释。

本发明还提供其生物缀合物或多聚体，包含：

a.式I-IV的任意一种的肽或多肽；

b.半衰期延长部分；

其中所述肽或多肽和所述半衰期延长部分任选地通过连接基共价连接。

本发明的半衰期延长部分可以与肽或多肽类似物共价结合、连接或缀合。例如，半衰期延长部分可以是聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、胆固醇基团、碳水化合物或寡糖；或结合补救受体的任意天然或合成蛋白质、多肽或肽。优选地，半衰期延长部分任选地通过连接基与具有长血清半衰期的血浆蛋白(白蛋白和免疫球蛋白)共价连接。例如，半衰期延长部分是IgG恒定区或其片段(例如Fc区)、人血清白蛋白(HSA)或白蛋白-结合多肽类。优选地，生物缀合物的半衰期延长部分是人血清白蛋白。

半衰期延长部分按照这样的方式连接，以便增强本发明生物缀合物例如本文所述式I’或其相关的式(式I-IV)的肽或多肽的成分部分的生物功能和/或不干扰该功能。半衰期延长部分可以是蛋白质，例如，IgG恒定区或其片段(例如Fc区)、人血清白蛋白(HSA)或白蛋白-结合多肽类。本文公开的这样的蛋白质还可以形成多聚体。

在一些实施方案中，半衰期延长部分与式I-IV的任意一种的肽或多肽的N-末端共价连接。在其它实施方案中，半衰期延长部分与本发明式I-IV的任意一种的肽或多肽的C-末端共价连接。

本发明的多肽类或其生物缀合物通过活化APJ受体具有治疗如下疾病的用途：急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水分潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂脑缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化、烧伤(包括晒伤)和先兆子痫。

在一个优选的实施方案中，本发明的多肽类或其生物缀合物用于治疗急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)。

在另一个实施方案中，本发明涉及对这样的治疗需要的受试者治疗对活化受体有响应的障碍或疾病的方法，包括：对该受试者施用有效量的式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯、盐或其生物缀合物，使得受试者的对活化APJ受体有响应的障碍或疾病得以治疗。

在另一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯、盐或其生物缀合物和一种或多种药学上可接受的载体。

在另一个实施方案中，本发明涉及组合，其包括式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯、盐或其生物缀合物和一种或多种治疗活性剂的药物组合。

在另一个实施方案中，本发明涉及活化需要的受试者的APJ受体的方法，包括：对该受试者施用治疗有效量的式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯、盐或其生物缀合物。

发明详述

为了解释本说明书的目的，除非另有指定，否则适用下列定义，且每当适合时，以单数使用的术语也包括复数，且反之亦然。

本文所用的“对调节APJ受体有响应的障碍或疾病”、“对调节APJ有响应的障碍和病症”、“对调节APJ受体活性有响应的障碍和病症”、“对活化(或激动)APJ受体活性有响应的障碍”等术语包括急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水分潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂脑缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化、烧伤(包括晒伤)和先兆子痫。

本文所用的“活化APJ受体活性”或“活化APJ受体”是指APJ受体活性增加。活化APJ受体活性也称作“激动”APJ受体，例如通过施用本发明的肽类和多肽类。

本文所用的术语“多肽”和“肽”可以互换使用，是指彼此连接的两种或多种氨基酸。除外下表1中举出的不常用或非天然氢基酸的缩写外，公认的3个字母或1个字母缩写用于表示构成本发明的肽类和多肽类的氨基酸残基。除外“D”位于之间，氨基酸是L-氨基酸。当1个字母是大写字母时，它是指D-氨基酸。当1个字母缩写是小写字母的情况时，它是指L-氨基酸。基团或字符串或氨基酸缩写用于表示肽类。肽类表示为左侧的N-末端，而序列从N-末端书写至C-末端。

本发明的肽类包含非天然氨基酸(即天然不出现的化合物)，且可以可选地使用如本领域公知的其它氨基酸类似物。

可以用Deiters等人，J Am Chem Soc 125：11782-11783，2003；Wang和Schultz，Science 301：964-967，2003；Wang等人，Science 292：498-500，2001；Zhang等人，Science303：371-373，2004或美国专利US7,083,970中所述的技术导入一些非天然氨基酸。简言之，这些表达系统的一些牵涉将无义密码子例如琥珀色TAG的定点诱变导入编码本发明多肽的开放读码框。然后将这样的表达载体导入宿主，该宿主可以使用对导入的无义密码子具有特异性并且载有非选择的非天然氨基酸的tRNA。对用于使部分缀合本发明的多肽类的目的具有有益性的具体的非天然氨基酸包括带有乙炔和叠氮基侧链的那些。

例如，可以通过添加化学实体例如碳水化合物基团、磷酸酯基团、异法呢基基团、脂肪酸基团、用于缀合、官能化或其它修饰的连接基等修饰本发明肽中的天然或非天然氨基酸的一个或多个。所述修饰可以以位点特异性或非位点特异性方式进行。在一个优选的实施方案中，肽的修饰产生更稳定的肽(例如显示出更长的体内半衰期的肽)。这些修饰可以包括将另外的D-氨基酸并入等。修饰中应无显著干扰所述肽的期望的生物活性，但这样的修饰可以赋予所述肽期望的特性，例如生物活性增加。

所述修饰相对于野生型蛋白质增强本发明蛋白质的生物特性，并且在一些情况中，用作例如标记和蛋白质半衰期延长剂的连接点，并且用于使所述变体附加于固体支持物表面上的目的。

在一些实施方案中，这样的修饰例如位点特异性修饰用于使缀合物例如PEG基团连接本发明的多肽类和/或肽类，目的在于例如延长所述多肽类和/或肽类的半衰期，否则就是改善所述多肽类和/或肽类的生物特性。所述技术如本文进一步描述。

在其它实施方案中，这样的修饰例如位点特异性修饰用于连接延长本发明多肽半衰期的其它聚合物和小分子和重组蛋白序列。一种这样的实施方案包括使脂肪酸或特异性白蛋白结合化合物连接多肽类和/或肽类。在其它实施方案中，所述修饰在特定氨基酸类型上进行并且可以连接在多肽类上的一个或多个位点上。

在其它实施方案中，这样的修饰例如位点特异性修饰用作连接野生型和/或变体多聚体的方式例如二聚体(同型二聚体或异二聚体)或三聚体或四聚体。这些多聚化蛋白质分子还可以具有例如PEG、糖和/或PEG-胆固醇缀合物这样的基团，其连接至其它蛋白质例如Fc、人血清白蛋白(HSA)等或与之在氨基末端或羧基末端稠合。

在其它实施方案中，这样的位点特异性修饰用于产生蛋白质、多肽类和/或肽类，其中位点特异性并入的吡咯赖氨酸(pyrrolysine)或吡咯赖氨酸类似物或非天然存在的氨基酸(对-乙酰基-Phe、对-叠氮基-Phe)的位置允许控制这样的蛋白质、多肽类和/或肽类的方向并且连接在所述固体支持物表面上或具有例如所连接的PEG、糖和/或PEG-胆固醇缀合物这样的基团。

在其它实施方案中，这样的位点特异性修饰用于以位点特异性方式交联蛋白质、多肽类和/或肽类，由此形成杂-寡聚体，包括、但不限于异二聚体和异三聚体。在其它实施方案中，这样的位点特异性修饰用于以位点特异性方式交联蛋白质、多肽类和/或肽类，由此形成蛋白质-蛋白质缀合物、蛋白质-多肽缀合物、蛋白质-肽缀合物、多肽-多肽缀合物、多肽-肽缀合物或肽-肽缀合物。在其它实施方案中，位点特异性修饰可以包括允许一种以上类型分子连接在蛋白质、多肽或肽的单一位点上的分支点。

在其它实施方案中，本文列出的修饰可以以非位点特异性方式进行，且产生本发明的蛋白质-蛋白质缀合物、蛋白质-多肽缀合物、蛋白质-肽缀合物、多肽-多肽缀合物、多肽-肽缀合物或肽-肽缀合物。

在一些实施方案中，本发明提供复合物，其包含结合抗体的式I-IV的任意一种的至少一种肽或多肽，所述抗体例如是为何特异性结合如本文公开的肽或多肽的抗体。

本领域普通技术人员可以理解，不同的氨基酸取代例如保守氨基酸取代可以在本文所述的多肽类的任意种的序列上进行，而不一定降低其活性。本文所用的“常用作其取代物的氨基酸”包括保守取代(即具有相差无几的化学特征的氨基酸取代)。为了保守取代的目的，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性(亲水性)、中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。氨基酸取代的实例包括用L-氨基酸取代其相应的D-氨基酸、用半胱氨酸取代高半胱氨酸或具有包含硫氢基的侧链的非天然氨基酸、用赖氨酸取代高赖氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸、鸟氨酸或具有包含氨基的侧链的其它非天然氨基酸或用丙氨酸取代正缬氨酸等。

本文所用的术语“氨基酸”是指天然存在的氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物和以与天然存在的氨基酸类似方式起作用的氨基酸模拟物，它们均为其D和L立体异构体，条件是它们的结构允许这样的立体异构体形式。氨基酸在本文中以由IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission推荐的其名称、其通常已知的3个字母符号或1个字母符号称谓。

术语“天然存在的”是指在天然中发现并且未经人处理的材料。类似地，本文所用的“非天然存在的”、“非天然的”等是指并非天然发现的或在结构上被人修饰或合成的材料。当与氨基酸联用时，术语“天然存在的”是指20种常用氨基酸(即丙氨酸(A或Ala)、半胱氨酸(C或Cys)、天冬氨酸(D或Asp)、谷氨酸(E或Glu)、苯丙氨酸(F或Phe)、甘氨酸(G或Gly)、组氨酸(H或His)、异亮氨酸(I或Ile)、赖氨酸(K或Lys)、亮氨酸(L或Leu)、甲硫氨酸(M或Met)、天冬酰胺(N或Asn)、脯氨酸(P或Pro)、谷氨酰胺(Q或Gln)、精氨酸(R或Arg)、丝氨酸(S或Ser)、苏氨酸(T或Thr)、缬氨酸(V或Val)、色氨酸(W或Trp)和酪氨酸(Y或Tyr))。

本文所用的术语“非天然氨基酸”和“非天然的氨基酸”可以互换使用，预以表示氨基酸结构，其不能使用来自任意生物体的未修饰或修饰基因以生物合成方式在任何生物体中生成，无论它们是相同还是不同。该术语是指并非天然存在的(野生型)apelin蛋白质序列或本发明的序列的氨基酸残基。它们包括、但不限于修饰的氨基酸和/或氨基酸类似物，其并非20种天然存在的氨基酸、硒代胱氨酸、吡咯赖氨酸(Pyl)或吡咯啉-羧基-赖氨酸(Pcl，例如在PCT专利申请WO2010/48582中所述)之一。这样的非天然氨基酸残基可以通过取代天然存在的氨基酸和/或将非天然氨基酸插入天然存在的(野生型)Apelin蛋白质序列或本发明的序列被导入。还可以并入非天然氨基酸残基，使得期望的功能性被赋予apelin分子，例如连接官能团部分(例如PEG)的能力。当与氨基酸联用时，符号“U”应指本文所用的“非天然氨基酸”和“非天然的氨基酸”。

此外，应理解这样的“非天然氨基酸”需要用于并入蛋白质的修饰的tRNA和修饰的tRNA合成酶(RS)。这些“选择的”正交tRNA/RS对通过如Schultz等人研发的选择方法或通过随机或靶向突变生成。作为实例，吡咯啉-羧基-赖氨酸是“天然氨基酸”，因为它通过将基因从一种生物体转入宿主细胞以生物合成方式生成并且因为它通过使用天然tRNA和tRNA合成酶基因被并入蛋白质，而对-氨基苯丙氨酸(参见，Generation 0f a bacterium with a21amino acids genetic code，Mehl RA，Anderson JC，Santoro SW，Wang L，Martin AB，King DS，Horn DM，Schultz PG.J Am Chem Soc.2003年1月29日；125(4)：935-9)是“非天然氨基酸”，因为尽管以生物合成方式生成，但是其通过“选择的”正交tRNA/tRNA合成酶对被并入蛋白质。

修饰的编码的氨基酸包括、但不限于羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、O-磷酸丝氨酸、氮杂环丁烷甲酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、p-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔-丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链赖氨素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、哌可酸和硫杂脯氨酸。术语“氨基酸”还包括天然存在的氨基酸，其在一些生物体中代谢，但不被并入蛋白质的遗传密码子编码。这样的氨基酸包括、但不限于鸟氨酸、D-鸟氨酸和D-精氨酸。

本文所用的术语“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同碱性化学结构的化合物，仅作为实例，结合氢、羧基、氢基和R基团的α-碳。氨基酸类似物包括天然和非天然氨基酸，其可逆或不可逆地被化学打断或其C-末端羧基、其N-末端氨基和/或其侧链官能团被化学修饰。这样的类似物包括、但不限于蛋氨酸亚砜、蛋氨酸砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸、S-(羧甲基)-半胱氨酸亚砜、S-(羧甲基)-半胱氨酸砜、天冬氨酸-(β-甲酯)、N-乙基甘氨酸、丙氨酸羧酰胺、高丝氨酸、正亮氨酸和甲硫氨酸甲基锍。

表1：如本发明中所述的非天然氨基酸：

Nal是指1-萘丙氨酸和2-萘丙氨酸，优选2-萘丙氨酸。

4-苯基脯氨酸是指顺式和反式4-苯基脯氨酸，优选反式-4-苯基脯氨酸。

本文所用的术语“酰胺”是指C-末端的羧酸基团的酰胺(例如-C(O)NH₂、-C(O)NH-C_1-6烷基、-C(O)NH-C_1-2烷基苯基、-C(O)NH-NHBn、-C(O)-4丙氧基哌啶或-C(O)N(C_1-6烷基)₂)。

术语“酰胺”还指N-末端的氨基衍生物(例如-NHC(O)C_1-16烷基、-NHC(O)(CH₂)_nPh(n是1-6的整数)、-NHC(O)(CH₂)₂CO₂H、4-Cl-Ph-(CH₂)₃C(O)NH-、C₁₁H₂₃C(O)NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-NH-、C₁₃H₂₇C(O)NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-NH-、C₁₅H₂₇C(O)NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)NH-、Ph-CH₂CH₂NHC(O)-NH-或CH₃(OCH₂CH₂)_mC(O)NH-(m是1-12的整数)。

本文所用的术语“酯”是指C-末端(例如-COOR)形式的羧酸基团的酯衍生物，其中酯的R是指C_1-6烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等；C_3-8环烷基，例如环戊基、环己基等；C_6-10芳基，例如苯基、α-萘基等；C_6-10芳基-C_1-6烷基，例如苯基-C_1-2烷基，例如苄基、苯乙基、二苯甲基等；和α-萘基-C_1-2烷基，例如α-萘基甲基等。还可以举出新戊酰氧基甲酯等，它们通常用作用于口服施用的酯。当本发明的多肽类在非C-末端的位置上具有另外的羧基或羧酸酯基团时，那些其中这样的基团被酰胺化或酯化的多肽类也落入本发明多肽的类别范畴。在这样的情况中，所述酯类例如可以是与上述举出的C-末端酯类相同种类的酯类。

术语烷基是指包含1-20个碳原子的完全饱和的支链或非支链(或直链或线性的)烃部分。优选烷基包含1-7个碳原子且更优选1-4个碳原子。

术语芳基是指在环部分上具有6-10个碳原子的单环或双环芳族烃基。芳基的有代表性的实例是苯基或萘基。

术语杂芳基包括包含5-10个环成员的单环或双环杂芳基，所述环成员选自碳原子和1-5个杂原子且每个杂原子独立地选自O、N或S，其中S和N可以被氧化成不同的氧化态。对于双环杂芳基系统，所述系统是完全芳族的(即全部的环是芳族的)。

术语环烷基是指3-12个碳原子、优选3-8或3-7个碳原子的饱和或不饱和的、但非芳族的单环、双环或三环烃基。对于双环和三环环烷基系统，所有的环都是非芳族的。

术语杂环基是指饱和或不饱和的非芳族的(部分不饱和的)环，其为4-、5-、6-或7-元单环且包含至少一个选自O、S和N的杂原子，其中N和S还可以任性地被氧化成不同的氧化态。在一个实施方案中，杂环基部分代表包含5-7个环原子且任选地包含另一个选自O、S或N的杂原子的饱和单环。

术语“APJ”(也称作“apelin受体”、“血管紧张素-样-1受体”、“血管紧张素II-样-1受体”等)表示380个残基的7跨膜区Gi偶联受体，其基因位于人中的第11条染色体的长臂上(NCBI参比序列：NP_005152.1并且被NCBI参比序列编码：NM_005161)。在1993年首先使用降解性寡核苷酸引物从基因组人DNA中克隆APJ(O′Dowd等人Gene，136：355-60，1993)且其与血管紧张素II受体1型共有显著的同源性。然而，尽管存在这种同源性，但是血管紧张素II不结合APJ。尽管单独存在多年，但是已经分离了内源性配体并且称作apelin(Tatemoto等人，Biochem Biophys Res Commun 251，471-6(1998))。

术语“apelin”表示77个残基的前蛋白(NCBI参比序列：NP_0059109.3并且被NCBI参比序列编码：NM_017413.3)，其被处理成apelin肽类的生物活性形式，例如apelin-36、apelin-17、apelin-16、apelin-13、apelin-12。全长成熟肽、称作“apelin-36”包含36个氨基酸，但大部分有效的亚型是apelin的13mer(apelin-13)的焦谷氨酸化形式，称作“Pyr-1-apelin-13或Pyr^l-apelin-13”。例如，不同的apelin形式描述在美国专利US6,492,324B1中。

术语“缀合物”和“生物缀合物”可以互换使用并且预以指作为式I-IV的任意一种的多肽与半衰期延长部分任选地通过连接基共价结合的产物形成的实体。

术语半衰期延长部分可以共价连接/结合至肽或多肽类似物。半衰期延长部分可以是，例如，聚合物，例如聚乙二醇(PEG)、胆固醇基团、碳水化合物或寡糖(olisaccharide)；或结合补救受体的任意天然或合成蛋白质、多肽或肽。优选地，半衰期延长部分任选地通过连接基共价连接至具有长血清半衰期的血浆蛋白(白蛋白)。例如，半衰期延长部分是人血清白蛋白(HSA)或白蛋白-结合多肽类。

术语“增加的半衰期”或“增加血清半衰期”或“延长半衰期”是指修饰的生物活性分子(例如apelin 13)相对于其未修饰形式(或肽的裸形式)的循环半衰期正向改变。通过在施用生物活性分子后的不同时间点采集血样并且测定每一样品中该分子的浓度确定血清半衰期。测定血清浓度随时间的改变能够计算修饰分子(例如缀合分子)的血清半衰期。通过比较修饰分子(例如缀合分子)与未修饰分子(例如apelin 13)的血清半衰期，可以确定血清半衰期或t1/2的相对增加。期望这种增加至少约为2倍，但较小的增加可能有用。

本发明的多肽类：

本发明的不同实施方案如本文所述。认为每个实施方案中指定的特征可以与其它指定的特征组合，得到另外的实施方案。

在实施方案1，本发明由此提供肽或多肽式(I)(SEQ ID NO：1)：

X1-X2-X3-R-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13

I

其中：

X1是所述多肽的N-末端和不存在、为Q、A或pE；

X2是R或r；

X3是P或4-PhP；

X5是L、Cha、D-L、F、Y、Y(Bzl)、3，4-Cl2-F或NaI；

X6是D-氨基酸、S或A；

X8是K、k、Q或E；

X9是G或D；

X10是P或哌可酸；

X11是D-Nle、Nle、f或D-Nva；

X12不存在、为P或D-氨基酸；

其中：

Nle是L-正亮氨酸；

D-Nle是D-正亮氨酸；

Nal是L-(萘基)丙氨酸；

D-Nva是D-正缬氨酸；

Aib是α-氨基异丁酸；

Cha是(S)-β-环己基丙氨酸；

D-Tic是D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酸；

pE是L-焦谷氨酸；

3，4-Cl2-F是(S)-3，4-二氯苯基丙氨酸；

Y是L-酪氨酸；且

Y(Bzl)是L-苄基-酪氨酸；

或所述多肽的酰胺、酯或盐；或基本上与之等效的多肽。

在实施方案1a，本发明由此提供肽或多肽式(IA)(SEQ ID NO：2)：

X1-X2-X3-R-X5-X6-X7-X8-G-X10-X11-X12-X13

IA

其中：

X1是所述多肽的N-末端和不存在、为Q、A或pE；

X2是R或r；

X3是P或4-PhP；

X5是L、Cha、D-L、F、Y、Y(Bzl)、3，4-Cl2-F或2-NaI；

X6是D-氨基酸或S；

X7是D-氨基酸、H或Aib；且X6和X7的至少一个是D-氨基酸或Aib；

X8是K或k；

X10是P或哌可酸；

X11是D-Nle或Nle；

X12不存在、为P或D-氨基酸；

或所述多肽的酰胺、酯或盐；或基本上与之等效的多肽。

在实施方案1b中，本发明涉及肽或多肽式(I)或(IA)，其中X1不存在或为pE(SEQID NO：3)或为所述多肽的酰胺、酯或盐；或基本上与之等效的多肽。

在实施方案1、1A或1B的一个方面中，本发明涉及式I或IA的肽或多肽，其中K或k侧链上的氨基任选地通过酰胺键连接至脂肪酸。在该实施方案的另一个方面，所述脂肪酸选自月桂酰基、肉豆蔻酰基或棕榈酰基，其中月桂酰基是C₁₁H₂₃C(O)-，肉豆蔻酰基是C₁₃H₂₇C(O)-，且棕榈酰基是C₁₅H₃₁C(O)-。

在实施方案1、1A或1B的一个方面中，本发明涉及式I或IA的肽或多肽，其中K或k侧链上的氨基任选地通过酰胺键连接至亲脂性基团，其中所述亲脂性基团选自如上所述的脂肪酸和月桂酰基(O2Oc)、肉豆蔻酰基(O2Oc)和棕榈酰基(O2Oc)，且其中月桂酰基(O2Oc)是C₁₁H₂₃C(O)NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂C(O)-；肉豆蔻酰基(O2Oc)是C₁₃H₂₇C(O)NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂C(O)-；棕榈酰基(O2Oc)是C₁₅H₃₁C(O)NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂C(O)-。侧链脂肪酸的实例描述在2012年1月27日提交的美国临时申请号61/591,557(律师案卷编号PAT054961-US-PSP)中，将该文献引入本文作为参考。

在实施方案2中，本发明涉及实施方案1、1A或1B的多肽，其中X6和X12是D-氨基酸(SEQ ID NO：4)；或其酰胺、酯或盐。

在实施方案3中，本发明涉及实施方案2的多肽，其中X13是D-氨基酸(SEQ ID NO：5)；或其酰胺、酯或盐。

在实施方案4中，本发明涉及实施方案3的多肽，其中X11是D-氨基酸(SEQ ID NO：6)；或其酰胺、酯或盐。

在实施方案5中，本发明涉及实施方案1、1A或1B的多肽，其中X6和X13是D-氨基酸(SEQ ID NO：7)；或其酰胺、酯或盐。

在实施方案6中，本发明涉及实施方案1、1A或1B的多肽，其中X7和X12是D-氨基酸(SEQ ID NO：8)；或其酰胺、酯或盐。

在实施方案7中，本发明涉及实施方案6的多肽，其中X13是D-氨基酸(SEQ ID NO：9)；或其酰胺、酯或盐。

在实施方案8中，本发明涉及实施方案1(1A或1B)-7任一项的多肽，具有下式II(SEQ ID NO：10)：

X1-R-P-R-X5-a-X7-X8-G-P-X11-X12-X13

II

或所述多肽的酰胺、酯或盐。

在实施方案9中，本发明涉及实施方案1(1A或1B)-8任一项的多肽，具有式III(SEQID NO：11)：

X1-R-P-R-X5-X6-X7-K-G-P-X11-a-f

III；

或所述多肽的酰胺、酯或盐。

在实施方案10中，本发明涉及实施方案1(1A或1B)、6、7和9任一项的多肽，具有式IV(SEQ ID NO：12)：

X1-R-P-R-X5-S-X7-K-G-P-X11-X12-X13

IV；

或所述多肽的酰胺、酯或盐。

在实施方案11中，本发明涉及实施方案1(1A或1B)-9任一项的多肽，其中X6是D-氨基酸，其选自a、D-Leu、k、s、d、nva、abu、f、h、v和D-Cys(tBu)(SEQ ID NO：13)；或其酰胺、酯或盐。在该实施方案的另一个方面，X11是nle或f。

在实施方案12中，本发明涉及实施方案1(1A或1B)-11任一项的多肽，其中X7是Aib或选自a、f和h的D-氨基酸(SEQ ID NO：14)；或其酰胺、酯或盐。

在实施方案13中，本发明涉及实施方案1(1A或1B)-12任一项的多肽，其中X12不存在或选自a、f、p、e、r、abu、nva和D-Leu的D-氨基酸(SEQ ID NO：15)；或其酰胺、酯或盐。在该实施方案的另一个方面，X12是a。

在实施方案14中，本发明涉及实施方案1(1A或1B)-13任一项的多肽，其中X13不存在或是选自f、y、d和D-Tic的D-氨基酸(SEQ ID NO：16)；或其酰胺、酯或盐。在该实施方案的另一个方面，X13是f。

在实施方案15中，本发明涉及实施方案14的多肽，其中X13不存在或f(SEQ ID NO：17)；或该多肽的酰胺、酯或盐。

在实施方案16中，本发明涉及上述实施方案任一项的多肽，其中X1是pE(SEQ IDNO：18)；或该多肽的酰胺、酯或盐。

在实施方案16A中，本发明涉及上述实施方案任一项的多肽，其中X1不存在、为A或Q(SEQ ID NO：19)；或该多肽的酰胺、酯或盐。在该实施方案的一个具体的方面，所述肽通过其A或Q N-末端共价连接至半衰期延长部分。

在实施方案17中，本发明涉及实施方案1-16任一项的多肽，其中X5是L(SEQ IDNO：20)；或该多肽的酰胺、酯或盐。

在实施方案18中，本发明涉及实施方案1-17任一项的多肽，其中X8是K(SEQ IDNO：21)；或该多肽的酰胺、酯或盐。

在实施方案19中，本发明涉及实施方案1-18任一项的多肽，其中X11是Nle或nle(SEQ ID NO：22)；或该多肽的酰胺、酯或盐。

在实施方案20中，本发明涉及上述实施方案任一项的多肽，其中C-末端是该多肽的酰胺、酯或盐。

在实施方案21中，本发明涉及实施方案20的多肽，其中C-末端是式-C(O)-R2的酰胺，且R2是-NH₂、-NH-(CH₂)₂-Ph或4-苯氧基哌啶；或该多肽的盐。

在另一个实施方案中，本发明涉及式I、IA、II、III或IV的任一种的肽类和多肽类或上述任意其它类型和亚类的任意种(即实施方案1-15和17-21的任一项)或其酰胺、酯或盐，其中X1不存在；或该多肽的酰胺、酯或盐。在该实施方案的一个方面，所述肽的N-末端是酰胺。在该实施方的另一个方面，本发明涉及式I、IA、II、III或IV的任一种的肽类和多肽类或上述任意其它类型和亚类的任意种或其酰胺、酯或盐，其中X1不存在，且N-末端是式-NHR的酰胺，且R是CH₃C(O)-、CH₃-(O-CH₂CH₂)_m-C(O)-、棕榈酰基(O2Oc)_p、肉豆蔻酰基(O2Oc)_p、月桂酰基(O2Oc)_p或Ph-CH₂CH₂NHC(O)-、苯甲酰基、苯甲酰甲基、琥珀酰基、辛酰基、4-苯基丁酰基、4-Cl-Ph-(CH2)₃C(O)-或Ph-CH₂CH₂NHC(O)-；且其中

p是1-4的整数；

m是1-12的整数；

月桂酰基(O2Oc)_p是C₁₁H₂₃C(O)[NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)]_p-；

肉豆蔻酰基(O2Oc)_p是C₁₃H₂₇C(O)[NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)]_p-；

棕榈酰基(O2Oc)_p是C₁₅H₃₁C(O)[NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)]_p-。在该实施方案的一个具体的方面，R是乙酰基、苯甲酰基、苯甲酰甲基、琥珀酰基、辛酰基、4-苯基丁酰基、4-Cl-Ph-(CH2)3C(O)-或Ph-CH₂CH₂NHC(O)-。N-末端酰胺的实例描述在2012年1月27日提交的美国临时申请号61/591,557(律师案卷编号PAT054961-US-PSP)中，将该文献引入本文作为参考。

在另一个实施方案中，本发明涉及式I、IA、II、III或IV的任一种的肽类和多肽类或上述任意其它类型和亚类的任意种(即实施方案1-21的任一项)或其酰胺、酯或盐，其中N-末端是式NHR1的酰胺，其中R1是CH₃C(O)-、CH₃-(O-CH₂CH₂)_m-C(O)-、棕榈酰基(O2Oc)、肉豆蔻酰基(O2Oc)、月桂酰基(O2Oc)或Ph-CH₂CH₂NHC(O)-；且其中m、月桂酰基(O2Oc)、肉豆蔻酰基(O2Oc)和棕榈酰基(O2Oc)如上述所定义。

在另一个实施方案中，本发明涉及式I、IA、II、III或IV的任一种的肽类和多肽类或上述任意其它类型和亚类的任意种(即实施方案1-8和10-21的任一项)，其中X13不存在，或其酰胺、酯或盐。在该实施方案的一个具体的方面，C-末端是酰胺。在该实施方案的另一个方面，本发明涉及式I、IA、II、III或IV的任一种的肽类和多肽类或上述任意其它类型和亚类的任意种(即实施方案1-8和10-21的任一项)或其酰胺、酯或盐，其中C-末端是式-C(O)R2的酰胺，且R2是-NH₂、-NH-Me、-NH-NHBn、4-苯氧基哌啶-1-基或-NH-(CH₂)₂-Ph。在该实施方案的一个优选的方面，本发明涉及式I-IV的任一种的肽类和多肽类或上述任意其它类型和亚类的任意种或其酰胺、酯或盐，其中C-末端是式-C(O)R2的酰胺，且R2是-NH₂、-NH-(CH₂)₂-Ph或4-苯氧基哌啶-1-基。

在一个实施方案中，本发明涉及实施方案1-21任一项的肽或多肽，其中氨基酸X1-X13中的3个与存在于Pyr-1-apelin-13的相应氨基酸不同。在另一个实施方案中，本发明涉及实施方案1-21任一项的肽或多肽，其中氨基酸X1-X13中的4个与存在于Pyr-1-apelin-13上的相应氨基酸不同。

在另一个实施方案中，X1、X2、X3、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12和X13氨基酸是如下实施例部分中X1、X2、X3、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12和X13氨基酸所定义的那些。

在另一个实施方案中，本发明的各多肽是是如下实施例部分中列出的那些或其药学上可接受的盐。

除非另有指定，否则术语“本发明的多肽”是指式(I)及其子式(式IA、II、III或IV)的多肽；或其酰胺、酯或盐。

除非另有指定，否则术语“本发明的多肽类”、“本发明的肽类”、“apelin肽激动剂”等是指式(I)及其子式(式IA、II、III或IV)的肽类和多肽类；或其酰胺、酯或盐。本发明的肽类和多肽类显示与已知的本文所述的apelin肽类和多肽类基本上等效或改善的活性和/或血浆稳定性，已知的本文所述的apelin肽类和多肽类包括、但不限于野生型apelin、apelin-13和pyr-1-apelin-13。

本发明的肽类和多肽类还包括与式I、IA、II、III或IV的任一种的肽类和多肽类至少约95％相同的肽类和多肽类或其酰胺、酯或盐以及本文特别列出的任意肽类或多肽类，包括、但不限于实验例。

本文所用的措词“同源氨基酸序列”或其变化形式是指特征在于在氨基酸水平上至少特定百分比的同源性且可以与“序列同一性”互换使用。同源氨基酸序列包括那些包含保守氨基酸取代且多肽类具有相同结合和/或活性的氨基酸序列。在一些实施方案中，氨基酸序列是同源的，条件是它与对比序列具有至少60％或以上至99％的同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列是同源的，条件是它与对比序列共有一个或多个至60个氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施方案中，同源氨基酸序列具有不超过5个或不超过3个的保守氨基酸取代。

同源性还可以是多肽水平上的。将本发明的肽类或多肽类或其部分和不同氨基酸序列的同一性程度或百分比计算为两个序列对比中的确切匹配数除以“BF序列”或“外源序列”的长度，无论是否最短。将结果表示为同一性百分比。

多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列与具体实施例中所述的氨基酸序列具有约80-99.9％、优选90-99.9％的同源性且具有超过apelin-13或pyr-1-apelin-13的血浆稳定性，这些多肽落入本发明多肽的类型范畴。在一个实施方案中，血浆稳定性改善至少2倍。在一个实施方案中，本发明的多肽具有至少30分钟的血浆稳定性。在另一个实施方案，本发明的多肽具有至少60分钟或至少80分钟、优选至少100min且更优选至少150分钟的血浆稳定性。

术语″基本上等效″是指受体-结合活性、信号转导活性等属性是等效的。因此，甚至允许在等级中存在差异，例如受体结合活性强度和多肽分子量。

可以举出本文所述或通过氨基酸的一种或多种的取代、缺失、添加或插入基本上与之等效的多肽作为包含上述含义中的氨基酸序列的基本上的等效物。可以举出本文所述通过用天然或非天然氨基酸取代1-5、优选1-3且更优选1或2个氨基酸的多肽作为包含上述含义中的多肽类。另外的修饰和改变可以包括用D-氨基酸替代L-氨基-酸或其它变化形式，包括、但不限于磷酸化、羧化、烷基化等，只要式I、IA、II、III或IV的肽或多肽的APJ激动剂活性得以维持且血浆稳定性的改善超过apelin-13的焦谷氨酸化形式。例如，D-氨基酸在式I、IA、II、III或IV的线性肽类和多肽类的2位(X2)、6位(X6)、7位(X7)、8位(X8)、11位(X11)、12位(X12)和13位(X13)上的多肽的活性和稳定性是充分耐受的。

在实施方案22中，本发明还涉及生物缀合物或多聚体，包含：

a.上述实施方案任一项的式I、IA、II、III或IV的肽或多肽，其酰胺、盐或酯；

b.半衰期延长部分；

在实施方案22A中，半衰期延长部分任选地通过连接基部分共价连接至式I、IA、II、III或IV的肽的N-末端。

在实施方案22B中，半衰期延长部分任选地通过连接基部分共价连接至式I、IA、II、HI或IV的肽的C-末端。

在实施方案22C中，半衰期延长部分任选地通过连接基部分共价连接至式I、IA、II、III或IV的肽的侧链，例如半衰期延长部分任选地通过连接基部分连接至K、Orn、Dab、Dap、hK或4-氨基-lsn的侧链上的氨基。优选地，半衰期延长部分任选地通过连接基部分连接至式I、IA、II、III或IV的肽的N-末端。

在实施方案23中，本发明涉及实施方案19的生物缀合物或其多聚体，其中半衰期延长部分是人血清白蛋白。

在实施方案24中，本发明涉及实施方案23的生物缀合物，其中人血清白蛋白通过下式的连接基以化学方式连接至式I-IV的任一种的多肽的N-末端：

其中x是1-20，R是直链或支链亚烷基、环烷基、芳基或杂芳基或其组合，R’是直链或支链亚烷基、芳基或环烷基或其组合。

在实施方案25中，本发明涉及实施方案22或23的生物缀合物，其中人血清白蛋白通过下式的连接基以化学方式连接至式I-IV的任一种的多肽的C-末端：

半衰期延长部分

半衰期延长部分包括白蛋白，其是指血浆中具有约65至67千道尔顿分子量的为其单体形式的最丰富蛋白质，视来源的种类而定。术语“白蛋白”与“血清白蛋白”可以互换使用且并非用于定义形成与本发明修饰多肽类的缀合物的白蛋白来源。因此，本文所用的术语“白蛋白”可以指纯化自天然来源例如血液或血清流体(fluis)的白蛋白或可以指化学合成或重组生产的白蛋白。本发明修饰的肽类或多肽类优选任选地通过连接基被束缚于白蛋白表面上半胱氨酸-34的游离巯基上。

半衰期延长部分包括“天然Fc”，其是指包含因消化完整抗体产生的非抗原-结合片段的序列或通过其它方式产生的分子或序列，无论是单体形式还是多聚化形式，且可以包含铰链区。天然Fc的原始免疫球蛋白来源优选来源于人且可以是任意的免疫球蛋白，不过，优选IgG1和IgG2。天然Fc分子由单体肽类构成，所述单体多肽类可以通过共价(即二硫键)和非共价结合连接成二聚化或多聚化形式。天然Fc分子的单体亚单位之间的分子间二硫键数量为1-4，这取决于类型(例如IgG、IgA和IgE)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)。天然Fc的一个实例是因IgG的木瓜蛋白酶消化产生的二硫键合的二聚体(参见Ellison等人，1982，Nucleic Acids Res.10：4071-9)。本文所用的术语“天然Fc”一般是指单体、二聚化和多聚化形式。

半衰期延长部分包括“Fc变体”，其是指从天然Fc修饰、但仍然包含用于补救受体FcRn(新生儿Fc受体)的结合位点的分子或序列。国际公开号WO 97/34631和WO 96/32478描述示例性Fc变体，并且与补救受体发生相互作用，且将这些文献引入本文作为参考。因此，术语“Fc变体”可以包含从非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含可以除去的区，因为它们提供本发明生物缀合物不需要的结构特征或生物活性。因此，术语“Fc变体”包含缺乏一个或多个天然Fc位点或残基或其中一个或多个Fc位点或残基被修饰的分子或序列，它们影响或牵涉：(1)二硫键形成；(2)与选择的宿主细胞的不相容性；(3)在选择的宿主细胞中表达时的N-末端不均一性；(4)糖基化；(5)与补体发生相互作用；(6)结合非补救受体的Fc受体；或(7)抗体-依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。Fc变体在下文中进一步详细描述。

半衰期延长部分是指包括如上述所定义的天然Fc和Fc变体的“Fc结构域”。关于Fc变体和天然Fc分子，术语“Fc结构域”包括单体或多聚化形式的分子，无论是从完整抗体消化还是通过其它方式产生。在本发明的一些实施方案中，Fc结构域可以通过例如Fc结构域与肽序列之间的共价键缀合至式I’的多肽或式I-IV的任意一种。这样的Fc蛋白质可以通过结合Fc结构域形成多聚体，且Fc蛋白质及其多聚体是本发明的一个方面。

半衰期延长部分包括″修饰的Fc片段″，其应指包含修饰的序列的抗体的Fc片段。Fc片段是包含CH2、CH3和铰链区部分的抗体部分。修饰的Fc片段可以衍生自例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。

作为适用于Fc结构域或包含Fc结构域的分子的术语“多聚体”是指具有两个或多个共价结合的多肽链的分子。

连接基

任意的连接基是任选的。当存在时，其化学结构并不关键，因为它主要用作间隔基。

连接基是包含两个反应基团/官能团的化学部分，其中的一个可以与多肽反应，而另一个与半衰期延长部分反应。连接基的两个反应基团通过连接基连接，其结构并非关键，只要它不干扰连接基与半衰期延长部分偶合即可。

连接基可以由彼此通过肽键连接的氨基酸构成。在本发明的一些实施方案中，连接基由1-20个通过肽键连接的氨基酸构成，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸。在不同的实施方案中，1-20个氨基酸选自氨基酸甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和赖氨酸。在一些实施方案中，连接基由多个氨基酸构成，所述氨基酸是无空间位阻的，例如甘氨酸和丙氨酸。在一些实施方案中，连接基是聚甘氨酸、聚丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合(例如聚(Gly-Ala))或甘氨酸和丝氨酸的组合(例如聚(Gly-Ser))。在其它实施方案中，连接基包含1-20个氨基酸，其选自非天然氨基酸。尽管3-15个氨基酸残基的连接基对于缀合半衰期延长部分是优选的，但是本发明关注任意长度或组成的连接基。优选的氨基酸连接基是下式的O2Oc：

或其重复单元。

本文所述的连接基是示例性的且更长且包括其它残基的连接基是本发明所关注的。非-肽连接基也是本发明所关注的。

连接基的连接部分可以包含一个或多个烷基、烷氧基、链烯基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基或其组合。例如，可以使用烷基连接基例如-NH-(CH₂)z-C(O)-或-S-(CH₂)z-C(O)-或-O-(CH₂)z-C(O)-，其中z是2-20。这些烷基连接基可以进一步被任意无位阻基团取代，包括、但不限于低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2或苯基。

连接基还可以具有聚合物属性。连接基可以包括为生物学稳定或生物可降解的聚合物链或单元。具有重复连接的聚合物在生理学条件下可以具有可变程度的稳定性，这取决于键的不稳定性。聚合物可以包含例如聚碳酸酯类(-O-C(O)-O-)、聚酯类(-C(O)-O-)、聚氨基甲酸酯类(-NH-C(O)-O-)、聚酰胺(-C(O)-NH-)。这些键作为实例提供且不预以限制本发明聚合物链或连接基中可使用的键类型。适合的聚合物包括，例如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物、聚丙二醇、聚氧乙基化多元醇、肝素、肝素片段、多糖类、纤维素和纤维素衍生物、淀粉和淀粉衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物、聚亚烷基二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚等及其混合物。聚合物连接基例如是PEG。示例性非-肽连接基是聚乙二醇连接基：

其中连接基具有100-5000kD、例如100-500kD的分子量。

优选地，连接部分包含一个或多个氨基酸部分，例如(O2Oc)单元或C_1-4亚烷基-C(O)-、C_1-4亚烷基、-NH-C_2-6亚烷基-NH-或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-NH-二氨基单元或其组合，且连接部分连接2个反应基团或官能团。

优选地，反应基团或官能团是马来酰亚胺、硫醇或吡啶-2-基二硫烷基。用于连接至半衰期延长部分的肽或多肽和肽-连接基构建体的制备：

本发明的肽类和多肽类可以通过自身已知的肽合成方法生产。用于肽合成的方法可以是固相合成和液相合成的任意种。因此，所关注的肽和多肽可以通过使能够构成蛋白质的部分肽或氨基酸与其残余部分缩合生产，此时产物具有保护基，保护基在可以在制备期望的肽时被分离。用于缩合和脱保护的已知方法包括如下文献(1)-(5)中所述的方法。

(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti，Peptide Synthesis，IntersciencePublishers，New York，1966，

(2)Schroeder和Luebke，The Peptide，Academic Press，New York，1965，

(3)Nobuo Izumiya等人Fundamentals and Experiments in PeptideSynthesis，Maruzen，1975，

(4)Haruaki Yajima和Shumpei Sakakibara，Biochemical Experiment Series1，Protein Chemistry IV，205，1977，和

(5)Haruaki Yajima(ed.)，Development of Drugs-Continued，14，PeptideSynthesis，Hirokawa Shoten。

反应后，可以通过常规纯化技术的组合纯化和分离肽，例如溶剂萃取、柱色谱法、液相色谱法和重结晶。如果上述分离的肽是游离化合物，则可以通过已知方法将其转化成适合的盐。相反，如果分离的产物是盐，则可以通过已知方法将其转化成游离肽。

可以通过使用适合于酰胺化的肽合成用树脂得到多肽的酰胺。所述树脂包括氯甲基树脂、羟基甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨基甲基树脂、4-苄氧基苄醇树脂、4-甲基二苯甲胺树脂、PAM树脂、4-羟基甲基甲基苯基乙酰氨基甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2′，4′-二甲氧基苯基-羟基甲基)苯氧基树脂、4-(2′，4′-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基树脂、2-氯三苯甲基氯树脂等。使用这样的树脂，根据目标肽序列，氨基酸(其侧链α-氨基和官能团被适当地保护)通过自身已知的不同缩合技术被缩合在所述树脂上。在反应系列结束时，肽或被保护的肽从树脂上被除去且保护基被除去，且如果必要，形成二硫键，得到目标多肽。

为了使上述举出的被保护的氨基酸缩合，可以使用各种用于肽合成的活化试剂，例如HATU、HCTU或例如碳二亚胺。碳二亚胺包括DCC、N，N′-二异丙基碳二亚胺和N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。为了使用这样的试剂活化，可以使用外消旋抑制剂添加剂，例如HOBt或Oxyma Pure。可以将被保护的氨基酸与活化试剂和外消旋抑制剂直接添加到树脂上或使其预活化为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后被添加到树脂上。用于活化被保护的氨基酸或与树脂缩合的溶剂可以适当地选自已知用于肽缩合反应的那些溶剂。例如，可以举出N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、氯仿、三氟乙醇、二甲亚砜、DMF、吡啶、二噁烷、二氯甲烷、四氢呋喃、乙腈、乙酸乙酯或它们的适合的混合物。

反应温度可以选自迄今为止已知用于肽键形成的范围，且通常地选自约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物一般以1.5-4倍过量的比例使用。如果通过使用茚三酮反应的试验发现缩合不充分，则可以重复缩合反应以便在不除去保护基的情况下实现充分缩合。如果多次的缩合仍然提供足够程度的缩合，则可以使用乙酐或乙酰基咪唑使未反应的氨基乙酰化。

用于原料氨基酸的氨基的保护基包括Z、Boc、叔芳基-戊氧羰基、异冰片基氧基羰基、4-甲氧基苄氧羰基、CI-Z、Br-Z、金刚烷基氧基羰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫氧基、二苯基膦基硫酰基或Fmoc。可以使用的羧基-保护基包括、但不限于上述举出的C_1-6烷基、C₃-₈环烷基和C_6-10芳基-C_1-2烷基以及2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧基苄基、4-氯苄基、苯甲酰甲基、苄氧羰基酰肼基、叔芳基-丁氧羰基酰肼基和三苯甲基酰肼基。

丝氨酸和苏氨酸的羟基可以通过酯化或醚化被保护。适合于所述酯化的基团包括碳衍生的基团，例如低级烷酰基，例如乙酰基等；芳酰基，例如苯甲酰基等；苄氧羰基和乙氧羰基。适合于所述醚化的基团包括苄基、四氢吡喃基和叔芳基-丁基。用于酪氨酸的酚羟基的保护基包括Bzl、Cl₂-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔芳基-丁基。

用于组氨酸的咪唑的保护基包括Tos、4-甲氧基-2，3，6-三乙基苯磺酰基、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。

起始氨基酸的活化羧基包括相应的酸酐、叠氮化物和活性酯类，例如与醇例如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲基醇、对-硝基苯酚、HONB、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基邻苯二甲酰亚胺、HOBt等的酯类。起始氨基酸的活化氨基包括相应的磷酰胺。

用于消除保护基的方法包括使用氢气在催化剂例如钯黑或披钯碳的存在下的催化还原；用无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或这样的酸的混合物的酸处理；用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪的碱处理；用金属钠在液体氨中还原。通过上述举出的酸处理的消除反应一般在-20℃-40℃的温度下进行，且可以通过添加阳离子受体例如茴香醚、苯酚、茴香硫醚、间-甲酚、对-甲酚、二甲硫、1，4-丁二硫醇、1，2-乙二硫醇有利地进行。用于保护组氨酸的咪唑的2，4-二硝基苯基可以通过用苯硫酚处理被消除，而用于保护色氨酸的吲哚基的甲酰基可以通过用稀氢氧化钠溶液或稀氨水的碱处理以及上述举出的在1，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇的存在下的酸处理被消除。

用于保护不应参与原料反应的官能团的方法、可以使用的保护基、除去保护基的方法和活化参与反应的官能团的方法均可以根据已知基团和方法合理地选择。

用于得到多肽的酰胺形式的另一种方法包括首先使C-末端氨基酸的-羧基酰胺化，然后使肽链延伸至N-端，直到达到期望的链长，然后选择性地使C-末端肽的α-氨基和形成目标多肽的其余部分的氨基酸或肽的α-羧基脱保护，并且使两个片段缩合，其α-氨基和侧链官能团在例如上述举出的混合溶剂中被上述举出的适合的保护基保护。缩合反应参数可以与上文所述的相同。通过上述方法从通过缩合得到的被保护的肽上除去所有保护基，由此得到期望的粗肽。可以通过已知纯化方法纯化这种粗肽并且冻干主要级分，得到目标酰胺化多肽。为了得到多肽的酯，使C-末端氨基酸的a-羧基与期望的醇缩合，得到氨基酸酯，且然后是用于生产酰胺的上述操作。

修饰的治疗肽类或多肽类和/或肽-连接基构建体包括可以与半衰期延长部分上可利用的反应官能团反应的反应基团，以形成共价键。反应基团是能够形成共价键的化学基团。反应基团一般可以是羧基、磷酰基、酰基、酯或混合酸酐、马来酰亚胺、酰胺化物、吡啶-2-基-二硫烷基，由此能够与半衰期延长部分的目标位点上或如下所述公开的化学修饰的Fc结构域上的官能团如氨基、羟基、羧基或巯基形成共价键。特别关注的用于连接至白蛋白的反应基团包括包含马来酰亚氨基的基团和包含吡啶-2-基-二硫烷基的基团。

官能团是修饰的肽类或多肽类能够与之反应形成共价键的半衰期延长部分的基团。官能团包括与酯反应实体键合的羟基、用于与马来酰亚胺类反应的巯基、包含马来酰亚氨基的基团或吡啶-2-基二硫烷基、酰胺化物和硫代酯基；和用于键合羧酸、磷酰基、酰基的氨基。

方案1-3描述肽-连接基构建体的合成，其中所述肽是式I-IV的任意一种的肽。

方案1描述包含马来酰亚胺的连接至式I-IV的多肽的N-末端的连接基的合成。

方案1.

根据充分建立的酰胺偶合化学使肽的N-末端与一个或多个O2Oc氨基酸单元偶合(x是1-20，优选1-10且更优选3-6)以生成(1A)。使(1A)的末端氨基官能团与活化的酸(1B)反应，其中R是直链或支链亚烷基、芳基、杂芳基、环烷基或其组合，以便生成包含肽-马来酰亚胺的连接基构建体(1C)。所述活化的酸(1B)是商购的或易于由其相应的羧酸根据本领域技术人员已知的技术得到。优选地，R是直链亚烷基，且更优选R是-CH₂-CH₂-。或者，对于在侧链上包含氨基官能团的肽类(例如包含赖氨酸的肽)，在偶合反应前需要正交保护基例如Alloc，随后进行另外的脱保护步骤，以便得到(1C)。

方案2A和2B描述包含吡啶-2-基-二硫烷基的连接至式I-IV的任意一种的多肽的N-末端的连接基的合成。

方案2A

方案2B

肽-连接基构建体(1A)如方案1中所述制备且使其进一步与式(2A)的活化的酸反应，其中R’是直链或支链亚烷基，以生成包含肽-吡啶-2-基-二硫烷基的连接基构建体(2B)。活化的酸(2A)是商购的或易于由其相应的羧酸根据本领域技术人员已知的技术得到。优选R’是-CH₂-CH₂-。或者，可以使用HO₂C-R’-SH或其被保护的形式(例如三苯甲基或Acm基团，需要另外的脱保护步骤)制备肽-连接基构建体(2C)，且使其进一步与(2D)反应，生成包含肽-吡啶-2-基-二硫烷基的连接基构建体(2B)。

类似的反应基团以方案1、2A和2B中所述类似的方式、使用二氨基单元例如-NH-CH₂CH₂-NH-或-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-NH-连接至肽的C-末端。这样的肽-连接基构建体(conducts)的非限制性实例是：

或者，可以根据方案3A、3B和3C，使马来酰亚胺或吡啶-2-基-二硫烷基反应基团连接至式I-IV的任意一种的多肽：

方案3A

使用标准酰胺偶合条件使肽的C-末端的羧酸基团与一个或多个O2Oc氨基酸单元偶合以生成(3A)。使末端羧酸官能团与(3B)或(3C)的氨基反应，其中R和R’如上述所定义，以便生成活化的肽-连接基构建体(3D)或(3E)。另外，当肽包含羧基官能团侧链(例如Glu或Asp)时，需要正交保护基(例如O-烯丙基)和另外的脱保护步骤。

方案3B

可以使用半胱胺2-氯三苯甲基树脂得到肽-连接基3F，且然后使其与3G或3H反应，以分别生成肽-连接基构建体3I或3E。

方案3C

可以由二胺树脂得到肽-连接基构建体(3J)，且然后使其与(1B)或(2A)进一步反应，以分别生成式(3K)或(3L)的肽-连接基构建体。

方案1-3C描述肽-连接基构建体，更具体地，其用于制备与白蛋白的生物缀合物。马来酰亚胺反应基团和吡啶-2-基-二硫烷基反应基团与白蛋白的半胱氨酸34的-SH官能团反应。

生物缀合物

在本发明的一个实施方案中，式I-IV的任意一种的肽或多肽与(以化学方式/共价连接方式)白蛋白的半胱氨酸34的巯基官能团缀合。在实施方案的一种实施方式中，白蛋白-肽是指生物缀合物，其中白蛋白(以化学连接方式)与肽的N-末端缀合。在另一个实施方案，白蛋白-肽是指生物缀合物，其中白蛋白(以化学连接方式)与肽的C-末端缀合。

发现与白蛋白共价连接的肽类显示出比未缀合复本的基本上更长的体内半衰期。

缀合物的制备：

方案4和5示例使APJ激动剂肽或式I-IV的任意一种的肽和半衰期延长部分例如Fc结构域或白蛋白缀合的化学反应。

方案4示例式4A的肽-连接基与白蛋白的半胱氨酸34的缀合。

方案4

其中L表示肽与马来酰亚胺官能团之间的连接部分。在一个具体的实施方案中，L是如方案1、3A、3B或3C中所公开的连接部分。

方案5示例式5A的肽-连接基构建体与白蛋白的半胱氨酸34的缀合。

方案5

其中L表示肽与-S-S-吡啶官能团之间的连接部分。在一个具体的实施方案中，L是如方案2、3A、3B或3C中所公开的连接部分。

还描述了用于制备如方案1-5中所述的缀合物和肽-连接基构建体的方法，且示例于共同提交的申请中(律师案卷编号：PAT055781-US-PSP)，将该文献引入本文作为参考。

药物组合物

可以通过不同方式的任意种施用本发明的多肽类或生物缀合物或其酰胺、酯或盐，包括皮下、肌内、静脉内、腹膜内、吸入、鼻内、口服等。本发明特别优选的实施方案使用本发明的多肽类或生物缀合物或其酰胺、酯或盐的连续静脉内施用。可以将本发明的多肽类作为快速浓注或连续输注在一定时间期限内施用。可以使用植入泵。在本发明的一些实施方案中，间歇或连续多肽类施用持续1天至几天(例如2-3天或3天以上)或更长时间期限，例如数周、数个月或数年。在一些实施方案中，将间歇或连续多肽或生物缀合物施用提供至少约3天。在其它实施方案中，将间歇或连续多肽施用提供至少约1周。在其它实施方案中，将间歇或连续多肽或生物缀合物施用提供至少约2周。在施用过程中或多次剂量施用之间可以期望维持高于特定阈值的平均血浆多肽浓度。例如，可以基于受试者的生理学情况、疾病严重性等确定期望的浓度。这样的期望值可以通过进行标准临床试验鉴定。或者，所述肽类及其缀合物可以通过经FcRn机制口服递送(Nat Rev Immunol.7(9)，715-25，2007；NatCommun.3；3：610，2012，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304：G262-G270，2013)。

在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明的多肽或生物缀合物或和其酰胺、酯或盐和一种或多种药学上可接受的载体。可以为特定施用途径配制药物组合物，例如口服施用、胃肠外施用和直肠施用等。此外，本发明的药物组合物可以由固体形式(包括、但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒、粉末或栓剂)或液体形式(包括、但不限于溶液、混悬液或乳剂)等构成。可以对药物组合物进行常规的制药操作，例如灭菌和/或其可以包含常用惰性稀释剂、润滑剂或缓冲液以及辅剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂和缓冲剂等。

适合于注射应用的药物组合物典型地包括无菌水溶液(如果是水溶性的)或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。

对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、细菌抑制的水、克列莫佛ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在所有情况中，组合物应是无菌的且应流动至易于以可注射性(syringability)存在的程度。优选的药物制剂在制备和储存条件下是稳定的且必须防止微生物例如细菌和真菌污染作用。一般而言，相关载体可以是溶剂或分散介质，其包含，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合的混合物。例如，可以通过使用包衣层例如卵磷脂、通过在分散体的情况中维持所需的粒度和通过使用表面活性剂维持适当的流动性。可以用各种抗菌剂和抗真菌剂防止微生物作用，例如对羟苯甲酸类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇类例如甘露糖醇、山梨醇、氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶延长可注射组合物的吸收。

一些可注射组合物是等渗水溶液或混悬液，且有利地由脂肪乳剂或混悬液制备栓剂。可以对所述组合物灭菌和/或其包含辅剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。此外，它们还可以包含其它治疗上有价值的物质。分别根据常规的混合、制粒或包衣方法制备所述组合物，且其包含约0.1-75％或包含约1-50％的活性成分。

可以通过将所需用量的活性化合物与上述成分之一或其组合进行组合、然后过滤灭菌制备无菌注射溶液。一般地，通过将活性化合物掺入无菌媒介物制备分散液，所述无菌媒介物包含碱性分散介质和所需的来自上述举出的那些的其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是从上述其无菌过滤的溶液中真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分与任意期望的成分。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。为了口服治疗施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂掺合并且以片剂、药片或胶囊例如明胶胶囊形式使用。还可以使用流体载体制备用作漱口药口服组合物。可以包括药学上相容性粘合剂和/或辅剂材料作为组合物的组成部分。片剂、丸剂、胶囊、药片等可以包含如下具有类似属性的成分或化合物的任意种：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或矫味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精。用于口服递送的制剂可以有利地掺入改善胃肠道中稳定性和/或增强吸收的活性剂。

对于通过吸入施用，优选以气雾喷雾器的形式从包含适合的推进剂例如气体例如二氧化碳的加压容器或分配器或喷雾器中递送本发明的治疗剂。注意肺提供用于全身递送治疗剂的大表面积。

例如，将所述活性剂包囊在微粒中，例如美国公开号20040096403中所述的那些或使其与各种其它本领域公知的递药媒介物的任意种合并。在本发明的其它实施方案中，例如，如美国公开号20040062718中所述将所述活性剂与带电荷的脂质一起递送。注意后面的系统可以已经用于施用治疗多肽、胰岛素，显示该系统在施用肽活性剂中的用途。

全身施用还可以通过跨粘膜或透皮方式进行。

用于透皮应用的适合的组合物包括有效量的本发明的多肽与适合的载体。适合于透皮递送的载体包括可吸收的药理学可接受的溶剂，以便辅助通过宿主皮肤。例如，透皮装置是绷带的形式，其包含裱褙层、包含化合物任选地与载体的储器、以受控和预定速率在延长时间期限内递送化合物至宿主皮肤的任选的速率控制屏障和用于将所述装置固定至皮肤的用具。

用于局部施用例如施用于皮肤和眼的适合的组合物包括水溶液、混悬液、软膏剂、霜剂、凝胶或可喷雾制剂，例如用于通过气雾剂递送等。这样的局部递送系统特别地适合于表皮施用。它们由此特别适用于局部，包括本领域众所周知的化妆品、制剂。它们可以包含增溶剂、稳定剂、张度增强剂、缓冲剂和防腐剂。

本文所用的局部施用还可以涉及吸入或鼻内施用。可以以干粉形式(单独地，作为混合物，例如与乳糖的干燥配混物或例如与磷脂类混合的成分颗粒)从干粉吸入器中或以气雾剂形式从加压容器、泵、喷雾器、雾化器或喷洒器中便利地递送它们，其中使用或不使用适合的推进剂。

本发明还提供药物组合物和剂型，其包含一种或多种减低本发明化合物作为活性成分降解速率的试剂。这样的试剂在本文中称作″稳定剂”，其包括、但不限于抗氧化剂，例如抗坏血酸、pH缓冲剂或盐缓冲剂等。

本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指保留本发明多肽类的生物有效性和特性且典型地无生物学、否则就是不期望的盐。在许多情况中，本发明的多肽类能够通过存在的氨基和/或羧基或与之类似的基团形成酸式盐和/或碱式盐。

药学上可接受的酸加成盐可与无机酸和有机酸形成，例如乙酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、溴化物/氢溴酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、樟脑磺酸盐、氯化物/盐酸盐、氯茶碱盐、柠檬酸盐、乙二磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、马尿酸盐、氢碘酸盐/碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、十八酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、聚半乳糖酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、磺基水杨酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和三氟乙酸盐。

可以衍生盐的无机酸包括，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。

可以衍生盐的有机酸包括，例如乙酸、丙酸、乙醇酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、磺基水杨酸等。药学上可接受的碱加成的盐可以与无机碱和有机碱形成。

可以衍生盐的无机碱包括，例如铵盐和周期表I至XII族金属的盐。在一些实施方案中，所述盐衍生自钠、钾、铵、钙、镁、铁、银、锌和铜；特别适合的盐包括铵、钾、钠、钙和镁的盐。

可以衍生盐的有机碱包括，例如伯、仲和叔胺类，取代的胺类，包括天然存在的取代的胺类，环胺类，碱性离子交换树脂等。一些有机胺类包括异丙基胺、苄星青霉素、胆碱酸盐(cholinate)、二乙醇胺、二乙胺、赖氨酸、葡甲胺、哌嗪和氨丁三醇。

通过常规化学方法，可以从母体化合物的碱性或酸性部分合成本发明的药学上可接受的盐。一般来讲，可以如下制备所述的盐：使这些化合物的游离酸形式与化学计算量的适当的碱(例如Na、Ca、Mg或K的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应或使这些化合物的游离碱形式与化学计算量的适当的酸反应。这类反应典型地在水或有机溶剂或两者的混合物中进行。一般来讲，在可行时，使用非水介质例如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是可取的。其它适合的盐的列表可以见于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第20版，Mack出版公司(Mack Publishing Company)，Easton，Pa.(1985)，以及见于Stahl和Wermuth的“Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use”(Wiley-VCH，Weinheim，德国，2002)。

本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括本领域技术人员已知的任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣衣料、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等张剂(isotonic agent)、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等以及它们的组合(参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，第1289-1329页)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则其在治疗或药物组合物中的应用将被考虑。

本发明的方法：

肽类的Apelin家族是G蛋白偶联APJ受体的配体的唯一已知的天然家族。Apelin基因编码77个氨基酸的多肽，其被加工成apelin肽类的生物活性形式，例如apelin-36、apelin-17、apelin-16、apelin-13、apelin-12和apelin-13的焦谷氨酸盐修饰形式(Pyr¹-apelin-13)。这些apelin肽类的任意一种在结合APJ受体时通过Gi和Gq蛋白转导信号。在心肌细胞中，Gi或Gq偶联导致胞内pH改变、PLC活化和IP3产生，这增强肌丝钙敏感性，且最终导致心肌收缩力增加。Gi偶联抑制活化的Gs、腺苷酸环化酶和cAMP产生并且增加pAkt水平，导致保护心脏。在血管内皮细胞中，APJ通过Gi、pAKT活化导致一氧化氮(NO)产生增加，这增加了平滑肌松弛，导致完全血管舒张。

具有慢性稳定性心力衰竭的患者具有偶然的急性代偿失调发作，其中心肌收缩力进一步下降和症状恶化。这些恶化称作急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)。用于ADHF的最新疗法包括利尿药、血管扩张剂和正性肌力药，它们直接增加心肌收缩力。众所周知目前的静脉内正性肌力药(多巴酚丁胺、多巴胺、米力农、左西孟旦)的不良反应，例如心律失常和长期死亡率增加。本发明的合成apelin多肽类似物或其生物缀合物提供用于ADHF的疗法，其增加心肌收缩力，但没有致心律失常性或死亡倾向性，并且解决了慢性心力衰竭中大量的未得到满足的医疗需求。

实际上，在人体中的紧急apelin治疗(5min)导致冠状血管扩张和心输出量改善。然而，天然apelins显示在体内极短的t_1/2(秒)和作用期限(几分钟)。本发明的有效合成apelin肽激动剂具有长于天然apelin的半衰期。

APJ受体在心肌细胞中活化：a)通过Gi/Gq、PLC和Ca2+改善心肌收缩力；和b)通过Gi、pAkt活化提供心脏保护，但没有增加cAMP(正如使用其它正性肌力药所观察到的)。此外，APJ在内皮细胞中的激动作用导致动脉血管扩张，通过卸载左心室的工作进一步有益心力衰竭治疗。合成apelin多肽类似物可以共同改善总体心脏功能、减少心律失常发生和提供存活有益性。

更近来，有大量临床前研究出版物集中于糖尿病和胰岛素抵抗中Apelin的潜在牵涉。已经证实Apelin：1)通过改善肌肉、脂肪细胞和心脏中的葡萄糖摄取降低血糖水平；2)防止胰腺β细胞发生ER应激和随后的细胞凋亡；3)降低β细胞中的胰岛素分泌；和4)调节脂肪组织中儿茶酚胺诱导的溶脂(lypolysis)。活化pAKT途径牵涉这些过程。

式I-IV的任意一种的多肽类或其药学上可接受的盐或其游离形式或药学上可接受的盐形式的生物缀合物显示出有价值的药理学特性，例如APJ受体激动特性，例如如下一部分中提供的体内和体外试验中所示，且由此指示用于疗法。

本发明的多肽类或其药学上可接受的盐或其生物缀合物可以用于治疗选自急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、Brugada综合征、室性心动过速、脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水分潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂脑缺血发作、创伤性脑损伤、萎缩侧索硬化、烧伤(包括晒伤)和先兆子痫的适应征。

因此，作为另一个实施方案。本发明提供式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物在治疗与APJ受体活性相关的疾病中的用途。在另一个实施方案中，所述疗法选自对APJ受体激动作用有响应的疾病。在另一个实施方案，所述疾病选自上述举出的列表，适合的是急性代偿失调性心力衰竭。在该实施方案的另一种亚型中，本发明提供式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物在制备用于治疗与APJ受体活性相关的疾病中的药物中的用途。

因此，作为另一个实施方案。本发明提供式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物在疗法中的用途。在另一个实施方案中，所述疗法选自可以通过活化(激动)APJ受体治疗的疾病。

在另一个实施方案中，本发明提供治疗对APJ受体激动作用有响应的疾病的方法，包含施用治疗有效量的式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物。在另一个实施方案中，所述疾病选自上述举出的列表，适合地是急性代偿失调性心力衰竭。

在该实施方案的另一种亚型中，本发明提供治疗与APJ受体活性相关的疾病的方法，包含施用治疗有效量的式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物。

例如，治疗上使用的本发明药物组合物或组合的有效量取决于治疗环境和目的。本领域和技术人员可以理解，适合的治疗剂量水平由此部分根据所递送的分子、使用融合蛋白变体针对的适应征、施用途径和患者大小(体重、体表面积或器官大小)和情况(年龄和一般健康状况)的不同而改变。因此，临床医师可以递增剂量并且改变施用途径，以得到最佳治疗效果。典型剂量可以在约0.1μg/kg至约100mg/kg或以上，这取决于上述举出的因素。在其它实施方案中，剂量可以在0.1μg/kg至约100mg/kg；或1μg/kg酯约100mg/kg。

给药频率取决于所用制剂中的双重功能蛋白的药代动力学参数。典型地，临床医师将组合物施用至剂量达到期望的效果为止。因此，可以将组合物作为单剂量、作为两次或多次剂量(可以包含相同量的期望的分子，也可以不包含相同量的期望的分子)在一定时间内施用或作为通过植入装置或导管连续输注施用。适合剂量的进一步精简通常由本领域技术人员进行且通常在他们所实施的任务范围内。可以通过使用适合的剂量响应数据确定适合的剂量。

在另一个非限制性实施方案中，术语“治疗有效量”是指在施用于细胞或组织或非细胞生物材料或介质时有效地至少部分活化APJ受体的本发明生物缀合物的用量。正如本领域技术人员可以理解的，为有效的特定药物的绝对用量可以根据例如期望的生物学终点、所递送的药物、靶组织等这样的因素的不同而改变。本领域技术人员可以理解，“治疗有效量”可以以单剂量施用或通过施用多次剂量实现。例如，在活性剂治疗心力衰竭的情况中，有效量可以是足以导致患者临床改善的用量，例如运动耐量/能力增加、血压增加、液体(fliud)潴留减少/或在心脏功能的定量试验时结果改善，例如射血分数、运动能力(达到筋疲力尽的时间)等。

本文所用的术语“受试者”是指动物。典型地，所述动物是哺乳动物。受试者还指例如灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方案中，所述受试者是灵长类动物。在其它实施方案中，所述受试者是人。

本文所用的术语“抑制”是指减轻或抑制给定的病症、症状、或障碍、或疾病，或者显著减少生物学活性或过程的基线活性。

本文所用的术语“治疗”任何疾病或障碍在一个实施方案中是指改善所述疾病或障碍(即，减慢或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施方案中，“治疗”是指缓解或改善至少一种物理参数，包括可能不是患者可辨别的那些物理参数。在又一个实施方案中，“治疗”是指在身体上(例如可辨别的症状的稳定)、生理上(例如物理参数的稳定)或者这两个方面对所述疾病或障碍进行调节。在又一个实施方案中，“治疗”是指预防或延迟所述疾病或障碍的发作或发生或进展。

本文所用的术语″预防″是指因施用疗法(例如治疗剂)或施用疗法的组合(例如治疗剂的组合)导致的防止受试者的障碍的一种或多种症状复发、发作或发展。

如本文所用的那样，如果受试者会在生物学上、医学上或生活质量方面从这类治疗中获益，那么该受试者是“需要”治疗的。

除非本文另有说明或者上下文清楚地有相反含义，否则本文所用的术语“一个”、“一种”、“该/所述”以及本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)所使用的类似术语应理解为既包括单数，又包括复数。

除非本文另有说明或者上下文清楚地有相反含义，否则本文所述的所有方法可以以任意适合的顺序进行。本文提供的任意和所有实施例或举例性语言(例如，“例如”)的使用仅仅旨在更好地举例说明本发明，不对在另外部分请求保护的本发明的范围构成限制。

可以通过如下所述体外方法评价本发明多肽的活性。

hAPJ钙流量测定：

将Chem-5APJ稳定细胞(Millipore#HTS068C)以10,000个细胞/孔在384-孔格中的25ul生长培养基中铺板，然后在37℃组织培养温育器中生长24小时。试验前1小时，加入25ul/孔FLIPR钙4染料(Molecular Devices R8142)与2.5mM丙磺舒，并且将细胞在37℃组织培养温育器中温育1小时。用HBSS、HEPES&0.1％BSA缓冲液增溶肽类并且从50uM至5pM顺序稀释10-倍，一式三份。FLIPR Tetra用于将肽与染料加入到细胞中(1：5，最终肽浓度10uM-1pM)。细胞内部的FLIPR染料在结合钙后发射荧光，而来自细胞外部的荧光被掩蔽。用FLIPR Tetra使用470-495激发和515-575发射波长测定荧光。总计读取3分钟，从肽添加前10秒开始。计算最大-最小值并且对于每个肽浓度绘图，且对于肽类的钙流量刺激，GraphPad prism软件用于计算曲线拐点上的EC₅₀值。

血浆稳定性试验：

材料：

工作溶液：1mg/mL测试制品用Milli-Q水制备。

萃取溶液：含有0.1％甲酸和400ng/mL格列本脲的甲醇∶乙腈∶水(1∶1∶1)。

血浆：雄性Sprague-Dawley大鼠血浆(含有肝素钠)，购自Bioreclamation LLC(Liverpool，NY)。

全血：雄性Sprague Dawley全血(含有肝素钠)，购自Bioreclamation LLC(Liverpool，NY)。

肺匀化物：雄性大鼠Sprague Dawley肺购自Bioreclamation LLC(Liverpool，NY)。在添加5x体积的IX PBS后使用polytron匀化器匀化肺。将匀化物在4℃以9000rpm离心10min。将上清液以3000rpm再次离心30min以使上清液澄清。使用商购试剂盒(Pierce，Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。

样品制备方法：(肽类)

用如下生物基质之一制备测试制品：肝素化大鼠血浆、肝素化大鼠全血或肺匀化物。通过将5uL 1mg/mL工作溶液添加到995uL大鼠血浆或全血中制备5000ng/mL血浆或全血样品。通过用磷酸缓冲盐水(PBS)将肺匀化物稀释至1mg/ml蛋白质浓度、随后将5uL工作溶液添加到995uL稀释的肺匀化物中制备肺匀化物。将样品在37℃与适度振摇下(65～75rpm)在水浴温育器中温育。在0min、5min、15min、30min、60min、120和240min的时间，将25uL等分的温育样品转入96-孔培养板，并且即刻使用150uL萃取溶液沉淀蛋白质。在温育实验完成后，将样品培养板在4℃以4000rpm离心10分钟。此后，移液装置(Tecan Temo)用于将上清液转入另一个培养板并且将50uL水添加到全部样品中。将培养板涡旋，然后进行LC-MS分析。

样品制备方法：(缀合物)

通过将5uL 1mg/mL工作溶液添加到495uL大鼠血浆中制备50,000ng/mL的测试制品。将样品在37℃与适度振摇下(65～75rpm)在水浴温育器中温育。在0hr、0.5hr、1hr、2hr、4hr、6和24hr的时间，将50uL等分的温育样品转入96-孔培养板，并且将100uL 40mM TCEP(三(2-羧基乙基)膦)加入到每个样品中。将该反应混合物在37℃温育1小时。反应完成后，使用300uL乙腈进行蛋白质沉淀。将样品培养板在4℃以4000rpm离心10分钟。此后，移液装置(Tecan Temo)用于将125uL上清液转入另一个培养板并且将50uL水添加到全部样品中。将培养板涡旋，然后进行LC-MS分析。

样品稳定性的LC-MS分析

HPLC：带有自动采样器的Agilent 1290HPLC

柱：MAC-MOD ACE C18，3μm，30mm x 2.1mm i.d.

流动相A：0.1％甲酸的乙腈溶液

流动相B：0.1％甲酸的水溶液

梯度程序：

质谱仪：Agilent Q-TOF 6530

数据采集模式：使用100-1000m/z质量范围的全扫描

数据采集和分析软件：MassHunter

数据分析：

稳定性试验：通过将每个时间点的峰面积转化成相当于起始(t＝0)峰面积的保留百分比测定稳定半衰期(t1/2)值。

保留百分比＝100x(样品峰面积)÷(t＝0峰面积)

计算保留百分比值的自然对数并且对样品时间绘图(Microsoft Excel)。通过线性回归(Microsoft Excel)测定这种直线的斜率k。

然后通过公式t1/2＝0.693÷k计算稳定半衰期。

基于替代物活性的血浆稳定性试验：

遵循上述钙流量方案，其中进行如下改变。将肽类还与5％大鼠血浆(Bioreclamation#RATPLNAHP-M，肝素Na处理的)一起温育。在37℃组织培养温育器中温育后在t₀和t₂₄hrs时间点采集读数。通过计算如下值估计以分钟计的肽血浆半衰期：

1)LN((在t₀时的EC₅₀)/(在t_24hrs时的EC₅₀))；

2)计算上述值的斜率；和

3)t_1/2＝0.693/(斜率^2)。

使用试验测定法(如上所述)，本发明的多肽类显示在如下提供的表2和3中的效能和稳定性。

表2：多肽类的活性和稳定性

表3：血浆稳定性试验与基于替代物活性的血浆稳定性试验之间的相关性：

本发明的多肽或其生物缀合物可以具有与apelin-13或pyr-1-apelin-13类似的APJ受体效能。在一个实施方案中，本发明的多肽或其生物缀合物具有低于100nM的EC₅₀。在另一个实施方案中，本发明的多肽或其生物缀合物具有低于50nM、优选低于25nM且更优选低于15nM的EC₅₀。在另一个实施方案，本发明的多肽具有低于10nM的EC₅₀。

本发明的多肽或其生物缀合物可以具有优于apelin-13或pyr-1-apelin-13的血浆稳定性。在一个实施方案中，血浆稳定性改善至少是2倍。在一个实施方案中，本发明的多肽或其生物缀合物具有至少30分钟的血浆稳定性。在另一个实施方案中，本发明的多肽或其生物缀合物具有至少60分钟或至少80min、优选至少100分钟且更优选至少150分钟的血浆稳定性。

可以与一种或多种另外的治疗剂同时或在其之前或之后施用本发明的多肽或其生物缀合物。可以通过相同或不同施用途径单独地或与另一种药物在同一药物组合物中一起施用本发明的多肽。

在一个实施方案中，本发明提供产品，其包含式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物和至少一种治疗剂作为组合制剂，用于同时、单独或依次用于疗法。在一个实施方案中，所述疗法是治疗对活化APJ受体有响应的疾病或病症。

提供作为组合制剂的产品，其包括包含在同一药物组合物中的式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、或盐或其生物缀合物和另一种治疗剂一起或单独形式的式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物和另一种治疗剂的组合物，例如药盒形式。

在一个实施方案中，本发明提供包含式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物和另一种治疗剂的药物组合物。任选地，该药物组合物可以包含如上所述的药学上可接受的赋形剂。

在一个实施方案中，本发明提供药盒，其包含两种或多种药物组合物，其中的至少一种包含式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物。在一个实施方案中，所述药盒包含单独地保留所述组合物的装置，例如容器、分开的小瓶或分开的箔袋。这样的药盒的实例是泡罩包，典型地用于包装片剂、胶囊等。

本发明的药盒可以用于施用不同的剂型，例如口服和胃肠外，例如用于在不同的剂量间隔施用单独的组合物，或用于彼此递增单独的组合物。为了有助于依从性，本发明的药盒典型地包含施用说明书。

在本发明的联合疗法中，可以由相同或不同的制造商制备和/或配制本发明的化合物和另一种治疗剂。此外，本发明的化合物和另一种治疗剂可以一起进入联合疗法：(i)在临床医师释放组合产品前(例如在包含本发明的化合物和另一种治疗剂的情况中)；(ii)在施用前即刻由临床医师自身(或在临床医师指导下)；(iii)由患者自身，例如在依次施用本发明的多肽和另一种治疗剂的过程中。

因此，本发明提供式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物在治疗对激动APJ受体有响应的疾病或病症中的用途，其中制备与另一种治疗剂一起施用的药物。本发明还提供另一种治疗剂在治疗对激动apelin受体有响应的疾病或病症中的用途，其中将所述药物与式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物一起施用。

本发明还提供式I-IV的任意一种的多肽或其药学上可接受的盐或其生物缀合物，其用于治疗对激动APJ受体有响应的疾病或病症的方法中，其中制备与另一种治疗剂一起施用的式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物。本发明还提供另一种治疗剂，其用于治疗对激动APJ受体有响应的疾病或病症的方法中，其中制备与式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物一起施用的另一种治疗剂。本发明还提供式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐，其用于治疗对激动APJ受体有响应的疾病或病症的方法中，其中将式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物与另一种治疗剂一起施用。本发明还提供另一种治疗剂，其用于治疗对激动APJ受体有响应的疾病或病症的方法中，其中将另一种治疗剂与式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物一起施用。

本发明还提供式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物在治疗对激动APJ受体有响应的疾病或病症中的用途，其中预先(例如在24小时内)用另一种治疗剂治疗患者。本发明还提供另一种治疗剂在治疗对激动APJ受体有响应的疾病或病症中的用途，其中预先(例如在24内)用式I-IV的任意一种的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物治疗患者。

在一个实施方案中，另一种治疗剂选自正性肌力药、β肾上腺素能受体阻滞剂、HMG-Co-A还原酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、钙通道阻滞剂(CCB)、内皮缩血管肽拮抗剂、肾素抑制剂、利尿药、ApoA-I模拟物、抗糖尿病药、减肥药、醛固酮受体阻滞剂、内皮素受体阻滞剂、醛固酮合酶抑制剂(ASI)、CETP抑制剂、抗凝血药、松弛素、BNP(奈西立肽)和NEP抑制剂。

术语“与”第二种药物或治疗组合包括共同-施用本发明的多肽(例如式I-IV的任意一种的多肽或本文另外所述的其生物缀合物或本文另外所述的多肽、生物缀合物)与第二种药物或治疗；首先施用本发明的化合物，然后施用第二种药物或治疗；和首先施用第二种药物或治疗，然后施用本发明的化合物。

术语“第二种药物”包括本领域已知用于治疗、预防或减轻本文所述的疾病或障碍例如对活化APJ受体有响应的障碍或疾病的症状的任意药物，所述疾病或障碍例如，急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水分潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂脑缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化、烧伤(包括晒伤)和先兆子痫。

第二种药物的实例包括正性肌力药、β肾上腺素能受体阻滞剂、HMG-Co-A还原酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、钙通道阻滞剂(CCB)、内皮缩血管肽拮抗剂、肾素抑制剂、利尿药、ApoA-I模拟物、抗糖尿病药、减肥药、醛固酮受体阻滞剂、内皮素受体阻滞剂、醛固酮合酶抑制剂(ASI)、CETP抑制剂、抗凝血药、松弛素、BNP(奈西立肽)和/或NEP抑制剂。

本文所用的正性肌力药包括，例如多巴酚丁胺、异丙肾上腺素、米力农、左西孟旦、肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素和地高辛。

本文所用的β肾上腺素能受体阻滞剂包括，例如醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、卡替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔。

本文所用的抗凝血药包括达肝素、达那肝素、依诺肝素、肝素、亭扎肝素、华法林。

术语“HMG-Co-A还原酶抑制剂”(也称作β-羟基-β-甲基戊二酰辅酶-A还原酶抑制剂)包括可以用于降低脂质包括血液中的胆固醇水平的活性剂。实例包括阿托伐他汀、西立伐他汀、美伐他汀、达伐他汀、二氢达伐他汀、fluindostatin、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、rivastatin、辛伐他汀和velostatin或其药学上可接受的盐。

术语“ACE-抑制剂”(也称作血管紧张转化酶抑制剂)包括打断血管紧张素I至血管紧张素II的酶降解的分子。这样的化合物可以用于调节血压并且用于治疗充血性心力衰竭。实例包括阿拉普利、贝那普利、贝那普利拉、卡托普利、西罗普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、enaprilat、福辛普利、咪达普利、赖诺普利、莫昔普利、moveltopril、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、替莫普利和群多普利或其药学上可接受的盐。

术语“内皮缩血管肽拮抗剂”包括波生坦(参考文献EP 526708 A)、替唑生坦(参考文献WO 96/19459)或其药学上可接受的盐。

术语“肾素抑制剂”包括地替吉仑(化学名：[1S-[1R＊，2R＊，4R＊(1R＊，2R＊)]]-1-[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]-L-脯氨酰基-L-苯基丙氨酰基-N-[2-羟基-5-甲基-1-(2-甲基丙基)-4-[[[2-甲基-1-[[(2-吡啶基甲基(mrthyl))氨基]羰基]丁基]氨基]羰基]己基]-N-α-甲基-L-组氨酰胺)；特拉吉仑(化学名：[R-(R＊，S＊)]-N-(4-吗啉基羰基)-L-苯基丙氨酰基-N-[1-(环己基甲基)-2-羟基-3-(1-甲基乙氧基)-3-氧代丙基]-S-甲基-L-半胱氨酸酰胺)；阿利吉仑(化学名：(2S，4S，5S，7S)-5-氨基-N-(2-氨基甲酰基-2，2-二甲基乙基)-4-羟基-7-{[4-甲氧基-3-(3-甲氧基丙氧基)苯基]甲基}-8-甲基-2-(丙-2-基)壬酰胺)和占吉仑(化学名：[1S-[1R＊[R＊(R＊)]，2S＊，3R＊]]-N-[1-(环己基甲基)-2，3-二羟基-5-甲基己基]-α-[[2-[[(4-甲基-1-哌嗪基)磺酰基]甲基]-1-氧代-3-苯基丙基]-氨基]-4-噻唑丙酰胺)或其盐酸盐或作为Speedel研发的SPP630，SPP635和SPP800或式(A)和(B)的RO66-1132和RO 66-1168：

和

或其药学上可接受的盐。

如果没有特别定义，则术语“阿利吉仑”应理解为其游离碱及其盐，尤其是其药学上可接受的盐，最优选其半富马酸盐。

术语“钙通道阻滞剂(CCB)”包括二氢吡啶类(DHP)和非-DHP(例如地尔硫卓-型和维拉帕米-型CCB)。实例包括氨氯地平、苄普地尔、地尔硫卓、非洛地平、ryosidine、伊拉地平、拉西地平、尼卡地平、硝苯地平、尼古地平、尼鲁地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平、维拉帕米和尼伐地平，且优选非-DHP代表，其选自氟桂利嗪、心可定、地尔硫卓、芬地林、戈洛帕米、米贝拉地尔、米贝拉地尔、阿尼帕米、噻帕米和维拉帕米或其药学上可接受的盐。CCB可以用作抗高血压药、抗心绞痛药或抗心律失常药。

术语“利尿药”包括噻嗪类衍生物(例如氯噻嗪、氢氯噻嗪、methylclothiazide和氯噻酮)。

术语“ApoA-I模拟物”包括D4F肽类(例如式D-W-F-K-A-F-Y-D-K-V-A-E-K-F-K-E-A-F)(SEQ ID NO：23)。

血管紧张素II受体拮抗剂或其药学上可接受的盐应理解为结合血管紧张素II受体的AT₁-亚型、但不会导致该受体活化的活性成分。作为抑制AT₁受体的结果，例如，这些拮抗剂可以用作抗高血压药或用于治疗充血性心力衰竭。

AT₁受体拮抗剂类型包含具有不同结构特征的化合物，尤其优选非肽化合物。例如，可以举出选自缬沙坦、氯沙坦、坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、沙普立沙坦、他索沙坦、替米沙坦的化合物、具有下式的命名为E-147的化合物

具有下式的命名为SC-52458的化合物

和具有下式的命名为ZD-8731的化合物

或在每种情况中的其药学上可接受的盐。

优选的AT₁-受体拮抗剂是坎地沙坦、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦、替米沙坦、缬沙坦。还优选已经销售的那些药物，优选缬沙坦或其药学上可接受的盐。

术语“抗糖尿病药”包括促进胰岛素从胰腺β-细胞分泌胰岛素的胰岛素分泌增强剂。实例包括双胍衍生物(例如二甲双胍)、磺酰脲类(SU)(例如甲苯磺丁脲、氯磺丙脲、妥拉磺脲、妥拉磺脲、4-氯-N-[(1-吡咯烷基氨基)羰基]-苯磺酰胺(glycopyramide)、格列己脲(格列本脲)、格列齐特、1-丁基-3-间氨基苯磺酰脲、磺胺丁脲、glibonuride、格列吡嗪、格列喹酮、格列派特(glisoxepid)、格列噻唑、glibuzole、格列己脲、格列嘧啶、格列平脲、苯磺丁脲和tolylcyclamide)或其药学上可接受的盐。另外的实例包括式

的苯基丙氨酸衍生物(例如那格列胺[N-(反式-4-异丙基环己基羰基)-D-苯基丙氨酸](参考文献EP 196222和EP 526171)；瑞格列奈[(S)-2-乙氧基-4-{2-[[3-甲基-1-[2-(1-哌啶基)苯基]丁基]氨基]-2-氧代乙基}苯甲酸](参考文献EP 589874、EP 147850 A2，特别是61页上的实施例11和EP 207331 A1)；(2S)-2-苄基-3-(顺式-六氢-2-异喹啉基羰基)-丙酸钙二水合物(例如米格列奈(参考文献EP 507534))；和格列美脲(参考文献EP31058)。

与本发明的肽和多肽组合使用的第二种药物的另外的实例包括DPP-IV抑制剂、GLP-1和GLP-1激动剂。

DPP-IV负责使GLP-1失活。更具体地，DPP-IV生成GLP-1受体拮抗剂且由此缩短对GLP-1的生理学响应。GLP-1是胰腺胰岛素分泌的主要刺激剂且对葡萄糖处置具有直接有益作用。

DPP-IV(二肽基肽酶IV)抑制剂可以是肽或优选非肽化合物。DPP-IV抑制剂在每种情况中一般和具体地公开在例如WO 98/19998、DE 196 16 486 A1、WO 00/34241和WO 95/15309中，特别地，在每种情况中，公开在化合物权利要求和制备实施例的终产物、终产物的主题、药物制剂和权利要求中，将这些文献引入本申请作为对这些出版物的参考。优选的是那些分别具体公开在WO 98/19998实施例3和WO 00/34241的实施例1中的化合物。

GLP-1(胰高血糖素样肽-1)是促胰岛素蛋白，其由例如W.E.Schmidt等人描述在Diabetologia，28，1985，704-707和US 5,705,483中。

术语“GLP-1激动剂”包括GLP-1(7-36)NH₂的变体和类似物，其具体地公开在US 5,120,712、US 5,118666、US 5,512,549、WO 91/11457和C.Orskov等人的J.Biol.Chem.264(1989)12826中。其它实例包括GLP-1(7-37)，在该化合物中，Arg³⁶的羧基末端酰胺官能团被GLP-1(7-36)NH₂分子的第37位上的Gly替代，且其变体和类似物包括GLN⁹-GLP-1(7-37)、D-GLN⁹-GLP-1(7-37)、乙酰基LYS⁹-GLP-1(7-37)、LYS¹⁸-GLP-1(7-37)，且特别是GLP-1(7-37)OH、VAL⁸-GLP-1(7-37)、GLY⁸-GLP-1(7-37)、THR⁸-GLP-1(7-37)、MET⁸-GLP-1(7-37)和4-咪唑基丙酰基-GLP-1。特别优选还指由Greig等人描述在Diabetologia 1999，42，45-50中的GLP激动剂类似物exendin-4。

定义“抗糖尿病药”中还包括恢复受损的胰岛素受体功能以减轻胰岛素抵抗且由此增强胰岛素敏感度的胰岛素敏感度增强剂。实例包括降血糖噻唑烷二酮衍生物(例如格列酮，(S)-((3，4-二氢-2-(苯基-甲基)-2H-1-苯并吡喃-6-基)甲基-噻唑烷-2，4-二酮(恩格列酮)、5-{[4-(3-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-1-氧代丙基)-苯基]-甲基}-噻唑烷-2，4-二酮(达格列酮)、5-{[4-(1-甲基-环己基)甲氧基]-苯基}甲基)-噻唑烷-2，4-二酮(环格列酮)、5-{[4-(2-(1-吲哚基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑烷-2，4-二酮(DRF2189)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-乙氧基]}苄基)-噻唑烷-2，4-二酮(BM-13.1246)、5-(2-萘基磺酰基)-噻唑烷-2，4-二酮(AY-31637)、双{4-[(2，4-二氧代-5-噻唑烷基)甲基]苯基}甲烷(YM268)、5-{4-[2-(5-甲基-2-苯基-4-噁唑基)-2-羟基乙氧基]苄基}-噻唑烷-2，4--二酮(AD-5075)、5-[4-(1-苯基-1-环丙烷羰基氨基)-苄基]-噻唑烷-2，4-二酮(DN-108)、5-{[4-(2-(2，3-二氢吲哚-1-基)乙氧基)苯基]甲基}-噻唑烷-2，4-二酮、5-[3-(4-氯-苯基)]-2-丙炔基)-5-苯基磺酰基)噻唑烷-2，4-二酮、5-[3-(4-氯苯基)]-2-丙炔基)-5-(4-氟苯基-磺酰基)噻唑烷-2，4-二酮、5-{[4-(2-(甲基-2-吡啶基-氨基)-乙氧基)苯基]甲基}-噻唑烷-2，4-二酮(罗格列酮)、5-{[4-(2-(5-乙基-2-吡啶基)乙氧基)苯基]-甲基}噻唑烷-2，4-二酮(吡格列酮)、5-{[4-((3，4-二氢-6-羟基-2，5，7，8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)甲氧基)-苯基]-甲基}-噻唑烷-2，4-二酮(曲格列酮)、5-[6-(2-氟-苄氧基)萘-2-基甲基]-噻唑烷-2，4-二酮(MCC555)、5-{[2-(2-萘基)-苯并噁唑-5-基]-甲基}噻唑烷-2，4-二酮(T-174)和5-(2，4-二氧代噻唑烷-5-基甲基)-2-甲氧基-N-(4-三氟甲基-苄基)苯甲酰胺(KRP297))。

另外的抗糖尿病药包括胰岛素信号传导途经调节剂，如蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTPases)抑制剂、抗糖尿病非小分子模拟物化合物和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶(GFAT)抑制剂；影响失调的肝葡萄糖生成的化合物，如葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)抑制剂、果糖-1，6-二磷酸酶(F-1，6-Bpase)抑制剂、糖原磷酸化酶(GP)抑制剂、胰高血糖素受体拮抗剂和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)的抑制剂；丙酮酸脱氢酶激酶(PDHK)抑制剂；胃排空抑制剂；胰岛素；GSK-3抑制剂；类视色素X受体(RXR)激动剂；β-3AR激动剂；解偶联蛋白(UCPs)激动剂；非-格列酮类PPARγ激动剂；双向PPARα/PPARγ激动剂；包含钒的抗糖尿病化合物；肠降血糖素激素，如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和GLP-1激动剂；β细胞咪唑啉受体拮抗剂；米格列醇；α₂-肾上腺素能拮抗剂；及其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，本发明提供组合，特别是药物组合，其包含治疗有效量的根据式I-IV的任意一种的定义的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物和一种或多种治疗活性剂，其选自β-肾上腺素能受体阻滞剂，例如醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、比索洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和噻吗洛尔；血管紧张素II受体拮抗剂，例如AT1阻滞剂；抗糖尿病药，例如DPPIV抑制剂(例如维格列汀)和GLP1肽激动剂。

术语“减肥药”包括脂肪酶抑制剂(例如奥利司他)和食欲抑制剂(例如西布曲明和芬特明)。

醛固酮合酶抑制剂或其药学上可接受的盐应理解为具有抑制醛固酮产生的属性的活性成分。醛固酮合酶(CYP11B2)是线粒体细胞色素P450酶，其催化肾上腺皮质中醛固酮产生的最终步骤，即将11-脱氧皮质固酮转化成醛固酮。已知用所谓的醛固酮合酶抑制剂抑制醛固酮产生是治疗低钾血症、高血压、充血性心力衰竭、心房颤动或肾衰竭的成功变化形式。这样的醛固酮合酶抑制活性易于由本领域技术人员根据标准测定法(例如US 2007/0049616)测定。

醛固酮合酶抑制剂的类型包含类固醇和非类固醇醛固酮合酶抑制剂，最优选后者。

优选商购醛固酮合酶抑制剂或那些已经被卫生当局批准的醛固酮合酶抑制剂。

醛固酮合酶抑制剂的类型包含具有不同结构特征的化合物。非类固醇醛固酮合酶抑制剂的实例是下式的法倔唑的盐酸盐的(+)-对映体(US专利4617307和4889861)

或如果适合，其药学上可接受的盐。

用于所述组合的醛固酮合酶抑制剂是一般和具体地公开在例如US2007/0049616中的化合物和类似物，特别地公开在化合物权利要求和制备实施例终产物、终产物主题、药物制剂和权利要求中，将该文献引入本申请作为对该出版物的参考。优选的适用于本发明的醛固酮合酶抑制剂包括、但不限于4-(6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-基)-3-甲基苄腈；5-(2-氯-4-氰基苯基)-6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-甲酸(4-甲氧基苄基)甲基酰胺；4’-氟-6-(6，7，8，9-四氢-5H-咪唑并[1，5-a]吖庚因-5-基)联苯-3-甲腈；5-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-甲酸丁酯；4-(6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-基)-2-甲氧基苄腈；5-(2-氯-4-氰基苯基)-6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-甲酸4-氟苄基酯；5-(4-氰基-2-三氟甲氧基苯基)-6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-甲酸甲基酯；5-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-甲酸2-异丙氧基乙基酯；4-(6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-基)-2-甲基苄腈；4-(6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-基)-3-氟苄腈；4-(6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-基)-2-甲氧基苄腈；3-氟-4-(7-亚甲基-6，7-二氢-5H-吡咯并[1，2-c]咪唑-5-基)苄腈；顺式-3-氟-4-[7-(4-氟-苄基)-5，6，7，8-四氢-咪唑并[1，5-a]吡啶-5-基]苄腈；4’-氟-6-(9-甲基-6，7，8，9-四氢-5H-咪唑并[1，5-a]吖庚因-5-基)联苯-3-甲腈；4’-氟-6-(9-甲基-6，7，8，9-四氢-5H-咪唑并[1，5-a]吖庚因-5-基)联苯-3-甲腈；或在每种情况中，为其(R)或(S)对映体；或如果适合，为其药学上可接受的盐。

术语醛固酮合酶抑制剂还包括WO2008/076860、WO2008/076336、WO2008/076862、WO2008/027284、WO2004/046145、WO2004/014914、WO2001/076574中公开的化合物和类似物。

此外，醛固酮合酶抑制剂还包括公开在美国专利申请US2007/0225232、US2007/0208035、US2008/0318978、US2008/0076794、US2009/0012068、US20090048241和PCT申请WO2006/005726、WO2006/128853、WO2006128851、WO2006/128852、WO2007065942、WO2007/116099、WO2007/116908、WO2008/119744和欧洲专利申请EP 1886695中的化合物和类似物。优选的适用于本发明的醛固酮合酶抑制剂包括、但不限于作为Speedel研发的8-(4-氟苯基)-5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c1[1，41噁嗪；4-(5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c][1，4]噁嗪-8-基)-2-氟苄腈；4-(5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c][1，4]噁嗪-8-基)-2，6-二氟苄腈；4-(5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c][1，4]噁嗪-8-基)-2-甲氧基苄腈；3-(5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c][1，4]噁嗪-8-基)苄腈；4-(5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c][1，4]噁嗪-8-基)酞腈；4-(8-(4-氰基苯基)-5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c][1，4]噁嗪-8-基)苄腈；4-(5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c][1，4]噁嗪-8-基)苄腈；4-(5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c][1，4]噁嗪-8-基)萘-1-甲腈；8-[4-(1H-四唑-5-基)苯基1-5，6-二氢-8H-咪唑并[5，1-c][1，4]噁嗪；或在每种情况中，为其(R)或(S)对映体；或如果适合，为其药学上可接受的盐。

用于所述组合的醛固酮合酶抑制剂是一般和具体地公开在例如WO 2009/156462和WO 2010/130796中的化合物，特别地公开在化合物权利要求和制备实施例终产物、终产物主题、药物制剂和权利要求中。适合于本发明中的组合的优选的醛固酮合酶抑制剂包括3-(6-氟-3-甲基-2-吡啶-3-基-1H-吲哚-1-基甲基)-苄腈盐酸盐、1-(4-甲磺酰基-苄基)-3-甲基-2-吡啶-3-基-1H-吲哚、2-(5-苄氧基-吡啶-3-基)-6-氯-1-甲基-1H-吲哚、5-(3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-烟酸乙酯、N-[5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-乙磺酰胺、吡咯烷-1-磺酸5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基酯、N-甲基-N-[5-(1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-甲磺酰胺、6-氯-1-甲基-2-{5-[(2-吡咯烷-1-基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-3-基}-1H-吲哚-3-甲腈、6-氯-2-[5-(4-甲磺酰基-哌嗪-1-基甲基)-吡啶-3-基]-1-甲基-1H-吲哚-3-甲腈、6-氯-1-甲基-2-{5-[(1-甲基-哌啶-4-基氨基)-甲基]-吡啶-3-基}-1H-吲哚-3-甲腈、吗啉-4-甲酸[5-(6-氯-3-氰基-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-酰胺、N-[5-(6-氯-1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-乙磺酰胺、C，C，C-三氟-N-[5-(1-甲基-1H-吲哚-2-基)-吡啶-3-基甲基]-甲磺酰胺、N-[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-4-三氟甲基-苯磺酰胺、N-[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-1-苯基-甲磺酰胺、N-(5-(3-氯-4-氰基苯基)吡啶-3-基)丁-1-磺酰胺、N-(1-(5-(4-氰基-3-甲氧基苯基)吡啶-3-基)乙基)乙磺酰胺、N-((5-(3-氯-4-氰基苯基)吡啶-3-基)(环丙基)甲基)乙磺酰胺、N-(环丙基(5-(1H-吲哚-5-基)吡啶-3-基)甲基)乙磺酰胺、N-(环丙基(5-萘-1-基-吡啶-3-基)甲基)乙磺酰胺、乙磺酸[5-(6-氯-1-甲基-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-2-基)-吡啶-3-基甲基]-酰胺和乙磺酸{[5-(3-氯-4-氰基-苯基)-吡啶-3-基]-环丙基-甲基}-乙基-酰胺。

术语“内皮缩血管肽受体阻滞剂”包括波生坦和安立生坦。

术语“CETP抑制剂”是指抑制胆固醇酯转移蛋白(CETP)介导的各种胆固醇酯和甘油三酯从HDL转运至LDL和VLDL的化合物。这样的CETP抑制活性易于由本领域技术人员根据标准测定法(例如美国专利号6,140,343)测定。实例包括公开在美国专利号6,140,343和美国专利号6,197,786中的化合物(例如[2R，4S]4-[(3，5-双-三氟甲基-苄基)-甲氧基羰基-氨基]-2-乙基-6-三氟甲基-3，4--二氢-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(torcetrapib)；美国专利号6,723,752中公开的化合物(例如(2R)-3-{[3-(4-氯-3-乙基-苯氧基)-苯基]-[[3-(1，1，2，2-四氟-乙氧基)-苯基]-甲基]-氨基}-1，1，1-三氟-2-丙醇)；美国专利申请顺序号10/807,838中公开的化合物；美国专利号5,512,548中公开的多肽衍生物；分别在J.Antibiot.，49(8)：815-816(1996)和Bioorg.Med.Chem.Lett.；6：1951-1954(1996)中公开的玫瑰酮内酯衍生物和包含磷酸酯的胆固醇酯的类似物。此外，CETP抑制剂还包括公开在WO2000/017165、WO2005/095409、WO2005/097806、WO 2007/128568、WO2008/009435、WO 2009/059943和WO2009/071509中的那些。

术语“NEP抑制剂”是指抑制中性肽链内切酶(NEP)EC 3.4.24.11的化合物。实例包括坎沙曲、坎沙曲拉、右卡多曲、依卡曲尔、消旋卡多曲、山帕曲拉、法西多曲、奥马曲拉、吉莫曲拉、达格鲁曲、SCH-42495、SCH-32615、UK-447841、AVE-0848、PL-37和(2R，4S)-5-联苯-4-基-4-(3-羧基-丙酰基氨基)-2-甲基-戊酸乙酯或其药学上可接受的盐。NEP抑制剂还包括膦酰基/联芳基取代的二肽衍生物，如US专利号5,155,100中所公开的。NEP抑制剂还包括如PCT申请号WO 2003/104200中公开的N-巯基酰基苯基丙氨酸衍生物。NEP抑制剂还包括双向作用的抗高血压药，它们公开在PCT申请号WO 2008/133896、WO 2009/035543或WO 2009/134741中。其它实例包括公开在US申请号12/788,794；12/788,766和12/947,029中的化合物。NEP抑制剂还包括公开在WO 2010/136474、WO 2010/136493、WO 2011/061271和US临时申请号61/414171和61/414163中的化合物。

在一个实施方案中，本发明提供活化受试者的APJ受体的方法，其中该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的根据式I-IV的任意一种的定义的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物。

在一个实施方案中，本发明提供治疗对活化受试者的APJ受体有响应的障碍或疾病的方法，其中该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的根据式I-IV的任意一种的定义的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物。

在一个实施方案中，本发明提供治疗对受试者的APJ受体活化(激动)有响应的障碍或疾病的方法，其中所述障碍或疾病选自急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水分潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂脑缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化、烧伤(包括晒伤)和先兆子痫。

在一个实施方案中，本发明提供式I-IV的任意一种的多肽或其生物缀合物，用作药物。

在一个实施方案中，本发明提供式I-IV的任意一种的多肽或其生物缀合物在制备用于治疗对活化APJ受体有响应的障碍或疾病的药物中的用途。在另一个实施方案中，本发明提供根据式I-IV的任意一种的定义的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物在制备用于治疗对活化APJ受体有响应的障碍或疾病的药物中的用途，其中所述障碍或疾病特别地选自急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、Brugada综合征、室性心动过速、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水分潴留、糖尿病(包括妊娠糖尿病)、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂脑缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化、烧伤(包括晒伤)和先兆子痫。

本发明的示例：肽和多肽合成

缩写	定义
		AA	氨基酸
Ac	乙酰基
		Acm	乙酰氨基甲基
ACN	乙腈
		AcOH	乙酸
Ac₂O	乙酐
		ε-Ahx	ε-氨基己酸
AM	氨基甲基
		BAL	骨架酰胺连接基
BSA	牛血清白蛋白
		Boc	叔-丁氧羰基
Bzl	苄基
		DCM	二氯甲烷
DIC	N，N’-二异丙基碳二亚胺
		DIPEA	N，N’-二异丙基乙胺
DMA	N，N’-二甲基乙酰胺
		DMF	N，N’-二甲基甲酰胺
DMSO	二甲亚砜

DTT	二硫苏糖醇
		DVB	二乙烯基苯
EDT	乙二硫醇
		FA	甲酸
Fmoc	9-芴基甲氧羰基
		HATU	2-(1H-9-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐
HBSS	Hank缓冲盐水溶液
		HCTU	2-(6-氯-1H-苯并三唑-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐
HEPES	4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
		HFIP	六氟异丙醇
HOAt	1-羟基-7-氮杂苯并三唑
		HPLC	高效液相色谱法
HSA	人白蛋白血清
		ivDde	(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己-1-亚基)-3-甲基丁基
LN	Logarithmus naturali(自然对数)
		MeOH	甲醇
MS	质谱法
		Nal	2-萘基丙氨酸
Nle	正亮氨酸
		NMP	N-甲基吡咯烷
Oxyma Pure	2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯
		Pbf	2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PBS	磷酸盐缓冲盐水
		pE	焦谷氨酸盐
PhP	苯基脯氨酸
		Pip	哌可酸
PG	保护基
		Ph	苯基

Pol	聚合物支持物
		PS	聚苯乙烯
rt	室温
		SEC	尺寸排阻色谱法
SPPS	固相肽合成
		tBuOH	叔丁醇
TCEP	三(2-羧基乙基)膦
		TFA	三氟乙酸
THF	四氢呋喃
		TIS或TIPS	三异丙基硅烷
TPA	3-巯基丙酸
		t_R	保留时间
Trt	三苯甲基
		UPLC	超性能液相色谱法
UV	紫外

通过标准固相Fmoc化学合成肽类。在Prelude^TM肽合成仪(Protein Technologies，Inc.，Tucson，USA)和Liberty微波肽合成仪(CEM Corporation，North Carolina，USA)上装配所述肽类。由2-氯三苯甲基氯-PS-树脂(ABCR，Karlsruhe，Germany或AnaSpec，Inc.，California，USA)合成C-末端上带有游离羧酸的肽类。由Fmoc被保护的Rink-酰胺-AM-PS-树脂(Merck，Darmstadt，Germany)合成C-末端上带有未取代的羧酰胺的肽类。由载有胺类的BAL-AM-PS-树脂(EMC Microcollections，Tübingen，Germany)合成C-末端上带有N-单取代的羧酰胺的肽类。

通过制备型反相HPLC纯化肽类。使用如下柱：

·Waters SunFire Prep C18 OBD柱，5 μm，30x100 mm，部件号186002572(1个柱或串连的2个柱)

·Waters SunFire Prep C18 OBD柱，5 μm，30x150 mm，部件号186002797

·Waters Atlantis Prep OBD T3柱，5μm，30x150mm，部件号186003703

·Waters XBridge Prep C8 OBD柱，5μm，30x150mm，部件号186003083

·Machery-Nagel100-5 C18，5μm，250x40mm，部件号715340.400

流动相由洗脱液A(0.1％TFA的H₂O溶液)和洗脱液B(ACN)组成。基于分离问题的特殊要求设计梯度。从ACN/H₂O冻干纯的产物。

通过分析型HPLC、使用在λ＝214nm的UV检测和使用电喷雾电离的UPLC-MS分析产物。

使用如下所述的一般方法合成表4中示例的肽类。未取代的N-或C-末端分别表示为斜体字H-或-OH。

表4：

实施例	序列	SEQ ID NO：
			实施例1	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-Pip-nle-a-f-OH	24
实施例2	pE-R-P-R-(D-Leu)-S-a-K-G-P-nle-a-f-OH	25
			实施例3	pE-r-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH	26
实施例4	pE-R-P-R-(D-Leu)-S-Aib-K-G-P-nle-a-f-OH	27
			实施例5	pE-R-P-R-L-S-Aib-k-G-P-nle-a-f-OH	28
实施例6	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-f-OH	29
			实施例7	pE-R-P-R-L-c(tBu)-H-K-G-P-nle-a-f-OH	30
实施例8	pE-R-P-R-L-d-H-K-G-P-nle-a-f-OH	31
			实施例9	pE-R-(trans-4-PhP)-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH	32
实施例10	pE-R-P-R-L-(D-Leu)-H-K-G-P-nle-a-f-OH	33
			实施例11	pE-R-P-R-L-k-H-K-G-P-nle-a-f-OH	34
实施例12	pE-R-P-R-L-s-H-K-G-P-nle-a-f-OH	35
			实施例13	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-p-f-OH	36
实施例14	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-(D-Leu)-f-OH	37
			实施例15	pE-R-P-R-L-a-Aib-K-G-P-nle-a-f-OH	38
实施例16	pE-R-P-R-L-a-h-K-G-P-nle-a-f-OH	39

实施例17	pE-R-P-R-L-a-F-K-G-P-nle-a-f-OH	40
			实施例18	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-F-OH	41
实施例19	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-e-f-OH	42
			实施例20	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-r-f-OH	43
实施例21	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-y-OH	44
			实施例22	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-d-OH	45
实施例23	pE-R-P-R-Cha-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH	46
			实施例24	pE-R-P-R-(3，4-Cl2-F)-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH	47
实施例25	pE-R-P-R-(2-Nal)-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH	48
			实施例26	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-tic-OH	49
实施例27	pE-R-P-R-Y(Bzl)-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH	50
			实施例28	pE-R-P-R-Y-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH	51
实施例29	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH	52
			实施例30	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-Nle-a-f-OH	53
实施例31	pE-R-P-R-L-a-H-k-G-P-Nle-a-f-OH	54
			实施例32	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-NH(苯乙基)	55
实施例33	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-f-NH2	56
			实施例34	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-Nle-P-f-OH	57
实施例35	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-Nle-f-OH	58
			实施例36	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-NH(苯乙基)	59
实施例37	pE-R-P-R-L-S-Aib-K-G-P-nle-a-F-OH	60
			实施例38	pE-R-P-R-L-S-Aib-K-G-P-Nle-a-f-OH	61
实施例39	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-Nle-a-F-OH	62
			实施例40	pE-R-P-R-L-S-Aib-K-G-P-nle-a-f-OH	63
实施例41	pE-R-P-R-L-S-Aib-K-G-P-Nle-P-f-OH	64
			实施例42	pE-R-P-R-L-S-Aib-K-G-P-Nle-a-F-OH	65
实施例43	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-(4-苯氧基哌啶-1-基)	66
			实施例44	pE-R-P-R-L-abu-H-K-G-P-nle-a-f-OH	67

实施例45	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-abu-f-OH	68
			实施例46	pE-R-P-R-L-a-f-K-G-P-nle-a-f-OH	69
实施例47	pE-R-P-R-L-a-L-K-G-P-nle-a-f-OH	70
			实施例48	pE-R-P-R-L-a-a-K-G-P-nle-a-f-OH	71
实施例49	pE-R-a-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH	72
			实施例50	H-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-f-OH	73
实施例51	pE-R-P-R-L-S-a-K-G-P-nle-a-f-OH	74
			实施例52	pE-R-P-R-L-nva-H-K-G-P-nle-a-f-OH	75
实施例53	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nva-a-f-OH	76
			实施例54	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-nva-f-OH	77
实施例55	pE-R-P-R-L-S-f-K-G-P-nle-a-f-OH	78
			实施例56	pE-R-P-R-L-S-h-K-G-P-nle-a-f-OH	79
实施例57	pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-f-a-f-OH	80
			实施例58	pE-R-P-R-L-A-h-K-G-P-nle-a-f-OH	81
实施例59	pE-R-P-R-L-a-H-Q-G-P-nle-a-f-OH	82
			实施例60	pE-R-P-R-L-a-H-E-G-P-nle-a-f-OH	83
实施例61	pE-R-P-R-L-V-H-K-G-P-nle-a-f-OH	84
			实施例62	pE-R-P-R-L-a-H-K-D-P-nle-a-f-OH	85
实施例63	pE-R-P-R-Cha-nva-H-K-G-P-nle-a-f-OH	86

分析方法

1a)HPLC-分析方法A

·柱：带有ProntoSil 120-3-C18-H的Bischoff UHC-640(53x4.0mm)，3μm；部件号：0604F185PS030

·洗脱液A：0.07％TFA的水溶液/洗脱液B：0.1％TFA的ACN溶液

·流速：1.5ml/min

·温度：40℃

·梯度：

时间[min]	A[％]	B[％]
			0.0	95	5
10	0	100
			12.0	0	100
12.2	95	5

1b)HPLC-分析方法B

·洗脱液A：0.1％TFA的水溶液/洗脱液B：0.4％TFA的ACN溶液/洗脱液C：MeOH

·流速：1.5ml/min

·温度：25℃

·梯度：

时间[min]	A[％]	B[％]	C[％]
				0.0	90	2.5	7.5
9.5	0	25	75
				12.0	0	25	75
12.2	90	2.5	7.5

1c)HPLC-分析方法C

·柱：XBridge BEH300 C18(100x4.6mm)，3μm；部件号：186003612

·洗脱液A：0.1％TFA的水溶液/洗脱液B：0.1％TFA的ACN溶液

·流速：1.0ml/min

·温度：40℃

·梯度：

时间[min]	A[％]	B[％]
			0.0	98	2
18	2	98
			20	2	98
22	98	2

2)UPLC-MS-分析方法D

·Waters AcquityBEH C18，1.7μm，2.1x50mm；部件号：186002350

·洗脱液A：0.1％FA的水溶液；洗脱液B：0.1％FA的ACN溶液

·流速：0.7ml/min

·温度：40℃

·梯度：

时间[min]	A[％]	B[％]
			0.0	99	1
1.0	97	3
			3.5	50	50
4.0	10	90
			4.3	0	100
4.6	80	20

3)UPLC-HRMS-分析方法E

·Waters AcquityBEH C18，1.7μm，2.1x50mm；部件号：186002350

·洗脱液A：0.1％FA；洗脱液B：0.1％FA的ACN溶液

·流速：1.0ml/min

·温度：50℃

·梯度：2-98％，4.4min

4)HPLC-分析方法F

·柱：YMC-Gel ODS-A-C18

·洗脱液A：0.1％v/v TFA的水溶液/洗脱液B：ACN/洗脱液A，9/1v/v

·使用梯度洗脱：

5)UPLC-MS-分析方法G

·Waters AcquityBEH C18，1.7μm，2.1x50mm；部件号：186002350

·洗脱液A：0.05％FA+3.75mM乙酸铵的水溶液；洗脱液B：0.04％FA的ACN溶液

·流速：1.0ml/min

·温度：50℃

·梯度：在1.7min从2％到44％

6)UPLC-HRMS-分析方法H

·Waters AcquityBEH C18，1.7μm，2.1x50mm；部件号：186002350

·流速：1.0ml/min

·温度：50℃

·梯度：在4.4min从2％到98％。

4)UPLC-MS-分析方法I

·Waters AcquityBEH300SEC保护柱，4.6x30mm；部件号：186005793

·洗脱液A：0.1％FA的水溶液；洗脱液B：0.04％FA的ACN溶液

·流速：1.0ml/min

·梯度：50％B，6min

5)UPLC-MS-分析方法J

·Waters AcquityProSwift RP-3，1.7μm，4.6x50mm；部件号：064298

·洗脱液A：0.1％FA的水溶液；洗脱液B：0.08％FA的ACN溶液

·流速：2.0ml/min(3-80％B，2min)-流速1.8mL/min

·温度：40℃

·梯度：在3min从2％到98％

将实施例1-63的肽类的分析数据概括在表5中并且使用上述分析方法生成。

表5

通用合成方法

1)氨基酸在2-氯三苯甲基氯树脂上的首次加载和Fmoc-除去

用DCM充分洗涤2-氯三苯甲基氯树脂(1eq.，1.0-1.6mmol/g)。将期望的氨基酸(相对于树脂典型地0.5-2eq.，视为1.6mmol/g载量)溶于DCM(约10mL/克树脂)和DIPEA(相对于树脂4eq.，视为1.6mmol/g载量)。将该溶液加入到树脂中，将该混悬液在rt振摇19h。排出树脂，然后依次用DCM/MeOH/DIPEA(17∶2∶1)、DCM、DMA、DCM充分洗涤。

为了Fmoc除去和载量测定，将树脂与哌啶/DMA(1∶4)或4-甲基哌啶/DMA(1∶4)一起反复振摇(12x 10mL/克起始树脂)，用DMA(2x 10mL/克起始树脂)洗涤。用MeOH稀释合并的溶液至体积V为250mL/克起始树脂。再用MeOH将2mL该溶液的等分部分(V_a)稀释至250mL(V_t)。在299.8nm对参比的MeOH测定UV吸收，得到吸光度A。依次用DMA、DCM、DMA、DCM充分洗涤树脂，在40℃高度真空干燥。得到mg的树脂。

根据公式计算树脂载量：

载量[mol/g]＝(A x V_tx V)/(d xεx V_ax m)

(其中d：比色杯宽度ε＝7800L mol^-1cm^-1)

2)固相肽合成

2a)使用Prelude^TM合成仪的合成循环A

用DMA洗涤树脂。通过用4-甲基哌啶/DMA(1∶4)反复处理除去Fmoc。用DMA洗涤树脂。通过添加Fmoc-氨基酸(3eq.；0.2M的NMP溶液)、HCTU(3eq.；0.3M的NMP溶液)和DIPEA(3.3eq.；0.66M的NMP溶液)进行偶合，然后在rt混合该混悬液与氮气，典型地15min至4h，视具体需求而定。用DMA洗涤后，典型地将偶合步骤重复1-3次，视具体需求而定。用DMA洗涤后，通过添加Ac₂O/吡啶/DMA(1∶1∶8)混合物且随后在rt混合该混悬液进行封端。用DMA洗涤树脂。

2b)使用Prelude^TM合成仪的合成循环B

用DMA洗涤树脂。通过用哌啶/DMA(1∶4)反复处理除去Fmoc。用DMA洗涤树脂。通过添加Fmoc-氨基酸(3eq.；0.3M的NMP溶液)、HCTU(3eq.；0.3M的NMP溶液)和DIPEA(4.5eq.；0.9M的NMP溶液)进行偶合，然后在rt混合该混悬液与氮气，典型地15min至4h，视具体需求而定。用DMA洗涤后，典型地将偶合步骤重复1-3次，视具体需求而定。用DMA洗涤后，通过添加Ac₂O/吡啶/DMA(1∶1∶8)混合物且随后在rt混合该混悬液进行封端。用DMA洗涤树脂。

2c)使用Liberty^TM合成仪的合成循环C

用DMF和DMA洗涤树脂。通过用20％哌啶/DMF(一般7ml/0.1mmol，两次)处理除去Fmoc。用DMF和DMA洗涤树脂。通过添加Fmoc-氨基酸(5eq.；0.2M的DMF溶液)、HCTU(5eq.；0.5M的DMF溶液)和DIPEA(10eq.；2M的NMP溶液)进行偶合，然后在75或50℃混合该混悬液与氮气，典型地5至50min，使用微波功率0-20瓦，视具体需求而定。用DMF洗涤后，可以重复偶合步骤1次，视具体需求而定。用DMF洗涤树脂。

3)在同时除去保护基或不除去保护基的情况下从树脂上的裂解

3a)裂解方法A

在rt将树脂(0.1mmol)与95％TFA/EDT/TIS水溶液(95∶2.5∶2.5)(2mL)一起典型地振摇1.5-2h。过滤出裂解溶液，加入新鲜溶液(2mL)。将该混悬液在rt典型地振摇0.75-1h，然后过滤出裂解溶液。加入新鲜溶液(2mL)，将该混悬液在rt典型地振摇0.75-1h。过滤出裂解溶液。用95％TFA水溶液(1mL)将树脂冲洗1次。将合并的裂解和洗涤溶液缓慢地倾倒在冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(35mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，倾倒出上清液。用冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(10mL)洗涤残余物，离心混悬液，倾倒出上清液。高度真空干燥固体。

3b)裂解方法B

在rt将树脂(0.1mmol)与95％TFA/TIS水溶液(97.5∶2.5)(2mL)一起振摇1.5h。过滤出裂解溶液，加入新鲜溶液(2mL)。将该混悬液在rt振摇45min，然后过滤出裂解溶液。加入新鲜溶液(2mL)，将该混悬液在rt振摇45min。过滤出裂解溶液。用95％TFA水溶液(1mL)将树脂冲洗1次。将合并的裂解和洗涤溶液缓慢地倾倒在冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(35mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，倾倒出上清液。用冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(10mL)洗涤残余物，离心混悬液，倾倒出上清液。高度真空干燥固体。

3c)裂解方法C

将HFIP/DCM(10∶90)(2mL)加入到树脂(0.1mmol)中，将该混悬液在rt振摇10min。将裂解溶液过滤入iPrOH(0.8mL)。将该步骤重复3次，直接合并裂解溶液与第一次包含iPrOH的裂解溶液。高度真空干燥合并的裂解溶液至干。从tBuOH/H₂O(4∶1)冻干残余物。

3d)裂解方法D

在rt将树脂(0.1mmol)与95％TFA/EDT/TIS水溶液(95∶2.5∶2.5)(3mL)一起振摇3h。用95％TFA水溶液(1mL)将树脂冲洗1次。将合并的裂解和洗涤溶液缓慢地倾倒在冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(10-15mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，倾倒出上清液。将乙醚(10mL)加入到残余物中，将该混悬液涡旋3min，离心，倾倒出上清液。将洗涤过程重复2次。高度真空干燥固体。

在下文中描述有代表性的实施例的合成。

实施例1 pE-R-P-R-L-a-H-K-G-Pip-nle-a-f-OH(SEQ ID NO：24)的合成，实施例1在下面按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 87和24。

实施例1

·中间体1a的制备

(2-氯三苯甲基氯树脂上Fmoc-f-OH的加载、Fmoc除去和树脂载量测定)

按照与上述通用方法类似的方式使2-氯三苯甲基氯树脂(3.0g，4.80mmol)与Fmoc-f-OH(1.86g，4.80mmol)在DCM(30mL)和DIPEA(3.35mL，19.2mmol)中的溶液反应，得到中间体1a(3.53g，载量＝0.96mmol/g)。

·中间体1b的制备

(线性肽的组装)

用Prelude^TM肽合成仪对中间体1a(0.100mmol)进行固相肽合成。如下进行偶合(SEQ ID NO：88)：

偶合	AA	偶合次数x反应时间	合成循环
				1	a	2x 15min	A
2	nle	2x 15min	A
				3	Pip	2x 15min	A
4	G	2x 30min	A
				5	K(Boc)	2x 15min	A
6	H(Trt)	2x 15min	A

7	a	2x 15min	A
				8	L	2x 15min	A
9	R(Pbf)	4x 1h	A
				10	P	2x 15min	A
11	R(Pbf)	4x 1h	A
				12	pE	2x 15min	A

·实施例1的制备

(从树脂上裂解、伴随除去保护基、然后纯化)

将95％TFA/EDT/TIS混合物水溶液(95∶2.5∶2.5)(2mL)加入到中间体1b(0.1mmol)中，将该混悬液在rt振摇1.5h。过滤出裂解溶液，加入新鲜裂解溶液(2mL)。将该混悬液在rt振摇45min，然后过滤出裂解溶液。加入新鲜溶液(2mL)，将该混悬液在rt振摇45min。过滤出裂解溶液。用95％TFA水溶液(1mL)洗涤树脂。将合并的裂解和洗涤溶液缓慢地倾倒在冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(35mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，倾倒出上清液。用冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(10mL)洗涤残余物，离心混悬液，倾倒出上清液。高度真空干燥固体。通过制备型HPLC纯化粗产物，从ACN/H₂O冻干，得到实施例1(86.5mg，0.044mmol)。

通过分析型HPLC(分析方法A：t_R＝3.43min)和UPLC-MS分析纯产物(分析方法D；测定值：[M+3H]³⁺＝496.7；计算值：[M+3H]³⁺＝496.6)。

实施例29 合成pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO：52)，实施例29在下面按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 89和52。

实施例29

·中间体29a的制备

按照与上述通用方法类似的方式使2-氯三苯甲基氯树脂(2g，3.20mmol)与Fmoc-f-OH(992mg，2.56mmol)在DCM(20mL)和DIPEA(2.236mL，12.80mmol)中的溶液反应，得到中间体29a(2.36g，载量＝0.82mmol/g)。

·中间体29b的制备

(线性肽的组装)

用Prelude^TM肽合成仪对中间体29a(0.600mmol)进行固相肽合成。如下进行偶合(SEQ ID NO：90)：

偶合	AA	偶合次数x反应时间	合成循环
				1	a	2x 15min	B
2	nle	2x 15min	B
				3	P	2x 15min	B

4	G	2x 30min	B
				5	K(Boc)	2x 15min	B
6	H(Trt)	2x 15min	B
				7	a	2x 15min	B
8	L	2x 15min	B
				9	R(Pbf)	4x 1h	B
10	P	2x 15min	B
				11	R(Pbf)	4x 1h	B
12	pE	2x 15min	B

·实施例29的制备

(从树脂上裂解、伴随除去保护基、然后纯化)

将95％TFA/EDT/TIS混合物水溶液(95∶2.5∶2.5)(10mL)加入到中间体29b(0.6mmol)中，将该混悬液在rt振摇2h。过滤出裂解溶液，加入新鲜裂解溶液(10mL)。将该混悬液在rt振摇1h，然后过滤出裂解溶液。加入新鲜溶液(10mL)，将该混悬液在rt振摇1h。过滤出裂解溶液。将合并的裂解溶液倾倒在冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(200mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，倾倒出上清液。用冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(100mL)洗涤残余物，离心混悬液，倾倒出上清液。高度真空干燥固体。通过制备型HPLC纯化粗产物，从ACN/H₂O冻干，得到实施例29(538.7mg，0.279mmol)。

通过分析型HPLC(分析方法A：t_R＝3.35min)和UPLC-MS分析纯产物(分析方法D；测定值：[M+3H]³⁺＝491.8；计算值：[M+3H]³⁺＝491.9)。

实施例32 pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-NH(苯乙基)(SEQ ID NO：55)的合成，实施例32在下面按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 91和55。

实施例32

·中间体32a的制备

(线性肽的组装)

用Prelude^TM肽合成仪对苯乙胺-BAL-PS树脂(167mg，0.100mmol)进行固相肽合成。如下进行偶合(SEQ ID NO：92)：

偶合	AA	偶合次数x反应时间	合成循环
				1	nle	2x 30min	B
2	P	2x 30min	B
				3	G	3x 1h	B
4	K(Boc)	2x 30min	B
				5	H(Trt)	2x 30min	B
6	a	2x 30min	B
				7	L	2x 30min	B
8	R(Pbf)	4x 1h	B
				9	P	2x 90min	B
10	R(Pbf)	4x 1h	B
				11	pE	2x 90min	B

·实施例32的制备

(从树脂上裂解、伴随除去保护基、然后纯化)

将95％TFA/EDT/TIS混合物水溶液(95∶2.5∶2.5)(2mL)加入到中间体32a(0.1mmol)中，将该混悬液在rt振摇1.5h。过滤出裂解溶液，加入新鲜裂解溶液(2mL)。将该混悬液在rt振摇1.5h，然后过滤出裂解溶液。加入新鲜溶液(2mL)，将该混悬液在rt振摇2h。过滤出裂解溶液，用95％TFA水溶液(1mL)洗涤树脂。将合并的裂解溶液倾倒在冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(35mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，倾倒出上清液。用冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(5mL)洗涤残余物，离心混悬液，倾倒出上清液。高度真空干燥固体。通过制备型HPLC纯化粗产物，从ACN/H₂O冻干，得到实施例32(37.0mg，0.020mmol)。

通过分析型HPLC(分析方法B：t_R＝5.47min)和UPLC-MS分析纯产物(分析方法D；测定值：[M+3H]³⁺＝453.6；计算值：[M+3H]³⁺＝453.6)。

实施例33 pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-f-NH₂(SEQ ID NO：56)的合成，实施例33在下面按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 93和56。

实施例33

·中间体33a的制备

(线性肽的组装)

用Prelude^TM肽合成仪对被保护的Rink-酰胺-AM-PS-树脂(217mg，0.100mmol)进行固相肽合成。如下进行偶合(SEQ ID NO：94)：

偶合	AA	偶合次数x反应时间	合成循环
				1	f	2x 15min	A
2	a	2x 1h	A
				3	nle	2x 15min	A
4	P	2x 15min	A
				5	G	2x 30min	A
6	K(Boc)	2x 15min	A
				7	H(Trt)	2x 15min	A
8	a	2x 15min	A
				9	L	2x 15min	A
10	R(Pbf)	4x 1h	A
				11	P	2x 30min	A
12	R(Pbf)	4x 1h	A
				13	pE	2x 30min	A

·实施例33的制备

(从树脂上裂解、伴随除去保护基、然后纯化)

将95％TFA/TIS混合物水溶液(97.5∶2.5)(2mL)加入到中间体33a(0.1mmol)中，将该混悬液在rt振摇1.5h。过滤出裂解溶液，加入新鲜裂解溶液(2mL)。将该混悬液在rt振摇45min，然后过滤出裂解溶液。加入新鲜溶液(2mL)，将该混悬液在rt振摇45min。过滤出裂解溶液，用95％TFA水溶液(1mL)洗涤树脂。将合并的裂解溶液倾倒在冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(35mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，倾倒出上清液。用冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(5mL)洗涤残余物，离心混悬液，倾倒出上清液。高度真空干燥固体。通过制备型HPLC纯化粗产物，从ACN/H₂O冻干，得到实施例实施例33(108.9mg，0.055mmol)。

通过分析型HPLC(分析方法A：t_R＝3.17min)和UPLC-MS分析纯产物(分析方法D；测定值：[M+3H]³⁺＝491.6；计算值：[M+3H]³⁺＝491.6)。

实施例43 合成pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-(4-苯氧基哌啶-1-基)(SEQ ID NO：66)，实施例43在下面按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 95-97和66。

实施例43

·中间体43a的制备

(2-氯三苯甲基氯树脂上Fmoc-nle-OH的加载、Fmoc除去和树脂载量测定)

按照与上述通用方法类似的方式使2-氯三苯甲基氯树脂(300mg，0.48mmol)与Fmoc-Nle-OH(136mg，0.384mmol)在DCM(3mL)和DIPEA(0.335mL，1.92mmol)中的溶液反应，得到中间体43a(329mg，载量＝0.99mmol/g)。

·中间体43b的制备

(线性肽的组装)

用PreludeTM肽合成仪对中间体43a(0.100mmol)进行固相肽合成。如下进行偶合(SEQ ID NO：98)：

偶合	AA	偶合次数x反应时间	合成循环
				1	P	2x 15min	A
2	G	2x 30min	A
				3	K(Boc)	2x 15min	A
4	H(Trt)	2x 15min	A
				5	a	2x 15min	A
6	L	2x 15min	A
				7	R(Pbf)	4x 1h	A
8	P	2x 30min	A
				9	R(Pbf)	4x 1h	A
10	pE	2x 30min	A

·中间体43c的制备

(从树脂上的HFIP裂解)

将HFIP/DCM(10∶90)(2mL)加入到中间体43b(0.100mmol)中，将该混悬液在rt搅拌10min。将裂解溶液过滤入iPrOH(0.8mL)。将该步骤重复3次，直接合并裂解溶液与第一次包含iPrOH的裂解溶液。高度真空干燥合并的裂解溶液至干。从tBuOH/H₂O(4∶1)冻干残余物，得到中间体43c。

·中间体43d的制备

(4-苯氧基哌啶的偶合)

将中间体43c与HATU(49.4mg，0.130mmol)、HOAt(17.7mg，0.130mmol)和2，6-卢剔淀(0.233mL，2.000mmol)在NMP(5mL)中的混合物在rt搅拌5min。加入4-苯氧基哌啶(35.0mg，0.197mmol)，在rt持续搅拌45min。将该反应混合物真空浓缩至干，得到中间体43d。

·实施例43的制备

(除去保护基和纯化)

将中间体43d溶于95％TFA/EDT/TIS水溶液(95∶2.5∶2.5)(5mL)，将该溶液在rt搅拌2h。将裂解溶液倾倒在冷庚烷/乙醚(1∶1)(35mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，过滤出上清液。用冷庚烷/乙醚(1∶1)(5mL)洗涤残余物，离心该混悬液，倾倒出上清液。高度真空干燥残余物。通过制备型HPLC分离产物，从ACN/H₂O冻干，得到实施例43(19.3mg，0.010mmol)。

通过分析型HPLC(分析方法A：t_R＝3.93min)和UPLC-MS分析纯产物(分析方法D；测定值：[M+3H]³⁺＝472.6；计算值：[M+3H]³⁺＝472.3)。

实施例57 pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-f-a-f-OH的合成(SEQ ID NO：80)，实施例57在下面按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 99和80。

实施例57

·中间体57a的制备

按照与上述通用方法类似的方式使2-氯三苯甲基氯树脂(5.0g，8.01mmol)与Fmoc-f-OH(3.10g，8.01mmol)在DCM(50mL)和DIPEA(5.59mL，32.0mmol)中的溶液反应，得到中间体57a(5.87g，载量＝0.897mmol/g)。

·中间体57b的制备

(线性肽的组装)

用Liberty^TM微波肽合成仪对中间体57a(0.100mmol)进行固相肽合成。如下进行偶合(SEQ ID NO：100)：

偶合	AA	偶合次数x反应时间	温度℃	微波功率	合成循环
						1	a	1x7.5min	50	20	C
2	f	1x7.5min	50	20	C
						3	P	1x7.5min	50	20	C
4	G	1x7.5min	50	20	C

5	K(Boc)	1x7.5min	50	20	C
						6	H(Trt)	1x2min	50	0	C
		1x4min	50	25
						7	a	1X7.5min	50	25	C
8	L	1x7.5min	50	25	C
						9	R(Pbf)	2x42min	50	0	C
		2x7.5min	50	25
						10	P	1x7.5min	50	25	C
11	R(Pbf)	2x42min	50	0	C
								2x7.5min	50	25
12	pE	1x7.5min	50	25	C

·实施例57的制备

(从树脂上裂解、伴随除去保护基、然后纯化)

将95％TFA/EDT/TIS混合物水溶液(95∶2.5∶2.5)(3mL)加入到中间体57b(0.1mmol)中，将该混悬液在rt振摇3h。过滤出裂解溶液，用95％TFA水溶液(1mL)洗涤树脂。将合并的裂解和洗涤溶液倾倒在冷庚烷/乙醚(1∶1)的混合物(11mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，倾倒出上清液。将乙醚(10mL)加入到残余物中，将该混悬液涡旋3min，离心，过滤出上清液。将洗涤过程重复2次。高度真空干燥固体。通过制备型HPLC纯化粗产物，从ACN/H₂O冻干，得到实施例57(59mg，0.030mmol)。

通过分析型HPLC(分析方法C：t_R＝7.16min)和UPLC-MS分析纯产物(分析方法E；测定值：[M+3H]³⁺＝503.3；计算值：[M+3H]³⁺＝503.6)。

将粗的分离的TFA盐溶于水(15mL水/mmol的多肽)，使用强碱的氢氧化物形式的离子交换树脂[离子交换剂III，强碱(^-OH形式，0.9mmol/ml)，Merck-Darmstadt，Germany，目录号；1.04767.0500，(25eq)]转化成乙酸盐，通过冻干分离纯的乙酸盐产物。

基于乙酸含量(离子色谱法)和含水量分析评价盐的化学计算量，并且确定在1∶3至1∶4的范围(多肽：乙酸盐)。

以类似方式合成其它实施例：

·按照与实施例1类似的方式合成实施例2-28。

·按照与实施例29类似的方式合成实施例30和31。

·按照与实施例33类似的方式合成实施例34-42。

·按照与实施例57类似的方式合成实施例44-56和58-63。

实施例64：白蛋白-TPA-O2Oc-O2Oc-O2Oc-O2Oc-Q-R-P-R-L-a-H-K-G-P-f-a-f-OH(SEQ ID NO：101)，其中TPA：3-巯基丙酸

步骤1：中间体64c(PPA-O2Oc-O2Oc-O2Oc-O2Oc-Q-R-P-R-L-a-H-K-G-P-f-a-f-OH) (SEQ ID NO：102)的合成，实施例在下面按出现的顺序分别公开了SEQ ID NO 103-104和102。

·中间体64a的制备

(线性肽的组装)

用Liberty^TM微波肽合成仪对H-f-O-PS(1.0mmol)进行固相肽合成。如下进行偶合(SEQ ID NO：105)：

偶合	AA	偶合次数x反应时间	温度℃	微波功率	合成循环
						1	a	1x7.5min	50	20	C
2	f	1x7.5min	50	20	C
						3	P	1x7.5min	50	20	C
4	G	1x7.5min	50	20	C
						5	K(Boc)	1x7.5min	50	20	C

6	H(Trt)	1x2min	50	0	C
								1x 4min	50	25
7	a	1x 7.5min	50	20	C
						8	L	1x 7.5min	50	25	C
9	R(Pbf)	2x 42min	50	0	C
								2x 7.5min	50	25
10	P	1x 7.5min	50	25	C
						11	R(Pbf)	2x 42min	50	0	C
		2x 7.5min	50	25
						12	Q(Trt)	1x 7.5min	50	25	C
13	O2Oc	1x 7.5min	50	25	C
						14	O2Oc	1x 7.5min	50	25	C
15	O2Oc	1x 7.5min	50	25	C
						16	O2Oc	1x 7.5min	50	25	C
17	(Trt)TPA	1x 7.5min	50	25	C

·中间体64b的制备

(从树脂上裂解、伴随除去保护基、然后纯化)

将由3.09g DTT和3mL茴香硫醚在25mL的TFA/TIPS/水(95∶2.5∶2.5)构成的溶液加入到中间体64a(1.0mmol)中，将该混悬液在rt振摇3hr。过滤出裂解溶液，用95％TFA水溶液(5mL)洗涤树脂。将合并的裂解和洗涤溶液倾倒在冷乙醚(80mL)上，得到沉淀。离心该混悬液，倾倒出上清液。将乙醚(80mL)加入到残余物中，将该混悬液涡旋3min，离心，过滤出上清液。将洗涤过程重复3次。高度真空干燥固体。通过制备型HPLC纯化粗产物，从ACN/H₂O冻干，得到中间体64b，为白色粉末(235mg，84μmol)。通过UPLC-MS分析纯产物(分析方法G；测定值：[M+2H]²⁺＝1097.5；计算值：[M+2H]²⁺＝1097.8。

中间体64c的制备：PPA-O2Oc-O2Oc-O2Oc-O2Oc-Q-R-P-R-L-a-H-K-G-P-f-a-f-OH (SEQ ID NO：102)，其中PPA：3-(2-吡啶基二硫代)丙酸

将中间体64b(76mg，29μmol)、2，2′-二硫代二吡啶(19mg，86μmol)在ACN(1mL)中的混合物在25℃振摇1hr。用MeOH稀释该反应混合物，过滤。通过制备型HPLC纯化该溶液，从ACN/H2O冻干，得到中间体64c，为白色粉末(28mg，10μmol)。

通过UPLC-MS分析纯产物(分析方法G；测定值：[M+2]²⁺＝1152.5；计算值：[M+2]²⁺＝1152.3)。

步骤2：白蛋白脱帽

·用TCEP脱帽

在15mL试管中向白蛋白(500mg，Aldrich，冻干粉末，来自人血清)在10mL PBS 1x缓冲液中的溶液中1次加入TCEP盐酸盐溶液(1.074mg在生物级纯水中)。将得到的溶液在Rt振摇1hr，然后脱盐，用2个Amicon Ultra-4离心过滤器(30K MWCO)洗涤。将滤器以4K g旋转40mins，弃去滤液。向每次洗涤的每个滤器上加入3mL生物级纯水(以14K g旋转10mins)，重复洗涤过程3次。将脱帽的HAS溶于水(总计～20mL)。将该溶液转入50mL Falcon试管，冻干，得到结晶粉末(500mg)。

通过UPLC-MS分析纯产物(分析方法I；测定值：66439.0；预测值：66437)。

·脱帽的HSA中游离巯基数量的测定

在2mL试管中向这种脱帽的HSA(2mg)在400μL PBS pH 7.4中的溶液中加入6-马来酰亚氨基己酸(13μg)的水溶液。将得到的溶液在Rt振摇2hr。UPLC-MS(分析方法J)显示仅一加合物形成，测定值：66649.0；预测值：66648。

·用DTT脱帽

在15mL试管中向白蛋白(400mg，Aldrich，冻干粉末，来自人血清)在5mL PBS 1x缓冲液中的溶液中1次加入DTT溶液(0.232μl，2mg/mL在生物级纯水中)。将得到的溶液在Rt振摇2hrs，然后脱盐，用20个Amicon Ultra-0.5离心过滤器(10K MWCO)洗涤。将滤器以14K g旋转10mins，弃去滤液。向每次洗涤的每个滤器上部加入生物级纯水(以14K g旋转10mins)，重复洗涤过程6次。将脱帽的HAS溶于水(总计～20mL)。将该溶液转入50mL Falcon试管，冻干，得到结晶粉末(376mg)。

通过UPLC-MS分析纯产物(分析方法J；测定值：66438.5；预测值：66437)。

·脱帽的HSA中游离巯基数量的测定

在2mL试管中向这种脱帽的HSA(3mg)400μL PBS pH 7.4中的溶液中加入3-马来酰亚氨基丙酸(25μg)的水溶液。将得到的溶液在Rt振摇过夜。UPLC-MS(分析方法J)显示仅一加合物形成，测定值：66608.0；预测值：66606。

·用半胱氨酸脱帽

在2mL试管中向白蛋白(120mg，Aldrich，冻干粉末，来自人血清)在1mL 50mM PBS缓冲液pH 8.0中的溶液中1次加入半胱氨酸(10.94mg)。将得到的溶液在Rt振摇1hrs，然后脱盐，用2个Amicon Ultra-0.5离心过滤器(10K MWCO)洗涤。将滤器以14K g旋转10mins，弃去滤液。向每次洗涤的每个滤器上部加入生物级纯水(以14K g旋转10mins)，重复洗涤过程5次。将脱帽的HAS溶于水(总计4mL)。将该溶液转入15mL Falcon试管，冻干，得到结晶粉末(108mg)。

通过UPLC-MS分析纯产物(分析方法J；测定值：66439；预测值：66437)。

·脱帽的HSA中游离巯基数量的测定

在2mL试管中向这种脱帽的HSA(3mg)500μL PBS pH 7.4中的溶液中加入3-马来酰亚氨基丙酸(15μg)的水溶液。将得到的溶液在Rt振摇1hr。UPLC-MS(分析方法J)显示仅一加合物形成，测定值：66608.0；预测值：66606。

步骤3：白蛋白-TPA-O2Oc-O2Oc-O2Oc-O2Oc-Q-R-P-R-L-a-H-K-G-P-f-a-f-OH(SEO ID NO：101)

用中间体64c的溶液(7.8mg的水溶液)处理脱帽的HSA(100mg)在PBS缓冲液(6mL)中的溶液。将得到的溶液在Rt振摇1hr，然后脱盐，用4个Amicon Ultra-0.5离心过滤器(10KMWCO)洗涤。将滤器以13K g旋转10mins，弃去滤液。向每次洗涤的每个滤器上部加入生物级纯水(以13K g旋转10mins)，重复洗涤过程6次。将缀合物溶于水(总计4mL)。将该溶液转入15mL Falcon试管，冻干，得到结晶粉末(90.5mg)。

通过UPLC-MS分析纯的产物(分析方法I；测定值：68630；预测值：68629)。

已经发现，上述实施例中的多肽对于APJ受体效能具有约0.01nM至约1100nM的EC₅₀值。已经发现，如下实施例中的多肽类具有大于2分钟、大于5分钟、大于10分钟、大于20分钟、大于50分钟和大于60分钟的血浆稳定性。

可以观察到，本发明的多肽类或其生物缀合物用作APJ受体激动剂，且由此由于治疗对活化APJ受体有响应的疾病和病症，例如本文公开的疾病。

此外，已经证实这些肽类的半衰期因形成生物缀合物而得到进一步延长，所述生物缀合物包含式I-IV的任意一种的肽或多肽与半衰期延长部分例如人血清白蛋白。

本领域普通技术人员应注意，在本公开文本内由此描述的本发明的示例性实施方案仅是示例性的，且可以在本发明范围内进行不同的其它选择、改变和变型。因此，本发明不限于如本文示例的具体的实施方案。

Claims

1.多肽，其选自：

或所述多肽的酰胺、酯或盐。

2.多肽，其选自：

pE-R-P-R-L-a-H-K-G-Pip-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:24)；

pE-R-P-R-(D-Leu)-S-Aib-K-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:27)；

pE-R-P-R-L-S-Aib-k-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:28)；

pE-R-P-R-L-d-H-K-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:31)；

pE-R-(trans-4-PhP)-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:32)；

pE-R-P-R-L-s-H-K-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:35)；

pE-R-P-R-L-a-F-K-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:40)；

pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-nle-a-tic-OH(SEQ ID NO:49)；

pE-R-P-R-L-a-H-k-G-P-Nle-a-f-OH(SEQ ID NO:54)；

pE-R-P-R-L-a-H-K-G-P-Nle-P-f-OH(SEQ ID NO:57)；

pE-R-P-R-L-abu-H-K-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:67)；

pE-R-P-R-L-nva-H-K-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:75)；

pE-R-P-R-L-A-h-K-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:81)；

pE-R-P-R-L-a-H-Q-G-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:82)；和

pE-R-P-R-L-a-H-K-D-P-nle-a-f-OH(SEQ ID NO:85)；

或所述多肽的酰胺、酯或盐；

其中Pip是哌可酸；

abu是2-氨基丁酸；

4-PhP是4-苯基脯氨酸。

3.生物缀合物或其多聚体，包含：

a.根据权利要求1或2的多肽，或其酰胺、酯或盐，和

b.半衰期延长部分；

其中所述半衰期延长部分是人血清白蛋白；且

其中所述多肽和半衰期延长部分通过连接基共价连接。

4.根据权利要求1－3任一项的多肽或其酰胺、酯或盐，或其生物缀合物在制备用于治疗或预防需要的受试者对APJ受体激动剂有响应的疾病或障碍的药物中的用途。

5.根据权利要求4的用途，其中所述疾病或障碍选自急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、Brugada综合征、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水分潴留、糖尿病、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂脑缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化、烧伤和先兆子痫。

6.根据权利要求1－3任一项的多肽或其酰胺、酯或盐，或其生物缀合物，其用作药物。

7.根据权利要求1－3任一项的多肽或其酰胺、酯或盐，或其生物缀合物，其用于治疗急性代偿失调性心力衰竭(ADHF)、慢性心力衰竭、肺动脉高压、心房颤动、Brugada综合征、动脉粥样硬化、高血压、再狭窄、缺血性心血管疾病、心肌病、心脏纤维化、心律失常、水分潴留、糖尿病、肥胖、外周动脉病、脑血管意外、短暂脑缺血发作、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化、烧伤或先兆子痫。

8.组合产品，其包含治疗有效量的根据权利要求1－3任一项的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物和一种或多种治疗活性共用药物。

9.根据权利要求8的组合产品，其中所述共用药物选自正性肌力药、β肾上腺素能受体阻滞剂、HMG-Co-A还原酶抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂、钙通道阻滞剂(CCB)、内皮缩血管肽拮抗剂、肾素抑制剂、利尿药、ApoA-I模拟物、抗糖尿病药、减肥药、醛固酮受体阻滞剂、内皮素受体阻滞剂、醛固酮合酶抑制剂(ASI)、CETP抑制剂、抗凝血药、松弛素、BNP(奈西立肽)和/或NEP抑制剂。

10.药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1－3任一项的多肽或其酰胺、酯或盐或其生物缀合物和一种或多种药学上可接受的载体。