CN105002244B - 一种卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基和培养方法 - Google Patents
一种卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基和培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种淡卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基和培养方法，利用本发明中提供的培养基配方和发酵控制工艺，能够提高卷曲霉素发酵单位，降低发酵成本，并且最大限度的降低原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现卷曲霉素稳定、高效的生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基和培养方法。
背景技术
卷曲霉素是由卷曲链霉菌发酵产生的环状多肽类抗生素，由4个结构相似的活性化合物——IA，IB，IIA和IIB组成，其中IA和IB的含量占80％～90％，是发挥疗效的主成分。卷曲霉素对耐多药及持留期结核分枝杆菌具有独特的疗效，被临床上确定为二线结核病治疗药物。
目前，国内卷曲霉素的发酵生产采用三级发酵模式，该方式存在的主要问题有以下几点：
1卷曲霉素发酵水平较低，其发酵水平维持在9000u/ml左右。
2常规培养基的速效碳源是葡萄糖，灭菌过程中易产生“美拉德反应”，即产生抑制菌体的有毒物质。
3卷曲霉素培养基中加入动物蛋白胨，增加了提取和纯化的难度。
4卷曲霉素补料工艺中加入部分前体物质，如甘氨酸、丝氨酸赖氨酸等，发酵液容易变色，增加了提取纯化的难度。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种发酵工艺简单，有效提高发酵单位，同时最大限度的降低原辅料对发酵单位的影响，降低生产成本，且原辅料来源不受环境影响，保证其供应充足，实现卷曲霉素稳定、高效生产的培养基。
本发明的另一目的是提供利用上述培养基生产卷曲霉素的培养方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基的组成为：
豆油2～6ml/L、小麦麸皮12～16g/L、麦芽糖8～12g/L、麦芽糖酶0.002～0.006g/L、鱼粉9～13g/L、玉米浆12～16ml/L、一浸豆粕粉7～11g/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述二级种子培养基的组成为：
豆油3～7ml/L、小麦麸皮15～19g/L、麦芽糖10～14g/L、麦芽糖酶0.003～0.007g/L、鱼粉12～16g/L、蚕蛹粉4～9g/L、一浸豆粕粉7～11g/L、玉米蛋白粉10～14g/L、硫酸铵0.2～0.6g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述发酵培养基的组成为：
豆油6～10ml/L、小麦麸皮21～25g/L、麦芽糖26～30g/L、麦芽糖酶0.005～0.009g/L、鱼粉16～20g/L、蚕蛹粉10～14g/L、一浸豆粕粉14～18g/L、玉米蛋白粉13～17g/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙3～7g/L、磷酸二氢钾0.1～0.5g/L、氯化钠0.002～0.006g/L、硫酸镁0.03～0.07g/L、硫酸亚铁0.1～0.5g/L、氯化锰0.003～0.007g/L，氧载体0.1～0.5g/L、聚醚改性硅油0.3～0.7ml/L。
所述氧载体是正己烷或全氟化碳。
一种利用上述培养基生产卷曲霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为：
1)一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至15～20℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液按照0.1～0.2L/m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，至菌体浓度20～30％、pH值6～7、培养时间30～50h移种；
2)二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至15～20℃，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度30～40％、pH值6～7、培养时间40～50h时移入发酵培养基；
3)发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至15～20℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度35～45％、总糖＜8mg/100ml、氨基氮5～10mg/100ml、化学效价＞11500u/L、卷曲霉素ⅠA+卷曲霉素ⅠB含量＞85％；pH5～7、培养时间140～150h时终止发酵。
所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮30～40mg/100ml、溶磷20～30ug/ml、总糖10～20mg/100ml、pH6～7。
所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮35～45mg/100ml、溶磷30～40ug/ml、总糖20～30mg/100ml、pH6～7。
所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮50～70mg/100ml、溶磷30～50ug/ml、总糖30～50mg/100ml、pH6～7。
所述培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液质量要求为：pH6～7；菌体浓度25～30％；镜检无杂菌。
所述一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～15h，采用空气搅拌代替机械搅拌；16h～移种：20～40m3/h；搅拌转速60～80r/min；
所述二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量40～60m3/h；搅拌转速60～80r/min；
所述发酵培养条件为：
a培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b温度：采用变温控制工艺，
0～50h：培养温度27～28℃，
51～130h：培养温度29～30℃，
131h～发酵结束：培养温度27～28℃；
c搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺，
0～80h：转速控制在80r/min，
81～130h：转速控制在110r/min，
131h～发酵结束：转速控制在80r/min；
d压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f空气流量：
0～50h：150～200m3/h，
51～130h：200～300m3/h，
131h～发酵结束：100～150m3/h；
h溶氧控制：
发酵前50h内，不控制溶氧，
51～80h，溶氧控制在60％以上，
81～130h，溶氧控制在30％以上，
131～发酵结束：溶氧控制在40％以上。
所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补增效剂、补水、补硫酸铵、补麦芽糖和pH控制，其中
a补增效剂工艺控制：
在发酵周期分别达到80h，120h补入增效剂。
b补水工艺控制：
发酵前50h不用进行补水，
发酵时间在51～130h，当菌体浓度高于45％，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～45％，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在131h～发酵结束，当菌体浓度高于40％，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35～40％，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c发酵过程pH控制工艺：
发酵前80h，pH不进行控制，
发酵时间在81～130h，若pH＜6.0，采用流加法加入10～20％的氢氧化钠，调节pH至6～7，若pH＞7，采用流加法加入30％的硫酸溶液，调节pH至6～7，
发酵时间在131～发酵结束，若pH＜6.2，加入10～20％的氢氧化钠，调节pH控至6.2～6.6；若pH＞6.6，加入30％的硫酸溶液，调节pH至6.3～6.6；
d补入麦芽糖：
发酵前60h，总糖含量不进行控制，
发酵61h至130h：总糖含量＜20mg/100ml时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在20～25mg/100ml，
发酵131h至发酵结束：总糖含量＜5mg/100ml时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在5～10mg/100ml，
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001～0.003％；
e补硫酸铵：
在发酵80h和130h时补入10％的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03％。
所述增效剂为丝氨酸、赖氨酸、吐温-80和核黄素的混合溶液，其各自浓度控制在0.001～0.005％；补料过程中，其用量为发酵液体积的0.01～0.03％。
豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品。按照提取的方法不同，可以分为一浸豆粕和二浸豆粕二种。其中以浸提法提取豆油后的副产品为一浸豆粕，而先以压榨取油，再经过浸提取油后所得的副产品称为二浸豆粕。
本发明的技术优势体现在：
1本发明确认了种子培养基、发酵培养基中碳源、氮源和最佳配伍比例。培养基中的碳源、氮源含有卷曲霉素生物合成过程中所需的关键物质，保证了卷曲霉素发酵的技术效果。
2本发明对种子培养、发酵培养的工艺进行了详细的阐述，确认了卷曲霉素最佳的发酵工艺和控制参数。通过本发明发酵生产卷曲霉素，其发酵单位达到11500u/ml以上，同国内技术相比，发酵单位提高了15％以上。
3本发明中卷曲霉素ⅠA+卷曲霉素ⅠB含量＞85％，有效含量高于卷曲霉素药典中的下限要求。
4本发明适用于规模化发酵生产卷曲霉素，至少能够满足年产100吨卷曲霉素的生产需求。
5培养基中使用麦芽糖代替葡萄糖，避免出现“美拉德反应”。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用卷曲链霉菌：生产使用的菌种来源为母瓶发酵液。母瓶发酵液质量要求为：pH6～7；菌体浓度25～30％；镜检无杂菌。
实施例1
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成：豆油2L、小麦麸皮12kg、麦芽糖8kg、麦芽糖酶2g、鱼粉9kg、玉米浆12L、一浸豆粕粉7kg、硫酸铵0.5kg、轻质碳酸钙1kg。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至15℃，并用无菌空气保压，灭菌后一级种子培养基的质量：氨基氮31mg/100ml、溶磷20ug/ml、总糖10.2mg/100ml、pH6.9。然后在火焰保护下，将已经培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液0.1L接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～15h，采用空气搅拌代替机械搅拌；16h～移种：20m3/h；搅拌转速60r/min。一级种子培养结束，菌体浓度20％、pH值6.1、培养时间30h。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成：豆油30L、小麦麸皮150kg、麦芽糖100kg、麦芽糖酶30g、鱼粉120kg、蚕蛹粉40kg、一浸豆粕粉70kg、玉米蛋白粉100kg、硫酸铵2kg、轻质碳酸钙10kg。
先将二级种子培养基灭菌并冷却至15℃，并用无菌空气保压，灭菌后的二级种子培养基的质量：氨基氮35.2mg/100ml、溶磷30ug/ml、总糖21mg/100ml、pH6.9。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量40m3/h；搅拌转速60r/min。至菌体浓度30％、pH值6.8、培养时间40h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成：豆油600L、小麦麸皮2100kg、麦芽糖2600kg、麦芽糖酶0.5kg、鱼粉1600kg、蚕蛹粉1000kg、一浸豆粕粉1400kg、玉米蛋白粉1300kg、硫酸铵50kg、轻质碳酸钙300kg、磷酸二氢钾10kg、氯化钠0.2kg、硫酸镁3kg、硫酸亚铁10kg、氯化锰0.3kg，正己烷10kg、聚醚改性硅油30L。
先将发酵培养基灭菌，冷却至15℃，并用无菌空气保压，灭菌后发酵培养基的质量为：氨基氮51mg/100ml、溶磷30ug/ml、总糖31mg/100ml、pH7。采用变温控制工艺，0～50h：培养温度27～28℃，51～130h：培养温度29～30℃，131h～发酵结束：培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，0～80h：转速控制在80r/min，81～130h：转速控制在110r/min，131h～发酵结束：转速控制在80r/min；发酵培养过程中罐压0.05～0.06MPa；pH控制在5～7；空气流量：0～50h：150m3/h；51～130h：200m3/h；131h～发酵结束：100m3/h；发酵前50h内，不控制溶氧；51～80h，溶氧控制在60％以上；81～130h，溶氧控制在30％以上；131～发酵结束：溶氧控制在40％以上。发酵培养140h终止发酵，菌体浓度35％、总糖7.6mg/100ml、氨基氮9.7mg/100ml、化学效价11621u/L、卷曲霉素ⅠA+卷曲霉素ⅠB含量86.7％、pH6.8。
实施例2
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成：豆油3L、小麦麸皮13kg、麦芽糖9kg、麦芽糖酶3g、鱼粉10kg、玉米浆13L、一浸豆粕粉8kg、硫酸铵0.6kg、轻质碳酸钙2kg。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至16℃，并用无菌空气保压，灭菌后一级种子培养基的质量：氨基氮33mg/100ml、溶磷22ug/ml、总糖12.9mg/100ml、pH6.7。然后在火焰保护下，将已经培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液0.13L接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～15h，采用空气搅拌代替机械搅拌；16h～移种：25m3/h；搅拌转速65r/min。一级种子培养结束，菌体浓度22％、pH值6.3、培养时间35h。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基祖成：豆油40L、小麦麸皮160kg、麦芽糖110kg、麦芽糖酶40g、鱼粉130kg、蚕蛹粉50kg、一浸豆粕粉80kg、玉米蛋白粉110kg、硫酸铵3kg、轻质碳酸钙20kg；首先将二级种子培养基灭菌并冷却至16℃，并用无菌空气保压，灭菌后的二级种子培养基的质量：氨基氮37.5mg/100ml、溶磷32.1ug/ml、总糖23mg/100ml、pH6.8。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量45m3/h；搅拌转速65r/min。至菌体浓度32％、pH值6.7、培养时间43h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成：豆油700L、小麦麸皮2200kg、麦芽糖2700kg、麦芽糖酶0.6kg、鱼粉1700kg、蚕蛹粉1100kg、一浸豆粕粉1500kg、玉米蛋白粉1400kg、硫酸铵60kg、轻质碳酸钙400kg、磷酸二氢钾20kg、氯化钠0.3kg、硫酸镁4kg、硫酸亚铁20kg、氯化锰0.4kg，全氟化碳20kg、聚醚改性硅油40L。先将发酵培养基灭菌，冷却至16℃，并用无菌空气保压，灭菌后发酵培养基的质量为：氨基氮56mg/100ml、溶磷34ug/ml、总糖33mg/100ml、pH6.8。采用变温控制工艺，0～50h：培养温度27～28℃，51～130h：培养温度29～30℃，131h～发酵结束：培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，0～80h：转速控制在80r/min，81～130h：转速控制在110r/min，131h～发酵结束：转速控制在80r/min；发酵培养过程中罐压0.05～0.06MPa；pH控制在5～7；空气流量：0～50h：160m3/h；51～130h：220m3/h；131h～发酵结束：110m3/h；发酵前50h内，不控制溶氧；51～80h，溶氧控制在60％以上；81～130h，溶氧控制在30％以上；131～发酵结束：溶氧控制在40％以上。发酵培养143h终止发酵，菌体浓度38％、总糖7.1mg/100ml、氨基氮8.6mg/100ml、化学效价11973u/L、卷曲霉素ⅠA+卷曲霉素ⅠB含量87.2％、pH6.7。
实施例3
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成：豆油4L、小麦麸皮14kg、麦芽糖10kg、麦芽糖酶4g、鱼粉11kg、玉米浆14L、一浸豆粕粉9kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙3kg。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至17℃，并用无菌空气保压，灭菌后一级种子培养基的质量：氨基氮35mg/100ml、溶磷26ug/ml、总糖16mg/100ml、pH6.5。然后在火焰保护下，将已经培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液0.15L接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～15h，采用空气搅拌代替机械搅拌；16h～移种：30m3/h；搅拌转速70r/min。一级种子培养结束，菌体浓度25％、pH值6.6、培养时间40h。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基祖成：豆油50L、小麦麸皮170kg、麦芽糖120kg、麦芽糖酶50g、鱼粉140kg、蚕蛹粉60kg、一浸豆粕粉90kg、玉米蛋白粉120kg、硫酸铵4kg、轻质碳酸钙30kg；首先将二级种子培养基灭菌并冷却至17℃，并用无菌空气保压，灭菌后的二级种子培养基的质量：氨基氮41mg/100ml、溶磷34.8ug/ml、总糖25mg/100ml、pH6.6。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量50m3/h；搅拌转速70r/min。至菌体浓度35％、pH值6.5、培养时间45h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成：豆油800L、小麦麸皮2300kg、麦芽糖2800kg、麦芽糖酶0.7kg、鱼粉1800kg、蚕蛹粉1200kg、一浸豆粕粉1600kg、玉米蛋白粉1500kg、硫酸铵70kg、轻质碳酸钙500kg、磷酸二氢钾30kg、氯化钠0.4kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁30kg、氯化锰0.5kg，全氟化碳30kg、聚醚改性硅油50L。先将发酵培养基灭菌，冷却至18℃，并用无菌空气保压，灭菌后发酵培养基的质量为：氨基氮61mg/100ml、溶磷40ug/ml、总糖39mg/100ml、pH6.7。采用变温控制工艺，0～50h：培养温度27～28℃，51～130h：培养温度29～30℃，131h～发酵结束：培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，0～80h：转速控制在80r/min，81～130h：转速控制在110r/min，131h～发酵结束：转速控制在80r/min；发酵培养过程中罐压0.05～0.06MPa；pH控制在5～7；空气流量：0～50h：170m3/h；51～130h：250m3/h；131h～发酵结束：120m3/h；发酵前50h内，不控制溶氧；51～80h，溶氧控制在60％以上；81～130h，溶氧控制在30％以上；131～发酵结束：溶氧控制在40％以上。发酵培养145h终止发酵，菌体浓度40％、总糖6.6mg/100ml、氨基氮8.1mg/100ml、化学效价12198u/L、卷曲霉素ⅠA+卷曲霉素ⅠB含量89.2％、pH6.5。
实施例4
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成：豆油5L、小麦麸皮15kg、麦芽糖11kg、麦芽糖酶5g、鱼粉12kg、玉米浆15L、一浸豆粕粉10kg、硫酸铵0.8kg、轻质碳酸钙4kg。首先将一级种子培养基灭菌并冷却至18℃，并用无菌空气保压，灭菌后一级种子培养基的质量：氨基氮37mg/100ml、溶磷28ug/ml、总糖18mg/100ml、pH6.5。然后在火焰保护下，将已经培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液0.17L接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～15h，采用空气搅拌代替机械搅拌；16h～移种：35m3/h；搅拌转速75r/min。一级种子培养结束，菌体浓度28％、pH值6.4、培养时间45h。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基祖成：豆油60L、小麦麸皮180kg、麦芽糖130kg、麦芽糖酶60g、鱼粉150kg、蚕蛹粉70kg、一浸豆粕粉100kg、玉米蛋白粉130kg、硫酸铵5kg、轻质碳酸钙40kg；首先将二级种子培养基灭菌并冷却至19℃，并用无菌空气保压，灭菌后的二级种子培养基的质量：氨基氮43mg/100ml、溶磷37ug/ml、总糖28mg/100ml、pH6.4。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量55m3/h；搅拌转速75r/min。至菌体浓度38％、pH值6.4、培养时间47h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成：豆油900L、小麦麸皮2400kg、麦芽糖2900kg、麦芽糖酶0.8kg、鱼粉1900kg、蚕蛹粉1300kg、一浸豆粕粉1700kg、玉米蛋白粉1600kg、硫酸铵80kg、轻质碳酸钙600kg、磷酸二氢钾40kg、氯化钠0.5kg、硫酸镁6kg、硫酸亚铁40kg、氯化锰0.6kg，全氟化碳40kg、聚醚改性硅油60L。先将发酵培养基灭菌，冷却至19℃，并用无菌空气保压，灭菌后发酵培养基的质量为：氨基氮66mg/100ml、溶磷46ug/ml、总糖45mg/100ml、pH6.4。采用变温控制工艺，0～50h：培养温度27～28℃，51～130h：培养温度29～30℃，131h～发酵结束：培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，0～80h：转速控制在80r/min，81～130h：转速控制在110r/min，131h～发酵结束：转速控制在80r/min；发酵培养过程中罐压0.05～0.06MPa；pH控制在5～7；空气流量：0～50h：180m3/h；51～130h：270m3/h；131h～发酵结束：140m3/h；发酵前50h内，不控制溶氧；51～80h，溶氧控制在60％以上；81～130h，溶氧控制在30％以上；131～发酵结束：溶氧控制在40％以上。发酵培养147h终止发酵，菌体浓度43％、总糖6.1mg/100ml、氨基氮7.2mg/100ml、化学效价12083u/L、卷曲霉素ⅠA+卷曲霉素ⅠB含量88.7％、pH6.3。
实施例5
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成：豆油6L、小麦麸皮16kg、麦芽糖12kg、麦芽糖酶6g、鱼粉13kg、玉米浆16L、一浸豆粕粉11kg、硫酸铵0.9kg、轻质碳酸钙5kg。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至20℃，并用无菌空气保压，灭菌后一级种子培养基的质量：氨基氮40mg/100ml、溶磷30ug/ml、总糖20mg/100ml、pH6.2。然后在火焰保护下，将已经培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液0.2L接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～15h，采用空气搅拌代替机械搅拌；16h～移种：40m3/h；搅拌转速80r/min。一级种子培养结束，菌体浓度30％、pH值6.1、培养时间50h。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成：豆油70L、小麦麸皮190kg、麦芽糖140kg、麦芽糖酶70g、鱼粉160kg、蚕蛹粉80kg、一浸豆粕粉110kg、玉米蛋白粉140kg、硫酸铵6kg、轻质碳酸钙50kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至20℃，并用无菌空气保压，灭菌后的二级种子培养基的质量：氨基氮45mg/100ml、溶磷40ug/ml、总糖30mg/100ml、pH6.2。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量60m3/h；搅拌转速80r/min。至菌体浓度40％、pH值6.1、培养时间50h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成：豆油1000L、小麦麸皮2500kg、麦芽糖3000kg、麦芽糖酶0.9kg、鱼粉2000kg、蚕蛹粉1400kg、一浸豆粕粉1800kg、玉米蛋白粉1700kg、硫酸铵90kg、轻质碳酸钙700kg、磷酸二氢钾50kg、氯化钠0.6kg、硫酸镁7kg、硫酸亚铁50kg、氯化锰0.7kg，正己烷50kg、聚醚改性硅油70L。
先将发酵培养基灭菌，冷却至20℃，并用无菌空气保压，灭菌后发酵培养基的质量为：氨基氮70mg/100ml、溶磷49ug/ml、总糖50mg/100ml、pH6.2。采用变温控制工艺，0～50h：培养温度27～28℃，51～130h：培养温度29～30℃，131h～发酵结束：培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，0～80h：转速控制在80r/min，81～130h：转速控制在110r/min，131h～发酵结束：转速控制在80r/min；发酵培养过程中罐压0.05～0.06MPa；pH控制在5～7；空气流量：0～50h：200m3/h；51～130h：300m3/h；131h～发酵结束：150m3/h；发酵前50h内，不控制溶氧；51～80h，溶氧控制在60％以上；81～130h，溶氧控制在30％以上；131～发酵结束：溶氧控制在40％以上。发酵培养150h终止发酵，菌体浓度45％、总糖5.3mg/100ml、氨基氮6.3mg/100ml、化学效价11853u/L、卷曲霉素ⅠA+卷曲霉素ⅠB含量88.1％、pH6.1。
上述实施例1-5的发酵过程中，根据检测情况，采用流加法进行补料，补料包括补增效剂、补水、补硝酸铵、补麦芽糖和pH控制，其中
a补增效剂工艺控制：
配置增效剂溶液，并灭菌。当发酵周期分别达到80h，120h补入增效剂，其加量为发酵液体积的1～3％。
b补水工艺控制：
发酵前50h不用进行补水，
发酵时间在51～130h，当菌体浓度高于45％，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～45％，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在131h～发酵结束，当菌体浓度高于40％，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35～40％，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c发酵过程pH控制工艺：
发酵前80h，pH不进行控制；
发酵时间在81～130h，若pH＜6.0，采用流加法加入10～20％的氢氧化钠，调节pH至6～7；若pH＞7，采用流加法加入30％的硫酸溶液，调节pH至6～7，
发酵时间在131～发酵结束，若pH＜6.2，加入10～20％的氢氧化钠，调节pH控至6.2～6.6；若pH＞6.6，加入30％的硫酸溶液，调节pH至6.3～6.6；
d补入麦芽糖：
发酵前60h，总糖含量不进行控制，
发酵61h至130h：总糖含量＜20mg/100ml时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在20～25mg/100ml.
发酵131h至发酵结束：总糖含量＜5mg/100ml时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在5～10mg/100ml。
上述补糖工艺中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001～0.003％。
e补硫酸铵：
卷曲霉素发酵培养过程中，分别在80h和130h补入10％的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03％。
增效剂的配方为丝氨酸、赖氨酸、吐温-80和核黄素的混合溶液，其各自浓度控制在0.001～0.005％；补料过程中，其用量为发酵液体积的0.01～0.03％。对比实施例
一级种子培养：一级种子培养基体积1m3。
一级种子培养基组成：玉米淀粉13kg、葡萄糖13kg、黄豆饼粉13kg、玉米浆14L、蛋白胨9kg、硫酸铵0.7kg、轻质碳酸钙3kg。
首先将一级种子培养基灭菌并冷却至15℃，并用无菌空气保压，灭菌后一级种子培养基的质量：氨基氮23mg/100ml、溶磷17ug/ml、总糖12mg/100ml、pH6.2。然后在火焰保护下，将已经培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液0.15L接种量接入一级种子培养基中进行种子培养。一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～15h，采用空气搅拌代替机械搅拌；16h～移种：30m3/h；搅拌转速70r/min。一级种子培养结束，菌体浓度18％、pH值6.4、培养时间40h。
二级种子培养：二级种子培养基体积10m3。
二级种子培养基组成：玉米淀粉170kg、葡萄糖120kg、黄豆饼粉120kg、玉米浆160L、蛋白胨100kg、硫酸铵4kg、轻质碳酸钙30kg。
首先将二级种子培养基灭菌并冷却至17℃，并用无菌空气保压，灭菌后的二级种子培养基的质量：氨基氮32mg/100ml、溶磷27ug/ml、总糖17mg/100ml、pH6.2。将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量50m3/h；搅拌转速70r/min。至菌体浓度241％、pH值6.4、培养时间45h时移入发酵培养基。
发酵培养：发酵培养基体积100m3。
发酵培养基组成：玉米淀粉2300kg、葡萄糖2800kg、黄豆饼粉1800kg、蛋白胨1200kg、玉米浆1800L、玉米蛋白粉1500kg、硫酸铵70kg、轻质碳酸钙500kg、磷酸二氢钾30kg、氯化钠0.4kg、硫酸镁5kg、硫酸亚铁30kg、氯化锰0.5kg，全氟化碳30kg、聚醚改性硅油50L。
先将发酵培养基灭菌，冷却至18℃，并用无菌空气保压，灭菌后发酵培养基的质量为：氨基氮53mg/100ml、溶磷34ug/ml、总糖33mg/100ml、pH6.4。采用变温控制工艺，0～50h：培养温度27～28℃，51～130h：培养温度29～30℃，131h～发酵结束：培养温度27～28℃；采用变频搅拌控制工艺，0～80h：转速控制在80r/min，81～130h：转速控制在110r/min，131h～发酵结束：转速控制在80r/min；发酵培养过程中罐压0.05～0.06MPa；pH控制在5～7；空气流量：0～50h：170m3/h；51～130h：250m3/h；131h～发酵结束：120m3/h；发酵前50h内，不控制溶氧；51～80h，溶氧控制在60％以上；81～130h，溶氧控制在30％以上；131～发酵结束：溶氧控制在40％以上。发酵过程中，按照补料工艺要求进行补料，不补入增效剂。发酵培养145h终止发酵，菌体浓度30％、总糖5.8mg/100ml、氨基氮9.5mg/100ml、化学效价9203u/L、卷曲霉素ⅠA+卷曲霉素ⅠB含量82.4％、pH6.8。
Claims (10)
1.一种卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基，其特征在于包括一级种子培养基、二级种子培养基和发酵培养基，其中
所述一级种子培养基的组成为：
豆油2～6ml/L、小麦麸皮12～16g/L、麦芽糖8～12g/L、麦芽糖酶0.002～0.006g/L、鱼粉9～13g/L、玉米浆12～16ml/L、一浸豆粕粉7～11g/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述二级种子培养基的组成为：
豆油3～7ml/L、小麦麸皮15～19g/L、麦芽糖10～14g/L、麦芽糖酶0.003～0.007g/L、鱼粉12～16g/L、蚕蛹粉4～9g/L、一浸豆粕粉7～11g/L、玉米蛋白粉10～14g/L、硫酸铵0.2～0.6g/L、轻质碳酸钙1～5g/L；
所述发酵培养基的组成为：
豆油6～10ml/L、小麦麸皮21～25g/L、麦芽糖26～30g/L、麦芽糖酶0.005～0.009g/L、鱼粉16～20g/L、蚕蛹粉10～14g/L、一浸豆粕粉14～18g/L、玉米蛋白粉13～17g/L、硫酸铵0.5～0.9g/L、轻质碳酸钙3～7g/L、磷酸二氢钾0.1～0.5g/L、氯化钠0.002～0.006g/L、硫酸镁0.03～0.07g/L、硫酸亚铁0.1～0.5g/L、氯化锰0.003～0.007g/L，氧载体0.1～0.5g/L、聚醚改性硅油0.3～0.7ml/L。
2.按照权利要求1所述的卷曲链霉菌发酵生产卷曲霉素的培养基，其特征在于所述氧载体是正己烷或全氟化碳。
3.一种利用权利要求1所述的培养基生产卷曲霉素的培养方法，其特征在于其工艺步骤为：
1）一级种子培养：首先将一级种子培养基灭菌并冷却至15～20℃，并用无菌空气保压，然后在火焰保护下，将已经培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液按照0.1～0.2L/m3的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，至菌体浓度20～30%、pH值6～7、培养时间30～50h移种；
2）二级种子培养：首先将二级种子培养基灭菌并冷却至15～20℃，并用无菌空气保压，将已经培养好的一级种子培养基移入二级种子培养基中进行二级种子培养，至菌体浓度30～40%、pH值6～7、培养时间40～50h时移入发酵培养基；
3）发酵培养：先将发酵培养基灭菌，冷却至15～20℃，并用无菌空气保压，然后将培养好的二级种子液移入发酵培养基进行发酵培养，至菌体浓度35～45%、总糖＜8mg/100ml、氨基氮5～10mg/100ml、化学效价＞11500u/L、卷曲霉素ⅠA+卷曲霉素ⅠB含量＞85%；pH5～7、培养时间140～150h时终止发酵。
4.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮30～40mg/100ml、溶磷20～30ug/ml、总糖10～20mg/100ml、pH6～7。
5.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮35～45mg/100ml、溶磷30～40ug/ml、总糖20～30mg/100ml、pH6～7。
6.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮50～70mg/100ml、溶磷30～50ug/ml、总糖30～50mg/100ml、pH6～7。
7.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述培养好的卷曲链霉菌母瓶发酵液质量要求为：pH6～7；菌体浓度25～30%；镜检无杂菌。
8.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～29℃；空气流量：0～15h，采用空气搅拌代替机械搅拌；16h～移种：20～40m3/h；搅拌转速60～80r/min；
所述二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28～30℃；空气流量40～60m3/h；搅拌转速60～80r/min；
所述发酵培养条件为：
a 培养基初始pH：发酵培养基灭菌后pH控制在6～7；
b 温度：采用变温控制工艺，
0～50h：培养温度27～28℃，
51～130h：培养温度29～30℃，
131h～发酵结束：培养温度27～28℃；
c 搅拌转速：采用变频搅拌控制工艺，
0～80h：转速控制在80r/min，
81～130h：转速控制在110r/min，
131h～发酵结束：转速控制在80r/min；
d 压力控制：罐压0.05～0.06MPa；
e pH控制：发酵过程中pH控制在5～7；
f 空气流量：
0～50h：150～200m3/h，
51～130h：200～300m3/h，
131h～发酵结束：100～150m3/h；
h 溶氧控制：
发酵前50h内，不控制溶氧，
51～80h，溶氧控制在60%以上，
81～130h，溶氧控制在30%以上，
131～发酵结束：溶氧控制在40%以上。
9.按照权利要求3所述的培养方法，其特征在于所述发酵过程中采用流加法进行补料，补料包括补增效剂、补水、补硫酸铵、补麦芽糖和pH控制，其中
a 补增效剂工艺控制：
在发酵周期分别达到80h，120h补入增效剂；
b补水工艺控制：
发酵前50h不用进行补水，
发酵时间在51～130h，当菌体浓度高于45%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在40～45%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度，
发酵时间在131h～发酵结束，当菌体浓度高于40%，加入灭菌水，要求控制发酵液菌体浓度在35～40%，每隔6～8h检测发酵液菌体浓度；
c 发酵过程pH控制工艺：
发酵前80h，pH不进行控制，
发酵时间在81～130h，若pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氢氧化钠，调节pH至6～7，若pH＞7，采用流加法加入30%的硫酸溶液，调节pH至6～7，
发酵时间在131～发酵结束，若pH＜6.2，加入10～20%的氢氧化钠，调节pH控至6.2～6.6；若pH＞6.6，加入30%的硫酸溶液，调节pH至6.3～6.6；
d 补入麦芽糖：
发酵前60h，总糖含量不进行控制，
发酵61h至130h：总糖含量＜20mg/100ml时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在20～25mg/100ml，
发酵131h至发酵结束：总糖含量＜5mg/100ml时，补入已灭菌的麦芽糖溶液，使总糖的含量控制在5～10mg/100ml，
上述麦芽糖溶液中加入麦芽糖酶，其浓度控制在0.001～0.003%；
e 补硫酸铵：
在发酵80h和130h时补入10%的硫酸铵溶液，其用量控制在发酵液体积的0.01～0.03%。
10.按照权利要求9所述的培养方法，其特征在于所述增效剂为丝氨酸、赖氨酸、吐温-80和核黄素的混合溶液，其各自浓度控制在0.001～0.005%；补料过程中，其用量为发酵液体积的0.01～0.03%。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3143468A (en) * | 1962-05-25 | 1964-08-04 | Lilly Co Eli | Capreomycin and its preparation |
| US4026766A (en) * | 1976-05-05 | 1977-05-31 | Bristol-Myers Company | Fermentation process |
| EP0053025A2 (en) * | 1980-11-22 | 1982-06-02 | Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai | Antibiotic and its preparation from a streptomyces microorganism |
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-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3143468A (en) * | 1962-05-25 | 1964-08-04 | Lilly Co Eli | Capreomycin and its preparation |
| US4026766A (en) * | 1976-05-05 | 1977-05-31 | Bristol-Myers Company | Fermentation process |
| EP0053025A2 (en) * | 1980-11-22 | 1982-06-02 | Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai | Antibiotic and its preparation from a streptomyces microorganism |
| CN103183727A (zh) * | 2012-12-17 | 2013-07-03 | 深圳翰宇药业股份有限公司 | 一种卷曲霉素的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "卷曲霉素产生菌的改良";梁淑芳等;《应用与环境生物学报》;19990825;第5卷(第4期);全文 * |
| "膜技术在卷曲霉素提炼工艺中的推广应用";张天兵;《万方数据知识服务平台》;20140429;全文 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |