CN104981481A

CN104981481A - 用于提高植物生产率的转录调控

Info

Publication number: CN104981481A
Application number: CN201380072676.5A
Authority: CN
Inventors: M·M·R·安巴瓦拉姆; M·索姆勒瓦
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Yield10 Bioscience Inc
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2013-12-18
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2033-12-18
Also published as: US10450580B2; EP3702364A1; AU2013361456A1; US11072798B2; EP2935315A1; CN104981481B; US20180340183A1; US20210332376A1; US11746356B2; US20200048651A1; WO2014100289A1; BR112015014488A2; EP2935315B1; US20160194650A1

Abstract

本发明描述了包含用于改善各种农作物和模式植物、具有C3或C4光合作用途径的双子叶植物和单子叶植物中的光合作用能力、生物量和/或谷物产量和胁迫耐受性的功能性转录因子的DNA构建体和多核苷酸的方法。

Description

用于提高植物生产率的转录调控

相关申请

本申请要求于2012年12月18日提交的美国临时申请第61/738,675号的利益。上述申请的全部内容通过引用的方式结合至本文。

通过引用合并ASCII文本文件形式的材料

本申请通过引用合并在下面ASCII文本文件中包含的序列表，所述文本文件与本申请同时提交：

文件名：46141011001_FINALSEQUENCELISTING.txt；生成于2013年12月18日；大小为163KB。

政府支持

本发明在能源部的DE-EE0004943政府支持下完成。政府享有本发明的一些权利。

背景技术

全球人口的规模增加、新兴国家(如中国)中居住标准的提高以及使用可再生资源(如植物)以生产生物燃料和生物基化学制品使得对农业有了额外的压力。这些因素与额外耕地和水资源的有限供给一起意味着农作物生产率或产量是满足这些需求的关键。农业需要以减少输入提供更多的产出。除了传统的和标记辅助育种计划，对于可以广泛地影响农作物产量以及减轻环境胁迫条件(如干旱、霜冻、高温和盐分)的影响和需要较少的化学产品(如肥料、除草剂、杀虫剂和杀真菌剂)的投入的新基因的鉴定和应用的需求增加。例如，2010年全球生物燃料生产(主要由源自植物碳水化合物源(如来自玉米、甘蔗的淀粉、糖类)的生物乙醇和来自植物油(来自棕榈和大豆)的生物柴油提供)达到了280亿加仑的产出，提供了全世界用于道路运输的燃料的大约2.7％。实现较高产量的关键之一是提高植物的光合作用能力，以使得每株植物固定更多的二氧化碳，这与上调关键代谢途径一起导致植物组织中存储碳水化合物(如淀粉和蔗糖)或脂质(如脂肪酸和甘油三酯(油))的水平提高。在用于饲料或能源生产的生物质农作物的情况中，增加每株植物的总生物量也是高度期望的结果。在很多情况中，为增加植物中存储碳水化合物或油的努力已经聚焦在使用编码特定代谢途径中的个别酶(即，“单一酶”或代谢途径方法)的基因的遗传修饰。

转录因子(TF)被认为是用于操纵植物代谢的“单一酶”方法的潜在替代方式(Grotewold,2008,Curr.Opin.Biotechnol.19:138-144)。它们是植物生长、发育和环境胁迫反应过程中差异基因表达的关键调节子。转录因子或者与参与关键生物过程的基因直接相互作用，或者与之后同靶基因结合的其它TF的调节相互作用，从而实现高水平的特异性和控制。得到的结果是影响多种基因并导致，例如，经由相互连接的或竞争的代谢途径的关键代谢物流的微调变化的多层调控网络(Ambavaram等,2011,Plant Physiol.155:916–931)。关于直接参与植物中光合作用相关基因的调节的转录因子的信息有限，光合作用参数的改进已经在过表达AP2/EREB、bZIP、NF-X1、NF-Y(HAP)和MYB的TF家族的成员的转基因农作物和模式植物中报导(Saibo等,2009,Ann.Bot.-London 103:609-623)。这些TF的大多数是胁迫诱导的，并赋予对一系列非生物胁迫因子(如干旱、盐分、高温或低温以及光抑制)的耐受性(Hussain等,2011,Biotechnology Prog.27:297-306，还参见WO 2005/112608 A2和Broun的美国专利6,835,540 B2号)。仅少许TF，如来自玉米的Dof1和MNF，与参与C4光合作用的基因的表达相关(Weissmann&Brutnell,2012,Curr.Opin.Biotechnol.23:298-304；Yanagisawa,2000,Plant J.21:281-288)。导致生物量产量提高的不同营养和/或花器官的生长增加已经在过表达TF(如ARGOS、AINTEGUMENTA、NAC1、ATAF2、MEGAINTEGUMENTA和ANGUSTIFOLIA)的植物中报导(Rojas等,2010,GM Crops 1:137-142及其中的参考文献；也参见WO 2011/109661 A1、WO 2010/129501、WO 2009/040665 A2、WO02/079403 A2和Heard等的美国专利7,598,429 B2号以及Beekman等的7,592,507 B2号)。也已经报导了通过改变调控木质素(Wang等的US 2012/0117691 A1)和次级代谢物(Broun的美国专利6,835,540 B2号)的生物合成中的基因的转录因子的表达改变植物代谢途径。

因此，存在鉴定转录因子的需要，所述转录因子增加或改变的表达不仅导致植物中在光合作用中使用的捕光色素水平提高以及光合作用能力的提高，而且上调产生一种或多种额外的期望效果的关键代谢途径，所述一种或多种额外的期望效果选自：植物组织中淀粉、葡萄糖或蔗糖(非结构碳水化合物)水平的提高，脂肪酸水平的提高，生物量和/或谷物产量的生产提高，以及增强的胁迫耐受性。同样期望能够在广泛的农作物物种中鉴定这些转录因子的合适变体，以及能够在广泛的农作物(包括具有C3或C4光合作用途径的双子叶植物和单子叶植物)中对这些基因进行工程改造。

用于实施本发明的感兴趣的具体农作物包括：柳枝稷、芒属(Miscathus)、苜蓿属(Medicago)、甜高粱、高粱、甘蔗、能源甘蔗、象草、玉米、小麦、大麦、燕麦、水稻、大豆、油棕榈、红花、芝麻、亚麻、棉花、向日葵、亚麻荠属(Camelina)、欧洲油菜(Brassica napus)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、芥菜(Brassicajuncea)、珍珠稷、粟、其它谷物、油菜籽、蔬菜、饲草、木本植物和生物质农作物。

发明内容

本发明总体地属于新基因和使用这些新基因增加植物农作物产量的方法的领域。本文描述的是新转录因子的应用，所述新转录因子在感兴趣的植物中过表达时影响农作物中多个生物途径的调控，导致例如绿色组织中光合色素的更高水平、光合作用效率提高、叶组织中非结构碳水化合物(淀粉、蔗糖、葡萄糖)和脂肪酸的含量增加、生物量产量增加以及胁迫耐受性提高。

多种转录因子候选物的筛选已经导致新转录因子的鉴定，这些新转录因子在转基因植物中从异源启动子表达时形成这些转录因子表达增加的植物。增加的表达水平可以是在野生型植物(如，非转基因植物、测试植物或对照植物)中发现的背景表达水平的多至1.2倍、1.3倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或多于10倍。作为这些转录因子表达提高的结果，实现了多种有益性状，包括但不限于，与野生型植物相比，光合色素的水平提高、光合作用能力提高、植物组织中非结构碳水化合物(包括淀粉、蔗糖和葡萄糖)的水平提高、植物组织中脂肪酸水平提高、生物量生长率和产量增加以及胁迫耐受性提高。本文还描述了用于鉴定转录因子和产生转基因植物的方法。这些转录因子基因、其同源物和/或直系同源物以及本文中描述的用于增加它们的表达或用于在异源宿主中表达它们的方法可以在广泛的农作物植物中实现产量增加。

用本发明的转录因子和其同源物和/或直系同源物转化的植物中的较高光合作用速率与由所描述的方法实现的提高的光合色素水平结合导致中心碳代谢的产物(如，淀粉、可溶性糖以及脂肪酸)的积累增加以及生物量和谷物产量提高。还可能，这些转录因子的表达水平提高的植物也可用于通过遗传工程增加在植物中生产的其它产物(包括，例如贮存淀粉)的产量。增加这些转录因子在植物中的表达的总体潜在影响在图1中示出。由本发明的转录因子介导的胁迫耐受性提高产生在非生物或生物胁迫条件下比非转化对照或测试植物(也被称为是野生型)具有更好农艺性能的转基因植物。在另一种相关的方面，还描述了用于测试大的转基因和野生型植物(如，农作物)群体的胁迫反应的快速和可靠的方法。本文还描述了新的基因序列、由它们编码的多肽、基因构建体和使用它们产生转基因植物、植物产物、农作物和种子的方法。

通过在本文鉴定的功能性转录因子和它们同源物、直系同源物以及功能性片段的引入或表达增加所产生的这些转基因植物、转基因植物的部分、转基因农作物和转基因种子比野生型植物具有提高的光合作用能力、提高的生物量产量和/或提高的谷物产量和胁迫耐受性。

本发明涉及转录因子基因的鉴定，所述转录因子基因与在野生型植物中发现的水平相比以更高水平表达或在异源植物中表达时产生一种或多种期望的性状，所述性状选自：更高的光合色素水平、更高的光合作用活性、更高的淀粉和/或蔗糖和/或葡萄糖水平、更高的生物量产量和提高的胁迫耐受性。

在本发明的一个方面，描述了编码属于APETALA2(AP2)/ETHYLENE RESPONSE FACTOR(ERF)家族的转录因子的基因(如，SEQ ID NO:1和2)和来自Nuclear-Factor Y(NF-YB)家族的转录因子的基因(如，SEQ ID NO:3)以及来自其它植物物种的其同源物和直系同源物的基因，以及产生在广泛植物中过表达这些转录因子的转基因植物以实现选自以下一种或多种性状的方法：更高的光合色素水平、更高的光合作用活性、更高的淀粉和/或蔗糖和/或葡萄糖水平、更高的产量和提高的胁迫耐受性。

宿主植物包括但不限于：粮食农作物、饲草农作物、生物能源和生物质农作物、多年生和一年生植物物种。用于实施本发明的感兴趣的具体农作物的例子包括：柳枝稷、芒属、苜蓿属、甜高粱、高粱、甘蔗、能源甘蔗、象草、玉米、小麦、大麦、燕麦、水稻、大豆、油棕榈、红花、芝麻、亚麻、棉花、向日葵、亚麻荠属、欧洲油菜、埃塞俄比亚芥、芥菜、珍珠稷、粟、其它谷物、油菜籽、蔬菜、饲草、木本植物和生物质农作物。

在第一个方面，描述了包含一种或多种核苷酸序列的转基因植物或植物的一部分或植物材料或植物种子或植物细胞，所述一种或多种核苷酸序列编码一种或多种AP2/ERF和/或NF-YB转录因子，其中，所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码，且一种或多种转录因子的表达增加导致在转基因植物、植物的一部分、植物材料、植物种子或植物细胞中选自以下的一种或多种性状：更高的光合色素水平、更高的光合作用活性、更高的淀粉和/或蔗糖和/或葡萄糖水平、更高产量和提高的胁迫耐受性。能够以多种方式测量转录因子的表达增加，包括相比于野生型植物的倍数增加，如与野生型植物中相同基因的表达相比高1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、多于9倍。在一些情况下，所述增加的表达来自于通过基因操作以在异源植物宿主中表达转录因子而实现的转录因子基因的表达。该特定实施方式的实例在选自以下的植物中表达分离自柳枝稷的基因之一(包括同源物或直系同源物)：芒属、苜蓿属、甜高粱、高粱、甘蔗、能源甘蔗、象草、玉米、小麦、大麦、燕麦、水稻、大豆、油棕榈、红花、芝麻、亚麻、棉花、向日葵、亚麻荠属、欧洲油菜、埃塞俄比亚芥、芥菜、珍珠稷、粟、其它谷物、油菜籽、蔬菜、饲草、木本植物和生物质农作物。

在第一个方面的第一实施方式中，一种或多种转录因子的表达提高了光合色素(包括叶绿素和/或类胡萝卜素)的水平。所述提高是与非转基因植物比较，且这样的提高可以以多种方式测量，包括倍数提高或百分比提高，如10％、20％、50％或75％。

在第一个方面的第二实施方式中，与野生型植物相比，一种或多种转录因子的表达增加提高了植物中光合作用的速率。所述提高是与非转基因植物相比较，且这样的提高可以以多种方式测量，包括倍数提高或百分比提高，如10％、20％、30％、40％、50％或更高。

在第一个方面的第三实施方式中，与野生型植物相比，一种或多种转录因子的表达增加导致植物组织中淀粉和/或蔗糖和/或葡萄糖的水平提高。植物组织中淀粉和/或蔗糖和/或葡萄糖水平的提高可以单独地或组合地被测量为所分析的植物组织的干重的％，例如，植物组织干重的2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％。

在第四实施方式中，与野生型植物相比，一种或多种转录因子的表达产生具有更高生物量产量的植物。所述提高是与非转基因植物相比较，且这样的提高可以以多种方式测量，与野生型植物相比，植物干重的百分提高，如10％、20％、50％或多于50％的提高。

在第五实施方式中，与野生型植物相比，一种或多种转录因子的表达提高了对选自以下的一种或多种非生物胁迫因子的耐受性：水和/或光的过量或缺乏、高温或低温以及高盐度。所述提高是与非转基因植物相比较，且这样的提高可以以多种方式测量，包括倍数增加或百分增加，如10％、20％、50％或75％。

在第一个方面的第二实施方式或第一实施方式中，所述转录因子由SEQ ID NO:1、2或3的直系同源物、同源物或功能性片段编码。在第一个方面的第三实施方式或其它实施方式中，在植物转化载体中，启动子可操作地与SEQ ID NO:1、2或3的一个或多个核苷酸序列连接。

在第一个方面的第三实施方式或其它实施方式中，与非转基因植物相比，所述植物具有增加的淀粉含量、可溶性糖含量、谷物产量、植物尺寸、器官尺寸、叶片尺寸和/或茎尺寸。

在第一个方面的第四实施方式或其它实施方式中，当与非转基因植物比较时，一种或多种转录因子的表达提高了粮食农作物、饲料农作物或在燃料或工业产品的生产中使用的农作物的产量。

在第二个方面，描述了一种包含编码AP2/ERF或NF-YB转录因子并选自SEQ ID NO:1、2和3的核酸序列的分离的核苷酸序列，其中，所述转录因子在植物中是功能性的，且所述转录因子的表达导致植物中更高的淀粉和/或蔗糖和/或葡萄糖水平。

在第二个方面的第一实施方式中，所述表达导致淀粉、蔗糖和葡萄糖中的一种或多种的更高水平及更高的生物量；或导致淀粉、蔗糖和葡萄糖中的一种或多种的水平更高而没有生物量的明显增加。

在第二个方面的第二实施方式或第二个方面的第一实施方式中，所述核酸序列进一步包含与SEQ ID NO:1、2或3的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列一致性。

在第二个方面的第三实施方式或多种实施方式中，所述植物进一步包括用于所有转录因子表达的时序启动子(temporal promoter)，以使得当所述植物完全生成且种子中储存材料的累积开始时，所述基因过表达。也预期筛选具有这种结果的植物的方法。可选地，预期用于转录因子的期望表达的其它选择启动子。

在第二个方面的第四实施方式或多种实施方式中，与非转基因植物相比，所述转录因子的表达提高了光合作用活性、碳流和/或光合色素的总含量。

在第二个方面的第五实施方式或任意其它实施方式中，所述核酸序列编码SEQ ID NO:4、5或6的多肽。

在第三个方面，描述了一种转录因子，包括选自SEQ ID NO:4、5和6的AP2/ERF或NF-YB转录因子多肽；其中所述转录因子在植物中是有功能的，且所述转录因子的表达增加了转基因植物中的碳流。

在第三个方面的第一实施方式中，所述转录因子在C3或C4双子叶植物、C3或C4单子叶植物中是有功能的。在第三个方面的第二实施方式或任意其它实施方式中，所述多肽序列进一步包含与SEQ ID NO:4、5或6的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列一致性。

在第三个方面的第三实施方式或任意其它实施方式中，与非转基因植物相比，所述增加的碳流是由于增加的生物量产量或者植物组织中增加的淀粉、葡萄糖或蔗糖。

在第三个方面的第四实施方式或任意其它实施方式中，与非转基因植物相比，转录因子的表达提高了光合作用活性、碳流和/或光合色素的总含量。

在第四个方面，描述了获自第一个方面以及所描述的具有100％生物基碳流的任何实施方式的转基因植物的生物基转基因植物产品。在该第四个方面的某些实施方式中，所述产品是具有至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、90％或95％的生物基含量的制品。

在第五个方面，描述了一种产生转基因植物的方法，包括共表达一种或多种AP2/ERF和NF-YB转录因子，其中所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码。

在第六个方面，描述了一种用于在组织培养物中测试植物对不同非生物胁迫因子的反应的方法，用于鉴定对胁迫因子具有提高的耐受性的植物，包括在引起胁迫的一种或多种条件(包括水、光、温度和盐分的不利变化)下将测试植物与权利要求1的转基因植物进行比较。

在第七个方面，描述了用于转化的方法，包括向植物的基因组中并入一种或多种包含本文描述的核苷酸序列的载体。

在第八个方面或第一个方面的任意实施方式中，第一个方面的转基因植物与非转基因植物的产率相比具有提高的光化量子产率。

在第九个方面或第一个方面的任意实施方式中，第一个方面的转基因植物的淀粉含量(即，产量)比非转基因植物的相应淀粉含量提高至少2倍。

在第十个方面或第一个方面的任意实施方式中，第一个方面的转基因植物的淀粉含量比非转基因植物的含量提高至少2倍至约4.3倍。

在第十一个方面或第一个方面的任意实施方式中，第一个方面的转基因植物的叶绿素含量高于非转基因植物的含量，或者转基因植物的叶绿素含量比非转基因植物的含量高至少1.1倍至约2.5倍。

在第十二个方面或第一个方面的任意实施方式中，第一个方面的转基因植物的蔗糖含量高于非转基因植物的含量，或者转基因植物的蔗糖含量比非转基因植物的含量高至少2倍至约4.3倍。

在第十三个方面或第一个方面的任意实施方式中，第一个方面的转基因植物的电子传递速率高于非转基因植物的速率。

在任何方面的进一步实施方式中，所述植物选自柳枝稷、芒属、苜蓿属、甜高粱、高粱、甘蔗、能源甘蔗、象草、玉米、小麦、大麦、燕麦、水稻、大豆、油棕榈、红花、芝麻、亚麻、棉花、向日葵、亚麻荠属、欧洲油菜、埃塞俄比亚芥、芥菜、珍珠稷、粟、其它谷物、油菜籽、蔬菜、饲草、工业植物、木本植物和生物质农作物。

在进一步的实施方式中，可以筛选前述实施方式的转基因植物以鉴定其中总体生物量产量与野生型植物相似但是选自以下的一种或多种性状的水平高于野生型植物的水平的植物：光合色素浓度提高、光合作用效率提高、淀粉和/或蔗糖和/或葡萄糖水平提高、脂肪酸水平提高以及胁迫耐受性提高。例如，可以鉴定生物量产量与野生型植物相似但是淀粉加葡萄糖加蔗糖的累积水平比野生型植物高1.5倍、2倍、5倍、10倍或更高的植物。

在进一步的实施方式中，本文描述了一种用于鉴定可以用于实现一些单独性状改善的特定基因或基因组合的筛选方法。

在一些实施方式中，描述了涉及通过PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1上调中心碳代谢的方法，其导致光合色素和活性的提高，淀粉、可溶性糖和脂肪酸水平提高，以及胁迫耐受性、植物和植物产品的生产力提高。这些方法包括并入一种或多种由SEQ ID NO:1、2和3描述的转录因子及其同源物、直系同源物和功能性片段。例如，所述转基因植物可以包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3，或它们的同源物、直系同源物或功能性片段，或者SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3(包括它们的同源物、直系同源物或功能性片段)的两种或更多种的任意组合(例如，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1的同源物和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1的同源物和SEQ ID NO:2的同源物等)。

在本发明的第十四个方面，描述了包含编码AP2/ERF或NF-YB转录因子家族的一种或多种核苷酸序列的转基因植物或植物的一部分或植物材料或植物种子或植物细胞，其中所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码，其中所述一种或多种转录因子的表达提高了所述转基因植物、植物的一部分、植物材料、植物种子或植物细胞中的碳流。在第十四个方面的第一实施方式中，一种或多种转录因子的表达改善了对选自以下的一种或多种非生物胁迫因子的耐受性：水和/或光的过量或缺乏、高温或低温以及高盐度。在第十四个方面的第二实施方式或该方面的第一实施方式中，所述转录因子由SEQ ID NO:1、2或3编码的直系同源物、同源物或功能性片段编码。在第十四个方面的第三实施方式或该方面的任意实施方式中，所述转基因植物、植物的一部分或植物材料、植物种子或植物细胞进一步包含载体，所述载体包含与SEQ ID NO:1、2或3的一个或多个核苷酸序列可操作地连接的启动子。在第十四个方面的第四实施方式或该方面的任意实施方式中，所述植物选自农作物植物、模式植物、单子叶植物、双子叶植物、具有C3光合作用的植物、具有C4光合作用的植物、一年生植物、多年生植物、柳枝稷植物、玉米植物或甘蔗植物。在第十四个方面的第五实施方式或该方面的任意实施方式中，所述一年生或多年生植物是生物能源植物或生物质植物。在第十四个方面的第六实施方式或该方面的任意实施方式中，一种或多种转录因子的表达提高了光合作用活性、碳流和/或光合色素的总含量。在第十四个方面的第七实施方式或该方面的任意实施方式中，所述增加的碳流导致与非转基因植物相比增加的生物量产量。在第十四个方面的第八实施方式或该方面的任意实施方式中，其中当与非转基因植物相比较时，所述植物具有以下一种或多种的提高：淀粉含量、可溶性糖含量、谷物产量、植物尺寸、器官尺寸、叶片尺寸和/或茎尺寸。在第十四个方面的第九实施方式或该方面的任意实施方式中，当所述一种或多种转录因子的表达导致与非转基因植物相比较粮食农作物、饲料农作物或在燃料或工业产品生产中使用的农作物的产量增加。

在本发明的第十五个方面，描述了一种包含编码AP2/ERF或NF-YB转录因子的核酸序列的分离的核苷酸序列，其中选自SEQ IDNO:1、2和3的所述转录因子在植物中是有功能的，且所述转录因子的表达增加了转基因植物中的碳流。在第十五个方面的第一实施方式中，所述植物选自C3或C4双子叶植物、C3或C4单子叶植物、草本植物、柳枝稷植物、玉米植物或甘蔗植物。在第十五个方面的第二实施方式或本方面的任意实施方式中，所述核酸序列进一步包括与SEQ ID NO:1、2或3的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列一致性。在第十五个方面的第三实施方式或本方面的任意实施方式中，所述增加的生物量产量是由于与非转基因植物相比增加的碳流。在第十五个方面的第四实施方式或本方面的任意实施方式中，当与非转基因植物相比较时，所述转录因子的表达提高了光合作用活性、碳流和/或光合色素的总含量。在第十五个方面的第五实施方式或本方面的任意实施方式中，所述核酸序列编码SEQ ID NO:4、5或6的多肽。在第十五个方面的第六实施方式或本方面的任意实施方式中，所述增加的碳流提高了转基因植物中淀粉、蔗糖和葡萄糖的水平而没有生物量产量的相同的相应提高。

在第十六个方面，描述了一种转录因子，包括选自SEQ ID NO:4、5和6的AP2/ERF或NF-YB转录因子多肽；其中，所述转录因子在植物中是有功能的，且所述转录因子的表达增加了转基因植物中的碳流。在第十六个方面的第一实施方式中，所述植物选自C3或C4双子叶植物、C3或C4单子叶植物、草本植物、或柳枝稷植物、玉米植物或甘蔗植物。在第十六个方面的第二实施方式或本方面的第一实施方式中，所述多肽序列进一步包含与SEQ ID NO:4、5或6的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列一致性。在第十六个方面的第三实施方式或本方面的第一或第二实施方式中，所述增加的生物量产量是由于与非转基因植物相比增加的碳流。在第十六个方面的第四实施方式或本方面的第一、第二或第三实施方式中，当与非转基因植物相比较时，所述转录因子的表达提高了光合作用活性、碳流和/或光合色素的总含量。

在第十七个方面，描述了一种用于生产转基因种子的方法，所述转基因种子用于产生具有增强的性状的转基因植物的农作物，所述增强的性状由SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列编码的一种或多种转录因子或其同源物、直系同源物或功能性片段的表达产生；所述方法包括：a)筛选用用于增强的性状的转录因子转化的植物群体；b)从所述群体中选择展示所述状态的一个或多个植物；以及c)收集所选择的植物的种子。在第十七个方面的第一实施方式中，所述种子是玉米种子或高粱种子，且所述增强的性状是种子碳含量。

在第十八个方面，描述了一种产生转基因植物的方法，包括在植物中共表达一种或多种AP2/ERF和NF-YB转录因子，其中所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码。

在第十九个方面，描述了一种用于在组织培养物中测试植物对不同胁迫因子的反应的方法，用于鉴定对胁迫因子具有增强的耐受性的植物，包括在引起胁迫的一种或多种条件(包括水、光、温度和盐度的变化)下将测试植物与第十四个方面的转基因植物进行比较。在第十七、十八或十九个方面的实施方式中，进一步包括向植物中引入一种或多种包含本发明的核苷酸序列的载体。

在上述的任意方面或实施方式中，所述植物的光化量子产率比对应的非转基因植物的产率高至少2倍。在上述的任意方面或实施方式中，所述植物的淀粉产量比对应的非转基因植物的含量增加至少2倍。在上述的任意方面或实施方式中，所述植物的淀粉产量比对应的非转基因植物的含量增加了至少2倍至约4.5倍。在上述的任意方面或实施方式中，所述植物的叶绿素含量比对应的非转基因植物的含量高1.5倍。在上述的任意方面或实施方式中，所述植物的叶绿素含量比对应的非转基因植物的含量高至少1.5倍至约2.5倍。在上述的任意方面或实施方式中，所述植物的蔗糖含量比对应的非转基因植物的含量高至少1.5倍。在上述的任意方面或实施方式中，所述植物的蔗糖含量比对应的非转基因植物的含量至少高2倍至约4.3倍。在上述的任意方面或实施方式中，所述植物的植物生长率比对应的非转基因植物的生长率提高至少10％。在上述的任意方面或实施方式中，所述植物是柳枝稷、玉米或甘蔗。

在第二十个方面，描述了一种与对照的非转基因植物相比增强转基因植物中的性状的方法，包括：a)增加编码来自AP2/ERF和NF-YB家族的转录因子的至少一种核酸序列的表达，所述核酸序列选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核酸序列或它们的直系同源物、同源物或功能性片段；以及b)选择与对照植物相比具有增强的性状的转基因植物。在第二十个方面的第一实施方式中，所述性状选自以下的一种或多种：碳流、初级代谢产物、对一种或多种非生物胁迫因子的耐受性以及一种或多种光合色素。

在第二十一个方面，描述了一种与对应的非转基因植物相比具有性状改变的转基因植物，所述转基因植物包含一种或多种编码AP2/ERF或NF-YB转录因子的核苷酸序列；其中，所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其直系同源物、同源物或功能性片段编码；其中，所述性状改变选自以下的一种或多种：碳流，光合色素的水平，光合作用能力，植物组织中淀粉、蔗糖和葡萄糖的水平，植物组织中脂肪酸的水平，生物量生长率和产量以及胁迫耐受性。在第二十一个方面的第一实施方式中，所述性状改变是淀粉或可溶性糖的产量高于3倍，而生物量产量的增加低于1.5倍。

在第二十二个方面，描述了一种具有提高的非结构碳水化合物含量的转基因玉米植物，包括a)向植物细胞中引入一种或多种编码AP2/ERF和/或NF-YB转录因子的核苷酸序列，其中，所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其直系同源物、同源物或功能性片段编码；和b)从与对应的非转基因植物相比具有增加的非结构碳水化合物含量的植物细胞产生转基因植物。在本方面的第一实施方式中，从转基因玉米或高粱植物获得种子或植物组织。

在第二十三个方面，描述了一种鉴定抗干旱和抗盐的转基因植物的方法，所述转基因植物具有一种或多种编码AP2/ERF和/或NF-YB转录因子的核苷酸序列，其中，所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其直系同源物、同源物或功能性片段编码；所述方法包括：a)在干旱和盐分胁迫的条件下生长一转基因和野生型植物的群体；b)选择对干旱和盐分展现出耐受性的转基因植物，从而鉴定包含与干旱和盐分的耐受性相关的基因型的转基因植物。

附图说明

前述内容从下面的如在所附的附图中所说明的本发明示例实施方式的更具体的描述中变得显而易见，其中在不同的视图中相似的附图标记表示相似的部件。这些附图不是必然按比例绘制，相反重点应当放在阐明本发明的实施方式上。

图1示意地图示了柳枝稷转录因子PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的转录调控网络模型以及它们与改善的植物生产力和胁迫耐受性的相关性。粗箭头说明了由所述转录因子直接调控的观察到的增加的碳流，而小箭头指示用于调控主要代谢途径中的关键基因的与下游TF的相互作用。

图2图示了通过RT-PCR分析的野生型柳枝稷中转录因子基因PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的组织特异性表达模式。从野生型植物的根(R)、嫩叶(YL)、秆(C)、成熟叶(ML)、叶鞘(LS)和/或圆锥花序(P)分离总RNA，并使用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen)和对于TF基因的编码区特异性的引物进行逆转录和PCR。

图3证明了通过DNA印记杂交检测到的柳枝稷基因组中与转录因子基因PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1同源的基因的存在。如之前描述的进行基因组DNA分离、用EcoRI消化和与对于转录因子基因的编码区特异性的探针杂交(Somleva等,2008,Plant Biotechnol J,6:663-678)。16和56，白杨基因型(我们指定)。

图4A-C显示了柳枝稷(Panicum virgatum L.)和其它植物物种中PvSTR1(图4A)、PvSTIF1(图4B)和PvBMY1(图4C)的保守域的多序列比对。方框中显示了使用clustal W程序(Thompson等,1994,Nucleic Acids Res.11:4673-4680)获得的DNA结合域序列(STIF1和STR1的AP2/ERF以及BMY1的NFYB-HAP3)的比对。

图5图示了基于PvSTR1(A)、PvSTIF1(B)和PvBMY1(C)的保守域，高等植物分类(包括单子叶和双子叶物种)之间可能的系统发生关系。

图6显示了携带TF基因和标记基因bar的载体pMBXS809(A)、pMBXS810(B)和pMBXS855(C)。

图7描述了携带TF基因和标记基因hptII的载体pMBXS881(A)、pMBXS882(B)和pMBXS883(C)。

图8显示了在转移至土壤之前，转基因柳枝稷植物中转录因子基因PvSTR1(A)、PvSTIF1(B)和PvBMY1(C)过表达的qRT-PCR(定量反转录聚合酶链式反应或实时RT-PCR)分析的结果。β-肌动蛋白扩增用于转录本归一化。WT1，从来自基因型16的非转化成熟颖果来源的愈伤组织培养物再生的植物；WT2，从来自基因型56的非转化未成熟花序来源的培养物再生的植物；1-5，代表独立转化情况的转基因株系。数据表示为平均值±SE(n＝3)。

图9显示了来自转基因和野生型柳枝稷植物的总蛋白的蛋白质印记。A：用抗光系统I(LhcA3)和光系统II(LhcB5)的光捕获中心的蛋白的抗体孵育的来自PvSTR1和PvSTIF1株系的蛋白提取物(每泳道6μg)。β-肌动蛋白用作上样对照。B：用抗磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的抗体孵育的来自PvBMY1株系的总蛋白提取物(每泳道6μg)。β-肌动蛋白用作上样对照。如之前描述的进行蛋白分离和膜印记(Somleva等,2008,Plant Biotechnol J,6:663-678)。商业可得的抗体(Agrisera)用于蛋白质检测。超敏感的化学发光底物系统(Thermo Scientific)用于信号发生。泳道：WT-对照，野生型植物；1～4-代表不同TF系的转基因柳枝稷植物。

图10图示了在过表达PvSTR1和PvSTIF1基因的柳枝稷植物中高盐度胁迫对相对水含量(A)、叶绿体Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD)蛋白的丰度(B)和光合色素水平(C)的作用。柱条表示平均值±SD值(n＝3)。

图11图示了大量柳枝稷基因，包括其表达受PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的过表达影响的转录因子。数据表示为调控的直系同源物的总数(A)以及三种TF共同的上调基因数(B)和下调基因数(C)。

图12表示由PvSTR1(A)、PvSTIF1(B)和PvBMY1(C)转录因子调控的差异表达基因的基因本体学分析。基于从万维网bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php获得的信息指定生物功能的描述(由费舍尔精确检验计算的P值)。考虑显示出多于2倍上调的基因以及最高富集的途径用于作图。

具体实施方式

本发明的示例实施方式的描述如下。

1、定义

除非特别说明，本公开包括植物转化、植物育种、微生物学、细胞生物学和重组DNA的所有常规技术，这些技术是本领域技术人员技能范围内的。参见，如，Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,2001；Current Protocols in MolecularBiology,F.M.Ausubel等编辑,1987；Plant Breeding:Principles andProspects,M.D.Hayward等,1993；Current Protocols in ProteinScience,Coligan等编辑,1995,(John Wiley&Sons,Inc.)；Methods inEnzymology系列(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach,M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995。

除非特别注明，技术术语按照常规用法使用。分子生物学中的常见术语的定义可以在Lewin,Genes VII,2001(Oxford UniversityPress)，The Encyclopedia of Molecular Biology,Kendrew等编辑,1999(Wiley-Interscience)以及Molecular Biology and Biotechnology,aComprehensive Desk Reference,Robert A.Meyers编辑,1995(VCHPublishers,Inc),Current Protocols In Molecular Biology,F.M.Ausubel等编辑,1987(Green Publishing),Sambrook and Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001中找到。

本文使用的许多术语在下面的章节中定义和阐明。

如在本文中所使用的，“载体”是其中另一种DNA片段可以插入至其中以使得产生插入的片段的复制的复制子，如质粒、噬菌体或粘粒。本文描述的载体可以是表达载体。

如在本文中所使用的，“表达载体”是包括一种或多种表达控制序列的载体。

如在本文中所使用的，“表达控制序列”是控制和调控另一DNA序列转录和/或翻译的DNA序列。

如在本文中所使用的，“可操作地连接的”表示并入基因构建体中以使得表达控制序列有效地控制感兴趣的编码序列的表达。

如在本文中所使用的，“转化的”和“转染的”包括通过本领域已知的多种技术将核酸(如载体)引入细胞中。

“质粒”由大写字母和/或数字之前和/或之后的小写“p”标明。

术语“植物”以其最广泛的含义使用。它包括但不限制于，木本的、观赏的或装饰性的、农作物或谷类、水果或蔬菜植物的任何物种，以及光合绿藻(如莱茵衣藻)。它也指主要分化成在植物发育的任何阶段存在的结构的多种植物细胞。这样的结构包括但不限于：果实、芽、茎、叶、花瓣等。

术语“植物组织”包括分化的和未分化的植物组织，包括在根、芽、叶、花序、花药、花粉、子房、种子和肿瘤(tumor)中存在的那些，以及培养物中的细胞(如，单一细胞、原生质体、胚、愈伤组织等)。植物组织可以是原位的(in planta)、在器官培养物中、组织培养物中或细胞培养物中。

在本文中使用的术语“植物部分”指植物结构、植物器官或植物组织。

“非天然存在的植物”指在没有人为干预的自然界中不存在的植物。非天然存在的植物包括转基因植物、通过基因工程产生的植物以及由非转基因方式(如传统或标记辅助植物育种)产生的植物。

术语“植物细胞”指包含原生质体和细胞壁的植物结构和生理单元。植物细胞可以是分离的单一细胞或培养细胞的形式，或者作为更高组织化单元(如，植物组织、植物器官或整个植物)的一部分。

术语“植物细胞培养物”指植物单元的培养物，如液体培养基中或固体培养上的原生质体、细胞和细胞群，植物组织和器官中的细胞，微孢子和花粉，花粉管，花药，胚珠，胚囊，接合子以及处于各个发育阶段的胚。

术语“植物材料”指植物的叶、茎、根、花序和花或花部分、果实、花粉、花药、卵细胞、接合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或任何其它部分或产品。

“植物器官”指独特的且明显地结构化和分化的植物部分，如根、茎、叶、花蕾、花序、小穗、小花、种子或胚。

术语“非转基因植物”指尚未用异源核酸进行遗传工程化的植物。这些非转基因植物可以是当进行比较时的测试植物或对照植物，包括野生型植物。

“对应的非转基因植物”指在引入异源核酸之前的植物。该植物可以是测试试植物或对照植物，包括野生型植物。

“性状”指植物或植物部分或细胞或植物材料的形态学、生理学、生物化学和物理学特性或其它区别特征。

术语“性状改变”指与没有表达本发明的多核苷酸或多肽的植物(如野生型植物)相比，由本发明的多核苷酸或多肽的表达所诱导的植物或植物部分或植物细胞的特征的可检测的变化。一些性状改变可以定量地评估，如遗传工程产物的不同代谢产物、蛋白质、色素、木质素、维生素、淀粉、蔗糖、葡萄糖、脂肪酸和其它储存化合物的含量，种子大小和数量，器官尺寸和重量，总植物生物量和产量。

更多感兴趣的性状改变包括对种子(如胚或胚乳)、果实、根、花、叶、茎、芽、幼苗等的性状改变，包括：对环境条件(包括严寒、骤冷、热、干旱、水饱和度、辐射和臭氧)的提高的耐受性、在不良光条件(如，低光照和/或短日长)下改善的生长或感兴趣基因的表达水平的变化。其它可以被改变的表型涉及植物代谢产物的产生，如光合色素产生的变化、增强的或组成改变的蛋白质或油产生(特别是在种子中)、或改变的糖(不溶性的或可溶性的)和/或淀粉组成。可以被改变的物理植物特性包括细胞发育(如毛状体的数量)、果实和种子的尺寸和数量、植物部分(如茎、叶和根)的产量和尺寸、存储期间种子的稳定性、种荚的特性(如脱落的敏感性)、根毛长度和量、节间距或种皮的品质。可以被改变的植物生长特性包括生长速率、种子的萌发率、植物和幼苗的活力、叶和花的老化、雄性不育、单性生殖、开花时间、落花、氮吸收速率、生物量或蒸腾特性、以及植物结构特性，如顶端优势、分枝模式、器官数目、器官确认、器官形状或尺寸。

如在本文中所使用的，“非生物胁迫”包括但不限于由以下任何一种引起的胁迫：干旱、盐分、极端的和非典型的温度、化学毒性和氧化变化。改善植物对非生物胁迫的耐受性的能力对全世界农民有非常大的经济益处，且使得能够在不利条件期间以及在其它情况下可能不能栽培农作物的地域中栽培农作物。

本发明的方法和转基因植物、植物组织、种子和植物细胞

本文描述的是产生转基因植物、植物组织、种子或植物细胞的方法，其中所述植物、植物组织、种子或植物细胞包括在所述植物、植物组织、种子或植物细胞的基因组中并入：编码植物转录因子的多核苷酸以及能够使其表达增加的序列或插入的以增加异源植物转录因子的表达增加的调控序列。

发现由SEQ ID NO:1、2和3编码的转录因子的并入改变了转基因植物中某些基因的表达，并增加了转基因植物的碳流而没有生物量的相应增加。例如，发现转基因植物中非结构碳水化合物的水平(如淀粉、蔗糖和葡萄糖水平)提高超过2倍而生物量没有增加，或者与非结构碳水化合物的增加相比生物量的增加是不显著的。

II.植物中基因表达的转录调控

已知转录因子(TF)涉及多种生物过程，作为其它基因或基因家族的激活子或遏制物起作用，表明了各种转录调控机制在调控下游信号转导途径中的功能。驱动任何植物反应的调控逻辑由信号传导调节子、TF、它们在靶基因的调控区域中的结合位点(顺式调控元件，CRE)和其它调控分子(如染色质修饰剂和小RNA)的组合以及蛋白质和RNA降解机构控制(Krishnan&Pereira,2008,BriefFunct.Genomic.Proteomic.7:264-74)。TF通过TF与各自靶基因的启动子中的对应CRE的特异性结合控制许多靶基因的表达。例如，最近的报告表明，玉米Dof1和MNF因子结合PEPC(光合作用的C4循环中的一种酶)的启动子(在Weissmann&Brutnell,2012,Current Opinion Biotech.23:298-304中综述)。已知几种TF由胁迫诱导，作为激活子或遏制物起作用，表明了各种转录调控机制在调控特定生物学过程和/或途径中的功能。

TF的鉴定和调控域作图：

通过设计的转录因子的靶向基因调控具有用于精确改变表型和加速新的农作物性状形成的巨大潜力。在过去的几年中，很多转录因子已经显示出包含调控域，其能够增加或降低它们的转录和/或DNA结合活性。使得该调控得以发生的机制通常涉及磷酸化、二聚体形成或者与负或正辅因子的相互作用(Facchinetti等,1997,Biochem.J.324:729-736)。然而，不同生物体已经进化有相异的时间和空间转录调控。大体上，时间和空间调控由不同类的DNA结合转录激活蛋白介导。不同于DNA结合域，转录激活域(TAD)具有较少的一级氨基酸序列相似性。TAD已经被分类为酸性的、富含谷氨酸的、富含脯氨酸的和/或富含丝氨酸/苏氨酸的。基于生物信息学分析，我们已经鉴定了本发明的转录因子的推定转录激活域。

通过新的顺式调控元件的空间-时间基因表达

空间-时间基因表达是在发育过程中的特定时间生物体的特定组织内基因的激活。植物启动子已经吸引了越来越多的关注，因为它们在调节与转录因子(TF)相互作用的基因的空间-时间表达中具有不可替代的作用。基因表达的控制主要由位于所调控基因的启动子序列中的顺式调控模块和它们的同源转录因子决定。虽然在剖析和预测顺式调控活性中已经有实质性进展，但我们关于来自多个增强子元件的信息如何汇聚以调控基因表达的理解仍然是困难的。组成型启动子广泛地用于功能性表征转基因植物中的植物基因，但是它们缺乏特异性且对蛋白表达的控制差可能是主要的不利因素。在另一方面，提供了时间或空间的转基因表达的精确调控的启动子通过将靶基因的过表达或敲除靶向于特定组织和/或具体发育阶段而有利于这样的研究。基于启动子的转基因技术早已经应用在小麦中以产生巨大影响，其中转基因植物中热诱导启动子有效地控制转基因的空间-时间表达(Freeman等,2011,Plant Biotech.J.9:788-796)。已经报道了用于气孔中转基因表达的空间-时间控制的模块化合成启动子，其是通过融合来自马铃薯磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的启动子的保卫细胞特异性元件和乙醇诱导基因开关AlcR/alcA(Xiong等,2009,J.Exp.Bot.60:4129–4136)。最近，开发了嵌合诱导系统，其结合了AtMYB60最小启动子的细胞特异性和rd29A启动子对脱水和ABA的正向反应性(Rusconi等,2013,J.Exp.Bot.64:3361–3371)。明显地，该合成的模块响应于对脱水或ABA特异性地上调拟南芥、烟草和西红柿的保卫细胞中的基因表达。同样地，启动子克隆和空间-时间基因表达的后续操作与本发明描述的来自柳枝稷转录因子的转录激活域一起提供了在生物量和生物能源农作物中对新的适应性性状进行遗传工程的优良前景。

IV.植物转化技术

通过本领域已知的核转化的任何方法可以将本发明的转录因子基因引入任何植物的基因组中。在本文的实施例中描述了可用于实施本发明的一系列植物的转化方法。通过本领域已知的用于核和质体转化的任何方法可以将感兴趣的任何其它基因引入任何植物的基因组和/或质体基因组中。感兴趣的其它基因包括除草剂抗性基因、害虫抗性基因、真菌抗性基因、用于提高油产量的基因或用于使得能够产生由所述植物形成的非植物产物的新的代谢途径的基因。使用本领域已知的任何靶向序列和方法可以将任何转基因的产物靶向于一种或多种植物细胞器。

A、用于转录的基因构建体

可在本文描述的方法中使用的DNA构建体包括能够将转基因引入植物中的转化载体。如在本文中所使用的，“转基因的”指已经引入包含异源核苷酸序列的核酸片段的生物体。转基因生物体中的转基因优选是稳定的和可遗传的。异源核酸片段可以整合或不整合至宿主基因组中。

几种植物转化载体选项是可得的，包括在以下文献中所描述的：Gene Transfer to Plants,1995,Potrykus等编辑,Springer-Verlag BerlinHeidelberg New York,Transgenic Plants:A Production System forIndustrial and Pharmaceutical Proteins,1996,Owen等编辑,JohnWiley&Sons Ltd.England,and Methods in Plant Molecular Biology:ALaboratory Course Manual,1995,Maliga等编辑,Cold SpringLaboratory Press,New York。植物转化载体一般包括在5’和3’调控序列(包括启动子、转录终止和/或多聚腺苷酸化信号)转录控制下的一种或多种感兴趣的编码序列，以及选择或筛选标记基因。对于单一转录本的两种或更多种多肽的表达，可以将附加的RNA加工信号和核酶序列设计至构建体中(美国专利第5,519,164号)。这一途径具有在单一基因座设置多个转基因的优势，其有利于后续的植物育种工作。

工程化的微型染色体也可以用于在植物细胞中表达一种或多种基因。通过在整合位点处形成新的端粒，引入细胞中的克隆的端粒重复序列可截断染色体的远端部分。使用该方法，可以通过修剪天然植物染色体的臂和添加用于大插入序列的插入位点制备用于基因转移的载体(Yu等,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:17331-17336；Yu等,2007,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:8924-8929)。

植物中染色体工程的可选途径包括自主植物微型染色体(autonomous plant minichromosome)的体内装配(Carlson等,2007,PLoS Genet.3:1965-74)。植物细胞可以用着丝粒序列转化，并筛选具有重新装配的自主染色体的植物。有用的构建体结合选择标记基因与包含着丝粒卫星和逆转录元件序列和/或其它重复序列的基因组DNA片段。

可用于所描述的发明的另一种途径是工程化性状位点(Engineered Trait Loci,“ETL”)技术(美国专利第6,077,697号，US2006/0143732)。该系统将DNA靶向至植物染色体的异染色质区域，如近端着丝粒染色体的短臂中的臂间异染色质。靶向序列可以包括核糖体DNA(rDNA)或λ噬菌体DNA。臂间DNA区域支持稳定的插入、低重组和高基因表达水平。该技术也可用于植物中多性状的堆叠(US 2006/0246586)。

锌指核酸酶(ZFN)也可用于实施本发明，因为它们允许在植物染色体的特定位点进行双链DNA切割，以使得可以进行靶向基因插入或删除(Shukla等,2009,Nature 459:437-441；Townsend等,2009,Nature 459:442-445)。该途径可以特别地用于本发明，其可以包括天然存在于感兴趣的植物的基因组中的转录因子基因。在这种情况下，ZFN可以用于改变调控感兴趣的TF的表达的序列以增加表达或改变表达的时机以超出在非工程化或野生型植物中发现的表达。

转基因可以构建为编码多功能转录因子，从而通过基因融合技术结合在本文中鉴定为可用于实施所要求保护的发明的转录因子的不同域，其中不同基因的不同域的编码序列在有或没有连接序列的情况下融合，以获得编码具有各单个基因的活性的单一蛋白质的单一基因。可以使用分子进化技术对这样的合成融合基因/TF组合进行进一步优化。

B、用于核转化的基于组织培养物的方法

转化方案以及用于将核苷酸序列引入植物中的方案可以依据预定用于转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶或双子叶植物)而变化。

将核苷酸序列引入植物细胞中并随后插入植物基因组中的合适方法在Somleva&Ali的US2010/0229256A1和Somleva等的US2012/0060413中描述。

根据常规技术，转化的细胞生长为植物。见，如，McCormick等,1986,Plant Cell Rep.5:81-84。然后这些植物可以生长，并用同样转化的品种或不同的品种授粉，并鉴定所得到的具有期望的表型特性组成型表达的杂种。可以生长两代或更多代以保证期望的表型特性的组成型表达是稳定维持的和遗传的，且然后获得确保实现期望的表型特性的组成型表达的收获的种子。

C、原位转化方法

用于原位转化的过程可以是简单的。避免组织培养操作和可能的体细胞无性系变异，且仅需要短的时间以获得转基因植物。但是，这种接种的植物的后代中转化体的频率相对低且是可变的。目前，非常少的物种可以在不存在基于组织培养物的再生系统的情况下常规转化。通过几种原位转化方法可以获得稳定的拟南芥转化体，包括真空渗入(Clough&Bent,1998,The Plant J.16:735-743)、萌发种子的转化(Feldmann&Marks,1987,Mol.Gen.Genet.208:1-9)、花序浸渍法(floral dip)(Clough和Bent,1998,Plant J.16:735-743)以及花序喷雾法(floral spray)(Chung等,2000,Transgenic Res.9:471-476)。已经通过原位转化方法成功转化的其它植物包括油菜籽和萝卜(真空渗入，Ian和Hong,2001,Transgenic Res.,10:363-371；Desfeux等,2000,Plant Physiol.123:895-904)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(真空渗入，Trieu等,2000,Plant J.22:531-541)、亚麻荠属(花序浸渍法，Nguyen等的WO/2009/117555)以及小麦(花序浸渍法，Zale等,2009,Plant Cell Rep.28:903-913)。原位方法也已经用于玉米生殖细胞(花粉，Wang等，2001,Acta Botanica Sin.,43,275-279；Zhang等,2005,Euphytica,144,11-22；雌蕊,Chumakov等.2006,Russian J.Genetics,42,893-897；Mamontova等2010,Russian J.Genetics,46,501-504)和高粱生殖细胞(花粉,Wang等.2007,Biotechnol.Appl.Biochem.,48,79-83)的转化。

D、感兴趣基因的植物转化

使用常规技术可以产生转基因植物以在植物或植物细胞中表达任何感兴趣的基因(Methods in Molecular Biology,2005,286卷,Transgenic Plants:Methods和Protocols,Pena L.,ed.,Humana Press,Inc.Totowa,NJ)。典型地，使用能够再生的外植体进行基因转移或转化以产生完整的、可育的植物。通常，待引入生物体中的DNA或RNA分子是转化载体的部分。可以使用本领域已知的大量这样的载体系统，如质粒。可以对表达系统的成分进行改变，例如，以增加引入的核酸的表达。例如，可以使用截短的序列、核苷酸取代或其它修饰。本领域已知的表达系统可以用于在合适的条件下转化几乎任何植物细胞。包含编码感兴趣基因的DNA分子的转基因优选地稳定转化并整合至宿主细胞的基因组中。转化的细胞优选地再生成完整植物。转化技术的详细描述在本领域技术人员的知识范围内。

1、转录因子的基因

使用转录因子(TF)的农作物改良是一种有希望的途径，因为它们可能在正常和胁迫条件下调控广泛的靶基因(其产物造成植物的农艺性能)。已经在不同农作物物种(双子叶植物和单子叶植物)中报道了TF介导的胁迫耐受性的改善(Hussain等,2011,Biotechnology Prog.27:297-306)。首先的尝试包括拟南芥中AP2/ERF因子CBF1、DREB1A和CBF4的过表达，其导致干旱/盐/寒冷耐受性(Jaglo-Ottosen等,1998,Science 280:104-106)。此后，已经在许多农作物植物中鉴定了CBF/DREB的直系同源基因，且功能性测试揭示了功能的保守性(在Xu等,2011.J.Int.Plant Biol.53:570–585中综述)。除了提高的胁迫耐受性，也已经证明这些TF基因的异位过表达引起一些特定表型变化-黑-绿色，已经获得具有更高水平的可溶性糖和脯氨酸的矮化植物。更近期的证据表明AP2家族蛋白SHINE/WAX INDUCER 1(SHN)作为细胞壁生物合成的总体水平调节子的作用，这对于从木质纤维素作物生产生物燃料可能具有经济价值(Ambavaram等,2011,Plant Physiol.155:916–931)。

在模式植物的研究中，已经显示出属于AP2/ERF、NF-Y、bZIP、MYB、锌指和NAC家族的转录因子赋予对生物胁迫和非生物胁迫两者的耐受性。比较基因组学也已经用于寻找在模式植物(主要为拟南芥)和农作物植物(如水稻和玉米)之间具有保守功能的基因，证明了一起使用双子叶-单子叶模型的用途。例如，拟南芥AP2/ERF样转录因子在水稻中的表达导致叶生物量和维管束鞘细胞的增加，这可能导致提高的光合同化作用和效率(Karaba等,2009,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104:15270-15275)。

2、报告基因和选择标记基因

报告基因或选择标记基因可以包括在美国专利申请20100229256和20120060413中描述的表达盒中，这两份申请通过引用的方式结合至本文中。包括与感兴趣的异源核苷酸序列可操作地连接的启动子序列的表达盒可以用于通过上述任何方法转化任何植物。对于一系列不同农作物物种有用的选择标记基因和选择转基因株系的方法在本文的实施例中描述。

E、植物中的转基因表达

可以选择植物启动子以控制转基因在不同植物组织或细胞器中的表达，用于全部这些的方法是本领域技术人员已知的(Gasser&Fraley,1989,Science 244:1293-1299)。在一种实施方式中，从已知在植物和藻类中产生高水平表达的真核或合成起源的启动子中选择启动子。在优选的实施方式中，从已知在单子叶植物中提供高水平表达的启动子中选择启动子。

1、诱导型启动子

化学物质调控的启动子可经由应用外源化学调节剂调节植物中基因的表达。取决于目的，启动子可以是化学诱导启动子(其中化学物质的应用诱导基因表达)或者是化学阻遏启动子(其中化学物质的应用抑制基因表达)。化学诱导启动子是本领域已知的，且包括但不限于：玉米1n2-2启动子(其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉米GST启动子(由用作出土前除草剂的疏水性亲电子化合物激活)以及烟草PR-1启动子(由水杨酸激活)。其它化学物质调控的启动子包括类固醇反应性启动子，见，例如，糖皮质激素诱导启动子(Schena等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-10425；McNellis等,1998,Plant J.14:247-257)，以及四环素诱导和四环素阻遏启动子(见，例如，Gatz等,1991,Mol.Gen.Genet.227:229-237；美国专利第5,814,618和5,789,156号，它们的全部内容通过引用的方式结合至本文)。

最近已经报道了适用于植物代谢工程的三组分渗透压诱导表达系统(Feng等,2011,PLoS ONE 6:1-9)。

2、组成型启动子

组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子以及在WO 99/43838和美国专利第6,072,050号中公开的其它组成型启动子的核心启动子、核心CaMV 35S启动子(Odell等,1985,Nature 313:810-812)、水稻肌动蛋白启动子(McElroy等,1990,Plant Cell 2:163-171)、泛素启动子(Christensen等,1989,Plant Mol.Biol.12:619-632；Christensen等,1992,Plant Mol.Biol.18:675-689)、pEMU启动子(Last等,1991,Theor.Appl.Genet.81:581-588)、MAS启动子(Velten等,1984,EMBOJ.3:2723-2730)和ALS启动子(美国专利第5,659,026号)。其它组成型启动子在美国专利第5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463和5,608,142号中描述。

3、弱启动子

当期望低水平表达时，可以使用弱启动子。通常，术语“弱启动子”意味着描述以低水平驱动编码序列的表达的启动子。当启动子以不可接受的高水平表达时，可以删除或修饰启动子序列的部分以降低表达水平。这样的弱组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子(WO 99/43838和美国专利第6,072,050号)。

4、组织特异性启动子

“组织优先的”启动子可以用于将基因表达靶定于特定组织中。与化学诱导系统相比，发育和空间调控的刺激较少地依赖于外部因子渗透入植物细胞中。组织优先的启动子包括由以下所描述的那些：Van Ex等,2009,Plant Cell Rep.28:1509-1520；Yamamoto等,1997,Plant J.12:255-265；Kawamata等,1997,Plant Cell Physiol.38:792-803；Hansen等,1997,Mol.Gen.Genet.254:337-343；Russell等,199),Transgenic Res.6:157-168；Rinehart等,1996,Plant Physiol.112:1331-1341；Van Camp等,1996,Plant Physiol.112:525-535；Canevascini等,1996,Plant Physiol.112:513-524；Yamamoto等,1994,Plant Cell Physiol.35:773-778；Lam,1994,Results Probl.Cell Differ.20:181-196,Orozco等,1993,Plant Mol.Biol.23:1129-1138；Matsuoka等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9586-9590和Guevara-Garcia等,1993,Plant J.4:495-505。如果需要，这样的启动子可以被修饰用于弱表达。

4.i.种子/胚特异性启动子

“种子优先的”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子，如种子存储蛋白的启动子)以及“种子萌发”启动子(在种子萌发期间有活性的那些启动子)。见，Thompson等,1989,BioEssays 10:108-113，其通过引用的方式结合至本文。这样的种子优先启动子包括但不限于：Cim1(细胞分裂素诱导信息)、cZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)、milps(肌醇-1-磷酸合酶)和celA(纤维素合成酶)。γ-玉米蛋白是优选的胚乳特异性启动子。Glob-1是优选的胚特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：豆类β-菜豆球蛋白、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米醇白、蜡状(waxy)、皱缩(shrunken)1、皱缩2和球蛋白1。晚期胚胎发生丰富蛋白基因LEA的阶段特异性发育启动子已经成功地用于驱动种子终止子技术中晚期胚胎发生阶段的致死基因的切除介导表达的重组系统(Oliver等的美国专利第5,723,765号)。

4.ii.叶特异性启动子

叶特异性启动子是本领域已知的。见，如，WO/2011/041499和Thilmony等的美国专利第2011/0179511 A1号；Yamamoto等,1997,Plant J.12:255-265；Kwon等,1994,Plant Physiol.105:357-367；Yamamoto等,1994,Plant Cell Physiol.35:773-778；Gotor等,1993,Plant J.3:509-518；Orozco等,1993,Plant Mol.Biol.23:1129-1138和Matsuoka等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9586-9590。

4.iii.时序特异性启动子

也设想可以在发育时间框架中使用的时序启动子，例如，在植物达到成熟期之后在叶中打开以增加碳流的启动子。

4.iv.花药/花粉特异性启动子

已经鉴定了在花药和/或花粉中特异性表达的多种基因，并且已经表征了它们在花粉发育和能育性中的功能。已经发现这些基因的特异性主要在转录水平上由它们的启动子调控(Ariizumi等,2002,Plant Cell Rep.21:90-96及其中引用的参考文献)。已经分离了来自不同植物物种的大量花药和/或花粉特异性启动子和它们的关键顺式元件并进行功能性分析。

4.v.花特异性启动子

花优先的启动子包括但不限于CHS(Liu等,2011,Plant Cell Rep.30:2187-2194)、OsMADS45(Bai等,2008,Transgenic Res.17:1035-1043)、PSC(Liu等,2008,Plant Cell Rep.27:995-1004)、LEAFY、AGAMOUS和AP1(Van Ex等,2009,Plant Cell Rep.28:1509-1520)、AP1(Verweire等,2007,Plant Physiol.145:1220-1231)、PtAGIP(Yang等,2011,Plant Mol.Biol.Rep.29:162-170)、Lem1(Somleva&Blechl,2005,Cereal Res.Comm.33:665-671；Skadsen等,2002,Plant Mol.Biol.45:545-555)、Lem2(Abebe等,2005,Plant Biotechnol.J.4:35-44)、AGL6和AGL13(Schauer等,2009,Plant J.59:987-1000)。

4.vi.启动子的组合

一些实施方式使用具有携带多于一个启动子的多基因表达构建体的转基因植物或植物细胞。这些启动子可以是相同的或不同的。

任何所描述的启动子可以用于控制本发明的一种或多种转录因子基因、它们的同源物和/或直系同源物以及任何其它感兴趣基因以限定的时空方式的表达。

F、用于构建植物表达盒的需要

意图用于在转基因植物中表达的核酸序列首先在表达盒中在植物中活性的合适启动子之后装配。所述表达盒可以包括转基因表达所需要或选择的任何其它序列。这样的序列包括但不限于：转录终止子、增强表达的外来序列(如内含子)、重要序列和意图用于将基因产物靶向于特定细胞器和细胞区室的序列。然后，这些表达盒可以转移至以下描述的植物转化载体。下面是典型表达盒的各种不同成分的描述。

1、转录终止子

多种转录终止子可用在表达盒中。它们负责地转基因之外转录的终止和转录本的正确腺苷酸化。合适的转录终止子是已知在植物中起作用的那些，且包括CaMV 35S终止子、tm1终止子、胭脂碱合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。这些用于单子叶植物和双子叶植物中。

2、用于增强或调控表达的序列

已经在转录单元中发现了增强基因表达的多种序列，且这些序列可以与所述基因结合使用以增加它们在转基因植物中的表达。例如，各种内含子序列(如玉米Adh1基因的内含子)已经显示出增强表达，特别是在单子叶植物细胞中。此外，还已知来源于病毒的多种非翻译的前导序列增强表达，且这些在双子叶植物细胞中特别有效。

G、编码序列优化

通过改变编码序列用于在感兴趣的农作物物种中的最佳表达，可以对所选择的基因的编码序列进行遗传工程改造。用于改变编码序列以实现在特定农作物物种中的最佳表达的方法是公知的(Perlak等,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3324和Koziel等,1993,Biotechnology 11:194-200)。

H、植物转化载体的构建

植物转化领域的技术人员已知多种可用于植物转化的载体。与本公开相关的基因可以与任何这样的载体结合使用。载体的选择取决于选择的转化技术和目标物种。

许多载体可用于使用根癌农杆菌的转化。它们典型地携带有至少一个T-DNA序列并包括如pBIN19的载体。适用于农杆菌转化的典型载体包括二元载体pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB10及其潮霉素选择衍生物(见，例如，美国专利第5,639,949号)。

不使用根癌农杆菌的转化避免在选择的转化载体中对T-DNA序列的需要，且因此，除了如上所述的包含T-DNA序列的载体之外，使用缺少这些序列的载体。用于不依赖于农杆菌的转化技术的载体的选择很大程度取决于转化的物种的优先选择。适合于非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG 19和pSOG35(见，如美国专利第5,639,949号)。

I、培养物和植物的转化和筛选

可以转化植物培养物并使用本领域技术人员公知的上述一种或多种方法进行选择。在柳枝稷中，选择通过在含有双丙氨膦的愈伤组织生长培养基上孵育培养物进行。在可选的实施方式中，可以在存在潮霉素的情况下进行选择。然后在包含优先选择剂的再生培养基上培养抗性愈伤组织(Somleva,2006,Agrobacterium Protocols,Wang K.,ed.,卷2,65-74页,Humana Press；Somleva等,2002,CropSci.42:2080-2087)。用于多种农作物物种的特异性选择标记的例子和转基因植物筛选方法在本文的实施例中描述。

实施例

实施例1：潜在地涉及光合作用和生物量相关性状的候选转录因子基因的鉴定和功能表征。

以下途径用于鉴定和注释潜在的柳枝稷转录因子(TF)：

A、基于系统生物学途径的基因预测

已经基于全基因组表达谱开发的水稻调控关联网络(Ambavaram等,2011,Plant Physiol.155:916–931)用于鉴定在光合作用和生物量相关性状中涉及的基因的调控中具有预测的功能的TF的柳枝稷直系同源物。公开可得的数据库用于进行水稻(C3单子叶植物，http://rice.plantbiology.msu.edu)、玉米(具有NADP-ME亚型C4光合作用的单子叶植物，在万维网maizesequence.org中找到)和柳枝稷(NAD-ME C4单子叶植物，phytozome.net/search.php？show＝blast&org＝Org_Pvirgatum)基因组之间的BlastN和BlastP相互检索，以鉴定用于功能验证和实验分析的候选基因。来自分子功能分类的基因本体学(GO)项的比较揭示了所鉴定的TF的DNA结合和转录调控活性的最明显功能。

基于全基因组直系同源性预测，从相应网站获取候选基因并评估它们的一致性百分比(表1)。

表1：候选转录因子基因

B、选择的柳枝稷TF的功能注释

根据植物转录因子数据库(见万维网planttfdb.cbi.edu.cn)和柳枝稷基因组(万维网phytozome.net)，SEQ ID NO:1(Pavirv00046166m)和SEQ ID NO:2(Pavirv00013751m)是属于APETALA2(AP2)/ETHYLENE RESPONSE FACTOR(ERF)家族的柳枝稷转录因子，和SEQ ID NO:3(Pavirv00029298m)是来自Nuclear-Factor Y(NF-YB)家族的柳枝稷转录因子。使用蛋白质结构域、家族和功能位点的数据库(万维网expacy.org)分析它们的蛋白序列分别揭示了特征性的AP2域(SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，下划线)和NFYA-HAP2基序(SEQ ID NO:6，下划线)。对于柳枝稷基因SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的基因本体学项的比较揭示了“转录因子”活性(GO:0003700)，而根据其序列特异转录调控子活性(GO:00030528)，SEQ ID NO:3属于MNF。根据TF功能关联网络，这些柳枝稷直系同源TF基因可能与“初级”碳代谢和几种“细胞代谢”过程中的功能有关。

C、柳枝稷中新转录因子的表达分析

为验证生物信息学的发现，通过RT-PCR分析柳枝稷中候选TF基因(表1)的组织特异性表达。从野生型的根(R)、秆(C)、叶鞘(LS)、嫩叶(YL)、成熟叶(ML)和圆锥花序(P)组织分离总RNA。在用DNA酶处理和柱纯化之后，将总RNA(每个反应200ng)进行逆转录，并用基因特异性引物在一步RT-PCR分析(Qiagen)中进行PCR。

该结果揭示了候选TF基因(在表1中列出)在嫩叶和成熟叶、根和茎组织(秆、叶鞘和圆锥花序)中表达水平的差异。基于它们的表达模式，我们鉴定了三种在成熟叶中高表达的基因，并选择这三种基因(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)用于在柳枝稷中进行过表达和进行功能分析。在成熟叶中观察到这三种基因的最高转录本累积(图2)。在试验条件下，在根中没有检测到选择的AP2/ERF转录因子(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的表达，而柳枝稷NF-Y基因(SEQ ID NO:3)的转录本在所有分析的组织中以不同水平存在(图2)。

根据这些TF对植物代谢和表型的作用(见实施例5)，将基因和编码的多肽命名为PvSTR1(淀粉调节子1；SEQ ID NO:1和SEQID NO:4)、PvSTIF1(胁迫诱导因子1；SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5)和PvBMY1(生物量产量1，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6)。

D、PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1转录因子的同源基因的鉴定

通过使用tBLASTN将PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的推导氨基酸序列与在万维网blast.ncbi.nlm.nih.gov和phytozome.net上发现的翻译的非冗余核苷酸数据库进行比较以及使用BLASTP将其与蛋白质数据库进行比较从而进行序列同源性检索。与本发明的转录因子同源的转录因子基因将通常具有其保守域或全部编码区的与SEQID NO:4-6具有80％或更高一致性的多肽序列。如在本文中所使用的，“同源物”表示与另一种蛋白执行相同的生物功能的蛋白质，包括通过序列一致性检索鉴定的这些。计算机模拟分析导致本发明的三种转录因子各自的几种同源物的鉴定，对于PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的同源物分别命名为PvSTR2-5(SEQ ID NO:7-10)、PvSTIF2-4(SEQ ID NO:11-13)和PvBMY2-6(SEQ ID NO:14-18)。

通过DNA印记杂交也测定了柳枝稷基因组中每种TF基因的拷贝数。研究了来自柳枝稷栽培种的两种基因型Alamo-56和16(我们命名)。来自这些基因型的愈伤组织培养物用于柳枝稷转化的所有试验中(如在实施例3中所描述的)。结果揭示了在所分析的两种基因型中存在相同数目的PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的同源物(图3)。

基于已有的序列相似性，包括相同DNA结合域的存在，可以容易地测试鉴定的同源基因PvSTR2-5、PvSTIF2-4和PvBMY2-6的过表达对于与由PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1诱导的那些相似的性状改变。

E、PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1转录因子的直系同源基因的鉴定

“直系同源”和“旁系同源”指与所要求保护的序列同源的多核苷酸序列和多肽序列。这些基因是相关的，因为它们起源于共同的祖先基因，且在进化过程中可能保留相似功能。直系同源物是在由物种形成而衍生的不同物种中结构相关的基因，而旁系同源物是在由遗传复制而衍生的相同物种中的结构相关基因。基于完整系列保守域的百分相似性或一致性鉴定直系同源基因。密切相关的转录因子可以共有大约70％、75％或大约80％或更高的氨基酸序列一致性。具有充分相似性的序列也可以结合转录调控元件的相同DNA结合位点。

使用本领域公知的方法鉴定柳枝稷转录因子基因PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的直系同源物。图4中显示了来自不同植物物种的具有多于75％、80％、85％、超过90％一致性的保守结合域的直系同源多肽序列。也基于PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的保守域序列评估系统发生关系(图5)。

实施例2：用于柳枝稷中转录因子基因过表达的转化载体的设计和构建。

使用广泛可得的遗传成分和标准的分子生物学技术制备所有基因构建体。将每一种基因克隆到单个表达盒中，并将2-5个表达盒装配到用于植物转化的一个载体中。

制备了两组基因构建体用于在柳枝稷中过表达本发明的转录因子基因，一组包含bar基因(赋予双丙氨膦抗性)作为选择标记，另一组具有hptII基因(赋予潮霉素抗性)(表2，图6和7)。

表2：用于表达转录因子和PHB生物合成基因的植物转化载体的总结

¹由与玉米hsp70内含子融合的玉米cab-m5启动子驱动；²由35S启动子驱动。

载体pMBXS809、pMBXS810和pMBXS855(图6)用于为产生转基因株系的柳枝稷的农杆菌介导的转化，所述转基因株系用于新转录因子的功能分析(见实施例3)。在每种载体中，转录因子基因在与热休克蛋白70(hsp70)内含子(美国专利第5593874号)融合的玉米叶绿素a/b结合蛋白的cab-m5光诱导启动子的控制下(Sullivan等,1989,Mol.Gen.Genet.215:431-440；Becker等,1992,Plant Mol.Biol.20:49-60)，而所述标记基因由35S启动子驱动(表2)。

在载体pMBXS809、pMBXS810和pMBXS855中装配的基因和遗传元件的注释在表3中呈现(也见图6和7)。

表3：用于在柳枝稷中过表达转录因子基因PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的植物转化载体

*所有的载体基于在万维网cambia.org中找到的转化载体pCambia3300；bar基因(赋予双丙氨膦抗性)用作选择转化的愈伤组织培养物和植物的标记。

实施例3：柳枝稷的转化

从不同外植体开始的高度胚发生性愈伤组织培养物用于在实施例2中描述的基因构建体的引入。

培养物的起始和植物再生

根据之前公开的方法(Denchev&Conger,1994,Crop Sci.,34:1623–1627)从cv.Alamo的成熟颖果开始愈伤组织培养。如之前描述的(Somleva等的美国专利第8487159号)评估它们的胚发生潜能和植物再生能力。

在温室条件下生长的来自Alamo基因型56的柳枝稷植物(Somleva等,2008,Plant Biotechol.J.6:663-678；Somleva等的美国专利第8487159号)用于开始未成熟花序来源的愈伤组织培养物。根据之前公开的方法(Alexandrova等,1996,Crop Sci.36:175-178)，具有3-4个可视节的拔节分蘖株的顶部秆节用于组织培养物中的花序发育。愈伤组织培养物起始于来自体外发育的圆锥花序的单个小穗，并通过每四周转移至用于愈伤组织生长的新鲜培养基上而增殖(Denchev和Conger,1994,Crop Sci.34:1623-1627)。

愈伤组织培养物在27℃下在黑暗中生长，并通过在用于愈伤组织生长的新鲜培养基上按月分培养而维持(Somleva等,2002,CropSci.42:2080-2087)。对于植物再生，将愈伤组织接种在补充有1.4μM赤霉酸的MS基础培养基上，并在27℃下以16h光周期(冷白色荧光灯泡，80μmol/m²/s)孵育。

成熟颖果来源的和未成熟花序来源的培养物的转化

根据之前公开的方案(Somleva等,2002,Crop Sci.42:2080-2087；Somleva,2006,Agrobacterium Protocols,Wang K.,ed.,65-74页:Humana Press)用根癌农杆菌转化高度胚发生性愈伤组织培养物。转化的培养物和从它们再生的植物用200mg/L潮霉素(WO2010/102220 A1和Somleva&Ali的US 2010/0229256 A1)或10mg/L双丙氨膦(Somleva等,2002,Crop Sci.42:2080-2087；Somleva,2006,Agrobacterium Protocols,Wang K.,ed.,65-74页:Humana Press)进行选择。过表达转录因子基因PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的转基因植物从用载体pMBXS809、pMBXS810和pMBXS855转化的培养物获得(表2)。通过使用对转基因的编码区特异性的引物和之前描述的扩增条件(Somleva等,Plant Biotechol.J.6:663-678)的PCR确认推定的转化体中转录因子和标记基因的存在。鉴定了代表58个独立转化事件的多于200株T₀植物(表4)。从未转化的愈伤组织培养物再生的并在相同条件下生长的植物用作转基因株系的表达和功能分析中的对照(非转基因植物；野生型植物)。

表4：用于在柳枝稷中过表达转录因子的转化

¹转化来自该基因型的未成熟花序来源的愈伤组织培养物；²转化来自该基因型的成熟颖果来源的愈伤组织培养物；³产生至少一株转基因植物的双丙氨膦抗性的愈伤组织系的数目；⁴原代转化体的数目(通过PCR确认)。

在转移至土壤之后，从不同的转化试验获得的转基因和野生型植物在温室中27℃/24℃(白天/黑夜)下以补充光照(16h光周期，卤化钠灯)生长。

实施例4：用编码转录因子PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的基因转化的转基因柳枝稷植物的表达分析。

在所有试验中，在转移至土壤之前，使用RNeasy植物小量试剂盒(Qiagen)从原代转化体和对照野生型植物(每系3株)的次最嫩叶分离总RNA。在用DNA酶处理和柱纯化之后，不同量的RNA用于RT-PCR和qRT-PCR(定量逆转录聚合酶链式反应或实时RT-PCR)。使用β-肌动蛋白作为参考物，通过qRT-PCR进行转基因和对照株系中TF基因的表达水平差异的定量分析。对于每一样品，使用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-Rad)将500ng的总RNA转化成cDNA。将cDNA稀释，并在Applied Biosystems 750 Fast Real-Time PCR系统中使用FastGreen Master Mix(Life Technologies)进行实时PCR。生成每一株系的扩增曲线，并用于计算与野生型对照相比的相对表达率(倍数变化)。如与对照植物转录本累积相比，所有分析的转基因株系显示出转录因子基因在转基因株系中显著更高的表达水平(如在图8中所示的3-9.5倍高)。

实施例5：转录因子PvSTR、PvSTIF1和PvBMY1的过表达对于转基因柳枝稷植物中生物质产生和光合作用活性的作用。

为了PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1转录因子的功能表征，用在土壤中生长两个月的转基因和对照野生型柳枝稷进行生物化学和生理学分析。两组植物均来自于形态不同的两种Alamo基因型-56和16(我们的命名)。

光合作用活性的测量

为分析过表达本发明的TF基因的植物中的光合作用速率，使用Dual-PAM-100测量系统(Heinz Walz GmbH)在光适应叶中测量各种参数。用与具有第四新生叶的营养分蘖株的底部开始第二节相连的叶进行所有测量。

就光化学量子产率(Y)和电子传递速率(ETR)研究光系统I(PSI)和光系统II(PSII)的机能。鉴定了与来自对应基因型的野生型对照相比具有改善的光合作用能力的转基因株系(对于PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1株系的结果分别总结在表5中)。在一些分析的转基因植物中，在30-37μmol m^-2 s^-1的光合活性辐射(PAR)下，PSI和PSII的量子产率明显增加(表5)。在PAR≥119μmol m^-2 s^-1时，与野生型对照植物相比，一些转基因植物中PSI和PSII的电子传递速率明显提高(表5)。

表5：转录因子的过表达对光合作用的作用

¹在单个转基因柳枝稷植物中测量的最大值；²按基因型、生长期和取样日期，与在对应的野生型对照中测量的平均值相比(5-6株植物；每株植物2-3次测量)；缩写：Y(I)，光系统I(PSI)的光化量子产率-反映PSI反应中心的量子能量吸收的效率；Y(II)，光系统II(PSII)的有效量子产率-表示吸收的量子由PSII反应中心转化成化学固定的能量的部分(从0-1)(其它部分的量子耗散成热和荧光)；ETR(I)，PSI的电子传递速率-表示电子从激发的反应中心叶绿素a分子至电子受体的循环传递或非循环传递的速率；ETR(II)，PSII的电子传递速率-反映非循环电子转移的效率。

由于C4植物中PSII的量子产率与CO₂固定之间的线性关系(Leipner等,1999,Environ.Exp.Bot.42:129-139；Krall&Edwards,1992,Physiol.Plant.86:180-187)，数据表明转录因子的过表达导致光合作用总体速率的提高(表5)。由于C4物种中缺少光呼吸，基于光合作用速率和ETR之间的线性关系，这一意见得到电子传递速率的显著提高(表5)的支持(Kakani等,2008,Photosynthetica 46:420-430)。此外，一些转基因系中提高的PSI的ETR(表5)可以指示PSI周围增加的循环电子传递，其提供了C4光合作用的CO₂固定循环所需的额外的ATP(Kiirats等.2010,Photosynth.Res.105:89-99)。

在测量光合作用活性之后，对叶片取样并用于测定初级代谢产物和光合色素的含量以及用于RNA和蛋白质的分离。

初级代谢产物

在液氮中研磨叶组织并冻干3天。得到的叶粉末用于测量初级代谢产物的水平，所述测量使用不同的分析方法：用于淀粉的定量的酶分析(淀粉分析试剂盒，Sigma)和用于可溶性糖和脂肪酸的HPLC。

在代表30个独立株系(10株系/TF基因)的多于80株转基因植物中测量中心碳代谢的产物(淀粉、蔗糖、葡萄糖和脂肪酸)的水平。结果总结在表6中。

光合色素

根据之前描述的方法(Lichtenhaler,1987,Methods Enzymol.,148:350-382)，在新收集的叶组织中测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素。用代表30个独立株系(10株系/TF基因)的97株转基因植物进行所述试验。结果总结在表6中。

该初步筛选导致鉴定比在相同的条件下生长的对照未转化植物明显更高的水平积累初级代谢产物和色素的转基因细胞株系(每株系2-5株植物)。该数据证实了测试的TF基因作为中心碳代谢的全局调控子的预测功能(见实施例1)且与来自基因表达微阵列分析的结果相关(见实施例7)。

表6：筛选过表达TF基因PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的转基因柳枝稷株系的结果总结

，值是每转基因株系或野生型2-5株植物的测量值的平均数，并按基因型、生长期和取样日期表示为对应野生型对照的％；n.a.-未分析。

鉴定了具有明显更高水平的淀粉(4.2倍增加)、蔗糖(4.4倍增加)、葡萄糖(2.7倍增加)、脂肪酸(1.5倍增加)和总叶绿素(2.5倍增加)的个体植物(表7)。

表7：转录因子的过表达对于柳枝稷叶中的初级代谢产物和光合色素水平的作用

¹淀粉、蔗糖、葡萄糖和脂肪酸的数据表示为％DW；叶绿素a+b和类胡萝卜素的数据表示为mg/g FW；²按基因型、生长期和取样日期与对应野生型对照相比的值。

在其它植物部分也检测到初级代谢产物水平的相似增加。例如，来自株系56-14的植株的第二片叶中的淀粉含量是对照的405％(表6和7)。来自该植株的第三片叶和旗叶也包含比来自野生型对照植株的相应叶多4倍的淀粉。

出乎意料地，与对照植物相比，一些具有显著增加水平的淀粉和可溶性糖的转基因柳枝稷植物产生相同或稍高的生物质的量。例如，来自PvBMY1株系56-8的植物(表6)与对应的对照植株相比包含3.2×多的淀粉和2.2×多的蔗糖和葡萄糖，但是它的生物量仅比野生型植株的平均生物量高1％。PvSTIF1植株中具有最高淀粉含量(为对照的405％)的植株的总生物量产量与对照野生型植物的生物量相似。在来自PvSTR1株系56-14的植物中测量的生物量产量增加20％(表6)，尽管事实上该植株的叶中淀粉和可溶性糖的含量是对照的333％。

蛋白质分析

如之前所描述的(Somleva等,2008,Plant Biotechol.J.6:663-678)进行总蛋白质的蛋白质印迹分析。与对应的野生型对照相比，在所分析的大多数PvSTR1和PvSTIF1株系中检测到PSI(LhcA蛋白)和PSII(LhcB蛋白)的光捕获中心蛋白质丰度的增加(对于LhcA3和LhcB5的实例在图9A中示出)。这些发现与这些株系中提高的叶绿素含量一致(表6和7)。磷酸烯醇式丙酮酸(PEPC)蛋白在大多数PvBMY1株系中的累积高于野生型植物(实例在图9B中示出)。

这是关于任何转录因子对Lhc和PEPC蛋白质丰度的作用的第一份报告。

生物量累积和植物发育

在转移至土壤之后，在植物高度和分蘖数方面监测过表达本发明的转录因子的转基因柳枝稷植物的生长和发育。与来自相应基因型的野生型植物相比，所有转基因植物具有更大的叶片和更长的节间距。

如在公开WO 2012/037324 A2和Metabolix的US 2012/0060413中所描述的，评估在温室条件下生长5个月的植物的总生物量产量。计数每株植物不同发育阶段的所有营养分蘖和生殖分蘖，并在基节以下切割。分离叶和茎组织，切成更小的片，在27℃下空气干燥12-14天，并得到干重测量值。评估营养分蘖-生殖分蘖的数量和比例以比较转基因植物和对照植物的发育模式。

测量了代表29个TF株系的82株转基因植物和12株野生型植物的总生物量。获得了具有增加的生物量产量(与对照相比高至142％)和分蘖数(与对照相比高至194％)的转基因株系。

与对照植物相比，大部分的转基因植物-81.5％的分析的PvSTR1植物、66.7％的PvSTIF1植物和82.1％的PvBMY1植物具有较高的生物量产量(高至162％)(表8)。也鉴定了具有显著增加的分蘖数(与对照相比高至216％)的的TF过表达植物。

表8：转录因子的过表达对柳枝稷生物量产量的影响

¹按基因型、生长期和取样时间，与对应的野生型对照相比的值；²在不同发育阶段的营养分蘖和生殖分蘖的总数(未包括新生分蘖)。

在移植之后，在土壤中生长6个月的植物中观察到生物量生产率的相似模式。例如，在转移至土壤之后4个月生物量为对照的148.8％的来自株系16-6的植株在移植之后产生大约300g DW总生物量，其是对应对照的182.3％。

实施例6：过表达转录因子的柳枝稷株系的胁迫反应的评估

为验证本发明的转录因子在改善植物胁迫耐受性方面的作用，已经开发了用于筛选转基因植物和对照植物大群体对干旱和盐分的反应的新方法。它利用之前开发的用于繁殖和提高转基因柳枝稷植物中聚合物产生的基于组织培养物的技术(WO 2010/102220 A1和Somleva和Ali的US 2010/0229256 A1)。

使用非转化的、野生型植物建立胁迫诱导条件。分别选择聚乙二醇(PEG)和NaCl用于诱导干旱和盐分胁迫。从来自Alamo基因型56的未成熟花序来源的愈伤组织培养物再生几百株植物。在用于植物再生的MS培养基上培养3-4周之后，将表型均一的植株转移至包含补充有不同浓度的PEG和NaCl的相同培养基的更大组织培养容器中。由于在初步试验中3-4天的处理后观察到初次胁迫诱导的植物形态学变化(如叶枯萎和变黄)，这一时期段用于后续试验中。相对水含量(RWC)、光合色素水平和叶绿体Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD)蛋白丰度用作胁迫标志物。如下测量它们：根据Smart&Bingham,1974,Plant Physiol.53:258–260测量RWC，如Lichtenhaler,1987,Methods Enzymol.,148:350-382所描述的测量色素，以及使用植物SOD ELISA试剂盒(MyBioSource)测量SOD。

对三种不同浓度的胁迫诱导剂进行测试，每种重复三次(每次重复10株植物)。根据这些处理的结果，200mM的NaCl和15％PEG用于TF植物的实验中。

从未成熟花序来源的愈伤组织培养物(起始于良好表征的TF株系)再生的植物以及野生型植物(从未转化的培养物再生)在上述条件下进行胁迫诱导处理。未处理的转基因植物和野生型植物作为对照。所有的处理进行3-4次重复(每次重复10株植物)。

如在图10的实施例中所示的，与未处理的对照相比，200mM的NaCl处理导致在转基因植物中RWC的轻微降低-在PvSTR1和PvSTIF1植物中分别为2.2％和1.6％，而在野生型植物中RWC降低7.6％(图10A)。有意思的是，非胁迫的TF植物中RWC比野生型植物中的相对水含量高4-8％。与未胁迫的野生型植物相比，未处理的转基因植物包含显著更低量的叶绿体Cu-Zn超氧化物歧化酶(SOD)蛋白(通过ELISA测定)(图10B)。高盐分胁迫条件在PvSTIF1和野生型植物中诱导SOD水平的相似增加(分别为16％和19％)，而在PvSTR1植物中检测的SOD蛋白含量比未处理的对照高大约7％(图10B)。未处理的TF植物也包含更高水平的光合色素-与未胁迫的野生型植物相比，PvSTR1和PvSTIF1植物中的总叶绿素含量分别高27％和43％(图10C)。盐分胁迫引起转基因植物和野生型植物中叶绿素含量的显著降低(37-63％)。与未处理的植物相比，胁迫的野生型植物中类胡萝卜素含量降低18.2％；而在TF植物中，它比对应的对照植物低30-39％(图10C)。当对植物进行PEG诱导的干旱胁迫时，观察到胁迫标志物的相似变化。

这是证明过表达本发明的转录因子对植物胁迫反应的作用以及在体外条件下测试任何转录因子在该过程中的作用的可能性的第一份报告。

实施例7：过表达PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的柳枝稷转基因株系的全基因表达分析

为鉴定由本发明转录因子通过其调控导致所观察到的生物量产量和胁迫耐受性提高(实施例5和6)的基因，使用Affymetrix柳枝稷cDNA GeneChip进行基因表达谱分析。

基因表达微阵列、数据处理和归一化

选择过表达一种TF基因的表现最好的柳枝稷株系中的三个(表6、7和8)用于微阵列基因表达分析。从如在实施例3中所描述的营养分蘖(每株植物3-4个分蘖)的第二片叶分离总RNA。汇集来自每个株系三株植物的RNA提取物，并使用RNA Nano Chip(AgilentTechnologies)根据生产商的说明书评估它们的质量。根据生产商的方案(http://www.affymetrix.com)，使用包含检测大约43,344个转录本的探针的Affymetrix柳枝稷GeneChip进行微阵列分析。代表每种特征的信号的原始数值输入至AffylmGUI，并使用RobustMultiarray Averaging(RMA)将数据进行背景校正、归一化和总结。线性模型用于对重复之间的数据进行平均以及检测差异表达。使用箱图和散点图分别评价数据质量以比较所有样品的强度分布以及评估重复之间的基因表达变异。与对应的野生型对照相比具有≥2.0倍数变化的显著探针组(significant probe set)(FDR<0.1)的基因被认为是差异表达的。

由PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1调控的差异表达基因的鉴定和功能注释

由于柳枝稷基因组序列没有良好注释，进行相互的BLAST分析(由两个后续BLAST分析组组成的用于预测推定直系同源物的常见计算方法)用于差异表达基因和它们的对应直系同源物的功能注释。使用玉米、高粱、水稻和拟南芥的良好注释全基因组进行第一BLAST。BLASTN或TBLASTX通常用于多核苷酸序列的分析，而BLASTP或TBLASTN用于多肽序列的分析。可以任选地过滤第一组BLAST结果。过滤的结果或非过滤结果的全长序列之后针对来自查询序列所来源的生物体的序列进行回复BLAST(第二BLAST)。然后比较第一和第二BLAST的结果。如果这返回初始用作最高得分者的柳枝稷基因，则两种基因被认为是推定的直系同源物。

在转基因柳枝稷植物中由PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1上调或下调的注释基因的数量在图11A中示出。基因表达数据的进一步分析揭示分别有450、135和619种基因被PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1上调(图11B)以及165、164和231种基因被下调(图11C)。仅1-2种基因由三种TF共同调控。由PvSTIF1调控的差异表达基因的相对小的部分也被另两种TF调控，而多于280种基因由PvSTR和PvBMY1两者调控(图11B和C)。

这些发现表明，本发明的转录因子通过不同机制调控涉及关键过程和途径的基因的表达。

由PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1调控的下游转录因子

在由转基因柳枝稷株系的微阵列分析所鉴定的上调基因中，80种基于DNA结合域的存在被预测为转录因子(植物TF数据库v3.0)。这些同源TF基因中的几种已经在模式植物和农作物植物中被证实为涉及经济上重要的农艺性状(如，生物量产量、谷物产量和非生物胁迫耐受性)的基因的调节子。

这些结果证实本发明的转录因子表现为作为全局转录调节子发挥功能。通过微阵列分析鉴定的转录因子基因的数量和多样性表明PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1直接或通过下游转录因子调控几种主要途径和它们的分支中的关键基因。

差异表达基因的途径分析：为进行本发明转录因子的调控模式的更详细的分析，差异表达数据用于鉴定转基因柳枝稷植物中的代谢和/或信号传导途径或上调的途径部分。为研究差异表达基因的生物学功能，使用公开可得的数据库(http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php)进行基因本体学(GO)分析以鉴定“生物学过程类别”。结果显示，PvSTR1和BMY1显著增加涉及初级代谢过程(如光合作用和碳水化合物代谢)以及氨基酸和细胞壁生物合成相关途径的几种基因的表达，而由PvSTIF1上调的大部分基因被分类为转录因子(图12)。

总之，这里和实施例5中呈现的结果表明在转录因子已经过表达的转基因植物中的中心碳代谢导致对中心碳代谢的重要的全局影响。

柳枝稷中中心碳代谢的转录调控网络

中心碳代谢(CCM)对于植物生长和发育是重要的，因为它在生产可用能量和用于其它代谢途径的初级构建块的产生中具有关键作用。过表达PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1的柳枝稷株系的基因表达分析显示涉及光合作用和碳水化合物代谢以及初级代谢过程的几种基因的独特上调，其对于植物生长和发育不仅是必要的，而且通常赋予高度期望的性状。

实施例8、有经济价值的性状的转录因子介导修饰

在本发明中表征的柳枝稷转录因子(SEQ ID NO:1-6)和它们的同源物(SEQ ID NO:7-18)可以引入其它植物的基因组中，包括但不限于多种谷物和饲草谷物和草、油籽、生物质农作物、豆类、树和蔬菜的品种。在本发明中鉴定的直系同源基因(见实施例1)也可以用于经济上重要农作物和模式植物系统的遗传工程。公知的是转录因子基因序列在不同物种系(包括植物)中是保守的(Goodrich等,1993,Cell 75:519-530；Lin等,1991,Nature 353:569-571)。由于柳枝稷TF STR1、STIF1和BMY1的序列与其它植物物种中的序列有关，本领域技术人员可以预期，当在其它植物中表达时，柳枝稷TF基因和/或它们的直系同源物对植物代谢和表型可以具有与在本文中所证明的那些相似的作用。为获得最佳结果，需要进行TF基因的顺序和系统发生分析。由于高粱(Sorghum bicolor L.)和玉米(Zea maysL.)与柳枝稷密切相关(图5)，可以表达柳枝稷基因和它们的相应直系同源物(图4)以增加光合作用活性，上调碳和氮代谢以及改善这些农作物的胁迫耐受性，从而导致更高的生物量和/或谷物产量。例如，在高粱中，预期PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1以及它们各自的直系同源物(登录号为XP002463183、XP002452171和XP002463163)(使用在实施例1中描述的方法鉴定)具有相似的作用，而在大豆(Glycine max L.)中，由于该作物和柳枝稷之间的远缘系统发生关系(图5)，直系同源基因(登录号NP001238200、XP003522453和XP003546199)是优选的。在全基因组序列未知的农作物中，可以使用来自系统发生密切的物种的直系同源基因。例如，本发明的转录因子的拟南芥直系同源物可以在亚麻荠中表达以实现期望的性状改变。

可以使用本发明提供的方法将编码序列克隆至表达盒中并装配在单基因或多基因载体中。本文描述的任何植物转化方法可以用于将TF基因引入目标植物中。例如，可以使用全质粒或最小盒的粒子轰击用于将基因递送至起始于小麦(Okubara等,2002,Theor.Appl.Genet.106:74-83)和大麦(Wan&Lemaux,1994,Plant Physiol.104:37-48)的未成熟合子胚的愈伤组织培养物以及递送至从甘蔗(Snyman等,2006,Plant Cell Rep.25:1016-1023)和能源甘蔗(Fouad等,2009,In Vitro Cell.Dev.Biol.45:S74)的未成熟卷叶诱导的愈伤组织。柳枝稷转录因子和它们的直系同源物的表达可以通过农杆菌介导的转化在不同植物中工程化，所述植物如水稻(Sahoo等,2011,Plant Methods 7:49-60)、其它小型谷物农作物(在Shrawat和2006,Plant Biotech.J.4:575-603中综述)、工业农作物(棉花，Leelavathi等,2004,Plant Cell Rep.22:465-470；烟草，Horsch等,1985,Science 227:1229-1231)以及具有C4光合作用的农作物，如玉米、甘蔗、高粱、甜高粱和珍珠稷(在Somleva等,2013,Plant Biotech.J.11:233-252中综述)。花序浸渍法可以用于转化油籽农作物，如加拿大油菜(Li等,2010,Int.J.Biol.2:127-131)和亚麻荠(Liu等,2012,In Vitro Cell.Dev.Biol.48:462-468)。已经开发了用于一些农作物(如大豆，在Yamada等,2012,Breed.Sci.61:480-494中综述)的物理和生物转化方法，且更有效的方法可以用于本发明的目的。

根据感兴趣的农作物和表型，可以使用不同启动子控制本发明的TF的表达。可以使用组成型启动子和诱导型启动子(对环境、化学和激素信号反应)。例如，由于其在叶组织中的高活性，玉米光诱导cab-m5启动子适于对生物能源农作物工程化，如柳枝稷(Somleva等,2008,Plant Biotech.J.6:663-678)和甘蔗(Petrasovitch等,2012,Plant Biotech J.10:569-578)。

能够驱动TF基因以组织特异性方式和发育调控方式表达的启动子对于有经济价值性状的修饰是特别感兴趣的。本发明转录因子的工程化时空活性可以例如，用于增加玉米、水稻、小麦、大麦和高粱的谷物品种中的谷物产量，用于增加加拿大油菜和亚麻荠中的油含量，以及用于改变生物能源农作物(如，柳枝稷、甘蔗、芒属、甜高粱和能源甘蔗)中的生物量组成。本发明的转录因子基因、它们的同源物和直系同源物可以在胚和种子发育的不同阶段在光合作用组织中过表达，用于改善谷物产量而不增加营养性生物量的产生。该途径需要使用具有高活性和严格控制的特异性的启动子。有希望的候选物是玉米基因细胞周期蛋白δ2的启动子(基因座#GRMZM2G476685；SEQ ID NO:22)、磷脂酶2A的启动子(基因座#GRMZM2G154523；SEQ ID NO:23)、蔗糖转运蛋白的启动子(基因座#GRMZM2G081589；SEQ ID NO:24)和细胞壁转化酶的启动子(基因座#GRMZM2G139300；SEQ ID NO:25)，其已经显示在叶中表达，但是在种子发育开始时在受精子房中不表达(Kakumanu等,2012,Plant Physiol.160:846-847)。

由于在本发明中表征的基因是全局转录调节子，也可以通过调节下游转录因子的表达实现性状改变。例如，通过基因表达微阵列分析在转基因柳枝稷中鉴定了由本发明的TF调控的10个bZIP转录因子(见实施例7)。bZIP TF家族的成员已经在不同植物物种中表征，并与各种发育和生理学过程(如，圆锥花序和种子发育、存储蛋白基因的胚乳特异性表达、营养性生长和非生物胁迫耐受性)关联(在Nijhawan等,2008,Plant Physiol.146:333-350中综述)。总之，在该研究中还鉴定了由PvSTR1、PvSTIF1和PvBMY1调控的18种MYB转录因子(表8)。这些基因中的一些在主要生物学过程(发育和细胞分化、光合作用和次级代谢、胁迫耐受和防御反应)中的作用是公知的(在Ambawat等,2013,Physiol.Mol.Biol.Plants 19:307-321中综述)，并可以在不同途径中用于农作物改良。

实施例9、其它农作物物种的转化

农杆菌介导的芒属物种的转化

自20世纪80年代早期在欧洲(Lewandowski等,2003,Biomassand Bioenergy,25:335-361)以及最近在北美(Heaton等,2008,GlobalChange Biology,14:2000-2014)，芒属植物已经被广泛评估为生物能源农作物。对生物量生产力和环境影响的研究主要集中于荻(M.sacchariflorus)和奇岗(Miscanthus x giganteus)(荻和芒(M.sinensis)之间的花粉不育杂种)(Jorgensen&Muhs,2001,In M.B.Jones和M.Walsh(eds.),Miscanthus for energy and fibre.James&James(Science Publishers)Ltd.,London,68-852页)。

为开发组织培养和转化系统，在土壤中从根茎建立的和在27℃、16小时光周期(使用补充的卤化钠灯，200mol/m²/s)温室条件下生长的奇岗植物用作外植体来源。收获未成熟的花序、腋生分生组织和叶基部分，并在表面灭菌后用于培养物起始。在27℃下在黑暗中孵育初始外植体和得到的培养物。测试它们对组织培养基中各种浓度和组合的植物生长调节剂和不同硝酸盐-氨盐比例的反应。培养3-4周后，对形成愈伤组织的外植体的数量评分并根据视觉外观和形态发生能力确定愈伤组织类型。从所有类型的外植体观察愈伤组织形成，在愈伤组织诱导频率和形成的愈伤组织类型的比例上有明显差异。结果显示，未成熟的花序是用于愈伤组织起始的最好外植体，且补充有合成植物生长素2,4-D作为唯一的植物生长调节剂的MS基础培养基对于愈伤组织起始、诱导体细胞胚形成和抑制这些培养物的过早植物再生是最佳的。

使用两种途径以改善用于愈伤组织起始和生长的培养基。通过在6-9个月中按月转移至含有5mg/L的2,4-D和30g/L蔗糖的MS培养基上增殖愈伤组织培养物进行实验。为确定用于愈伤组织生长的最佳植物生长素浓度，将预称重的胚发生愈伤组织块(每个重复30块，每个变种2个重复)铺种在补充有1、2、3、4和5mg/L的2,4-D的MS培养基上。在没有任何植物生长调节剂的MS培养基上生长的培养物作为对照。4周后，将所有愈伤组织称重，且它们的生长率计算为％＝[(愈伤组织最终鲜重–愈伤组织最初鲜重)/愈伤组织最初鲜重]×100。由于在存在2mg/L的2,4-D的情况中检测到最高的生长率，该浓度用于转化试验中的愈伤组织起始、增殖和选择。

为进一步优化组织培养过程，评估了几种抗坏死化合物对愈伤组织生长和胚发生反应的作用。简言之，将预称重的胚发生愈伤组织(每个重复27-77mg鲜重，每个变种2个重复)铺种在含有2mg/L的2,4-D和补充有单独的或不同组合的抗坏血酸(15mg/L)、半胱氨酸(40mg/L)和硝酸银(5mg/L)的MS培养基上。每周监测培养物生长和发育，并在4周后如上所述地计算愈伤组织生长率。结果显示，愈伤组织生长由抗坏血酸和半胱氨酸促进，但不受硝酸银影响。尽管在存在全部三种抗坏死化合物的情况下生长的愈伤组织中检测到最高生长率，但也观察到在这些培养物的发育中的一些不期望的变化。总之，结果证明补充有2mg/L的2,4-D、15mg/L的抗坏血酸和40mg/L的半胱氨酸的MS培养基对于胚发生愈伤组织培养物的生长和发育是最佳的。

由于嫩的、发育圆锥花序被证明是Miscanthus x giganteus中愈伤组织起始的极好的外植体来源，进一步扩大这些研究以开发一种用于未成熟花序的体外产生和来自于它们的愈伤组织起始的新方案。也探究了通过节培养物的营养性繁殖的可能性。在开花之前来自于在温室条件下生长的植物的顶部秆节和顶端分蘖之下的节用作外植体来源。在表面灭菌后，节片段在聚乙烯吡咯烷酮(PVP40，Sigma)的10％水溶液中孵育、纵向分裂并铺种在含有10mg/L BAP和30g/L蔗糖的MS培养基上。将来自于从顶节形成的圆锥花序的单个小穗铺种在如上描述的用于愈伤组织起始的优化培养基上。通过每3-4周转移至新鲜培养基上增殖得到的愈伤组织并用在转化试验中。对于植物再生，将起始于体外发育的圆锥花序的愈伤组织铺种在无激素的MS培养基上，并在27℃下以16h光周期(冷白色荧光灯泡，80μmol/m²/s)孵育，并每3-4周分培养。在转移至土壤之前，将具有3-4片叶的小植株转移至具有相同培养基的更大组织培养容器中，并再生长2-3周。

在转移至土壤之前，将从顶节之下的具节茎段产生的嫩芽也培养在无激素的MS培养基上3-4周。

根据之前描述的用于柳枝稷转化的方法(Somleva,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,pp 65-74:Humana Press；Somleva等,2002,Crop Sci.42:2080-2087)对起始于体外发育的圆锥花序的已确立的胚发生愈伤组织培养物进行农杆菌介导的转化，所述方法具有以下改变：在转移至用于愈伤组织选择的补充有3mg/L双丙氨膦的培养基之前，感染的培养物与根癌农杆菌共培养5-10天。使用已开发的方法，芒属物种可以用本发明的转录因子基因进行工程化用于增加生物量产生和/或改变其用于生物能源应用的组成。

芒愈伤组织培养物起始于成熟的颖果，并如之前对于柳枝稷所描述的评估它们的胚发生潜能(Somleva等的美国专利第8,487,159号)。根据用于柳枝稷的农杆菌介导的转化方法转化它们(Somleva,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,65-74页:Humana Press；Somleva等,2002,Crop Sci.42:2080-2087)。

农杆菌介导的玉米转化

根据之前描述的方法(Frame等,2006,Agrobacterium ProtocolsWang K.,ed.,卷1,185-199页,Humana Press)，本发明提供的二元载体可以用于农杆菌介导的玉米转化。

植物材料：在温室中生长的植物用作外植体来源。在授粉9-13天后收获穗，并用80％乙醇进行表面灭菌。

外植体分离、感染和共培养：从单个籽粒无菌解剖未成熟的合子胚(1.2-2.0mm)，并在室温下在根癌农杆菌菌株EHA101培养物中(在转化之前，在5ml的补充有100μM乙酰丁香酮的N6培养基中生长2-5小时以刺激细菌vir基因)孵育5分钟。将感染的胚盾片侧向上转移至共培养培养基(含有300mg/L半胱氨酸、5μM硝酸银和100μM乙酰丁香酮的N6琼脂固化培养基)上，并在黑暗中，在20℃下孵育3天。将胚转移至包含100mg/L头孢噻肟、100mg/L万古霉素和5μM硝酸银的N6静息培养基(resting medium)，并在28℃下、在黑暗中孵育7天。

愈伤组织选择：将所有胚转移至第一选择培养基(补充有1.5mg/L双丙氨膦的上述静息培养基)上，并在28℃下、在黑暗中孵育2周，随后在含有3mg/L双丙氨膦的选择培养基上进行分培养。增殖愈伤组织的增殖块，并通过在相同培养基上每2周分培养而维持。

植物再生和选择：将双丙氨膦抗性的胚发生愈伤组织系转移至再生培养基I(MS基础培养基，补充有60g/L蔗糖、1.5mg/L双丙氨膦和100mg/L头孢噻肟，并用3g/L Gelrite固化)上，并在25℃下、在黑暗中孵育2-3周。将在该期间形成的成熟胚转移至再生培养基II(与再生培养基I相同，具有3mg/L双丙氨膦)上，用于在光(25℃、80-100μE/m²/s光强度、16/8-h光周期)中发芽。再生的植物准备用于在10-14天内转移至土壤。

农杆菌介导的高粱转化

根据之前描述的方法(Zhao,2006,Agrobacterium Protocols WangK.,ed.,卷1,233-244页,Humana Press)，本发明提供的载体可以用于高粱转化。

植物材料：在温室、生长室或田间条件下生长的植物用作外植体来源。在授粉后9-12天收获未成熟的圆锥花序，并将单个籽粒用50％漂白剂表面灭菌30分钟，随后用无菌蒸馏水清洗3次。

外植体分离、感染和共培养：从单个籽粒无菌解剖未成熟的合子胚(1-1.5mm)，并在室温下在PHI-I液体培养基(MS基础培养基，补充有1g/L酪蛋白氨基酸、1.5mg/L的2,4-D、68.5g/L蔗糖、36g/L葡萄糖和100μM乙酰丁香酮)的根癌农杆菌菌株LBA4404悬浮液中孵育5分钟。将感染的胚以胚轴向下转移至共培养PHI-T培养基(琼脂固化的改良PHI-I培养基，包含2.0mg/L的2,4-D、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、0.5g/L的MES、0.7g/L脯氨酸、10mg/L抗坏血酸和100μM乙酰丁香酮)上，并在25℃、黑暗中孵育3天。为休眠，将胚转移至补充有100mg/L羧苄青霉素的相同培养基(没有乙酰丁香酮)，并在28℃下、在黑暗中孵育4天。

愈伤组织选择：将胚转移至第一选择培养基PHI-U(上述PHI-U培养基，补充有1.5mg/L的2,4-D、100mg/L羧苄青霉素和5mg/LPPT，没有葡萄糖和乙酰丁香酮)上，并在28℃下在黑暗中孵育2周，随后在含有100mg/L PPT的选择培养基上分培养。增殖愈伤组织的增殖块，并通过在相同培养基上每2周分培养而持续剩余的10周愈伤组织选择过程。

植物再生和选择：将除草剂抗性的愈伤组织转移至再生培养基I(补充有0.5mg/L激动素的PHI-U培养基)上，并在28℃下在黑暗中孵育2-3周用于愈伤组织生长和胚发育。将培养物转移至再生培养基II(具有0.5mg/L的玉米素、700mg/L的脯氨酸、60g/L的蔗糖和100mg/L的羧苄青霉素的MS基础培养基)上用于芽形成(28℃下，黑暗中)。在2-3周后，将芽转移至生根培养基(补充有20g/L蔗糖、0.5mg/L NAA和0.5mg/L IBA的再生培养基II)上，并在25℃、270μE/m²/s光强度和16/8h光周期下生长。当再生的植物是8-10cm高时，可以将它们转移至土壤并在温室条件下生长。

农杆菌介导的大麦转化

本发明提供的载体可以用于如Tingay等,1997,Plant J.11:1369-1376所描述的大麦转化。

植物材料：春季栽培品种Golden Promise的植株在温室或生长室条件下、在18℃、16/8小时光周期下生长。当合子胚为1.5-2.5mm长时收获穗。用次氯酸钠(！5w/v氯)对发育的颖果灭菌10分钟，并用无菌水漂洗4次。

外植体分离、感染和共培养：

从单个籽粒无菌解剖未成熟的合子胚，并在移除胚轴后盾片侧向上地放置在愈伤组织诱导培养基(Gelrite固化的MS基础培养基，含有30g/L麦芽糖、1.0g/L酪蛋白水解产物、0.69g/L脯氨酸和2.5mg/L麦草畏)上。在后续培养期间，在24℃、黑暗中孵育胚。分离后1天，将胚在根癌农杆菌菌株AGL1培养物(从MG/L培养基中的单一集落生长)中培养，随后转移至如上所述的培养基上。

愈伤组织选择：

在共培养2-3天后，将胚转移至补充有3mg/L双丙氨膦和150mg/L特美汀的愈伤组织诱导培养基上。通过每2周转移至新鲜选择培养基对培养物选择约2个月。

植物再生和选择：

将双丙氨膦抗性的胚形成愈伤组织系转移至Phytagel固化的含有1mg/L BA和3mg/L双丙氨膦的再生培养基用于转基因植物的选择，并在24℃、荧光灯下以16/8h光周期生长。为了根发育，将再生的植物转移至补充有1mg/L双丙氨膦的无激素愈伤组织诱导培养基。在根系统发育之后，将植物转移至土壤，并在上述条件下在温室或生长室中生长。

农杆菌介导的水稻转化

根据之前描述的方法(Herve和Kayano,2006,AgrobacteriumProtocols Wang K.,ed.,卷1,213-222页,Humana Press)，本发明提供的二元载体可以用于农杆菌介导的水稻转化。

植物材料：来自于在温室中生长的粳稻品种的成熟种子用作外植体来源。

培养物转化和选择：将脱壳种子用70％乙醇表面灭菌1分钟并用3％次氯酸钠表面灭菌30分钟，随后用无菌蒸馏水清洗6次。胚侧向上地将种子铺种在诱导培养基(补充有300mg/L的酪蛋白氨基酸、2.88g/L脯氨酸、30g/L蔗糖和2mg/L的2,4-D的Gelrite固化的N6基础培养基)上，并在32℃、持续光照条件下孵育5天。盾片溶胀的萌发种子用根癌农杆菌菌株LBA440(来自在补充有100μM的乙酰丁香酮、68.5g/L蔗糖和36g/L葡萄糖的N6培养基中重悬的3天时间平板的培养物)在室温下感染2分钟，随后转移至共培养培养基(包含300mg/L酪蛋白氨基酸、30g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、2mg/L的2,4-D和100μM乙酰丁香酮的N6 Gelrite固化培养基)上，并在25℃下黑暗中孵育3天。

为进行转化的胚发生组织的选择，将用250mg/L头孢噻肟(cephotaxine)清洗的全幼苗转移至N6琼脂固化的培养基上，所述培养基包含300mg/L酪蛋白氨基酸、2.88g/L脯氨酸、30g/L蔗糖、2mg/L的2,4-D、100mg/L头孢噻肟、100mg/L的万古霉素和35mg/L的G418重硫酸盐。培养物在32℃、持续光照下孵育2-3周。

植物再生和选择：将抗性的增殖愈伤组织转移至琼脂固化的N6培养基上，所述培养基包含300mg/L酪蛋白氨基酸、500mg/l脯氨酸、30g/l蔗糖、1mg/l NAA、5mg/l ABA、2mg/l激动素、100mg/l头孢噻肟、100mg/l万古霉素和20mg/l G418重硫酸盐。在32℃、持续光照下生长1周后，将存活的愈伤组织转移至MS培养基(用10g/l琼脂糖固化)上，所述培养基补充有2g/l酪蛋白氨基酸、30g/l蔗糖、30g/l山梨醇、0.02mg/l NAA、2mg/l激动素、100mg/l头孢噻肟、100mg/l万古霉素和20mg/l G418重硫酸盐，并在相同条件下再孵育1周，随后转移至含有7g/l琼脂糖的相同培养基上。2周后，将新出现的芽转移至Gelrite固化的含有30g/l蔗糖的无激素MS培养基上，并在持续光照下生长1-2周以促进芽和根发育。当再生的植物为8-10cm高时，将它们转移至土壤并在温室条件下生长。约10-16周之后，收获转基因种子。

依据相似方法(Datta和Datta,2006,Agrobacterium ProtocolsWang K.,ed.,卷1,201-212页,Humana Press)，用农杆菌转化籼稻品种。

微粒轰击介导的甘蔗转化

根据之前描述的方法(Taparia等,2012,In Vitro Cell.Dev.Biol.48:15-22)，可以经由基因枪(biolistics)将包含转录因子基因的表达盒与标记基因(如，npt)的盒共同引入甘蔗中。

植物材料：具有6-8个可视节的温室生长植物用作外植体来源。收集顶部并用70％乙醇进行表面灭菌。在无菌条件下移除最外面的叶，并从顶端节以上1-10cm的区域切下未成熟叶轮节段(约2mm)。

培养物起始、转化和选择：将分离的叶节段在28℃、30μmol/m²/s光强度和16/8-h光周期下、在MS基础培养基上培养7天，所述MS基础培养基补充有20g/l蔗糖、1.86mg/l对氯苯氧基乙酸(CPA)、1.86mg/l NAA和0.09mg/l BA。胚形成培养物在新鲜培养基上分培养并用于转化。

为进行微粒轰击，在基因转移之前，将叶盘平铺于补充有0.4M的山梨醇的培养起始培养基上4个小时。根据之前描述的方法(Altpeter和Sandhu,2010,Genetic transformation–biolistics,Davey&Anthony eds.,217-237页,Wiley,Hoboken)，将包含TF和标记基因的表达盒的质粒DNA(200 ng)沉淀在1.8mg金微粒(0.6μm)上。通过PDS-1000 Biolistc微粒递送系统(Biorad)使用1100psi破裂盘、26.5mmHg室真空和6cm压力的架距离(shelf distance)，将DNA(每次轰击10 ng)递送至外植体中。将轰击的外植体转移至上述培养物起始培养基并孵育4天。

为进行选择，将培养物转移至补充有30mg/l遗传霉素的起始培养基上，并孵育10天，接着在相同条件下进行另一选择循环。

植物再生和选择：将培养物转移至没有CPA的上述选择培养基上，并在28℃、100μmol/m²/s光强度下以16/8-h光周期生长。将具有小芽(约0.5cm)的叶盘铺种在含有30mg/l遗传霉素的无激素培养基上用于芽生长和根发育。在转移至土壤之前，将再生植物的根浸入商业可得的根促进粉末中。

通过微粒轰击的小麦转化

通过根据之前描述的方法(Weeks等,1993,Plant Physiol.102:1077-1084)的微粒轰击，本发明提供的基因构建体可以用于小麦转化。

植物材料：来自于春小麦栽培种Bobwhite的植物在白天18-20℃、晚上14-16℃温度、16h光周期下生长。在播种后10-12周(开花后12-16天)收集穗。将早-中乳熟期的单个颖果用70％乙醇灭菌5分钟，并用20％次氯酸钠灭菌15分钟，然后用无菌水洗涤3次。

培养物起始、转化和选择：在无菌条件下解剖未成熟的合子胚(0.5-1.5mm)，盾片侧向上地放置在培养物诱导培养基(Phytagel固化的MS培养基，包含20g/l蔗糖和1.5mg/l的2,4-D)上，并在27℃下在光(43μmol/m²/s)中孵育3-5天。

为进行微粒轰击，在基因转移之前，将胚来源的愈伤组织铺种在补充有0.4M山梨醇的培养物起始培养基上4小时。将包含TF和标记基因bar的表达盒的质粒DNA沉淀在0.6μm的金微粒上，并如上对于甘蔗所述的递送至外植体。

将轰击的外植体转移至愈伤组织选择培养基(包含1-2mg/l双丙氨膦的上述培养物起始培养基)，并每2周分培养。

植物再生和选择：在1-2个选择循环后，将培养物转移至补充有0.5mg/l麦草畏和2mg/l双丙氨膦的MS再生培养基。为根形成，将得到的双丙氨膦抗性的芽转移至无激素的半强度MS培养基。将具有良好发育根的植物转移至土壤，并在转移至温室之前，在21℃、16h光周期(300μmol/m²/s)下适应较低湿度约2周。

农杆菌介导的亚麻荠转化

通过根据之前描述的方案(国际专利申请WO 2011034946)的花序浸渍法，本发明提供的基因构建体可以用于亚麻荠转化。

植物材料：在温室条件(24℃/18℃白天/夜晚温度)下从种子生长的具有未打开花苞的植物用于花序浸渍转化。

农杆菌培养物制备和植物接种：通过电穿孔将感兴趣的构建体引入农杆菌菌株GV3101中。从新划线的平板上获得GV3101的单一集落，并接种至5mL LB培养基中。在28℃下过夜生长之后，将2ml的培养物转移至包含300ml LB的500mL烧瓶中，并在28℃下孵育过夜。通过离心(6000rpm，20min)沉淀细胞，并用包含5％蔗糖和0.05％(v/v)Silwet-L77(Lehle Seeds,Round Rock,TX,美国)的渗透培养基稀释至OD₆₀₀0.8。如下转化亚麻荠植物。将包含开花期的植物的盆放置在真空干燥器(Bel-Art,Pequannock,NJ,美国)中，并将它们的花序浸入至农杆菌培养物中。施加真空(85kPa)5分钟。从干燥器中移出植物，用塑料袋覆盖，并在室温下、黑暗中保持24小时。植物在温室中生长以用于种子形成。

转基因种子的鉴定：为鉴定双丙氨膦抗性种子，收获来自接种的植物的种子，用70％的乙醇和10％的漂白剂灭菌，随后用无菌水清洗。将灭菌的种子放置在含有10mg/L双丙氨膦的萌发和选择培养基(半强度MS基础培养基)上，并在生长室中在23/20℃(白天/夜晚)下以16h光周期(3000 lux)孵育。在开始萌发后约6天，将具有绿色子叶的幼苗转移至土壤。

农杆菌介导的欧洲油菜转化

植物材料：将成熟的种子在10％商用漂白剂中通过轻柔振荡而表面灭菌30分钟，并用无菌蒸馏水清洗三次。

培养物起始和转化：将种子放置在萌发培养基(补充有30g/l蔗糖的MS基础培养基)上，并在24℃下以16h光周期在60-80μE/m²/s光强度下孵育4-5天。为转化，从所产生的幼苗在基部切除具有～2mm叶柄的子叶，浸入在根癌农杆菌菌株EHA101悬浮液(在补充有合适抗生素的5ml的最低培养基中、在28℃下从单集落生长48小时)中1秒钟，并直接嵌入共培养培养基(含有30g/l蔗糖和20μM苄基腺嘌呤的MS基础培养基)中～2mm深度。接种的子叶在相同生长条件下孵育48小时。

植物再生和选择：共培养之后，将子叶转移至再生培养基上，所述再生培养基包含补充有30g/l蔗糖和20μM苄基腺嘌呤、300mg/l特美汀(timentinin)和20mg/l硫酸卡那霉素的MS培养基。2-3周后，切下再生的芽并维持在MS培养基上用于芽延伸，所述MS培养基包含30g/l蔗糖、300mg/l特美汀和20mg/l硫酸卡那霉素。将延长的芽转移至生根培养基，所述生根培养基包含补充有30g/l蔗糖、2mg/l吲哚丁酸(IBA)和500mg/l羧苄青霉素的MS基础培养基。在根形成后，将植物转移至土壤并在生长室或温室条件下生长至种子成熟。

农杆菌介导的大豆转化

将在本发明中鉴定的柳枝稷转录因子基因的大豆直系同源物(图4)装配在二元载体(表9)中，并根据之前描述的方法(Ko等,2006,Agrobacterium Protocols Wang K.,ed.,卷1,397-405页,Humana Press)用于农杆菌介导的大豆转化。

植物材料：来自于在温室或田间条件下生长的大豆植物的未成熟种子用作外植体来源。收获嫩豆荚，并用70％的2-丙醇表面灭菌30秒，和用25％的Clorox灭菌20分钟，然后用无菌蒸馏水清洗三次。

培养物转化和选择：在无菌条件下，从豆荚中移除未成熟的种子，并将子叶从种皮分离，随后在补充有30g/l蔗糖、40mg/l的2,4-D和40mg/l乙酰丁香酮的共培养培养基(MS盐和B5维生素)的根癌农杆菌培养物(在28℃下从单集落生长过夜)中孵育60分钟。将感染的外植体远轴侧向上放置在琼脂固化的共培养培养基上并在25℃下、在黑暗中孵育4天。

为选择转化的组织，将用500mg/l的头孢噻肟清洗的子叶远轴侧向上放置在用于诱导体细胞胚形成的培养基(Gelrite固化的MS培养基，包含30g/l蔗糖、40mg/l的2,4-D、500mg/l头孢噻肟和10mg/l潮霉素)上，并在25℃下、在23h光周期(10-20μE/m²/s)下孵育2周。在相同条件下、在25mg/l潮霉素存在下再生长两周后，将抗生素抗性的体细胞胚转移至用于胚成熟的MS培养基(补充有60g/l麦芽糖、500mg/l头孢噻肟和10mg/l潮霉素)上，并在相同条件下以2周分培养的间隔生长8周。

植物再生和选择：在25℃、23h光周期(60-80μE/m²/s)下，将得到的子叶期胚干燥5-7天，接着在包含30g/l蔗糖和500mg/l头孢噻肟的MS再生培养基上培养4-6周用于芽和根发育。当植物为5-10cm高时，将它们转移至土壤，并在适应7天后在温室中生长。

表9、用于在大豆中过表达直系同源转录因子基因GmSTR1、GmSTIF1和GmBMY1的植物转化载体

*所有的载体基于在万维网cambia.org上发现的转化载体pCambia3300；hpt基因(赋予潮霉素抗性)用作选择转化的外植体和植物的标记。

序列：

SEQ ID NO:1 PvSTR1(淀粉调节子)转录因子DNA编码序列

SEQ ID NO:2 PvSTIF1(胁迫诱导因子)转录因子DNA编码序列

SEQ ID NO:3 PvBMY1(生物量产量)转录因子DNA编码序列

SEQ ID NO:4 PvSTR1转录因子编码的多肽序列

SEQ ID NO:5 PvSTIF1转录因子编码的多肽序列

SEQ ID NO:6 PvBMY1转录因子编码的多肽序列

SEQ ID NO:7 PvSTR同源物2 Pavirv00061015m

SEQ ID NO:8 PvSTR同源物3 Pavirv00030328m

SEQ ID NO:9 PvSTR同源物4 Pavirv00035924m

SEQ ID NO:10 PvSTR同源物5 Pavirv00053297m

SEQ ID NO:11 PvSTIF同源物2 Pavirv00058988m

SEQ ID NO:12 PvSTIF同源物3 Pavirv00031839m

SEQ ID NO:13 PvSTIF同源物4 Pavirv00030284m

SEQ ID NO:14 PvBMY同源物2 Pavirv00066236m

SEQ ID NO:15 PvBMY同源物3 Pavirv00042310m

SEQ ID NO:16 PvBMY同源物4 Pavirv00023203m

SEQ ID NO:17 PvBMY同源物5 Pavirv00061773m

SEQ ID NO:18 PvBMY同源物6 Pavirv00024249m

SEQ ID NO:19 pMBXS809

SEQ ID NO:20 pMBXS810

SEQ ID NO:21 pMBXS855

SEQ ID NO:22来自于玉米的细胞周期蛋白δ2启动子

SEQ ID NO:23来自于玉米的磷脂酶2A启动子

SEQ ID NO:24来自于玉米的蔗糖转运蛋白启动子

SEQ ID NO:25来自于玉米的细胞壁转化酶启动子

SEQ ID NO:26 pMBXS884

SEQ ID NO:27 pMBXS885

SEQ ID NO:28 pMBXS886

本文所引用的全部专利、公开的申请和参考文献的内容通过引用的方式全文并入本文。

虽然本发明已经参考其示例实施方式详细地显示和描述，本领域技术人员应当理解，在不背离所附的权利要求书所包含的本发明范围的情况下，可以在其中做出多种形式和细节的各种改变。

Claims

1.一种转基因植物或植物的一部分或植物材料或植物种子或植物细胞，包含编码AP2/ERF或NF-YB转录因子家族的一种或多种核苷酸序列，其中所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，且所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码；其中，所述一种或多种转录因子的表达增加了所述转基因植物、植物的一部分、植物材料、植物种子或植物细胞中的碳流。

2.根据权利要求1所述的转基因植物，其中，所述一种或多种转录因子的表达改善了对一种或多种非生物胁迫因子的耐受性，所述非生物胁迫因子选自：水和/或光的过量或缺乏、高温或低温以及高盐度。

3.根据权利要求1或2所述的转基因植物，其中，所述转录因子由SEQ ID NO:1、2或3编码的直系同源物、同源物或功能性片段编码。

4.根据任意一项前述权利要求所述的转基因植物，进一步包含含有与SEQ ID NO:1、2或3的一种或多种核苷酸序列可操作性连接的启动子的载体。

5.根据任意一项前述权利要求所述的转基因植物，其中，所述植物选自农作物植物、模式植物、单子叶植物、双子叶植物、具有C3光合作用的植物、具有C4光合作用的植物、一年生植物、多年生植物、柳枝稷植物、玉米植物或甘蔗植物。

6.根据权利要求5所述的转基因植物，其中，所述一年生植物或多年生植物是生物能源或生物质植物。

7.根据权利要求1-6任一项所述的转基因植物，其中，一种或多种转录因子的表达增加了光合作用活性、碳流和/或光合色素的总含量。

8.根据权利要求1-6任一项所述的转基因植物，其中，所述增加的碳流导致与非转基因植物相比增加的生物量产量。

9.根据权利要求8所述的转基因植物，其中，与非转基因植物相比，所述植物具有以下一项或多项的增加：淀粉含量、可溶性糖含量、谷物产量、植物尺寸、器官尺寸、叶尺寸和/或茎尺寸。

10.根据权利要求1所述的转基因植物，其中，与非转基因植物相比，所述一种或多种转录因子的表达导致食物农作物、饲料农作物或用于生产燃料或工业产品的农作物的产量的增加。

11.一种分离的核苷酸序列，包含编码AP2/ERF或NF-YB转录因子的核酸序列，其中，选自SEQ ID NO:1、2和3的转录因子在植物中是有功能的，且所述转录因子的表达增加了转基因植物中的碳流。

12.根据权利要求11所述的分离的核苷酸序列，其中，所述植物选自C3或C4双子叶植物、C3或C4单子叶植物、草本植物、柳枝稷植物、玉米植物或甘蔗植物。

13.根据权利要求11所述的分离的核苷酸序列，其中，所述核酸序列进一步包含与SEQ ID NO:1、2或3的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列一致性。

14.根据权利要求11所述的分离的核苷酸序列，其中，所述增加的生物量产量是由于与非转基因植物相比增加的碳流。

15.根据权利要求11所述的分离的核苷酸序列，其中，与非转基因植物相比，所述转录因子的表达增加了光合作用活性、碳流和/或光合色素的总含量。

16.根据权利要求11所述的分离的核苷酸序列，进一步包含编码SEQ ID NO:4、5或6的多肽的核酸序列。

17.根据权利要求11-16任一项所述的分离的核苷酸序列，其中，所述增加的碳流增加转基因植物中的淀粉、蔗糖和葡萄糖水平，而生物量产量没有相同的对应增加。

18.一种转录因子，包含选自SEQ ID NO:4、5和6的AP2/ERF或NF-YB转录因子多肽；其中，所述转录因子在植物中是有功能的，且所述转录因子的表达增加转基因植物中的碳流。

19.根据权利要求18所述的转录因子，其中，所述植物选自C3或C4双子叶植物、C3或C4单子叶植物、草本植物、或柳枝稷植物、玉米植物或甘蔗植物。

20.根据权利要求18所述的转录因子，其中，所述多肽序列进一步包含与SEQ ID NO:4、5或6的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列一致性。

21.根据权利要求18所述的转录因子，其中，所述增加的生物量产量是由于与非转基因植物相比增加的碳流。

22.根据权利要求18所述的转录因子，其中，与非转基因植物相比，所述转录因子的表达增加了光合作用活性、碳流和/或光合色素的总含量。

23.一种用于生产用于产生转基因植物农作物的转基因种子的方法，所述转基因植物具有由SEQ ID NO:1、2或3的核苷酸序列编码的一种或多种转录因子或其同源物、直系同源物或功能性片段的表达导致的增强的性状，所述方法包括：

a)筛选用用于所述增强的性状的转录因子转化的植物群体；

b)从所述群体中选择一个或多个展示所述性状的植物；以及

c)收集来自所选择的植物的种子。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述种子是玉米种子或高粱种子，且所述增强的性状是种子碳含量。

25.一种产生转基因植物的方法，包括在植物中共表达一种或多种AP2/ERF和NF-YB转录因子，其中，所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，且所述NF-YB转录因子由SEQID NO:3的核苷酸序列编码。

26.一种用于在组织培养物中测试植物对不同胁迫因子的反应以用于鉴定对所述胁迫因子具有增强的耐受性的植物的方法，包括在引起胁迫的一种或多种条件下比较测试植物和权利要求1的转基因植物，所述胁迫包括水、光、温度和盐度的改变。

27.用于植物的转化的方法，包括将包含权利要求11、12或13所述的核苷酸序列的一种或多种载体引入植物中。

28.根据权利要求1-10任一项所述的转基因植物，其中，所述光化量子产率比对应的非转基因植物的产率高至少2倍。

29.根据权利要求1-10任一项所述的转基因植物，其中，所述植物的淀粉产量比对应的非转基因植物的含量增加至少2倍。

30.根据权利要求1-10任一项所述的转基因植物，其中，所述植物的淀粉产量比对应的非转基因植物的含量增加至少2倍至约4.5倍。

31.根据权利要求1-10任一项所述的转基因植物，其中，所述植物的叶绿素含量比对应的非转基因植物的含量高1.5倍。

32.根据权利要求1-10任一项所述的转基因植物，其中，所述植物的叶绿素含量比对应的非转基因植物的含量高至少1.5倍至约2.5倍。

33.根据权利要求1-10任一项所述的转基因植物，其中，所述植物的蔗糖含量比对应的非转基因植物的含量高至少1.5倍。

34.根据权利要求1-10任一项所述的转基因植物，其中，所述植物的蔗糖含量比对应的非转基因植物的含量高至少2倍至约4.3倍。

35.根据权利要求1-10任一项所述的转基因植物，其中，所述植物的植物生长速率比对应的非转基因植物的生长速率增加至少10％。

36.根据权利要求28-35任一项所述的转基因植物，其中，所述植物是柳枝稷、玉米或甘蔗。

37.一种相对于对照的非转基因植物增强转基因植物中的性状的方法，包括：(a)增加编码来自AP2/ERF和NF-YB家族的转录因子的至少一种核酸序列的表达，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO.3的核酸序列或它们的直系同源物、同源物或功能性片段；和(b)选择相对于对照植物具有增强的性状的转基因植物。

38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述性状选自以下的一种或多种：碳流、初级代谢物、对一种或多种非生物胁迫因子的耐受性和一种或多种光合色素。

39.一种相对于对应的非转基因植物具有性状改变的转基因植物，包含一种或多种编码AP2/ERF或NF-YB转录因子的核苷酸序列，其中，所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其直系同源物、同源物或功能性片段编码，其中所述性状改变选自以下的一种或多种：碳流，光合色素水平，光合作用能力，植物组织中淀粉、蔗糖和葡萄糖的水平，植物组织中脂肪酸的水平，生物量生长率和产量，以及胁迫耐受性。

40.根据权利要求39所述的转基因植物，其中所述性状改变是高于3倍的淀粉或可溶性糖的产量，而生物量产量的增加低于1.5倍。

41.一种具有增加的非结构碳水化合物含量的转基因玉米植物，包括：

a)将编码AP2/ERF和/或NF-YB转录因子的一种或多种核苷酸引入植物细胞中，其中，所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其直系同源物、同源物或功能性片段编码；以及

b)从与对应的非转基因植物相比具有增加的非结构碳水化合物含量的植物细胞产生转基因植物。

42.来自权利要求41的转基因植物的种子。

43.来自权利要求41的转基因植物的植物组织。

44.一种用于鉴定抗干旱和抗盐的转基因植物的方法，所述转基因植物具有一种或多种编码AP2/ERF和/或NF-YB转录因子的核苷酸，其中，所述AP2/ERF转录因子由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列编码，和所述NF-YB转录因子由SEQ ID NO:3的核苷酸序列或其直系同源物、同源物或功能性片段编码，所述方法包括：

a)在干旱和盐分胁迫条件下生长转基因植物和野生型植物的群体；

b)选择展现对干旱和盐分的耐受性的转基因植物，从而鉴定包含与干旱和盐分的耐受性相关的基因型的转基因植物。