CN104977278A - 一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统 - Google Patents

Abstract

一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，包含N通道马赛克滤光片（微滤片）与光电转换单元紧密结合的多光谱荧光收集单元；均匀、稳定的激发光光场；N通道激发滤光片（N≥1），掌上计算机系统和五卡同读的绝对测量校准系统。多光谱荧光收集单元、激发光光场、N通道激发滤光片构成实时收集N种受激发射荧光信号的检测模块，与掌上计算机系统连接能够实现实时地同时地对多色荧光免疫层析半定量、定量的高灵敏度测量。

Description

一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统

技术领域

本发明涉及一种便携式体外荧光分析及检测系统，特别涉及一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析系统，适用于多种荧光标记的免疫层析诊断试纸结果的实时地同时地快速判定或定量测量。

背景技术

免疫层析（immunochromatography）是近十年来兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于层析膜（如硝酸纤维素膜）的某一区带，当该干燥的层析膜一端滴加样本（尿液或血清）后，由于毛细作用，样本将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样本中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。

免疫层析试纸条具有精确、快速和操作简单等优点。如胶体金免疫层析技术法，该方法已经在临床检验中得到了广泛应用，其基本原理是通过胶体金标记物与分析物及包被抗体或抗原反应形成胶体金本身的颜色（红色），可通过肉眼观察检测结果。但是对于某些抗原或抗体含量极低的样本，胶体金的颜色很浅且很难用肉眼来判断结果，灵敏度低。这是由于胶体金标记利用静电吸附，在液相中稳定性较差，已标记过的蛋白质分组容易脱落；不同材料基质效应明显，背景干扰较大，难以准确定量，造成灵敏度不高。

近几年来发展起来的荧光免疫层析技术，结合纳米技术、定向标记技术、生物膜技术、横向流动技术及荧光检测技术，采用化学偶联方法标记抗体，具备了传统免疫层析方法检测的优势，也克服了其固有的缺陷，具有灵敏度高、特异性强、快速、可定性定量检测。

如中国专利201010591112.0《免疫层析检测试纸条显色信号定量检测器》提出一种基于光电二极管三极管模块化的免疫试纸条检测线显色信号定量检测探测器，结构简单，体积小，成本低，可适应各种封装试纸条显色信号检测，提高定量检测灵敏度和可靠性。但是该装置需要对试剂条进行逐个扫描，影响了数据获取的实时性，耗费了大量的时间，不适用于批量检测。

为了实现批量检测、节省检测时间，带有面阵CCD的荧光免疫层析分析检测技术也逐步发展。如中国专利201110115964.7《一种CCD型胶体金免疫层析诊断试纸定量分析系统》提出了采用CCD数字图像技术对被检测目标进行即时拍摄、处理和读数的一种CCD型胶体金免疫层析诊断试纸定量分析系统及分析方法。该系统采用增加或减少曝光时间，来降低图像的噪声，有效保证读数结果的稳定性、一致性和精确度，有力解决了人眼判读时的主观偏差问题。但CCD感光电流产生、放大和AD转换，不可避免的还要使用模拟放大电路来完成。模拟电路会因为热噪声、电感应、器件性能等因素引起噪声电流，虽然很低，在亮度较高的情况下，相比正常感光电流幅度比例很小，而且曝光时间很短，所以几乎表现不出来。但这种普通的CCD在对微弱荧光拍摄，对光子信号进行累积的时候，需要的曝光的时候比较长，导致CCD产生较多的暗电流，对图像的质量影响非常大，造成荧光信号采集的灵敏度极低。

发明内容

为避免背景技术中的不足之处，本发明提出一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，包含N通道马赛克滤光片（微滤片）与光电转换单元紧密结合的多光谱荧光收集单元；均匀、稳定的激发光光场；N通道激发滤光片（N≥1）；包括掌上计算机系统和五卡同读绝对测量的校准系统。荧光收集单元、激发光光场、N通道激发滤光片紧凑的集合在一个不透光的密闭装置里，构成实时收集N种受激发射荧光信号的检测模块，检测模块与掌上计算机系统组成荧光免疫层析检测仪系统（或者称为平台）；掌上计算机系统显示荧光强度图像，并对图像进行分析和处理；五卡同读的绝对测量校准系统提供可以同时读取五种不同浓度的有荧光标记物稀释液的绝对测量机构和校样。

其中，N通道马赛克滤光片（微滤片）紧贴在光电转换单元的表面，或者采用微加工制作方式将N通道马赛克滤光片（微滤片）直接制作在光电转换单元的表面，所述N通道马赛克滤光片（微滤片）按“像素对像素”对准的粘贴在或制作在光电转换单元表面（N≥1）。

其中，N通道马赛克滤光片（微滤片）通过的波长数为N，包含多个滤光微元，每个微元包含N个紧密排列的通道，即一个通道只允许一种特征波长的光信号通过，实现多个标记荧光实时地同时地收集（N≥1），这种组装方式使得仪器体积可以很小，实时收集多道（即：多个不同波长的）受激发射荧光信号，一台机代替多机，实现多病种检测，减少机械转动部件，稳定性好，免维修。

其中，光电转换单元是对弱光具有高灵敏度成像能力的光电转换单元，如可以是但不限于一维和二维空间分辨率的、制冷的，带有时间积分的图像传感器或者集成的带有一维和二维空间分辨率的PMT等，本发明通过采用高灵敏度的新型图像传感器提高图像输出信噪比，大幅度提高仪器的检测下限；可以实时地收集试剂条上所发射的荧光信号，无须机械拖动试剂盒来获得所发射荧光的空间分布，不会出现机械故障；同时信号输出不受温度变化影响，仪器稳定。

其中，多光谱荧光收集单元、激发光光场、N通道激发滤光片构成的实时收集N种受激发射荧光信号的检测模块与掌上计算机组成荧光免疫层析检测仪系统（或者称为平台）。

其中，N通道马赛克滤光片（微滤片）与光电转换单元紧密结合的多光谱荧光收集单元可以对受激发射荧光信号进行时间积分和二维空间积分；实时性收集多道（即：多个不同波长的）受激发射荧光的信号；通过弱信号图像传感器的相机对受激发射荧光信号的时间积分和受激发射荧光信号的二维空间积分可以将信噪比大幅度提升。可以检测低于0.005ng/ml的荧光物质， 高于市场上的仪器的平均灵敏度的20倍。不需要扫描，结果实时输出，没有移动部件，故障机会能做到最小，十分方便和简单地实现不同时刻对受激发射荧光信号的收集。

其中，多光谱荧光收集单元将经过时间积分和二维空间积分收集的多道（即：多个不同波长的）受激发射荧光信号上传到掌上计算机系统。掌上计算机系统显示荧光强度图像，掌上计算机系统为开放型系统，所述开放型系统的存储，不受样本数目、存储空间的限制，具有无线通讯功能，可以通过无线互联网在任何医疗机构中实现荧光免疫层析监测数据结果的共享、数据交换和远程监控；所述开放型系统柔性强，检测功能容易添加和修改，可以承载更加复杂的程序算法；省去信号放大，维稳电子线路，A/D转换和其它硬件开发和反复的工程过程，单纯应用软件的高级语言，程序短，简单，编程工作量少，不涉及软硬件相互作用的编程，开发时间大幅缩短和难度大幅降低 ，软件升级方便。

其中，基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统设置有一个五卡同读的绝对测量校准系统，所述五卡同读的绝对测量校准系统可以同时读取五种不同浓度的荧光标记物稀释液的绝对测量机构和校样；所述绝对测量机构和校样可以对仪器系统随时进行校准，保证输出检测数值的高重复性和可靠性。

其中，激发光源由恒流源驱动，实现光场照明的稳定。

其中，激发光源配备有弥散装置，实现光场的均匀照明。

其中，N通道激发滤光片是能同时通过需要的波长数的多道窄带滤光片，通过的波长数为N，实现多个样品的同时激发（N≥1）。

本发明的基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，能够实现对不同种类的荧光免疫层析试剂条实时地同时地收集成像，无需对试剂条进行逐个扫描，数据实时获取。不仅简化了操作过程，而且工艺结构简单、紧凑，成本低，体积小，同时提升了荧光采集效率。本发明采用对弱光具有高灵敏度成像能力的光电转换单元来最大限度的减少暗电流等对成像质量的影响，实现对低强度的荧光信号进行采集，使得荧光免疫层析系统的检测下限大幅度提升，更容易被广大用户接受。

 附图说明

图1 为荧光免疫层析定量分析系统示意图。

图2 为图像获取的时间积分图。

图3 为N通道马赛克滤光片（微滤片）与光电转换单元紧密结合形成的多光谱荧光收集单元结构示意图。

图4为N通道马赛克滤光片（微滤片）在荧光免疫层析检测仪系统的作用示意图(以N=4为例)。

图5为试剂条检测位置输出的数字荧光信号图。

图6为多光谱荧光收集单元在荧光免疫层析检测系统荧光信号收集的作用示意图。

图7为对微弱荧光信号检测的时间积分和空间积分示意图。

具体实施案例

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图祥予说明。

请一并参阅图1，本实施例中基于多光谱的荧光免疫层析定量分析系统，包含激发光源1，N通道激发滤光片2，弥散装置3，弱光光电转换单元4，与弱光光电转换单元紧密结合的N通道马赛克滤光片（微滤片）5，聚焦单元6，试剂条插口7组成的不透光的紧凑的检测模块10。

系统工作时，先将置于PVC底衬8上的反应后的免疫层析诊断试纸9送入仪器的试剂条插口7固定。半定量测量中诊断试纸9中包含检测带92和质控带91，能够对不低于传感器检测灵敏度的物质含量的荧光进行捕捉显示，通过荧光信号的强弱显示样品中待测物的有无；在定量中系统中录有待测物质样的标准曲线，软件根据得到的荧光图像，计算得出试纸条上检测带的相应数值。免疫层析诊断试纸9在仪器内固定后，经过恒流源驱动的稳定激发光源1经过N通道激发滤光片2后形成N个需要的激发光波长，后由弥散装置3形成均匀的照明。激发光均匀、稳定的照亮试诊断试纸9表面，发射波长经聚焦单元6聚焦成像在N通道马赛克滤光片（微滤片）5与弱光光电转换单元4紧密结合的多光谱荧光收集单元上，最后，软件根据得到的数字图像直接显示颜色的情况，或者计算得出免疫层析诊断试纸9的检测带的相应数值。掌上计算机系统11显示荧光强度图像，并对图像进行分析和处理；五卡同读的绝对测量校准系统提供读取不同稀释浓度的荧光标记物稀释液的绝对测量机构和校样。

请一并参阅图2，如图所示为图像获取的时间积分图。具有弱光成像能力的光电转换单元的曝光量计算方式中，E为投射到光电转换单元单位面积表面的光通量，阴影的面积为光电转换单元表面某一面元接收的光照度E在时间t1~t2内的积分，用公式表示为：

H(t)为阴影面积，表示与时间有关的曝光量，E（t）表示光通量随时间变化的函数。而普通相机曝光量H=E*t。其中照度E由光圈决定，而时间由快门控制。光圈大小与快门长短决定了曝光量的多少，因此，普通相机曝光量是固定的，很难实现对微弱荧光的拍摄。在本实施例中，则是采用带有制冷装置的天文相机，通过降低暗电流来提升图像的信噪比。同时所收集到的光信号是通过光照度E在时间t1~t2内的积分来获得，有利于对微弱荧光信号检测，从而全面提升了荧光免疫层析检测的灵敏度。

N通道马赛克滤光片（微滤片）与光电转换单元紧密结合的多光谱荧光收集单元可以对受激发射荧光信号进行时间积分和二维空间积分；实时性收集多道（即：多个不同波长的）受激发射荧光的信号；通过具有弱光成像能力的图像传感器的多光谱荧光收集单元对受激发射荧光信号的时间积分和受激发射荧光信号的二维空间积分可以将信噪比大幅度提升。

请一并参阅图3，本实施例中发射光经过光学成像单元成像后成像在四通道马赛克滤光片（以N=4为例）5与具有弱光成像能力的光电转换单元4（如CCD/CMOS图像传感器或者集成的带有空间分辨率的PMT等）紧密结合形成的多光谱荧光收集单元上。N通道马赛克滤光（微滤片）包含多个滤光微元，每一个微滤单元中都含有N个波长的通道51。

请一并参阅图4，本实施例中N通道马赛克滤光片（微滤片）在荧光免疫层析检测仪系统的作用示意图。以N=4的情况来说明N通道马赛克滤光片（微滤片）在荧光免疫层析检测仪系统的作用。图中标号为4的部件为具有弱光成像能力的图像传感器；5为微滤片；6为聚焦单元；9为试剂条； 11为计算机系统；13为数据线；12为原始图像；121、122、123、124分别为原始图12分离后的不同波长图像；λ_0i（i=1, 2, 3，4）， 即：λ₀₁，λ₀₂，λ₀₃和λ₀₄为不同波长的激发光，λ_i（i=1, 2, 3，4），即：λ₁，λ₂，λ₃和λ₄为不同波长的受激荧光。

给定试剂条9，根据需要检测的内容，选择所需要的激发光。不同波长的激发光λ₀₁或λ₀₂或λ₀₃或λ₀₄ 对试剂条9进行激发，试剂条9内的（标记了某种疾病的）荧光物质受激发后发射出的荧光信号λ₁或λ₂或λ₃或λ₄ 到达微滤片5上，图像传感器4通过数据线13连接到计算机，实时的获取原始图像12并同时分裂成对应于λ₁，λ₂，λ₃和λ₄不同波长受激荧光的121、122、123、124四幅图像，四幅图像中只有对应于λ₁或λ₂或λ₃或λ₄ 的图像可以看到亮线，其它的图像则不会显示亮线。

请一并参阅图5，如图所示为系统输出的荧光信号。本发明能够实现实时地同时地输出试剂条上所有检测位置的荧光信号强度。

请一并参阅图6，本实施例中多光谱荧光收集单元、激发光光场、N通道激发滤光片构成实时收集N种受激发射荧光信号的检测模块与掌上计算机组成荧光免疫层析检测仪系统（或者称为平台）其中7为试剂条板；9为试剂条；5为微滤片；4为弱信号图像传感器；41为微滤片5与具有弱光成像能力的图像传感器4相结合的荧光收集单元；10为实时收集N种受激发射荧光信号的检测模块；11为掌上计算机系统。

微滤片5与具有弱光成像能力的图像传感器4相结合形成的受激发射荧光信号收集单元41可以实时性收集多道（即：多个不同波长的）受激发射荧光的信号；通过弱信号图像传感器的相机对受激发射荧光信号的时间积分和受激发射荧光信号的二维空间积分可以将信噪比大幅度提升。检测低于0.005ng/ml的荧光物质， 高于市场上的仪器的平均灵敏度的20倍。

多光谱荧光收集单元41将经过时间积分和二维空间积分收集的多道（即：多个不同波长的）受激发射荧光信号上传到掌上计算机系统；所述掌上计算机系统显示荧光强度图像，所述掌上计算机系统为开放型系统，所述开放型系统的存储，内存对于检测的数量来说不限，可以承载更加复杂的程序算法，所述开放型系统具有无线通讯功能，可以通过无线互联网实现荧光免疫层析监测数据结果的共享、数据交换和远程监控；所述开放型系统柔性强，检测功能容易添加和修改；省去信号放大，维稳电子线路，A/D转换和其它硬件开发和反复的工程过程，单纯应用软件的高级语言，程序短，简单，编程工作量少，不涉及软硬件相互作用的编程，开发时间大幅缩短和难度大幅降低。

基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统实时性，不需要扫描，结果实时输出，没有移动部件，故障机会能做到最小，十分方便和简单地实现不同时刻对受激发射荧光信号的收集。

请一并参阅图7，如图所示为对微弱荧光信号检测的时间积分和空间积分示意图。其中X-Y轴坐标为二维空间坐标，Z轴坐标为时间坐标，微滤片与带有弱信号图像传感器相结合的相机而形成的受激发射荧光信号的单元可以对受激发射荧光信号进行时间积分和二维空间积分，简单地实现不同时刻对受激发射荧光信号的收集。所测荧光信号同时具有时间分辨率和空间分辨率。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，包含：N通道马赛克滤光片（微滤片）与光电转换单元紧密结合的多光谱荧光收集单元；均匀、稳定的激发光光场；N通道激发滤光片（N≥1）；掌上计算机系统和五卡同读的绝对测量校准系统；其特征在于所述的多光谱荧光收集单元、激发光光场、N通道激发滤光片紧凑的集合在一个不透光的密闭装置里，构成实时收集N种受激发射荧光信号的检测模块；所述检测模块与掌上计算机系统组成荧光免疫层析检测仪系统（或者称为平台）；掌上计算机系统显示荧光强度图像，并对图像进行分析和处理；五卡同读的绝对测量校准系统提供可以同时读取五种不同浓度的有荧光标记物稀释液的绝对测量机构和校样。

2.根据权利要求1所述的一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，其特征在于所述的多光谱荧光收集单元由N通道马赛克滤光片（微滤片）紧贴在光电转换单元表面；或者N通道马赛克滤光片（微滤片）直接镀膜制作在光电转换单元的表面。

3.根据权利要求1所述的一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，其特征在于所述的N通道马赛克滤光片(微滤片)包含多个滤光微元，每个滤光微元包含N个紧密排列的通道，所述每一个通道只允许一种特征波长的光信号通过，N通道马赛克滤光片（微滤片）同时通过的波长数为N。

4.根据权利要求1所述的一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，其特征在于所述的多光谱荧光收集单元的N通道马赛克滤光片（微滤片）同时通过的波长数为N，能够对一个试剂条的N种标记荧光或N个试剂条的N种标记荧光实现实时地同时地收集。

5.根据权利要求1所述的一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，其特征在于所述的多光谱荧光收集单元的光电转换单元是对弱光具有高灵敏度成像能力的光电转换单元，所述光电转换单元可以是但不限于是一维和二维空间分辨率的、制冷的，带有时间积分的图像传感器或者集成的带有一维和二维空间分辨率的PMT等。

6.根据权利要求5所述的一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，其特征在于所述的N通道马赛克滤光片（微滤片）与光电转换单元紧密结合的多光谱荧光收集单元对受激发射荧光信号进行时间积分和二维空间积分成像；实时收集N道（即：N个不同波长的）受激发射荧光的信号。

7.根据权利要求6所述的一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，其特征在于所述多光谱荧光收集单元将经过时间积分和二维空间积分收集的N道（即：N个不同波长的）受激发射荧光信号上传到掌上计算机系统；所述掌上计算机系统显示荧光强度图像，并对图像进行分析和处理。

8.根据权利要求1所述的一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，其特征在于所述系统设置有一个五卡同读的绝对测量校准系统，所述五卡同读的绝对测量校准系统可以同时读取五种不同浓度的荧光标记物稀释液的绝对测量机构和校样；所述绝对测量机构和校样可以对仪器系统随时进行校准，保证输出检测数值的高重复性和可靠性。

9.根据权利要求1所述的一种基于多光谱的荧光免疫层析定量分析及检测系统，其特征在于所述的均匀、稳定的激发光光场由恒流源驱动的激发光源，N通道激发滤光片和弥散装置构成。