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CN104968346B - 酪氨酸蛋白激酶抑制剂 - Google Patents

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CN104968346B CN201380062020.5A CN201380062020A CN104968346B CN 104968346 B CN104968346 B CN 104968346B CN 201380062020 A CN201380062020 A CN 201380062020A CN 104968346 B CN104968346 B CN 104968346B
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Abstract

本申请公开了如本文所述的Btk抑制剂化合物6‑叔丁基‑8‑氟‑2‑{3‑羟基甲基‑4‑[1‑甲基‑5‑(1′‑甲基‑1′，2′，3′，4′，5′，6′‑六氢‑[3，4′]联吡啶‑6‑基氨基)‑6‑氧代‑1，6‑二氢‑哒嗪‑3‑基]‑吡啶‑2‑基}‑2H‑酞嗪‑1‑酮、2‑(2‑{3‑[5‑(5‑氮杂环丁烷‑1‑基甲基‑1‑甲基‑1H‑吡唑‑3‑基氨基)‑1‑甲基‑6‑氧代‑1，6‑二氢‑哒嗪‑3‑基]‑2‑羟基甲基‑苯基}‑8‑氟‑1‑氧代‑1，2‑二氢‑异喹啉‑6‑基)‑2‑甲基‑丙腈和6‑叔丁基‑2‑[2‑羟基甲基‑3‑(5‑{5‑[(2‑甲氧基‑乙基氨基)‑甲基]‑吡啶‑2‑基氨基}‑6‑氧代‑1，6‑二氢‑吡啶‑3‑基)‑苯基]‑3，4‑二氢‑2H‑异喹啉‑1‑酮、其制剂和治疗哮喘的方法。

Description

酪氨酸蛋白激酶抑制剂
发明领域
本申请涉及抑制Btk并且可以用于治疗由异常B-细胞活化导致的自身免疫疾病和炎性疾病的新化合物的用途。
发明背景
蛋白质激酶组成人类酶的最大家族之一并且通过添加磷酸基团到蛋白质上来调节许多不同的信号传导过程(T.Hunter，Cell 1987 50：823-829)。特别地，酪氨酸激酶磷酸化蛋白质在酪氨酸残基的酚部分。酪氨酸激酶家族包括控制细胞生长、迁移和分化的成员。异常的激酶活性已经涉及许多人类疾病，包括癌症、自身免疫病症和炎性疾病。由于蛋白质激酶属于细胞信号传导的关键调节剂，它们提供用小分子激酶抑制剂来调节细胞功能的目标，并且因此成为了良好的药物设计靶标。除了激酶介导的疾病过程的治疗，激酶活性的选择性和有效抑制剂还可用于研究细胞信号传导过程和鉴定其它具有治疗意义的细胞靶标。
关于B细胞在自身免疫和/或炎性疾病的发病机制中的关键作用存在良好的证据。消耗B细胞的基于蛋白质的治疗剂如Rituxan针对自身抗体导致的炎性疾病如类风湿性关节炎是有效的(Rastetter等人Annu Rev Med2004 55：477)。因此，在B-细胞活化中发挥作用的蛋白质激酶的抑制剂应该是对于B细胞介导的疾病病理如自身抗体生成的有用的治疗剂。
通过B-细胞受体(BCR)的信号传导控制一系列B细胞应答，包括增殖和分化成成熟的抗体生成细胞。BCR是B-细胞活性的关键调节点并且异常的信号传导可以导致失调的B-细胞增殖和病原性自身抗体的形成，其导致多种自身免疫疾病和/或炎性疾病。酪氨酸蛋白激酶(Btk)是在BCR的膜近端和紧接下游的非-BCR相关的激酶。Btk的缺乏已经显示阻断BCR信号传导，并且因此Btk的抑制可以是阻断B细胞介导的疾病过程的有效治疗方法。
Btk是酪氨酸激酶Tec家族的成员，并且显示是早期B细胞形成以及成熟B细胞活化和存活的关键调节剂(Khan等人Immunity 1995 3：283；Ellmeier等人J.Exp.Med.2000192：1611)。人中的Btk突变导致病症X染色体连锁性无γ球蛋白血症(XLA)(Rosen等人NewEng.J.Med.1995333：431和Lindvall等人Immunol.Rev.2005 203：200中综述)。这些患者是免疫受损的，并且显示受损的B细胞成熟，降低的免疫球蛋白和外周B细胞水平，减少的不依赖T细胞的免疫应答以及在BCR刺激后的减弱的钙动员。
关于Btk在自身免疫病症和炎性疾病中的作用的证据已经由Btk-缺陷型小鼠模型提供。在系统性红斑狼疮(SLE)的临床前鼠模型中，Btk缺陷型小鼠显示疾病进展的显著改善。此外，Btk-缺陷型小鼠对胶原诱导的关节炎具有抗性(Jansson和HolmdahlClin.Exp.Immunol.1993 94：459)。已经证明选择性Btk抑制剂在小鼠关节炎模型中的剂量依赖性功效(Z.Pan等人，Chem.Med Chem.2007 2：58-61)。
Btk还由除了B-细胞之外可能涉及疾病过程的细胞表达。例如，Btk由肥大细胞表达并且Btk缺陷型骨髓来源的肥大细胞显示受损的抗原诱导的脱粒(Iwaki等人J.Biol.Chem.2005280：40261)。研究突出显示了Btk在调节其它细胞类型中的关键作用，所述其它类型细胞关键牵连过敏性哮喘的发生。特别地，不存在Btk在过敏性细胞因子产生和脱粒方面严重地损害FcεRI-依赖性细胞应答(Iyer等人J.Biol.Chem.2011 286：9503-13；Hata等人J.Exp.Med.1998 187：1235-47)。还证实Btk是IgE-介导的人嗜碱粒细胞活化所需的(MacGlashan等人Int.Immunopharmacol 2011 11：475-9)。这显示Btk可以用于治疗病理性肥大细胞应答，例如过敏症和哮喘。
先天性免疫信号传导逐步地被认识到在哮喘天然史中有关哮喘发作中可能的作用方面(Wu等人，Am J Respir Crit Care Med 2008；178：1123-1129)和该病的急性加重(Johnston等人，Br.Med.J.1995；310：1225-1229)起重要作用。已经证实模式识别受体例如Toll-样受体(TLRs)在过敏原致敏和气道炎症、重塑和高应答性方面起作用(Hammad等人Nat Med.2009；15(4)：410-6.)。Btk涉及这些受体的先天性信号传导下游。例如，已经证实Btk是体外TLR信号传导完全活化所需的(Liu等人，Nat Immunol.2011；12(5)：416-24)。已经证实体外Btk在启动TLR3信号传导方面起关键作用(Lee等人，Proc Natl Acad Sci U SA.2012；109(15)：5791-6)。这些数据表明Btk可以用于治疗TLR且特别是TLR3介导的先天性免疫应答疾病过程。
此外，来自XLA患者的单核细胞(其中Btk活性不存在)显示刺激后减少的TNFα产生(Horwood等人J Exp Med 197：1603，2003)。因此，TNFα介导的炎症可以被小分子Btk抑制剂调节。此外，已经报道Btk在细胞凋亡中起作用(Islam和Smith Immunol.Rev.2000 178：49)，且由此Btk抑制剂可以用于治疗一些B-细胞淋巴瘤和白血病(Feldhahn等人J.Exp.Med.2005 201：1837)。
发明概述
本申请公开了如下文所述的Btk抑制剂化合物6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮、2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮、其制剂和通过随其吸入治疗哮喘的方法。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮；2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈；或6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮。
本申请提供化合物6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮；2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈；或6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮，其用于通过吸入治疗哮喘。
本申请提供化合物6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮；2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈；或6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮在制备用于通过吸入治疗哮喘的药物中的用途。
本申请提供化合物6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮；2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈；或6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮在通过吸入治疗哮喘中的用途。
本申请提供包含微粉化的6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供包含微粉化的2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供包含微粉化的6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供包含微粉化的6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮和微粉化乳糖；微粉化的2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和微粉化乳糖；或微粉化的6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供式I的化合物，
或其药学上可接受的盐。
在附图中
图1：微粉化前后粉末X-射线衍射图案。上部曲线是微粉化后的。下部曲线是微粉化前的。
图2：化合物1对于mOVA36的粒度分布
图3：化合物1对于mOVA40的粒度分布
发明详述
定义
如本文使用的，短语“一(a)”或“一(an)”种实体是指一种或多种该实体；例如，一种化合物指一种或多种化合物或至少一种化合物。因此，术语“一种(a)”(或“一种(an)”)，“一种或多种”和“至少一种”可以在本文中可交换使用。
如在此说明书中使用的，不管在过渡性短语中或在权利要求的主体中，术语″包含″和″包括″应当被解释为具有开放式的含义。即，该术语应当被解释为与短语″至少具有″或″至少包括″同义。当在方法的上下文中使用时，术语″包含″是指该方法至少包括所述的步骤，但是可以包括另外的步骤。当在化合物或组合物的上下文中使用时，术语″包含″是指该化合物或组合物至少包括所述的特征或组分，但是还可以包括另外的特征或组分。
如本文中所用的，除非另外具体指出，单词″或″的使用是“和/或”的“包括”意思，而不是“或/或”的“排它”意思。
在描绘或描述本申请中采用的或要求保护的化合物的任何部分或式中，任何变量出现多于一次时，其在每一次出现时的定义独立于其在每一次另外出现时的定义。此外，取代基和/或变量的组合只有在这些化合物导致稳定的化合物的情况下才是允许的。
在键末端处的符号″＊″或划过键的″------″分别是指官能团或其它化学部分与其作为一部分的分子的余下部分的连接点。因此，例如：
MeC(＝O)OR4其中或
划入环体系中的键(与在明确的顶点处连接相反的)是指该键可以连接到任何适宜的环原子。
如本文中所用的术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情形可以、但不是必须发生，并且是指该描述包括事件或情形发生的情况，和它不发生的情况。例如，“任选取代的”是指任选取代的部分可以结合氢原子或取代基。
本文使用的术语″约″是指大致地、在...的附近、粗略地或大约。当术语″约″与一个数值范围一起使用时，它通过将边界延伸高于和低于所列出的数值而改变该范围。通常，本文使用的术语″约″将数值改变到高于和低于所述的值20％的方差。
本文使用的技术和科学术语具有本发明所属技术领域内的技术人员所通常理解的含义，除非另外定义。本文参考本领域技术人员已知的各种方法和材料。列出药理学的通用原理的标准参考作品包括Goodman和Gilman′s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第10版，McGraw Hill Companies Inc.，New York(2001)。可以将本领域技术人员已知的任何适宜材料和/或方法用于实施本发明。在下面的说明和实施例中涉及的材料、试剂等可获自商业来源，除非另外指出。
Btk抑制剂
本申请公开了如本文所述的Btk抑制剂化合物6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮(化合物1)、2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈(化合物2)和6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮(化合物3)、其制剂、通过随其吸入治疗哮喘的方法和在通过随其吸入治疗哮喘中的用途。
本申请涉及化合物1、2和3，其用于治疗无论任何类型、病因或发病机理的哮喘，且特别是选自如下成员的哮喘：特应性哮喘、非特应性哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、特应性支气管IgE-介导的哮喘、支气管哮喘、特发性气喘、真气喘、内源性哮喘、外源性哮喘、支气管炎性气喘、肺气肿性气喘、运动诱发哮喘、变应原诱发的哮喘、冷空气诱发的哮喘、职业性哮喘、夜间哮喘、季节性哮喘、咳嗽变异性哮喘、久喘、间歇性哮喘、轻度持续性哮喘、中度持续性哮喘、严重持续性哮喘、中性白细胞性哮喘、嗜酸细胞性哮喘、混合型哮喘、粒细胞缺乏性哮喘(paucigranulocytic asthma)、Th2-高哮喘、Th2-低哮喘、儿童哮喘、细菌、真菌、原生动物或病毒感染导致的病原体诱发的哮喘、初始哮喘、喘鸣婴儿综合征和毛细支气管炎。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮。
本申请提供上述方法，其中将6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮作为干粉通过吸入施用。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈。
本申请提供上述方法，其中将2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈作为干粉通过吸入施用。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮。
本申请提供上述方法，其中将6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮作为干粉通过吸入施用。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮、2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈或6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮，其中将任意的化合物作为干粉通过吸入施用。
本申请提供化合物6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮；2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈；或6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮，其作为干粉通过吸入治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症。
本申请提供6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮；2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈；或6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮在制备作为干粉通过吸入治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的药物中的用途。
本申请提供化合物6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮；2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈；或6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮在作为干粉通过吸入治疗哮喘中的用途。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪1-酮和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮和Lactohale LH 300的制剂。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮和Respitose ML 006的制剂。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮和微粉化乳糖；微粉化6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮和Lactohale LH 300；或微粉化6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮和Respitose ML 006的制剂。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的包含微粉化6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮和微粉化乳糖的制剂在通过吸入药理学有效量的该制剂治疗或改善哮喘或相关病症中的用途。
本申请提供包含微粉化2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供包含微粉化2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和Lactohale LH 300的制剂。
本申请提供包含微粉化2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和Respitose ML 006的制剂。
本申请提供包含微粉化2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和微粉化乳糖；微粉化2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和Lactohale LH 300；或微粉化2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和Respitose ML 006的制剂。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的包含微粉化2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供包含微粉化2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈和微粉化乳糖的制剂在通过吸入药理学有效量的该制剂治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症中的用途。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮丙腈和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮丙腈和Lactohale LH 300的制剂。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮和Respitose ML 006的制剂。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮丙腈和微粉化乳糖；微粉化6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮丙腈和大致为Lactohale LH 300；或微粉化6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮和Respitose ML 006的制剂。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的包含微粉化6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮和微粉化乳糖的制剂。
本申请提供包含微粉化6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮和微粉化乳糖的制剂在通过吸入药理学有效量的该制剂治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症中的用途。
本申请提供式I的化合物，
或其药学上可接受的盐。
本申请提供化合物6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮、2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈、或6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮的任意一种的化合物或其制剂与治疗剂的任意一种或多种的组合，所述治疗剂的一种或多种选自：
(a)5-脂氧合酶(5-LO)抑制剂或5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)拮抗剂；
(b)白三烯拮抗剂(LTRAs)，包括LTB4、LTC4、LTD4和LTE4的拮抗剂；
(c)组胺受体拮抗剂，包括H1和H3拮抗剂；
(d)用于减充血用途的α1-和α2-肾上腺素受体激动剂血管收缩拟交感神经药；
(e)短效或长效β2激动剂；
(f)PDE抑制剂，例如PDE3、PDE4和PDE5抑制剂；
(g)茶碱；
(h)色甘酸钠；
(i)COX抑制剂，即非选择性和选择性COX-1或COX-2抑制剂(NSAIDs)；
(j)口服和吸入糖皮质激素；
(k)针对内源性炎症实体的单克隆抗体；
(I)抗肿瘤坏死因子(抗-TNF-α)药；
(m)粘附分子抑制剂，包括VLA-4拮抗剂；
(n)激肽-B1-和B2-受体拮抗剂；
(o)免疫抑制剂；
(p)基质金属蛋白酶抑制剂(MMPs)；
(q)速激肽NK1、NK2和NK3受体拮抗剂；
(r)弹性酶抑制剂；
(s)腺苷A2a受体激动剂；
(t)尿激酶抑制剂；
(u)对多巴胺受体起作用的化合物，例如D2激动剂；
(v)NFκB途径调节剂，例如IKK抑制剂；
(w)细胞因子信号传导途径例如p38MAP激酶或syk激酶调节剂；
(x)可以被分类为祛痰药或镇咳药的活性剂；
(y)抗生素；
(z)HDAC抑制剂；
(aa)PI3激酶抑制剂；
(bb)CXCR2拮抗剂；和
(cc)毒蕈碱拮抗剂。
本申请提供治疗或改善哺乳动物的哮喘或相关病症的方法，包括通过吸入施用药理学有效量的上述组合。
本申请提供上述化合物或制剂的任一种在制备用于治疗炎性障碍的药物中的用途。
本申请提供上述化合物或制剂的任一种在制备用于治疗自身免疫疾病的药物中的用途。
本申请提供上述化合物或制剂的任一种在制备用于通过吸入治疗哮喘的药物中的用途。
本申请提供上述化合物或制剂的任一种在治疗炎性障碍中的用途。
本申请提供上述化合物或制剂的任一种在治疗自身免疫疾病中的用途。
本申请提供上述化合物或制剂的任一种在通过吸入治疗哮喘中的用途。
本申请提供用于治疗炎性障碍的上述化合物或制剂。
本申请提供用于治疗自身免疫疾病的上述化合物或制剂。
本申请提供用于治疗通过吸入治疗哮喘的上述化合物或制剂。
本申请提供如本文所述的方法、制剂、化合物或组合物。
化合物和制备
下表中提供本申请和本申请范围内包括的有代表性的化合物的实施例。提供这些实施例和随后的制备能够使本领域技术人员更清楚地理解和实施本发明。不应将它们视为限定本发明的范围，而是仅作为本发明的示例和代表。
一般而言，用于本申请中的命名法基于AUTONOMTM v.4.0，即用于生成IUPAC系统命名的Beilstein Institute计算机化系统。如果在描述的结构与给予该结构的名称之间存在不一致，则描述的结构被赋予更大的权重。此外，如果结构或结构部分的立体化学未使用例如实线或虚线表示，则该结构或结构部分被解释为包括其所有的立体异构体。
化合物1、2和3的发现
典型地在肺中发挥其作用的吸入药物的设计一般需要化合物是有效的并且具有足够的药代动力学特性(即高清除率和低生物利用度)，以便将全身暴露减少到最低限度(Tayab等人，Expert Opin.Drug Deliv.(2005)，2(3)，519-532)。对于预以用干粉吸入器(DPI)递送的药物而言，需要鉴定适合的稳定的和结晶的固体形式(Selby等人，FutureMed.Chem.(2011)，3(13)，1679-1701)。此外，在毒性研究中难溶性化合物具有与不需要的不良反应相关的可能性(Forbes等人，Adv Drug Del.Rev(2011)，63，69-87)。考虑到这些理念，筛选Roche的Btk抑制剂采集库以鉴定用于吸入的适合的候选物。
首先，一组33种化合物根据其高效能(FRET IC50＜50nM和/或HWB IC50＜1μM)和高溶解度(LYSA sol＞200μg/mL)选自Roche的1918种Btk化合物的采集库。还排除了具有低清除率(大鼠Cl＜40mL/min/kg或大鼠微粒体CLint＜25μl/min/mg蛋白质)即GSH试验中的标志或化合物库中的低利用度(＜10mg)的化合物。
其次，在获取有关33种化合物的组的另外的数据后(例如丢失的大鼠PK数据、结晶度信息、在刺激的肺流体的溶解度)，主要根据在大鼠体内的高清除率(大鼠Cl＞40mL/min/kg)进一步筛选一小组11种化合物。
最终，基于其结晶度和在与哮喘相关的体外试验中的高效能，将化合物1、2和3选作潜在的吸入候选物。
表I描述本申请中公开的化合物的实例：
表I.
一般合成方案
可以通过任意常规方式制备本申请的化合物。将合成这些化合物的适合的方法提供在实施例中。一般而言，可以根据如下方案制备本申请的化合物。
可以如方案1中所示在7个步骤中由商购原料制备化合物1。
方案1：化合物1的制备
如方案2、3和4中所示，在19个步骤中由商购原料制备化合物2。
方案2：化合物2的制备(步骤1-10)
方案3：化合物2的制备(步骤11-17)
方案4：化合物2的制备(步骤18-19)
如方案5、6和7中所示，在10个步骤中由化合物A和商购原料制备化合物3。5-溴-1-甲基-3-(5-(吗啉-4-羰基)吡啶-2-基氨基)吡啶-2(1H)-酮A的制备描述在文献(WO2011140488(A1))中。
方案5：化合物3的制备(步骤1-5)
方案6：化合物3的制备(步骤5-8)
方案7：化合物3的制备(步骤9-10)
药物组合物与施用
可以以广泛种类的施用剂型和适合于吸入递送的载体配制本发明的化合物。优选的施用方式是通过使用便利的每日给药方案进行吸入，所述给药方案可以根据痛苦的程度和患者对活性成分的反应进行调节。
本申请的一种化合物或多种化合物以及它们的药用盐，与一种或多种常规赋形剂、载体或稀释剂一起可以被置于药物组合物和单位剂量的形式中。药物组合物和单位剂型可以由常规比例的常用的成分组成，存在或不存在另外的活性化合物或要素，并且所述单位剂型可以包含与所意欲使用的日剂量范围相当的任何适合的有效量的活性成分。可以将药物组合物作为粉末使用。
术语“赋形剂”用于本文时指用于制备药物组合物的、通常是安全无毒并且没有生物学上或其它方面不适宜的化合物，并且包括可用于兽医使用以及人药物应用的赋形剂。本申请的化合物可以单独施用，但是通常与一种或多种根据意欲施用的途径和标准的药物实践选择的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体混合施用。
“药学上可接受的”是指其可以用于制备通常安全、无毒并且在生物学上和其它方面都没有不适宜的药物组合物，并且包括其对于兽医以及人类药物用途是可接受的。
活性成分的“药学上可接受的盐”形式也可以在开始赋予活性成分需要的药物代谢动力学性质，所述药物代谢动力学性质在非盐形式中是缺乏的，并且就其体内治疗活性而论，可能甚至正面影响活性成分的药效学。短语化合物的“药学上可接受的盐”指药物学上可接受的并且具有母体化合物的需要的药理活性的盐。所述盐包括：(1)酸加成盐，与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸等形成；或与有机酸如乙酸、富马酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、L(+)-酒石酸、D(-)-酒石酸、柠檬酸、1-羟基-2-萘甲酸、丙酸、对甲苯磺酸、肉桂酸、1，2-二苯丙烯酸、双羟萘酸、苯均四酸、癸二酸、均三甲苯磺酸、联苯二磺酸、2-萘磺酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸、硬脂酸、月桂酸(+)-樟脑酸、抗坏血酸、戊二酸等形成；或(2)当在母体化合物中存在的酸质子被金属离子例如碱金属离子、碱土离子或铝离子替换时形成的盐；或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等配位形成的盐。
在另一个方面，本申请涉及适用于通过吸入给患者施用的剂型，例如，为干粉、气雾剂、混悬液或溶液组合物。在一个实施方案中，本申请涉及适合于通过作为干粉吸入对或者施用的剂型。在另一个实施方案中，本申请涉及适用于通过经喷雾器吸入对患者施用的剂型。
通过吸入递送至肺的干粉组合物典型地包含作为精细粉末的本申请的多晶型物或盐与作为精细粉末的一种或多种药学上可接受的赋形剂。特别适用于干粉的药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员公知的，且包括乳糖、淀粉、甘露糖醇和单糖、二糖和多糖。例如，可以通过微粉化和研磨制备精细粉末。一般而言，可以将尺寸减小的(例如微粉化的)化合物定义为D(50)值约为1-约10微米(例如使用激光衍射测定的)。
可以通过储器式干粉吸入器(RDPI)将干粉施用于患者，所述储器式干粉吸入器(RDPI)具有适合于储存以干粉形式的多种(未计量剂量)药物的储器。RDPIs典型地包括用于将每种药物剂量从储器中到达递送位置的用具。例如，剂量用具可以包含计量杯，其从可以填充来自储器的药物的杯的第一个位置移动至患者可以利用吸入经计量的药物的第二个位置。
或者，干粉可以以用于多剂量干粉吸入器(MDPI)的胶囊(例如明胶或塑料)、药筒或泡罩包的形式提供。MDPIs是这样的气雾吸入器，其中药物包含在多剂量药包中，其包含(否则就是携带)多种确定剂量(或其部分)的药物。当将干粉作为泡罩包提供时，其包含多个封闭干粉形式的药物的泡罩。这些泡罩典型地以规则形式排列，以易于从其中释放药物。例如，泡罩可以以一般环状方式排列在盘形泡罩包上，或泡罩可以为长形，例如包含条或带。例如，每个胶囊、药筒或泡罩可以包含20μg-10mg的本申请的多晶型物或盐。
可以通过将本申请的多晶型物或盐混悬于液化抛射剂形成气雾剂。适合的抛射剂包括卤烃类、烃类和其它液化气体。有代表性的抛射剂包括：三氯氟甲烷(抛射剂11)、二氯氟甲烷(抛射剂12)、二氯四氟乙烷(抛射剂114)、四氟乙烷(H FA-134a)、1，1-二氟乙烷(HFA-152a)、二氟甲烷(HFA-32)、五氟乙烷(HFA-12)、七氟丙烷(HFA-227a)、全氟丙烷、全氟丁烷、全氟戊烷、丁烷、异丁烷和戊烷。包含本申请的多晶型物或盐的气雾剂典型地通过定量定压式气雾器(MDI)对患者施用。这样的装置是本领域技术人员公知的。
气雾剂还可以包含药学上可接受的典型地用于MDIs的赋形剂，例如表面活性剂、润滑剂、共溶剂和用于改善制剂物理稳定性、改善阀门性能、改善溶解性或改善味道的其它赋形剂。
因此，提供气雾剂药物制剂作为本申请的另一个方面，其包含本申请的多晶型物或盐和氟碳化合物或含氢氯氟碳化合物作为抛射剂，任选地与表面活性剂和/或共溶剂组合。
根据本申请的另一个方面，提供气雾剂药物制剂，其中抛射剂选自1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-七氟-正-丙烷及其混合物。
可以通过添加适合的缓冲剂缓冲本申请的制剂。
可以配制用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊和药筒，其包含用于吸入本申请多晶型物或盐和适合的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。每个胶囊或药筒一般可以包含20μg-10mg的本申请的多晶型物或盐。或者，可以以不含赋形剂例如乳糖的形式提供本申请的多晶型物或盐。
本申请局部用组合物中的活性多晶型物或盐的比例取决于所制备的制剂的精确类型，但一般在0.001-10％重量范围内。一般地，对于大部分类型的制剂，所用比例可以在0.005-1％，例如0.01-0.5％。然而，在用于吸入或吹入的粉末中，所用比例通常在0.1-5％。
优选这样安排气雾剂，使得每种经计量的气雾剂剂量或″粉扑″包含20μg-10mg、优选20μg-2000μg、更优选约20μg-500μg的本申请的多晶型物或盐。可以每日施用1次或几次，例如2、3、4或8次，得到，例如，每次1、2或3个剂量。使用气雾剂的每日总剂量在10μg-10mg，优选20μg-2000μg。由吸入器或吹入器中胶囊和药筒递送的总每日剂量和经计量的剂量一般双倍于使用气雾剂递送的剂量。
在混悬液气雾剂的情况中，例如，在施用气雾剂时，药物颗粒(例如微粉化的)的粒度应允许基本上所有药物吸入肺，并且由此应小于100微米，期望小于20微米，特别是在1-10微米，例如1-5微米，更优选2-3微米。
可以通过在适合的容器中，例如借助于超声或高剪切混合器将本申请的药物和多晶型物或盐分散或溶解于选择的抛射剂中制备本申请的制剂。该方法期望在受控的湿度条件下进行。
本申请气雾剂的化学和物理稳定性和药物可接受性可以通过本领域技术人员众所周知的技术测定。因此，例如，可以通过HPLC测定法，例如在延长贮存产品后测定成分的化学稳定性。物理稳定性数据可以得自其它常规分析技术，例如通过渗滤试验、阀门递送试验(每次启动的平均射出重量)、剂量再现性试验(每次启动的活性成分)和喷雾分布分析。
可以通过常规技术测定本申请混悬液气雾剂的稳定性，例如通过使用逆光散射仪器测定絮凝尺寸分布或通过用串连压紧测定粒度分布或通过″双冲击式吸收管″分析法。本文所用的涉及的″双冲击式吸收管″试验是指如英国药典(British Pharmacopaeia)1988的A204-207页附录XVII C中所定义的″使用仪器A测定加压吸入剂中发射的剂量沉积″。这样的技术能够计算气雾剂的″可吸收的部分″。用于计算″可吸收的部分″的一种方法涉及″细颗粒部分″，其为每次启动收集在下部碰撞室内的活性成分的量，表示为每次使用上述双冲击式吸收管启动递送的活性成分的总量百分比。
术语″定量定压式气雾器″或MDI是指包含罐、覆盖罐的固定帽和定位于帽中的制剂计量阀的装置。MDI系统包括适合的多路传输装置。适合的多路传输装置包含，例如阀门传动装置和圆柱形或圆锥形通道，通过该通道药物可以从充满的罐中经计量阀被递送至患者鼻部或口腔，例如喉口传动装置。
MDI罐一般包含能够承受所用抛射剂的蒸气压的容器，例如塑料或塑料涂敷的玻璃瓶或优选金属罐例如铝或其合金，其可任选被阳极化的涂漆涂敷的和/或塑料涂敷的(例如本文引入的参考文献WO96/32099，其中内表面的部分或全部被一种或多种氟碳化合物聚合物任选地与一种或多种非氟碳化合物聚合物的组合涂敷)，该容器用计量阀门密封。可以将帽通过超声焊接、螺丝配合或旋紧固定在罐上。本文教导的MDIs可以通过本领域的方法制备(例如，参见上文的Byron和WO96/32099)。优选地，所述罐可以配有帽组件，其中药物计量阀门定位于帽中且所述帽旋紧就位。
在本申请的一个实施方案中，罐的金属内表面上涂敷有氟聚合物，更优选该氟聚合物掺合了非氟聚合物。在本申请的另一个实施方案中，所述罐的金属内表面上涂敷有聚四氟乙烯(PTFE)和聚醚砜(PES)的聚合物掺合物。在本申请的另一个实施方案中，所述罐的金属内表面上整体涂敷有聚四氟乙烯(PTFE)和聚醚砜(PES)的聚合物掺合物。将计量阀门设计成每次启动可递送经计量的制剂用量，并且结合有垫圈，以防止抛射剂通过阀门泄漏。垫圈可以包含任意适合的弹性材料，例如低密度聚乙烯、氯丁化合物(chorobutyl)、溴丁化合物(bromobutyl)、EPDM、黑和白丁二烯-丙烯腈橡胶、丁基橡胶和氯丁橡胶。适合的阀门商购自气雾剂工业中众所周知的制造商，例如购自Valois，France(例如DF10、DF30、DF60)、Bespak pic、UK(例如BK300，BK357)和3M-Neotechnic Ltd，UK(例如SpraymiserTM)。在不同的实施方案中，MDIs也可以与其它结构结合使用，例如、但不限于用于储存和包含MDIs的外包装，包括描述在美国专利US 6,119,853；US 6,179,118；6,315,112；US 6,352,152；US 6,390,291；和US 6,679,374中的那些，以及剂量计数装置，例如、但不限于描述在美国专利US6,360,739和US 6,431,168中的那些。
本领域技术人员众所周知的常规批量制备方法和机器可以用于制备用于商业化生产填充罐的大规模批量。因此，例如在一种用于制备混悬液气雾剂的批量制备方法中，将计量阀门旋紧在铝罐上，形成空罐。将液化的抛射剂与任选的赋形剂通过加料容器加压填充入制造容器。混合药物混悬液，然后再循环至填充机，然后将药物混悬液的等分部分通过计量阀门填充入罐。在一个用于制备溶液气雾剂的批量制备方法的实例中，将计量阀门旋紧在铝罐上，形成空罐。将液化的抛射剂与任选的赋形剂和溶解的药物一起通过加料容器加压填充入制造容器。
在一种可选的方法中，将液化的制剂的一部分在足够冷以确保制剂不汽化的条件下加入到开放的罐中，然后将计量阀门在罐上旋紧。
典型地，在为制药应用制备的批量中，检查每个填充罐的重量，用批号编码，并且填充入储存盘，然后进行释放测试。还可以将包含本申请多晶型物或盐的混悬液和溶液通过喷雾器施用于患者。用于雾化的溶剂或助悬剂可以是任意的药学上可接受的液体，例如水、盐水溶液、醇类或二醇类例如乙醇、异丙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇等或其混合物。盐水溶液使用在施用后几乎不展示出或不展示药理学活性的盐。有机盐例如碱金属或铵卤盐例如氯化钠、氯化钾或有机盐例如钾、钠和铵盐或有机酸例如抗坏血酸、柠檬酸、乙酸、酒石酸等可以用于该目的。
可以将其它药学上可接受的赋形剂加入到混悬液或溶液中。本申请的多晶型物或盐可以通过添加如下成分稳定：无机酸，例如盐酸、硝酸、硫酸和/或磷酸；有机酸，例如抗坏血酸、柠檬酸、乙酸和酒石酸等；配合剂，例如EDTA或柠檬酸及其盐；或抗氧化剂，例如抗氧化剂，例如维生素E或抗坏血酸。它们可以单独使用或一起使用以稳定本申请的多晶型物或盐。可以加入防腐剂，例如苯扎氯铵或苯甲酸及其盐。特别地可以加入表面活性剂以改善混悬液的物理稳定性。它们包括卵磷脂、二辛基磺基琥珀酸二钠、油酸和山梨坦酯类。
适应症和治疗方法
如本文所述的化合物1、2和3抑制酪氨酸激酶(Btk)。上游激酶活化Btk导致磷酸酶-Cγ活化，由此刺激促炎介体释放。化合物1、2和3用于治疗哮喘。本申请还公开用于通过吸入递送治疗哮喘的药物组合物或制剂，其包含化合物1、2或3与药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本申请提供治疗具有哮喘的患者的方法，所述哮喘对通过吸入如本文所述的化合物1、2或3抑制Btk活性有应答。
本申请提供如本文所述的化合物1、2或3在治疗具有对通过吸入抑制Btk活性有应答的哮喘的患者中的用途。
本申请提供如本文所述的化合物1、2或3在制备用于治疗具有对通过吸入抑制Btk活性有应答的哮喘的患者的药物中的用途。
本申请提供如本文所述的化合物1、2或3，其用于治疗具有对通过吸入抑制Btk活性有应答的哮喘的患者。
本申请提供如上所述的本发明。
联合治疗
为避免疑惑，本文涉及的″治疗″包括涉及治愈、缓解和预防性治疗。
根据本申请的另一个实施方案，本申请化合物1、2或3或其组合物还可以作为与一种或多种另外的治疗剂的组合使用，以共同施用于患者，得到一些特别期望的最终治疗结果，例如治疗病理生理学相关疾病过程，包括、但不限于：(i)支气管收缩；(ii)炎症；(iii)过敏症；(iv)气道重塑；v)症候和症状，例如气绝、咳嗽。
本文涉及本申请化合物1、2或3和一种或多种其它治疗剂所用的术语″共同施用″、″共施用″和″组合使用″预以指且确切地是指和包括如下内容：
·本申请这样的化合物1、2或3与治疗剂的组合对需要治疗的患者同时施用，此时将这样的成分一起配制成单一剂型，其基本上同时给所述患者释放所述成分；
·本申请这样的化合物1、2或3与治疗剂的组合对需要治疗的患者基本上同时施用，此时将这样的成分彼此分别配制成单独的剂型，在基本上同时给所述患者释放所述成分时，由所述患者基本上同时服用所述剂型；
·本申请这样的化合物1、2或3与治疗剂的组合对需要治疗的患者依次施用，此时将这样的成分彼此分别配制成单独的剂型，在基本上不同时间给所述患者释放所述成分时，由所述患者在每次施用之间明显的时间间隔依次服用所述剂型；和
·本申请这样的化合物1、2或3与治疗剂的组合对需要治疗的患者依次施用，此时将这样的成分配制成单一剂型，在由所述患者在相同和/或不同时间同时、依次和/或重叠施用它们时，所述剂型以受控方式释放所述成分，其中可以通过相同或不同途经施用每个部分。
可以与化合物1、2或3或其药学上可接受的盐联用的其它治疗剂的适合的实例包括、但绝不限于：
(a)5-脂氧合酶(5-LO)抑制剂或5-脂氧合酶活化蛋白(FLAP)拮抗剂；
(b)白三烯拮抗剂(LTRAs)，包括LTB4、LTC4、LTD4和LTE4拮抗剂；
(c)组胺受体拮抗剂，包括H1和H3拮抗剂；
(d)用于减充血用途的α1-和α2-肾上腺素受体激动剂血管收缩拟交感神经药；
(e)短效或长效β2激动剂；
(f)PDE抑制剂，例如PDE3、PDE4和PDE5抑制剂；
(g)茶碱；
(h)色甘酸钠；
(i)为非选择性和选择性COX-1或COX-2抑制剂(NSAIDs)的COX抑制剂；
(j)口服和吸入糖皮质激素；
(k)针对内源性炎症实体的单克隆抗体；
(I)抗肿瘤坏死因子(抗-TNF-α)药；
(m)粘附分子抑制剂，包括VLA-4拮抗剂；
(n)激肽-B1-和B2-受体拮抗剂；
(o)免疫抑制剂；
(p)基质金属蛋白酶抑制剂(MMPs)；
(q)速激肽NK1、NK2和NK3受体拮抗剂；
(r)弹性酶抑制剂；
(s)腺苷A2a受体激动剂；
(t)尿激酶抑制剂；
(u)对多巴胺受体起作用的化合物，例如D2激动剂；
(v)NFκB途径调节剂，例如IKK抑制剂；
(w)细胞因子信号传导途径例如p38MAP激酶或syk激酶调节剂；
(x)可以被分类为祛痰药或镇咳药的活性剂；
(y)抗生素；
(z)HDAC抑制剂；
(aa)PI3激酶抑制剂；
(bb)CXCR2拮抗剂；和
(cc)毒蕈碱拮抗剂。
本申请提供化合物1、2或3与如下活性成分的组合：
-H3拮抗剂；
-β2激动剂；
-毒蕈碱拮抗剂；
-PDE4抑制剂；
-类固醇，尤其是糖皮质激素；
-腺苷A2a受体激动剂；
-细胞因子信号传导途径例如p38MAP激酶或syk激酶调节剂；或
-白三烯拮抗剂(LTRAs)，包括LTB4、LTC4、LTD4和LTE4的拮抗剂。
本申请提供化合物1、2或3与如下活性剂的组合：
-糖皮质激素，特别是具有减少的全身副作用的吸入糖皮质激素，包括泼尼松、泼尼松龙、氟尼缩松、曲安奈德、丙酸倍氯米松、布地奈德、丙酸氟替卡松、环索奈德和糠酸莫米松；或
-β2激动剂，特别地包括舒喘灵、特布他林、班布特罗、非诺特罗、沙美特罗、福莫特罗、妥洛特罗及其盐；或
-毒蕈碱拮抗剂，包括噻托溴铵、异丙托溴铵、芜地溴铵(umeclidinium bromide)、格隆溴铵、氧托溴铵、aclidium bromide、达罗溴铵和PF-3635659。
本申请提供用于治疗哮喘中的如上所述的组合。
本申请提供如上所述的组合在治疗哮喘中的用途。
实施例
一般缩写
通常使用的缩写包括：乙酰基(Ac)，偶氮二异丁腈(AIBN)，大气压(Atm)，9-硼杂双环[3.3.1]壬烷(9-BBN或BBN)，2，2’-双(二苯基膦)-1，1’-联萘(BINAP)，叔丁氧羰基(Boc)，焦碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl pyrocarbonate)或boc酸酐(BOC2O)，苄基(Bn)，丁基(Bu)，化学文摘登记号(CASRN)，苄氧羰基(CBZ或Z)，羰基二咪唑(CDI)，1，4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)，三氟化二乙氨基硫(DAST)，二亚苄基丙酮(dba)，1，5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)，1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)，N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)，1，2-二氯乙烷(DCE)，二氯甲烷(DCM)，2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯并醌(DDQ)，偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)，偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)，氢化二异丁基铝(DIBAL或DIBAL-H)，二异丙基乙胺(DIPEA)，N，N-二甲基乙酰胺(DMA)，4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，1，1′-双-(二苯基膦基)乙烷(dppe)，1，1′-双-(二苯基膦基)二茂铁(dppf)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)，乙基(Et)，乙酸乙酯(EtOAc)，乙醇(EtOH)，2-乙氧基-2H-喹啉-1-甲酸乙酯(EEDQ)，二乙醚(Et2O)，乙基异丙基醚(EtOiPr)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐乙酸(HATU)，乙酸(HOAc)，1-N-羟基苯并三唑(HOBt)，高压液相色谱(HPLC)，异丙醇(IPA)，氯化异丙基镁(iPrMgCl)，六甲基二甲硅基胺(HMDS)，液相色谱质谱(LCMS)，六甲基锂二甲硅基胺(LiHMDS)，间-氯过氧苯甲酸(m-CPBA)，甲醇(MeOH)，熔点(mp)，MeSO2-(甲磺酰基或Ms)，甲基(Me)，乙腈(MeCN)，间氯过苯甲酸(MCPBA)，质谱(ms)，甲基叔丁基醚(MTBE)，甲基四氢呋喃(MeTHF)、N-溴琥珀酰亚胺(NBS)，n-丁基锂(nBuLi)，N-羧基酸酐(NCA)，N-氯琥珀酰亚胺(NCS)，N-甲基吗啉(NMM)，N-甲基-吡咯烷酮(NMP)，氯铬酸吡啶鎓(PCC)，二氯-((双-二苯基膦基)二茂铁基)钯(II)(Pd(dppf)Cl2)，醋酸钯(II)(Pd(OAc)2)，三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(Pd2(dba)3)，重铬酸吡啶鎓(PDC)，苯基(Ph)，丙基(Pr)，异丙基(i-Pr)，磅/平方英寸(psi)，吡啶(pyr)，1，2，3，4，5-五苯基-1′-(二叔丁基膦基)二茂铁(Q-Phos)，室温(rt或RT)，仲丁基锂(sBuLi)，叔丁基二甲基甲硅烷基或t-BuMe2Si(TBDMS)，四正丁基氟化铵(TBAF)，三乙胺(TEA或Et3N)，2，2，6，6-四甲基哌啶1-氧基(TEMPO)，三甲基甲硅烷基乙氧基甲基(SEM)，三氟甲磺酸根或CF3SO2-(Tf)，三氟乙酸(TFA)，1，1′-双-2，2，6，6-四甲基庚烷-2，6-二酮(TMHD)，O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU)，薄层色谱(TLC)，四氢呋喃(THF)，三甲代甲硅烷基或Me3Si(TMS)，一水合对甲苯磺酸(TsOH或pTsOH)，4-Me-C6H4SO2-或甲苯磺酰基(Ts)和N-氨基甲酸乙酯-N-羧基酸酐(UNCA)。当用于烷基部分时，包括前缀正(n)、异(i-)、仲(sec-)、叔(tert-)和新(neo)的常规命名法具有它们的惯用含义(J.Rigaudy和D.P.Klesney，Nomenclature in Organic Chemistry，IUPAC 1979 Pergamon Press，Oxford.)。
一般条件
可以以商购原料开始，通过使用本领域技术人员公知的一般合成技术和方法制备本申请的化合物。下文概括了适合于制备这样的化合物的反应方案。另外的示例可以在具体实施例中找到。
具体缩写
boc 叔丁氧基羰基
CH2Cl2 二氯甲烷
Cs2CO3 碳酸铯
DCM 二氯甲烷
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲亚砜
EtOAc 乙酸乙酯
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐
Hunig’s Base N，N-二异丙基乙胺
HCl 氯化氢
LC-MS 液相色谱法质谱法
HPLC 高压液相色谱法
MeOH 甲醇
MgSO4 硬脂酸镁
nBuLi 正丁基锂
NaCl 氯化钠
Na2CO3 碳酸钠
NaOMe 甲醇钠
Na2SO4 硫酸钠
NH4OH 氢氧化铵
NMP 1-甲基-2-吡咯烷酮
NMR 核磁共振
Pd(OAc)2 乙酸钯(II)
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
TMSCl 三甲基甲硅烷基氯
一般实验详细描述
试剂购自Aldrich，Oakwood，Matrix或其它供应商并且无需进一步纯化使用。使用用于加热的微波照射的反应使用Personal Chemistry Emrys Optimizer System或CEMDiscovery System进行。本领域技术人员公知的方法例如硅胶闪蒸塔洗脱、制备型闪蒸塔纯化也在一些情况中通过使用一次性预装填多克硅胶柱(RediSep)进行，用CombiFlash系统洗脱。BiotageTM和ISCOTM也是闪蒸塔仪器，其可以用于本申请，以便纯化中间体。
为了判断化合物身份和纯度的目的，使用下列系统记录LC/MS(液相色谱法/质谱法)光谱。为了测定质谱，所述系统由Micromass Platform II光谱仪组成：正模式ES电离(质量范围：150-1200)。使用如下HPLC系统进行同时的色谱分离：ES IndustriesChromegabond WR C-18 3u(3.2x 30mm)柱体；流动相A：水(0.02％TFA)和B相：乙腈(0.02％TFA)；梯度10％B-90％B，3分钟；平衡时间1分钟；流速2mL/分钟。
还通过反相HPLC、使用本领域技术人员众所周知的方法纯化下述化合物。在一些情况中，使用PE Sciex 150 EX Mass Spec进行制备型HPLC纯化，所述PE Sciex 150 EXMass Spec控制Gilson 215采集器，该采集器连接至Shimadzu制备型HPLC系统和Leap自动注射器。从洗脱流中采集化合物，使用正离子检测形式的LC/MS检测：从C-18柱上洗脱化合物(2.0 X 10cm，以20mL/min洗脱)使用适合的溶剂(A)0.05％TFA/H2O和溶剂(B)0.035％TFA/乙腈的线性梯度模式在10分钟内进行。为了注射在HPLC系统上，将粗样品溶于甲醇、乙腈和DMSO的混合物。
通过1H-NMR、使用Bruker 400MHz NMR光谱仪或LCMS表征化合物。
可以根据公知技术合成本申请的化合物。提供如下实施例和参比例是为了有助于理解本申请。然而，不预以将实施例限定本申请，其真实的范围在待批权利要求中举出。实施例终产物的名称一般使用Isis AutoNom2000生成。
制备实施例
化合物1的制备
步骤1. 6-硝基-3′，6′-二氢-2′H-[3，4′]联吡啶-1′-甲酸叔丁酯的制备
方法A
在500mL圆底烧瓶中，合并5-溴-2-硝基吡啶(6.56g，32.3mmol)和4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(10g，32.3mmol)与二噁烷(160ml)，得到淡黄色溶液。加入Cs2CO3(21.1g，64.7mmol)和水(6ml)。用氩气给该反应混合物脱气，然后加入二氯化双(三苯膦)钯(II)(2.27g，3.23mmol)。将该反应混合物加热至80℃，搅拌15h。将该反应混合物倾入500mL H2O，用EtOAc(3x 200mL)萃取。用盐水洗涤合并的萃取物，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。通过快速色谱法纯化粗物质(硅胶，220g，10％-40％EtOAc的己烷溶液)，得到粉红色固体。将得到的固体与乙醚一起研磨，得到期望的产物，为固体(4.8g)。合并来自研磨的滤液和来自首次色谱的混合级分，通过快速色谱法纯化(硅胶，220g，20％-40％EtOAc的己烷溶液)，又得到产物(2.2g)。1H NMR(400MHz，CHCl3-d)δppm 1.52(s，9H)2.59(d，J＝1.52Hz，2H)3.72(t，J＝5.56Hz，2H)4.19(d，J＝3.03Hz，2H)6.35(br.s.，1H)7.97(dd，J＝8.46，2.40Hz，1H)8.27(d，J＝8.34Hz，1H)8.67(d，J＝2.27Hz，1H)。
方法B
向安装机械搅拌器、加热罩、冷凝器、温度计的12.0L三颈烧瓶中加入5-溴-2-硝基吡啶(322g，1.59mol)、碳酸钾(658g，4.76mol)、4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(500g，1.62mol)、1，4-二噁烷(3.24kg，3.14l)和水(314g，314ml)。通过抽真空、然后用N2释放给该溶液脱气。在N2强气流气氛中，加入二氯化双(三苯膦)钯(ii)(11.1g，15.9mmol)。将该反应混合物在80℃搅拌5小时。切断加热，将该反应混合物在环境温度搅拌过夜。将该混合物加热至40℃，然后加入活性炭(200g，16.7mol)。将该混合物在40℃搅拌1小时。将该混合物冷却至30℃，然后通过CeliteTM过滤，用大量二噁烷洗涤。向合并的滤液和洗涤液中加入过氧化氢(50.0g，45.0ml，441mmol)，将该混合物在环境温度搅拌1小时。将淡红色溶液储存在室温下48小时，然后在50℃真空浓缩至小体积溶液(重量约3226g)。将该溶液转入12L三颈烧瓶，储存在室温下和N2气氛中过夜。将该溶液加热至40℃，然后缓慢地加入到水(3.38kg，3.38l，188mol)中。结晶出固体。切断加热，将该混合物冷却至室温。将该混合物冷却至8℃，搅拌2小时。过滤出固体，用1∶2二噁烷/水、然后用水洗涤。真空干燥固体30分钟。将固体转入干燥盘，然后在50℃/26英寸Hg下与N2气流气氛中真空烘箱干燥至恒重，得到460g(95％)期望的产物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 1.43(s，9H)2.55(d，J＝1.89Hz，2H)3.47-3.73(m，2H)4.08(d，J＝2.64Hz，2H)6.57(br.s.，1H)8.20-8.26(m，1H)8.27-8.33(m，1H)8.77(d，J＝1.89Hz，1H)。
步骤2.6-氨基-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[3，4′]联吡啶-1′-甲酸叔丁酯的制备
方法A
在500mL圆底烧瓶中，合并在EtOH(300ml)和乙酸乙酯(75ml)中的4-(6-硝基吡啶-3-基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(4.9g，16.0mmol)与披钯碳(1.32g，1.24mmol)。用氢将该反应混合物抽真空2次，然后用充氢的气囊搅拌过夜。LC/MS分析显示反应完成。用氮气净化该反应混合物，通过硅藻土过滤。用EtOAc将硅藻土饼洗涤几次。向无色合并的滤液和洗涤液中加入CH2Cl2，将该溶液蒸发至干。再加入CH2Cl2。真空浓缩该溶液，得到定量收率的期望的产物。(M+H)+＝278m/e。
方法B
反应器预处理：向20L氢化反应器加入10g Pd/C和8L乙酸乙酯。将该混合物在60℃搅拌4小时。切断加热，将混悬液冷却至室温。排出该混悬液。向20L氢化反应器中加入4-(6-硝基吡啶-3-基)-5，6-二氢吡啶-1(2H)-甲酸叔丁酯(460g，1.51mol)在乙酸乙酯(2.3kg，2.56l)中的混悬液。将EtOH(2.02kg，2.56l)用于将残余物从包含该混悬液的烧瓶中冲洗入氢化反应器。然后加入Pd/C(160g，75.4mmol)。用N2将该混悬液脱气3次和H2脱气3次后，将该反应体系在500psi氢气气氛中在60℃搅拌3小时。排出反应器的内容物，通过CeliteTM过滤，用大量乙酸乙酯洗涤。将合并的滤液和洗涤液储存在冷的室内和N2气氛中过夜，然后在40℃真空浓缩至干，得到灰色固体。加入MTBE(1.53kg，2.06l，17.3mol)，真空浓缩该溶液至小体积，以除去700ml溶剂。加入N-庚烷(705g，1.03l，7.04mol)，真空浓缩该溶液以除400ml溶剂。再加入N-庚烷(705g，1.03l，7.04mol)，真空浓缩该溶液，得到可流动的淤浆。将该淤浆在室温搅拌30分钟，然后冷却至9℃，其中将其搅拌45分钟。然后过滤该混悬液，用冷庚烷洗涤。将黄白色固体转入干燥盘，在30℃/26英寸Hg下与N2气流气氛中真空烘箱干燥过周末。过滤得到381g(91％)期望的产物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 1.18-1.53(m，11H)1.66(d，J＝11.33Hz，2H)2.76(br.s.，2H)4.04(d，J＝12.46Hz，2H)5.67(s，2H)6.38(d，J＝8.69Hz，1H)7.25(dd，J＝8.50，2.45Hz，1H)7.76(d，J＝2.27Hz，1H)。
步骤3.6-(6-氯-2-甲基-3-氧代-2，3-二氢-哒嗪-4-基氨基)-3′，4′，5′，6′-四氢-2′H-[3，4′]联吡啶-1′-甲酸叔丁酯的制备
方法A
在氩气气氛中将4-溴-6-氯-2-甲基哒嗪-3(2H)-酮(3.59g，16.0mmol)、4-(6-氨基吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(4.45g，16.0mmol)、4，5-双(二苯基膦基)-9，9-二甲基呫吨(696mg，1.2mmol)和碳酸铯(18.3g，56.2mmol)混悬于二噁烷(150ml)。最终加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(551mg，602μmol)。将该反应混合物在90℃加热过夜。用硅藻土过滤该反应混合物，用二噁烷将硅藻土饼洗涤几次。真空浓缩合并的滤液和洗涤液。将得到的固体与EtOAc一起研磨，用乙醚洗涤，在50℃真空烘箱干燥，得到4.57g期望的产物，为白色固体。将合并的滤液和洗涤液蒸发至干，溶于CH2Cl2(4ml)，然后通过快速色谱法纯化(硅胶，120gAnalogix柱，20％-50％EtOAc的己烷溶液，20min)，又得到582mg。总收率(5.15g，12.3mmol，76.4％收率)。(M+H)+＝420m/e；1H NMR(400MHz，CHCl3-d)δppm 1.50(s，9H)1.54-1.69(m，3H)1.83(d，J＝13.64Hz，2H)2.67(tt，J＝12.38，3.66Hz，1H)2.83(t，J＝13.14Hz，2H)3.82(s，3H)6.89(d，J＝8.59Hz，1H)7.51(dd，J＝8.46，2.40Hz，1H)8.25(d，J＝2.27Hz，1H)8.27(br.s.，1H)8.30(s，1H)。
方法B
向安装机械搅拌器、N2起泡器和温度计的12L三颈烧瓶中加入4-(6-氨基吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(381g，1.37mol)，然后加入THF(2.35kg，2.67l)。将该反应混合物搅拌至试剂溶入溶液。向该溶液中滴加叔戊醇钠的2.5M的THF溶液(577ml，1.44mol)。温度从22℃升至25℃。将该反应混合物搅拌30min。制备4-溴-6-氯-2-甲基-2H-哒嗪-3-酮(322g，1.44mol)在THF(1.17kg，1.33l)中的溶液，总体积为1640mL。在30min内缓慢地将820mL 4-溴-6-氯-2-甲基-2H-哒嗪-3-酮溶液(0.5eq.)加入到4-(6-氨基吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯中；通过向水浴中添加一些冰保持该反应体系的温度低于30℃。将该反应混合物搅拌30分钟以上。向该反应混合物中加入叔戊醇钠的2.5M的THF溶液(275ml，687mmol)，然后将该混合物再搅拌20min。再缓慢地加入410mL 4-溴-6-氯-2-甲基-2H-哒嗪-3-酮溶液(0.25eq.)，保持温度低于30℃，然后将该反应混合物搅拌20min。向该反应混合物中加入叔戊醇钠的2.5M的THF溶液(137ml，343mmol)，然后将该混合物再搅拌20min。最终加入410mL4-溴-6-氯-2-甲基-2H-哒嗪-3-酮溶液(0.25eq.)，保持温度低于30℃，然后将该反应混合物再搅拌20min。向该反应混合物中加入叔戊醇钠的2.5M的THF溶液(137ml，343mmol)，然后将该红色混合物再搅拌1小时20min。将通过将柠檬酸(264g，1.37mol)溶于水(1.14kg，1.14l)(～20％溶液)制备的600ml柠檬酸溶液缓慢地加入到该反应体系中，维持温度低于30℃，使该反应体系的pH达到4.6。该反应混合物变成黄色混悬液。加入水(800ml)。将该混合物加热至50℃，搅拌2小时。将该反应混合物冷却至室温过夜，得到良好的易于搅拌的黄色混悬液。将该混悬液转入20LBuchi烧瓶，在40℃真空浓缩以除去约3.2L溶剂。将该淤浆在室温搅拌3小时，然后使用台式漏斗过滤固体，用水洗涤。通过抽真空干燥黄白色固体1小时。在60℃/26英寸Hg下与N2气流中真空烘箱干燥至恒重，得到488g(84％)期望的产物。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 1.42(s，9H)1.50(dd，J＝12.65，3.59Hz，2H)1.74(d，J＝11.33Hz，2H)2.58-2.96(m，3H)3.68(s，3H)4.07(d，J＝12.09Hz，2H)7.48(d，J＝8.69Hz，1H)7.67(dd，J＝8.50，2.45Hz，1H)8.27(d，J＝2.27Hz，1H)8.33(s，1H)9.62(s，1H)。
步骤4.6-氯-2-甲基-4-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-2H-哒嗪-3-酮的制备
方法A
将4-(6-(6-氯-2-甲基-3-氧代-2，3-二氢哒嗪-4-基氨基)吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.0g，4.76mmol)溶于甲酸(40.0ml)和甲醛37％(80.0ml)的溶剂混合物。将该反应混合物在70℃搅拌过夜，直到通过LCMS分析测定反应完成，然后冷却至环境温度。加入水，用CH2Cl2洗涤得到的水性混合物，弃去CH2Cl2层。用固体K2CO3将水层的pH谨慎地调整至pH＝12，导致固体沉淀。通过过滤采集固体，用水洗涤，在50℃72h内真空烘箱干燥至得到1.4g期望的产物。(M+H)+＝334m/e。1H NMR(300MHz，CHCl3-d)δppm 1.84(dd，J＝8.31，3.02Hz，4H)1.99-2.19(m，2H)2.35(s，3H)2.42-2.68(m，1H)3.02(d，J＝12.09Hz，2H)3.81(s，3H)6.86(d，J＝8.31Hz，1H)7.52(dd，J＝8.50，2.46Hz，1H)8.16-8.33(m，3H)。
方法B
向安装机械搅拌器、N2起泡器、温度计、冷凝器和加热罩的5.0L三颈烧瓶中加入4-(6-(6-氯-2-甲基-3-氧代-2，3-二氢哒嗪-4-基氨基)吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(488g，1.16mol)。向该烧瓶中加入甲酸(2.34kg，1.95l)。该反应混合物变成深色溶液。将该溶液加热至55℃，搅拌1hr。通过HPLC判断脱保护完成。向该混合物中加入37％甲醛水溶液(472g，433ml，5.81mol)。将该反应混合物加热至85℃，搅拌3小时。切断加热，将该反应混合物冷却至室温过夜，然后在70℃真空浓缩，得到深色油状物。将该油状物转入12L三颈烧瓶，向其中加入IPA(593g，761ml)。结晶出固体。向固体中加入20％K2CO3水溶液(总计2650ml以使pH为8.3)，在添加碱的过程中，该混合物变成溶液，然后在pH 7时，变成再变成白色混悬液。将该混悬液在65℃加热3hrs，然后缓慢地冷却至环境温度过夜。通过使用台式漏斗过滤采集固体。用水洗涤白色固体。用庚烷洗涤固体，通过抽真空干燥，然后再在75℃/26英寸Hg下与N2气流气氛中真空烘箱干燥得到367g(94％)期望的产物。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 1.57-1.76(m，4H)1.94(td，J＝11.24，3.59Hz，2H)2.18(s，3H)2.38-2.47(m，1H)2.85(d，J＝11.33Hz，2H)3.68(s，3H)7.48(d，J＝8.69Hz，1H)7.58-7.71(m，1H)8.26(d，J＝2.64Hz，1H)8.33(s，1H)9.61(s，1H)。
步骤5.2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-碘-吡啶-3-甲醛的制备
方法A
在1L圆底烧瓶中，合并6-叔丁基-8-氟酞嗪-1(2H)-酮(5.6g，25.4mmol)与THF(300ml)，得到无色溶液。加入氢化钠(1.12g，28.0mmol)。将该反应混合物在环境温度搅拌10min。加入2-氟-4-碘烟醛(7.02g，28.0mmol)，将该反应混合物在环境温度搅拌1h。通过LCMS分析测定反应完成。用饱和NH4Cl使该反应混合物猝灭。将该反应混合物倾入200mLH2O，用CH2Cl2萃取2次。用盐水洗涤有机层，然后用Na2SO4干燥，真空浓缩。将得到的亮黄色固体转入过滤漏斗，用少量EtOAc将烧瓶洗涤2次以确保固体完全转入漏斗。过滤液体。将固体与Et2O一起研磨2次，真空干燥，得到期望的产物，为奶油色固体(8.09g，17.9mmol，70.5％收率)。(M+H)+＝452m/e。1H NMR(400MHz，CHCl3-d)δppm 1.44(s，9H)7.49-7.54(m，1H)7.54(d，J＝1.77Hz，1H)8.03(d，J＝5.31Hz，1H)8.30(d，J＝2.53Hz，1H)8.37(d，J＝5.31Hz，1H)9.98(s，1H)。
方法B
向50-L加套的反应器中加入6-叔丁基-8-氟酞嗪-1(2H)-酮(799g，3.63mol)和THF(5.28kg，6.00l)。在30分钟内通过滴加1M LiHMDS的THF溶液(4.00l，4.00mol)处理该黄色混悬液，维持温度＜29℃。添加完成后，将该棕色溶液在约22℃搅拌40分钟。将该反应体系加热至60℃。一旦该反应体系达到温度，则开始缓慢地添加2-氟-4-碘烟醛(1.00kg，3.99mol)的THF(5.28kg，6.00l)溶液。注意：约10分钟添加醛溶液，橙色-红色混悬液形成。一旦添加完成，则该反应体系为深棕色溶液。将该反应体系在65℃加热15min。″切断″加热。
将该反应体系冷却至室温，在室温搅拌过夜。向该反应混合物中一次加入水(6L)，观察到放热(20-26℃)。将该混合物搅拌约50min。真空除去大部分THF(17L)(浴温：42℃)，得到橙色混悬液。向烧瓶中加入2-丙醇(4.68kg，6.00l)，将该混合物在60℃加热15分钟。将该反应体系冷却至室温，同时搅拌过夜。通过粗釉料台式漏斗过滤产物，用1.6L IPA(3.2L)洗涤2次，通过抽真空干燥。在约27英寸Hg/50℃下与氮气气流气氛中真空烘箱干燥湿饼状物(2.155kg橙色固体)，得到1.31kg(79％)期望的产物，为浅棕色固体。
步骤6.2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代-1H-酞嗪-2-基)-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-3-甲醛
方法A
将6-氯-2-甲基-4-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)哒嗪-3(2H)-酮(1.4g，4.19mmol)、双(频哪酸)二硼(1.17g，4.61mmol)和乙酸钾(1.23g，12.6mmol)混悬于二噁烷(60ml)。在氩气气氛中给该反应混合物脱气。加入X-PHOS(300mg，629μmol)和乙酸钯(II)(47.1mg，210μmol)，将该反应混合物在100℃(外部温度)在氮气气氛中搅拌1h。通过LCMS密切监测该反应体系，经取样等分部分并且将其溶于甲醇且寻找起始氯化物的消失和当前硼酸的出现(M+1＝344)来进行，但谨慎地将脱-氯化的副产物(M+1＝300)的量减少至最低限度。1h后反应完成。将加热浴的温度切换至80℃，使烧瓶升起脱离加热浴，但持续搅拌。加入2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-4-碘烟醛(1.89g，4.19mmol)和碳酸钾(1.74g，12.6mmol)，然后加入水(6.00ml)。加入三环己膦(118mg，419μmol)和双(二亚苄基丙酮)钯(121mg，210μmol)。在80℃剧烈搅拌下加热该反应混合物，搅拌2h，然后将该反应混合物冷却至环境温度。将该反应混合物倾入水，通过缓慢振摇萃取入EtOAc(2x)。用盐水洗涤合并的EtOAc萃取物。用CH2Cl2将水相萃取3次。合并CH2Cl2和乙酸乙酯层，用Na2SO4干燥合并的有机层，真空浓缩。将粗物质在50ml CH2Cl2中搅拌成淤浆，加入200ml Et2O。过滤固体，用Et2O洗涤。第二批固体沉淀出来，通过过滤采集，用乙醚洗涤。两批具有类似的LCMS和1H-NMR光谱，与期望的产物一致，合并它们，得到1.62g产物。(M+H)+＝623m/e。1H NMR(300MHz，CHCl3-d)δppm 1.42(s，9H)1.88(br.s.，3H)2.39(br.s.，3H)2.46-2.64(m，1H)3.05(br.s.，2H)3.89(s，3H)6.91(d，J＝8.31Hz，1H)7.38-7.66(m，3H)7.76(d，J＝5.29Hz，1H)8.19-8.38(m，3H)8.81(s，1H)8.87(d，J＝5.29Hz，1H)10.11(s，1H)。
方法B
向反应器中加入6-氯-2-甲基-4-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)哒嗪-3(2H)-酮(450g，1.35mol)、4，4，4′，4′，5，5，5′，5′-八甲基-2，2′-双(1，3，2-二氧杂环戊硼烷)(513g，2.02mol)、三环己膦(22.7g，80.9mmol)、Pd(dba)2(23.3g，40.4mmol)和乙酸钾(265g，2.7mol)。真空加入2-甲基四氢呋喃(10.0l)。开始搅拌，设定在10。抽真空，向反应器中回充氮气2次。将该反应混合物在N2气氛中加热至78℃(内部)/80℃(循环)。将该反应混合物加热过夜。将反应器冷却至10℃。一旦反应温度降至40℃以下，则将温度设定在30℃。将2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-4-碘烟醛(578g，1.28mol)、碳酸钾(373g，2.7mol)和水(1.00l)加入到该反应混合物中。将该反应体系加热至74℃(内部温度)/78℃(循环)，达到适度回流。将该反应混合物回流加热过夜。将该反应混合物冷却至40℃(循环)/38℃(反应)。向该反应混合物中加入(R)-2-乙酰氨基-3-巯基丙酸(33.0g，202mmol)水(3.00l)溶液。将该反应混合物在38℃(内部)/40℃(循环)搅拌3h。加入水(6L)，然后蒸馏9.5LMeTHF(循环温度，不超过40℃)。加入IPA(3L)，在搅拌的同时维持该混合物的温度在23℃。极为缓慢地过夜过滤后通过过滤采集固体(Chem玻璃50L滤器)。向反应器中加入H2O(5L)。然后用水从反应器中洗涤滤饼。过滤仍然缓慢。在此期间用IPA(6L)洗涤滤饼，完全不了解滤器带有少量颗粒。将该物质转入大的台式过滤器，然后持续IPA过滤。用正庚烷洗涤固体。通过它过滤具有小粒度的一些产物，此后再次回收它们。将固体空气干燥过夜，得到不完全干燥的标题化合物(797g)，但照此用于步骤6方法B。
步骤6.6-叔丁基-8-氟-2-{3-羟基甲基-4-[1-甲基-5-(1′-甲基-1′，2′，3′，4′，5′，6′-六氢-[3，4′]联吡啶-6-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-吡啶-2-基}-2H-酞嗪-1-酮
方法A
在250mL圆底烧瓶中，在干CH2Cl2(45ml)和干MeOH(20mL)中合并2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-4-(1-甲基-5-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基)烟醛(1.62g，2.6mmol)，得到棕色溶液。加入硼氢化钠(177mg，4.68mmol)，将该反应体系在环境温度搅拌1h，然后用饱NH4Cl和猝灭。用50mL H2O稀释该反应混合物，用CH2Cl2(3x 150mL)萃取。用Na2SO4干燥有机层，真空浓缩。通过快速色谱法纯化粗物质[硅胶，80g，0％-50％在CH2Cl2中的(60∶10∶1CH2Cl2∶MeOH∶NH4OH)]，得到稍不纯的泡沫体。将该泡沫体在30ml Et2O和10ml EtOAc中搅拌成淤浆，然后缓慢地使用大搅棒搅拌1h，得到白色固体。通过过滤采集固体，在50℃真空干燥48h，得到期望的产物，为白色固体(880mg)。(M+H)+＝625m/e。1H NMR(300MHz，CHCl3-d)δppm 1.44(s，9H)1.87(br.s.，3H)2.15(br.s.，2H)2.39(br.s.，3H)2.52(t，J＝7.74Hz，1H)3.04(br.s.，2H)3.82-3.91(m，1H)3.93(s，3H)4.46-4.63(m，2H)6.93(d，J＝8.69Hz，1H)7.42-7.59(m，3H)7.64(d，J＝4.91Hz，1H)8.15-8.39(m，3H)8.70(s，1H)8.73(d，J＝4.91Hz，1H)。
方法B
将2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-4-(1-甲基-5-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基)烟醛(797g，1.28mol)溶于DCM(7.36kg，5.58l)和MeOH(1.26kg，1.59l)。在室温用活性炭(10％wt)、CeliteTM(10％wt)和QuadraPureTU(5wt％)将该溶液处理过夜。将该混合物通过硅藻土垫过滤。在1h内分6部分向该溶液中加入NaBH4(24.2g，640mmol)，维持温度在15-18℃。用水(5L)使反应停止。将该混合物搅拌30min，然后分离各相。用DCM(2L)将水层萃取，精滤，总计得到9L DCM溶液。在30℃真空蒸馏DCM，同时向该溶液中加入MEK(5L)和MeOH(5L)。除去大部分DCM后，使温度增加至40℃，确保不遗留DCM(在40℃追加使用MeOH)；在该温度下产物结晶出来。使温度增加至80℃。再加入MEK(5L)。在80℃真空除去MeOH。将该混合物在80℃加热3hr，然后缓慢地冷却至室温过夜。过滤固体，用MEK洗涤，在一周末内真空干燥，得到6-叔丁基-8-氟-2-(3-(羟基甲基)-4-(1-甲基-5-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基)吡啶-2-基)酞嗪-1(2H)-酮(471g，754mmol，58.9％收率)。DSC显示多晶型物混合物(无水和MeOH溶剂合物)，仍然有硼烷复合物(3％)遗留。
重结晶
将6-叔丁基-8-氟-2-(3-(羟基甲基)-4-(1-甲基-5-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基)吡啶-2-基)酞嗪-1(2H)-酮(540g，864mmol)(在先批量+来自如上述方法B中所述类似方式制备的3次小批量的物质)加入12L圆底烧瓶，加入MeOH(2.14kg，2.7l)和甲基乙基酮(5.4l)。将该混悬液加热至64-66℃(内部)3h，得到适度MeOH回流，以破坏3％硼烷复合物。3h后，仅遗留～1％的硼烷复合物。从该溶液中蒸馏出MeOH；使温度达到68-70℃(内部)/80-85℃(加热罩)，向MeOH中再追加MEK。在68-70℃(内部)静置10h，然后缓慢地冷却至室温。将该淤浆在70-75℃加热5-6h，DSC显示晶型的混合物。将该淤浆再加热至70-75℃(内部)/90-95℃(加热罩)以完全除去MeOH；再加入MEK。在内部温度达到76-77℃后，停止蒸馏(最终MEK，6vol.(～3L))，将该淤浆在75℃(内部)静置10h；然后缓慢地冷却至室温。通过DSC证实晶型后，通过过滤采集该物质，用MEK(400mL)洗涤，在50℃真空干燥过夜。NMR显示0.23％的残留MEK。将该固体转入干燥平皿，在50℃真空干燥过夜，得到标题化合物(503g，805mmol，6293.1％收率)，其具有99.44％HPLC纯度和15ppm残留Pd。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 1.38(s，9H)1.52-1.77(m，4H)1.87-2.01(m，2H)2.18(s，3H)2.33-2.46(m，1H)2.84(d，J＝11.33Hz，2H)3.79(s，3H)4.47(dd，J＝15.86，5.29Hz，2H)4.76-4.88(m，1H)7.45(d，J＝8.69Hz，1H)7.58-7.66(m，2H)7.77(dd，J＝13.22，1.51Hz，1H)7.89(d，J＝1.89Hz，1H)8.18(d，J＝2.27Hz，1H)8.53(d，J＝2.64Hz，1H)8.56(s，1H)8.63(d，J＝4.91Hz，1H)9.45(s，1H)。
化合物1的富马酸盐的制备：6-叔丁基-8-氟-2-(3-(羟基甲基)-4-(1-甲基-5-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基)吡啶-2-基)酞嗪-1(2H)-酮富马酸盐
将6-叔丁基-8-氟-2-(3-(羟基甲基)-4-(1-甲基-5-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基)吡啶-2-基)酞嗪-1(2H)-酮(639mg，1.02mmol)与丙酮(15ml)混合。向该淤浆中加入富马酸(125mg，1.07mmol)。将该溶液搅拌1hr。过滤形成的固体，然后在50℃放入真空烘箱中的真空中过夜。回收黄色固体(718.0mg)，使其从回流的丙酮(250ml)中重结晶，得到6-叔丁基-8-氟-2-(3-(羟基甲基)-4-(1-甲基-5-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基)吡啶-2-基)酞嗪-1(2H)-酮富马酸盐(718mg，969μmol，94.8％收率)，为基本上无定形固体。(M+H)+＝625m/e。
化合物2的制备
步骤1.2，4，6-三氟-N-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苯甲酰胺的制备
向安装氯化钙干燥管的烧瓶中加入2，4，6-三氟苯甲酸(25g，142mmol)，溶于干二氯甲烷(220mL)。将该物质冷却至0℃(冰浴)，通过注射器向其中加入草酰氯(13.2ml；156mmol)。接下来加入干二甲基甲酰胺(104mg；1.42mmol)，观察到适度的起泡。15分钟后，除去冷却浴，将该混合物剧烈搅拌5h。汽提挥发性物质(旋转蒸发器)，将剩余物溶于干二氯甲烷(150ml)，冷却至0℃(冰浴)。通过缓慢滴加向该溶液中加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇(27.2ml，284mmol)。完全添加后，除去冷却浴，将该混合物温至环境温度过夜。使用相同规模重复如上所述的反应，如下后处理合并的反应产物：抽滤不均匀的混合物，用二氯甲烷冲洗(约300ml)。将首批滤液放置，使用缓慢重力过滤用二氯甲烷(500ml)二次冲洗过滤的固体。从第二次过滤中汽提二氯甲烷，得到极纯的产物，为白色结晶固体(22.9g)。从第一次过滤中汽提二氯甲烷，得到不纯的棕色剩余物。将该物质溶于二氯甲烷(200ml)和水(250ml)，用分液漏斗振摇。采集有机相，用二氯甲烷(2x 120ml)反萃取水相。合并二氯甲烷相，干燥(硫酸镁)，过滤，汽提。通过从热二氯甲烷/己烷中研磨纯化粗剩余物，又得到期望的产物，为黄色固体(43.8g)。(M+H)+＝246m/e。
步骤2.4，4-二甲基-2-(2，4，6-三氟-苯基)-4，5-二氢-噁唑的制备
通过在25分钟内缓慢滴加向2，4，6-三氟-N-(2-羟基-1，1-二甲基-乙基)-苯甲酰胺(43.8g，177.1mmol)在干二氯甲烷(400mL)中的溶液中加入亚硫酰氯(58.9ml，415mmol)(反应烧瓶浸入通过半路添加的冰浴)。添加完成后，将该物质搅拌至环境温度过夜。接下来将该物质放置在旋转蒸发器上，冷凝(除去约70％的体积)。将剩余物溶于乙醚(200ml)，通过过滤采集固体沉淀(39.94g黄白色固体)。将乙醚滤液放置，将固体物质溶于水(120ml)，用氢氧化钠水溶液(2N，55ml)处理。加入乙酸乙酯(120ml)，将该混合物转入分液漏斗，振摇。采集有机相，用等体积的水洗涤。采集乙酸乙酯相，用乙酸乙酯(2x 100ml)反萃取水相。将合并的有机相合并，干燥(硫酸镁)，过滤，汽提，得到标题化合物，为纯的黄白色固体(33.98g)。(M+H)+＝230m/e。
步骤3.2-(2，4-二氟-6-甲基-苯基)-4，4-二甲基-4，5-二氢-噁唑的制备
通过缓慢滴加向冷却的(冰浴)4，4-二甲基-2-(2，4，6-三氟苯基)-4，5-二氢噁唑(16.8g，73.3mmol)在干四氢呋喃(150ml)中的溶液中加入溴化甲基镁(73.3ml，3M的乙醚溶液)。将该混合物在0℃搅拌2h，然后在6h内温至环境温度。通过添加饱和氯化铵水溶液(30ml)谨慎地使反应停止，将该物质溶于水(200ml)和乙酸乙酯(150ml)，转入分液漏斗，采集有机相。用水(200ml)洗涤有机相，采集乙酸乙酯相。用乙酸乙酯(2x 120ml)反萃取水相，合并有机相，用硫酸镁干燥，过滤，汽提，得到期望的产物，为淡黄色油状物(16.31g)。(M+H)+＝226m/e。
步骤4. 2-[4-(4，4-二甲基-4，5-二氢-噁唑-2-基)-3-氟-5-甲基-苯基]-2-甲基-丙腈的制备
在氩气气氛中将包含2-(2，4-二氟-6-甲基苯基)-4，4-二甲基-4，5-二氢噁唑(14.84g，65.9mmol)和丁腈(9.11g，132mmol)在干四氢呋喃(130ml)中的溶液的烧瓶冷却至-15至-20℃(乙腈/干冰浴)。通过缓慢滴加加入双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾的溶液(171ml，0.5M的甲苯溶液)。将该混合物在-15℃搅拌30分钟，然后在1.5h内逐步温至15℃。通过添加饱和氯化铵水溶液(100ml)使该物质猝灭。加入水(80ml)和乙醚(50ml)，将该物质转入分液漏斗，采集有机相。用等体积的水洗涤，采集有机相。用乙醚(2x 100ml)反萃取水相，用硫酸镁干燥合并的有机相，过滤，汽提。通过硅胶色谱法纯化该物质，用60％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到半纯的产物，为金黄色油状物(13.52g，75％纯)。将该物质“照此”用于随后的步骤。(M+H)+＝275m/e。
步骤5. 2-(4-(2-氰基丙基(poropyl)-2-基)-2-氟-6-甲基苯基)-3，4，4-三甲基-4，5-二氢噁唑-3-鎓碘化物的制备
通过在10分钟内滴加向2-[4-(4，4-二甲基-4，5-二氢-噁唑-2-基)-3-氟-5-甲基-苯基]-2-甲基-丙腈(23.86g，60％纯度，52.2mmol)在干乙腈(237ml)中的溶液中加入碘甲烷(37g，261mmol)。将该混合物转入加热至63℃的油浴，搅拌过夜。将烧瓶冷却至环境温度，然后用水浴冷却。通过滗析采集固体沉淀的产物，得到标题化合物，为黄白色固体产物，静置时变成淡黄色(21.49g)，不经进一步纯化用于下一步。
步骤6. 4-(氰基-二甲基-甲基)-2-氟-6-甲基-苯甲酸的制备
向烧瓶中加入2-(4-(2-氰基丙基-2-基)-2-氟-6-甲基苯基)-3，4，4-三甲基-4，5-二氢噁唑-3-鎓碘化物(21.9g，52.7mmol)，溶于甲醇(89ml)。向该淤浆中加入氢氧化钠(10.5g，263mmol)的水(178ml)溶液，在80℃在油浴中加热该物质。将该混合物剧烈搅拌60分钟，然后加入甲苯(120ml)。搅拌该混合物，在油浴中振摇5分钟。在仍然热的同时将该物质转入分液漏斗，采集水相。用1.5N盐酸水溶液酸化该相(至pH＝1)。加入乙酸乙酯(25ml)和水(5ml)，在分液漏斗中振摇该混合物。采集有机相，用乙酸乙酯(2x40ml)反萃取水相。用硫酸镁干燥合并的有机相，过滤，汽提，得到具有杂质的标题化合物，为淡黄色固体(5.4g)。(M-H)-＝220m/e。
步骤7. 4-(氰基-二甲基-甲基)-2-氟-6-甲基-苯甲酰胺的制备
在15分钟内向溶于干四氢呋喃(100ml)中的4-(2-氰基丙-2-基)-2-氟-6-甲基苯甲酸(14g，35mmol，75％纯)中分4等分部分加入1，1’-羰基二咪唑(11.2g，69.1mmol)。将该混合物搅拌2.5h，然后通过滴加加入28％氢氧化铵水溶液(20.4ml)。将该物质搅拌4h，然后减压浓缩，以除去90％挥发性物质。将剩余物溶于水(80ml)和二氯甲烷(80ml)，用分液漏斗振摇。采集有机相，用二氯甲烷(3x60ml)反萃取水相。干燥合并的有机相(硫酸镁)，过滤，汽提，通过从热二氯甲烷/己烷中研磨纯化得到的半固体，得到具有杂质的标题化合物，为黄白色固体(10.71g，80％纯度)。(M+H)+＝221m/e。
步骤8. 4-(氰基-二甲基-甲基)-N-[1-二甲基氨基-甲-(E)-基亚基]-2-氟-6-甲基-苯甲酰胺的制备
在250ml圆底烧瓶中放入在四氢呋喃(61ml)中的4-(2-氰基丙-2-基)-2-氟-6-甲基苯甲酰胺(8.71g，31.6mmol，80％纯度)和二甲基甲酰胺二甲基乙缩醛(7.26ml，51.4mmol)，得到不均匀黄色混悬液。将该反应混合物加热至63℃(油浴)，搅拌3h。用旋转蒸发器浓缩该混合物，然后溶于己烷(80ml)。将其剧烈搅拌几分钟，直到白色沉淀形成为止。通过过滤采集沉淀，用己烷充分冲洗，得到标题化合物，为白色固体(7.02g)。(M+H)+＝276m/e。
步骤9. 2-(8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈的制备
将4-(氰基-二甲基-甲基)-N-[1-二甲基氨基-甲-(E)-基亚基]-2-氟-6-甲基-苯甲酰胺(10.66g，38.7mmol)溶于干四氢呋喃(100ml)，放入加热至55℃的油浴。在15分钟内从加液漏斗中滴加叔丁醇钾溶液(58.1ml，1M的四氢呋喃溶液)。将该反应混合物加热至62℃，搅拌2h。将形成的固体物质冷却至环境温度，通过滴加用浓盐酸(5.3ml)处理。加入水(30ml)，将该物质转入分液漏斗。采集有机相，用盐水溶液(25ml)洗涤。用乙酸乙酯(25ml)反萃取水相，合并有机相，用硫酸镁干燥，过滤，汽提。使剩余物从热二氯甲烷/己烷中结晶，得到期望的产物，为黄白色固体(5.91g)。(M+H)+＝231m/e。
步骤10. 2-[2-(3-溴-2-甲酰基-苯基)-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基]-2-甲基-丙腈的制备
将2-(8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈(250mg，1.09mmol)、2，6-二溴苯甲醛(459mg，1.74mmol)和碳酸氢钠(182mg，2.17mmol)在干二甲亚砜(8ml)中的溶液放入真空，反充氩气(重复2次以上)。向其中加入碘化亚铜(207mg，1.09mmol)，给烧瓶抽真空，反充氩气(重复2次以上)。将该混合物在油浴中加热至110℃，搅拌3.5h。将烧瓶冷却至环境温度，溶于乙酸乙酯(40ml)和水(40ml)。通过硅藻土垫过滤双相物质，用乙酸乙酯充分冲洗。将滤液转入分液漏斗，采集有机相。用等体积的50％稀盐水溶液洗涤，采集乙酸乙酯相。用乙酸乙酯(2x30ml)反萃取水相。用硫酸镁干燥合并的有机相，过滤，汽提。通过硅胶HPLC纯化剩余物，用1％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到期望的产物，淡黄色固体(285mg)。(M+H)+＝413/415m/e。
步骤11： 5-硝基-2H-吡唑-3-甲酸甲酯的制备
向10mL单颈圆底烧瓶中加入5-硝基-1H-吡唑-3-甲酸(4.0g，25.5mmol)和无水MeOH(40.0ml)。用冰/水冷却浴将该反应混合物冷却至0℃。向该混合物中滴加亚硫酰氯(7.88g，4.83ml，66.2mmol)。添加完成后，除去浴，将该分液混合物回流加热2h。然后减压浓缩该反应混合物至干，得到期望的产物(4.36g，89.3％)。(M+Na)+＝198.9m/e。
步骤12： 2-甲基-5-硝基-2H-吡唑-3-甲酸甲酯的制备
向100-mL单颈圆底烧瓶中加入5-硝基-1H-吡唑-3-甲酸甲酯(3.89g，22.7mmol)、无水DMF(30ml)、碳酸钾(6.28g，45.5mmol)。加入MeI(4.19g，1.85ml，29.6mmol)，将该反应混合物在室温搅拌18h。然后用水(150mL)稀释该混合物，用DCM(3x75mL)萃取。用MgSO4干燥合并的有机层，真空浓缩。通过快速色谱法纯化粗物质(硅胶，AnaLogix系统，SF40-240g柱，10％-50％EtOAc的己烷溶液)，得到期望的产物，为异构体混合物(3.75g)。M+＝185.0m/e。
步骤13： (2-甲基-5-硝基-2H-吡唑-3-基)-甲醇的制备
在安装温度计和氮气入口的250mL三颈烧瓶中合并LiBH4(882mg，40.5mmol)与THF(30mL)，得到白色混悬液，使用冰浴冷却至0℃。向该混合物中缓慢地加入溶于THF(10mL)的1-甲基-3-硝基-1H-吡唑-5-甲酸甲酯(3.75g，20.3mmol)，保持内部温度在0℃。添加完成后，除去冷却浴，将该反应混合物在室温搅拌1h。然后加入几滴MeOH，将该反应混合物搅拌2h。使用冰浴将该反应体系冷却至0℃，加入EtOAc(20mL)，然后缓慢添加水(100mL)。分离各层，用EtOAc(3x100mL)萃取水层。用盐水(100mL)洗涤合并的萃取物，用MgSO4干燥，真空浓缩。通过快速色谱法纯化粗物质(硅胶，Analogix系统SF40-240g，30％-60％EtOAc的己烷溶液)，分别得到标题化合物(2.09g，65.7％)及其异构体(249mg，7.82g)。(M+H)+＝157.9m/e。
步骤14： 5-溴甲基-1-甲基-3-硝基-1H-吡唑的制备
在250ml圆底烧瓶中，合并(2-甲基-5-硝基-2H-吡唑-3-基)-甲醇(2.09g，13.3mmol)与CHCl3(80mL)，得到白色混悬液。使用冰浴将该反应体系冷却至0℃，滴加PBr3(3.6g，1.25mL，13.3mmol)。除去冷却浴，将该反应混合物在室温搅拌1h。然后将该反应体系冷却至0℃，用DCM(100mL)稀释。加入饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)，直到pH达到8.5。分离水层，用DCM(3x75mL)萃取。合并有机层，用MgSO4干燥，然后真空浓缩，得到粗物质，将其照此用于下一步(2.48g，84.7％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 3.96(s，3H)4.85(s，2H)7.15(s，1H)。
步骤15： 5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-3-硝基-1H-吡唑的制备
在50mL圆底烧瓶中，合并5-(溴甲基)-1-甲基-3-硝基-1H-吡唑(2.48g，11.3mmol)与THF(60ml)，得到淡黄色溶液。向该混合物中加入氮杂环丁烷(804mg，946μl，14.1mmol)，然后滴加DIPEA(1.75g，2.36ml，13.5mmol)。将该反应混合物在室温搅拌24h，然后用EtOAc(100mL)稀释，用水(200mL)洗涤。用EtOAc(2x75mL)反萃取水层。用MgSO4干燥合并的有机层，真空浓缩。通过快速色谱法纯化粗物质(硅胶，240g，1％-5％MeOH的DCM溶液)，得到标题化合物(2.21g，75.1％)。(M)+＝196.9m/e。
步骤16： 5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基胺的制备
在100mL圆底烧瓶中合并5-(氮杂环丁烷-1-基甲基)-1-甲基-3-硝基-1H-吡唑(1.66g，8.46mmol)与EtOH(50mL)，得到白色混悬液。将该反应混合物亚氩气真空净化3次，然后在氢气气氛中搅拌过夜。通过硅藻土垫过滤该反应混合物，用乙醇洗涤，浓缩，得到标题化合物。(M+H)+＝166.9m/e。
步骤17： 4-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-6-氯-2-甲基2H-哒嗪-3-酮的制备
在25mL圆底烧瓶中，合并5-(氮杂环丁烷-1-基甲基)-1-甲基-1H-吡唑-3-胺(1.0g，6.02mmol)、4-溴-6-氯-2-甲基哒嗪-3(2H)-酮(1.34g，6.02mmol)、Cs2CO3(6.86g，21.1mmol)和4，5-双(二苯基膦基)-9，9-二甲基呫吨(522mg，902μmol)与二噁烷(50ml)。用氩气将得到的反应混合物真空净化3次，然后加入Pd2dba3(413mg，451μmol)，将其在90℃加热18h。冷却至室温后，用50mL二氯甲烷和水稀释。用DCM(2x25mL)反萃取水层。用MgSO4干燥有机层，真空浓缩近干。过滤出沉淀，用乙醚洗涤，然后风干过夜，得到0.93g标题化合物，为黄白色固体。浓缩滤液，然后通过快速色谱法纯化(硅胶，24g，2％-7％MeOH的DCM溶液)。采集包含产物的级分，合并，然后浓缩近干，过滤出得到的固体，用乙醚洗涤，又得到265mg标题化合物(总计1.19g，64.1％)。1H NMR(300MHz，DMSO-d6)δppm 1.96(t，J＝6.99Hz，2H)3.11(t，J＝6.99Hz，4H)3.48(s，2H)3.63(s，3H)3.71(s，3H)6.07(s，1H)7.68(s，1H)9.53(s，1H)。
步骤18. 2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-甲酰基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈的制备
将4-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-6-氯-2-甲基-2H-哒嗪-3-酮(219mg，0.71mmol)、双(频哪酸)二硼(234mg，0.92mmol)、2-二环己基膦基-2’，4’，6’-三异丙基联苯(x-phos，51mg，0.106mmol)和乙酸钾(209mg，2.13mmol)溶于干二噁烷(6.6ml)，放入真空中，反充氩气(步骤重复5次)。向该混合物中加入乙酸钯(17.4mg，0.077mmol)，给烧瓶抽真空，反充氩气(步骤重复5次)。将该混合物在100℃加热，搅拌16分钟。将烧瓶冷却至环境温度，将该烧瓶的粗内含物(通过硅藻土，用3ml二噁烷冲洗)过滤入第二个烧瓶(在氩气气囊下浸入110℃油浴)，其包含真空脱气的如下试剂的溶液：在叔丁醇(0.825ml)、二噁烷(3.44ml)和水(2.58ml)的混合物中的2-(2-(3-溴-2-甲酰基苯基)-8-氟-1-氧代-1，2-二氢异喹啉-6-基)-2-甲基丙腈(275mg，0.665mmol)、碳酸钾(460mg，3.3mmol)、三环己膦(57.1mg，0.204mmol)和双(二亚苄基丙酮)钯(57.4mg，0.0998mmol)。搅拌烧瓶，加热1h，然后冷却至环境温度。通过短硅藻土垫过滤粗产物，用乙酸乙酯(40mL)充分冲洗。向滤液中加入水(40ml)，将该物质在分液漏斗中振摇。采集有机相，用乙酸乙酯(2x20ml)反萃取水相。用硫酸钠干燥合并的有机相，过滤，汽提。通过制备型硅胶HPLC纯化得到的粗产物(Analogix SF15-24g柱)，用1％-13％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到期望的产物，为黄-棕色固体(282mg)。(M-H)-＝646m/e。
步骤19. 2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-羟基甲基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈的制备
用冰浴冷却2-(2-{3-[5-(5-氮杂环丁烷-1-基甲基-1-甲基-1H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-哒嗪-3-基]-2-甲酰基-苯基}-8-氟-1-氧代-1，2-二氢-异喹啉-6-基)-2-甲基-丙腈(792mg，1.31mmol)在甲醇(10ml)和二氯甲烷(10ml)中的溶液。向该黄色均匀溶液中加入硼氢化钠(247mg，6.53mmol)的水(1.5ml)溶液。将该混合物搅拌2分钟，然后温至环境温度。搅拌约5mins后，LC/MS显示完全转化。加入水(60ml)和二氯甲烷(50ml)。采集有机相，用等体积的50％稀盐水溶液洗涤。用二氯甲烷(2x 40ml)反萃取水相。用硫酸镁干燥合并的有机相，过滤，汽提。通过制备型硅胶HPLC纯化得到的粗物质(Analogix SF15-24g柱)，用1％-15％甲醇/二氯甲烷洗脱，得到黄色泡沫状固体。进一步从乙酸邻丙酯/己烷中结晶，得到产物，再从2∶1乙醚/乙酸异丙酯中研磨。在得到的产物中检测到乙酸邻丙酯。加入纳米纯水(8-10滴)，将得到的混合物放入超声处理器2分钟，使用真空烘箱汽提挥发性物质，得到471mg标题化合物，为黄白色粉末。(M+H)+＝609m/e，1H NMR(300MHz，CDCl3-d)δppm 1.81(s，6H)2.12(五重峰，J＝7.20Hz，2H)3.27(t，J＝7.0Hz，4H)3.55(s，2H)3.81(s，3H)3.88(s，3H)4.03-4.19(m，1H)4.22-4.44(m，2H)5.94(s，1H)6.61(dd，J＝7.36，2.08Hz，1H)7.21(dd，J＝12.09，1.89Hz，1H)7.35(d，J＝7.55Hz，1H)7.41(dd，J＝7.74，1.32Hz，1H)7.52(d，J＝1.51Hz，1H)7.56(t，J＝7.74Hz，1H)7.65(dd，J＝7.55，1.51Hz，1H)7.82(s，1H)7.91(s，1H)。
化合物3的制备
步骤1. (5-溴-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-吡啶-3-基)-[5-(吗啉-4-羰基)-吡啶-2-基]-氨基甲酸叔丁酯的制备
在250ml圆底烧瓶中，将5-溴-1-甲基-3-(5-(吗啉-4-羰基)吡啶-2-基氨基)吡啶-2(1H)-酮(10g，25.4mmol)溶于THF(125ml)。在10分钟内分部分加入氢化钠(1.12g，28.0mmol)，搅拌10分钟。然后加入二碳酸二-叔丁酯(6.12g，6.51ml，28.0mmol)。再加入20ml THF，因为红色混悬液未搅动。将其加热至70℃，搅拌过夜。该混悬液变成棕色。将该反应体系冷却至室温，然后加入125ml水和125ml乙酸乙酯，分离各层。用100ml盐水洗涤有机层，用硫酸镁干燥，浓缩，得到11.8g橙-棕色粉末。加入80ml乙酸乙酯，过滤出溶解性较低的物质。蒸发滤液，得到棕色泡沫体。在过滤漏斗上回收的粉末包含原料和产物，因此，滤液也包含原料和产物。合并粉末和滤液，溶于二氯甲烷，蒸发，得到标题化合物与约20％原料(10.71g，21.7mmol，85.4％收率)。(M+H)+＝494.9m/e。
步骤2. (5-溴-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-吡啶-3-基)-(5-甲酰基-吡啶-2-基)-氨基甲酸叔丁酯的制备
向氢化四氯化双(环戊二烯基)锆(9.37g，36.3mmol)在THF(180ml)中的淤浆中同时加入5-溴-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基(5-(吗啉-4-羰基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(13.7g，27.8mmol)和四氢呋喃(350ml)的溶液。将橙色溶液在室温搅拌2h。1.5h后LCMS显示反应基本上完成。将该反应混合物倾倒在180ml乙酸乙酯中的110g硅胶上，搅拌10分钟。过滤，浓缩，得到标题化合物(10.7g，26.2mmol，94.4％收率)，为浅棕色粉末。(M-BOC)+＝309.9m/e。
步骤3. (5-溴-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-吡啶-3-基)-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基}-氨基甲酸叔丁酯的制备
在250ml圆底烧瓶中，将5-溴-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基(5-甲酰基吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(5g，12.2mmol)混悬于二氯甲烷(122ml)，然后加入2-甲氧基乙胺(2.3g，2.66ml，30.6mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(6.49g，30.6mmol)和乙酸(1.47g，1.4ml，24.5mmol)。将黄色浑浊溶液在40℃加热过夜。起泡沫，变成深绿色过夜(LCMS过夜显示反应完成)。将该反应混合物冷却至室温，然后与50ml二氯甲烷一起转入分液漏斗，用100ml饱和NaHCO3萃取。分离有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到6.1g深绿色油状物，用二氯甲烷和甲醇溶解，在硅藻土上浓缩。通过快速色谱法纯化(AnaLogix IntelliFlash 280，50g硅胶柱，10-75％″魔术碱″(14％MeOH的DCM溶液+0.14％NH4OH)/二氯甲烷)，得到1.04g绿-蓝色泡沫体，用甲醇将其溶解3次，然后浓缩，最终用高度真空泵干燥过夜，得到标题化合物(1.0g，2.14mmol，17.5％收率)，为绿-蓝色泡沫体。再蒸发混合的级分10-27，得到2.5g深绿色油状物，再用二氯甲烷和甲醇溶解，在硅藻土上浓缩。通过快速色谱法进一步纯化(AnaLogix IntelliFlash 280，80g硅胶柱，1-10％甲醇/二氯甲烷，然后75％″魔术碱″(14％MeOH的DCM溶液+0.14％NH4OH)/DCM)，又得到1.2g标题化合物，为绿-蓝色油状物。(M+H)+＝469.0m/e。
步骤4. 5-溴-3-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-1-甲基-1H-吡啶-2-酮的制备
向在包含DCM(25ml)的250ml圆底烧瓶中的5-溴-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢吡啶-3-基(5-((2-甲氧基乙基氨基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(2.2g，4.71mmol)加入TFA(7.4g，5ml，64.9mmol)。将该反应体系搅拌2h。LCMS显示反应未完成。将该反应体系再持续搅拌1.5h。LCMS显示反应仍然未完成，但使其进行。搅拌3小时以上后，反应完成。蒸发溶剂，将残余物置于真空中过夜，然后溶于DCM。加入饱和NaHCO3水溶液，剧烈搅拌该混合物。固体形成。将该混合物搅拌至全部气体放出停止。固体再溶于有机层。分离各层。用DCM将水层萃取1次。合并有机层，用Na2SO4干燥，然后真空浓缩，得到标题化合物(1.8g，4.9mmol)。(M)+＝366.9m/e。
步骤5. 2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢-1H-异喹啉-2-基)-6-氯-苯甲醛酮的制备
方法A
将6-叔丁基-3，4-二氢异喹啉-1(2H)-酮(10.81g，53.2mmol)、2-溴-6-氯苯甲醛(15.2g，69.1mmol)、Xantphos(3.08g，5.32mmol)和碳酸铯(43.3g，133mmol)混悬于二噁烷(216ml)。用氩气给该反应混合物脱气。最终加入双(二亚苄基丙酮)钯(2.29g，3.99mmol)。将该反应混合物在100℃(外部温度)搅拌3.5h。将整个反应混合物冷却至室温，通过硅藻土垫过滤。用二噁烷(100ml)洗涤，浓缩滤液。用乙酸乙酯处理粗产物：过滤出沉淀，得到13.8g黄色固体，浓缩滤液，得到19.46g橙色固体。将黄色固体(滤饼)混悬于二氯甲烷，然后过滤，用二氯甲烷(100ml)洗涤。真空浓缩滤液，得到标题化合物(11.68g)，为黄色固体。(M)+＝341.9m/e。
方法B
向1L Atlas反应器中加入6-叔丁基-3，4-二氢异喹啉-1(2H)-酮(80g，394mmol)、2-溴-6-氯苯甲醛(90.7g，413mmol)、乙酸钯(II)(1.77g，7.87mmol)、Xantphos(6.83g，11.8mmol)和K2CO3(109g，787mmol)。然后给反应器抽真空，回充氮气。将该次序重复3次。加入DMF(604g，640ml)，然后将反应器加热至90℃16.5h，然后冷却至～70℃。加入水(3vol.；240mL)以析出产物。在70℃放置2h后，将该反应器冷却至室温(观察到含有盐的水层)。通过过滤采集物质，用水洗涤，以除去一些无机物/IPA，然后在1周末内风干，得到2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-6-氯苯甲醛(123.5g，361mmol，91.8％收率)，为具有97％HPLC纯度的淡黄色固体。分析显示物质中有Pd残留物。将该物质溶于650mL DMF，同时加热至80℃，然后缓慢地加入240mL包含16g N-乙酰-L-半胱氨酸的水溶液。将该混合物在80℃再搅拌5hr；在该过程中观察到结晶。将该混合物缓慢地冷却至环境温度。通过过滤采集该物质，用水/IPA洗涤，然后在80℃真空干燥过夜。回收109g标题化合物，其具有99.5+％HPLC纯度。
步骤6. 6-叔丁基-2-(3-氯-2-羟基甲基-苯基)-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮的制备
方法A
将2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-6-氯苯甲醛(3.04g，8.89mmol)溶于THF(46.1ml)和MeOH(4.61ml)。将该混合物冷却至-40℃(外部温度)。分部分(3x 50mg，然后25mg)加入硼氢化钠(404mg，10.7mmol)。将该反应混合物温至0℃，然后在0℃搅拌30min。加入氯化铵溶液，用EtOAc萃取该反应混合物。用水、盐水洗涤有机相，然后用硫酸钠干燥。过滤后，真空浓缩，得到标题化合物2.38g，为淡黄色泡沫体。(M)+＝344.0m/e。
方法B
向1L Atlas反应器中加入2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-6-氯苯甲醛(80g，234mmol)，在室温用DCM(634g，480ml)溶解该物质。向该溶液中加入IPA(250g，320ml)，随后冷却至～2℃。在15min逐份加入NaBH4(4.43g，117mmol)，在此过程中使温度速跳至～9℃。将该反应混合物在～2℃搅拌1hr，得到澄清均匀溶液，然后用水(320g，320ml)猝灭。在～60-80℃在加热的同时蒸馏出DCM。完全除去DCM后，使产物从IPA/H2O溶液(1/1，～8vol.)中结晶出来，无需相分离。在80℃放置3-4hrs后，将该混合物缓慢地冷却至环境温度，搅拌过夜。通过过滤采集该物质，用IPA/H2O(1/1)洗涤，在80℃真空烘箱干燥过周末，得到标题化合物(77.7g，226mmol)，通过HPLC发现其具有99.4％纯度。
步骤7.乙酸2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢-1H-异喹啉-2-基)-6-氯-苄酯的制备
在250mL圆底烧瓶中，合并6-叔丁基-2-(3-氯-2-(羟基甲基)苯基)-3，4-二氢异喹啉-1(2H)-酮(21.9g，63.7mmol)与在DCM(600ml)中的乙酐(32.5g，30.0ml，318mmol)和吡啶(15.1g，15.5ml，191mmol)，得到无色溶液。将该反应混合物搅拌过夜。真空浓缩粗反应混合物，得到黄褐色油状物。将残余物溶于DCM，然后用水洗涤，用MgSO4干燥，蒸发，通过柱色谱法纯化(0％-25％EtOAc/Hex，10min，然后保持在25％20min)，得到标题化合物(22.9g，59.3mmol)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 1.32-1.45(m，9H)2.06(s，3H)3.05(dt，J＝15.73，4.77Hz，1H)3.35(ddd，J＝15.98，10.93，5.43Hz，1H)3.79(dt，J＝11.94，5.27Hz，1H)3.95-4.14(m，1H)5.07-5.39(m，2H)7.21(dd，J＝7.71，1.39Hz，1H)7.27(d，J＝1.77Hz，1H)7.36-7.47(m，3H)8.06(d，J＝8.08Hz，1H)。
步骤8.乙酸2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢-1H-异喹啉-2-基)-6-(4，4，5，5-四甲基-[1，3，2]二氧杂环戊硼烷-2-基)-苄酯的制备
在加热的同时将乙酸2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-6-氯苄酯(5g，13.0mmol)溶于二噁烷(50.0ml)，加入X-PHOS(618mg，1.3mmol)、乙酸钾(2.6g，26.5mmol)、双(频哪酸)二硼(4.28g，16.8mmol)。通过真空超声处理和回充氩气再次给该混悬液脱气。最终加入乙酸钯(II)(145mg，648μmol)，将该混合物在75℃(外部温度)搅拌2hr。2h后反应未完成。再加入等分的乙酸钯(II)和X-Phos。将该反应体系在75℃搅拌3小时以上。LCMS显示剩余的原料和一些脱-氯的副产物。在75℃持续加热过夜，然后将该反应混合物冷却至室温。通过硅藻土过滤该反应混合物，用二噁烷洗涤。真空浓缩滤液，得到棕色树胶状物，将其溶于二氯甲烷(5ml)，通过快速色谱法纯化(硅胶，220G，10％-100％EtOAc的己烷溶液[保持在10％5min，然后在15min内至100％])，得到包含约60％标题化合物和约40％的脱-氯副产物的黄色树胶状物，将其照此用于下一步。产物(M+H)+＝478.1m/e。脱-氯副产物(M+H)+＝452.0m/e。
步骤9.乙酸2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢-1H-异喹啉-2-基)-6-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苄酯的制备
在250ml圆底烧瓶中合并乙酸2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-6-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苄酯(5.8g，7.29mmol)和5-溴-3-(5-((2-甲氧基乙基氨基)甲基)吡啶-2-基氨基)-1-甲基吡啶-2(1H)-酮(2.68g，7.29mmol)。加入磷酸三钾(3.09g，14.6mmol)，然后加入X-PHOS(348mg，729μmol)和双(二亚苄基丙酮)钯(210mg，364μmol)。加入溶剂溶液、BuOH(60ml)和水(15.0ml)。用氩气将该反应混合物净化2次。密封容器，加热至100℃(外部温度)1.5h。加入DCM和水，分离DCM相，通过硅藻土过滤，通过色谱法纯化，使用0％-5％甲醇的DCM溶液梯度20min，然后是50％魔术碱的DCM溶液30min以上)，得到标题化合物与脱-乙酸盐和一些杂质。将该混合物照此用于下一步。产物(M+H)+＝638.1m/e。脱-乙酸盐副产物(M+H)+＝596.1m/e。
步骤10. 6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮的制备
在室温向溶于THF的乙酸2-(6-叔丁基-1-氧代-3，4-二氢异喹啉-2(1H)-基)-6-(5-(5-((2-甲氧基乙基氨基)甲基)吡啶-2-基氨基)-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢吡啶-3-基)苄酯(3.18g，4.99mmol)中加入氢氧化钠(24.9ml，24.9mmol)。将该反应混合物在60℃加热2hrs。LCMS显示仍然存在原料。将该反应混合物在60℃搅拌过夜，LCMS显示反应完成。将其冷却至室温，用饱和NaHCO3和DCM稀释。分离各层。用DCM将水层萃取3次。用Na2SO4干燥有机层，然后真空浓缩。将残余物与乙醚一起研磨，其变成树胶状物。蒸发溶剂，然后加入EtOAc，直到残余物溶解。加入Et2O。固体形成，然后变成树胶状物。蒸发溶剂，得到3.18g粗收率。将该固体置于带有搅棒的放置在50℃(外部温度)下的圆底烧瓶中。缓慢地加入30ml丙酮。全部进入溶液。用特氟隆塞子密封容器。将该反应混合物搅拌约30min，然后固体开始形成。将该混合物在50℃搅拌72h。72h后，将浓稠混悬液冷却至室温。过滤固体，用冰冷丙酮洗涤，在50℃置于真空烘箱中2h，然后置于室温过夜，得到标题化合物。(M+H)+＝596.1m/e。
1H NMR(400MHz，CHCl3-d)δppm 1.39(s，9H)2.70-2.90(m，2H)3.11-3.22(m，1H)3.25-3.34(m，1H)3.37(s，3H)3.51-3.60(m，2H)3.72(s，3H)3.78(s，2H)3.81-3.89(m，1H)4.12(ddd，J＝12.25，9.85，4.67Hz，1H)4.28-4.47(m，2H)4.63(d，J＝10.61Hz，1H)6.83(d，J＝8.59Hz，1H)7.27(dd，J＝7.45，1.64Hz，2H)7.31(d，J＝1.52Hz，1H)7.41-7.53(m，4H)7.60(dd，J＝8.59，2.27Hz，1H)7.93(s，1H)8.11(d，J＝8.08Hz，1H)8.18(d，J＝2.02Hz，1H)8.70(d，J＝2.27Hz，1H)。
制剂数据
用于PD实验(mOVA36)的化合物1的制剂
用Jet-O-Mizer气流粉碎机时以90psi的进料和研磨压力将10.6g化合物1微粉化。通过分别如图1和2中所示的粉末X-射线衍射图和粒度分布分析由此得到的微粉化物质。在微粉化过程中未观察到多晶型改变。80％的颗粒具有5μm或以下的尺寸与适合于吸入递送的范围的平均粒度(d50％＝2.88μm)。该物质用于体内实验mOVA36。参见图1和2。
用于PD实验(mOVA 40、mPolyIC-3-12和mPolyIC-3-12)的化合物1的制剂
用Jet-O-Mizer气流粉碎机时以80psi将8.6g的2-(6-叔丁基-8-氟-1-氧代酞嗪-2(1H)-基)-4-(1-甲基-5-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基氨基)-6-氧代-1，6-二氢哒嗪-3-基)烟醛微粉化。平均粒度(d50％)为3.05μm，其中90％颗粒≤6μm(图3)。在Turbula混合器中以22rpm将该物质(30％w/w)和乳糖(Lactohale LH 300，70％w/w)混合15分钟。乳糖成分的d50％和d90％粒度分别为＜5μm和≤10μm(DFE Pharma规范(#001/2011年10月)。将由此得到的掺合物用于体内实验mOVA40、mPolyIC-3-12和mPolyIC-5-12。参见图3。
用于PD实验mOVA 20的化合物1的制剂
如下制备两种不同浓度(0.15和1.5mg/mL)的化合物1在缓冲液中的混合物。
10mL 1.5mg/mL浓度的化合物1溶液的制备
将化合物1的富马酸盐(17.8mg)与2mL丙二醇(PG)混合。将该制备物超声处理约20-30分钟，直到药物完全溶解为止。将足量的纯水加入至10.0g。通过涡旋搅拌得到的混合物，得到澄清均匀的溶液(pH 4.4)。
10mL 0.15mg/mL浓度的化合物1溶液的制备
将如所述制备的1.0g 1.5mg/mL溶液放入小瓶。加入足量的媒介物(20％PG/80％水)至10.0g。通过涡旋搅拌得到的混合物。
用于PD实验mOVA 50的化合物2的制剂
如下制备三种不同浓度(0.15、0.5和1.5mg/mL)的化合物2在缓冲液中的混合物：
1.5mg/mL浓度的化合物2溶液的制备
将化合物2(1.65mg)放入小瓶。加入足量的媒介物(20％PG/80％水)至1.1g。将该制备物超声处理约2分钟。得到精细混悬液(pH 4.833)。
0.5mg/mL浓度的化合物2溶液的制备
将如所述制备的0.1740g 1.5mg/mL混悬液放入小瓶。加入足量的媒介物(20％PG/80％水)至0.521g。混合该制备物。
0.15mg/mL浓度的化合物2溶液的制备
将如上述制备的0.07716g 1.5mg/mL混悬液放入小瓶。加入足量的媒介物(20％PG/80％水)至0.7717g。得到的制备物的pH为4.71。
用于PD实验mOVA 49的化合物3的制剂
如下制备三种不同浓度(0.15、0.5和1.5mg/mL)的化合物3在缓冲液中的混合物。
媒介物的制备(30mL)
1.在烧杯中，直接称重0.06g聚山梨醇酯80。
2.加入约26g水并且搅拌至溶解。
3.加入柠檬酸、柠檬酸钠和氯化钠。
4.搅拌至溶解。适量至30mL。
5.测定pH＝4.68。
1.5mg/mL浓度的化合物3溶液的制备
将化合物3(1.59)放入小瓶。加入如上所述制备的足量的媒介物至1.06g。将该制备物超声处理约2分钟。得到精细混悬液(pH 4.85)。
0.5mg/mL浓度的化合物2溶液的制备
将如上述制备的0.16773g 1.5mg/mL混悬液放入小瓶。加入如上所述制备的足量的媒介物至0.50735g。混合该制备物。
0.15mg/mL浓度的化合物2溶液的制备
将如上述制备的0.06675g的1.5mg/mL混悬液放入小瓶。加入如上所述制备的足量的媒介物至0.65608g。得到的制备物的pH为4.70。
生物学实施例
Btk Biacore结合试验
对Biacore T-100进行分析。对Btk激酶进行avi-标记，在杆状病毒中与生物素连接酶一起共表达，以生成单一位点生物素标记的Btk(Avidity，LLC)。用Biacore链霉抗生物素传感器芯片(Series S Sensor Chip SA)以～10000共振单位(1ru～1pg蛋白质/mm2)的密度俘获生物素标记的靶标。从用于10mM储备溶液的100％DMSO中的粉末增溶测试化合物，用8点0.78nM-100nM的2-倍系列稀释。将化合物注射100秒联想时间，随后解离20min。在25℃进行实验，不使用再生缓冲液，因此，每个芯片分析不超过2种高亲和力化合物。运行缓冲液由50mM Hepes pH 7.2、150mM NaCl、10mM MgCl2、2mM MnCl2、1mM TCEP、1％PEG 3350、5％DMSO组成。使用Biacore BIAevaluation软件、应用1∶1(Langmuir)结合用单纯模型进行动力学分析。来自这些实验的数据显示化合物1、化合物2和化合物3的解离速率极为缓慢且得到的KDs与FRET试验极为一致(表1)。
酪氨酸激酶(BTK)抑制TR-FRET(时间分辨FRET)试验
这种BTK竞争性试验使用FRET(/荧光共振能量转移)技术测定在酪氨酸激酶的失活状态中的化合物效能(IC50)。在应用前1小时以50nM BTK-BioeaseTm起始浓度在冰上温育BTK-Eu复合物：10nM Eu-链霉抗生物素(Perkin-Elmer Catalog#AD0062)。试验缓冲液由20mM HEPES(pH 7.15)、0.1mM DTT、10mM MgCl2、0.5mg/ml BSA与3％激酶稳定剂(Fremont Biosolutions，Catalog#STB-K02)组成。1h后，用试验缓冲液稀释来自上述的反应混合物，制成5nM BTK：1nM Eu-链霉抗生物素复合物(供体荧光团)。然后将作为非阴性对照的18μl 0.11nM BTK-Eu和0.11nM激酶示踪物178(Invitrogen，Catalog#PV5593)与单独的BTK-Eu的混合物配入384-孔平底培养板(Greiner，784076)。将试验中测试的化合物制备成10x浓度，用DMSO进行半对数递增的连续稀释以便生成10点曲线。为了启动FRET反应，将制备成在DMSO中的10x储备溶液的化合物加入到培养板中，将培养板在14℃温育18-24h。
温育后，用BMG Pherastar Fluorescent培养板读出器(或等效物)读取培养板，并且用于测定来自铕供体荧光团的发射能量(620nm发射)和FRET(665nm发射)。求阴性对照孔值的平均值，得到最小平均值。求阳性“无抑制剂”对照孔的平均值，得到最大平均值。使用如下方程计算最大FRET百分比：
％max FRET＝100x[(FSR化合物-FSR最小平均值)/(FSR最大平均值-FSR最小平均值)]其中FSR＝FRET信号比。用Activity Base(Excel)绘制％Max FRET曲线，测定IC50(％)、希尔斜率、z’和％CV。平均IC50和标准偏差使用Microsoft Excel衍生自一式两份曲线(来自两次独立稀释液的单线态抑制曲线)。
来自FRET的数据显示化合物1、化合物2和化合物3是极为有效的Btk抑制剂(表1)。
表1.化合物1-3的Biacore和FRET数据
化合物1-3对人肥大细胞活化的作用
将来自不同供体(AllCells#CB008F-S，Emeryville，CA)的100万人脐带血衍生的CD34+造血干细胞(HSCs)在不含血清的完全培养基(具有补体的StemPro-34；Invitrogen，Carlsbad，CA)中与重组h-SCF(100ng/ml)和h-IL6(50ng/ml)一起培养8周。在第一周培养期间，也包括重组h-IL3(10ng/ml)以支持HSCs分化。8周培养后，用重组h-IL-4(10ng/ml)刺激细胞5天。常规地通过FACS证实肥大细胞分化过程，以检查c-kit和FcεRI表达；分化细胞通常90％以上c-kit阳性，FcεRI阳性。
在37℃用0.1μg/ml抗-NP IgE(Serotec，Raleigh，NC)使分化的肥大细胞致敏过夜。洗涤细胞，然后用化合物1在37℃处理1小时。处理后，用1μg/ml NP(30)-BSA(BiosearchTechnologies，Novato CA)使细胞交联30分钟(用于组胺和脂质介体评价)或过夜(用于细胞因子评价)。采集培养物上清液，按照每种试剂盒的说明测定组胺(Oxford BiomedicalResearch，Rochester Hills，MI)、PGD2和LTC4(Cayman Chemical Company，Ann Arbor MI)和IL-5和IL-13(Bio-Rad Bio-Plex Pro细胞因子定量试剂盒)释放。化合物1、化合物2和化合物3以达100％效能的浓度依赖性方式减少这些介体释放入上清液，将IC50值报道在表2中。令人感兴趣的是，用糖皮质激素处理细胞未减弱任意的这些响应。
表2.化合物1-3对高亲和力Fcε受体(FCεRI)活化后释放的肥大细胞介体的作用的IC50值
N＝3个供体
化合物1-3对人B细胞抗体产生的作用
用来自血沉棕黄层白细胞包(New York Blood Center)的RosetteSep人B细胞富集混合物(#28921，Vancouver，BC)、按照制造商的方案富集人总B细胞。通过FACS与CD19+染色检查富集的B细胞纯度(约80％)。将B细胞混悬(0.1百万细胞/孔/100μl)于基于RPMI-1640的条件培养基(50ng/ml IL-2、50ng/ml IL-10和1μg/ml抗-IgD，用于活化B细胞以产生IgG/IgM；10ng/ml IL-4、10ng/ml IL-10、25ng/ml IL-21和1μg/ml抗-CD40，用于活化B细胞以产生IgE)与化合物1(1nM-10μM)。将细胞在37℃胞培养10天(用于IgG/IgM产生)或14天(用于IgE产生)。采集培养物上清液用于按照Bethyl Laboratory方案(#E80-104，#E80-100，#E80-108，Montgomery，TX)的IgM、IgG和IgE分析。化合物1以达100％效能的浓度依赖性方式降低上清液中测定的IgM、IgG和IgE水平，将IC50值报道在表X中。令人感兴趣的是，用糖皮质激素处理细胞未减弱IgM或IgG响应且实际上诱导与上述报道一致的上清液中IgE水平显著增加[Zieg等人JACI，1994，94：222；Hemady等人JACI 1985，75：304；Wu等人JCI1991，87：870]。化合物2和化合物3对IgM和IgG产生具有类似的抑制作用(表3)。
表3.化合物1-3对B细胞受体(BCR)活化后B细胞抗体产生的作用的IC50值
化合物 IgM IgG IgE
化合物1
化合物2 N/A
化合物3 N/A
N＝3个供体
化合物1-3在过敏性气道疾病模型中的作用
使用卵清蛋白诱导的过敏性气道疾病的小鼠模型以评价化合物1对过敏原诱导的支气管收缩和过敏原诱导的气道炎症的作用。简言之，在第0天和第14天时，用10μg卵清蛋白(OVA)在0.2ml明矾中的溶液(2％Al(OH)3水溶液，Serva，Heidelberg，Germany)对小鼠(雄性；BALB/c；7-9周龄)i.p.免疫接种。对照组动物仅接受明矾。在第21-23天时，使动物暴露于雾化(Proneb Ultra II，PARI Respiratory Equipment，Midlothian，VA，)1％OVA(10mg/ml)在磷酸缓冲盐水(PBS)中的气雾剂20min，以建立肺中的炎症过程；或单独的PBS作为对照。为了研究其中使用鼻内施用的情况，用异氟烷麻醉小鼠，在每次气雾化OVA攻击前1小时，鼻内(i.n.)施用媒介物(20％丙二醇)或化合物1(0.3mg/kg)。
为了试验吸入递送研究，用气流粉碎机(MC One Jet Mill，Jetpharma USA Inc.，South Plainfield，NJ)使化合物1微粉化，使用Wright粉尘干粉进料气雾剂发生器生成干粉气雾剂。使用约1000psi液压机将微粉化药物粉末填充入圆锥形储器，以产生用作Wright粉尘进料的输入物的压紧的粉饼。粉尘进料生成并且气雾剂通过声波喷嘴，以便松团，且进入旋风分离器，以除去不可吸收的颗粒和聚集物。旋风分离器输出物进入仅TSE鼻的啮齿动物暴露系统。使小鼠剂量组暴露于气雾剂测试气氛5、15或45分钟。TSE具有24个动物口和3个用于采样的采样口：实时气雾剂浓度(Microdust pro)、重量分析气雾剂浓度(绝对过滤器)和粒度(级联冲击器)。在暴露过程中，将动物约束在为小鼠解剖设计的玻璃管内。根据空气质量平衡，所述暴露系统符合空间均匀度和暂时稳定性规格。在设定在每分钟17升的输入流速下，到达每个口的气流和口与口之间的流速可以改变2％以下。通过使用8阶段级联冲击器采集气雾剂样品评价每次暴露的粒度分布。通过级联冲击器以每分钟1升的气流速度对气雾剂采样45分钟。使用推定的对数正态分布的几何分析以数学方式评价冲击器数据以测定6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-1-甲基-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮的总气体动力学中位数直径(MMAD)和几何标准差(GSD)。使用每分钟0.026升的小鼠每分钟量计算评估的化合物1的储存剂量，根据MMAD测定肺沉积部分。在暴露于气雾化或静脉内施用的OVA前给小鼠施药45分钟。
为了评价化合物1对急性支气管收缩的作用，用150mg/kg戊巴比妥i.p.麻醉对照(注射明矾和盐水攻击)和OVA致敏和攻击的小鼠，手术准备气管插管，用计算机控制的呼吸机(flexiVent，SCIREQ Inc.；潮气量＝10ml/kg；呼吸频率150次呼吸/min；3cmH2O呼气末正压)以机械方式通风。在注入尾静脉100μl 7.5mg/ml(30mg/kg)卵清蛋白在0.9％盐水中的溶液前和7分钟后每隔10秒测定呼吸系统阻力(R)(SnapShot150波动)。使用flexiWare软件(7.1版)以数字方式记录数据。将基线与峰值抗原诱导的R之间的差异计算为R的增加百分比并且作为OVA-诱导的急性支气管收缩的减少百分比报道在表2中。在本文报道的两种研究中，i.v.施用OVA诱导R～60-80％的增加，其在施用或作为通过吸入干粉制剂施用时被化合物1有效地抑制。
表4.化合物1-3对过敏原诱发的支气管收缩的作用
为了研究化合物1对气道炎症的作用，在3次1％OVA攻击后，将最终的OVA攻击作为5％OVA在PBS中的气雾剂溶液(50mg/ml)或单独的PBS给予20min。在5％OVA攻击后24小时用戊巴比妥(75μl 50mg/ml溶液：150mg/kg)麻醉小鼠，手术准备气管插管(18号Angiocath，Becton Dickinson，Sandy，Utah，USA)。灌洗肺，如上所述通过进行总体和分化细胞计数评价气道炎症[Harris等人，2012，Mucosal Immunology]。将数据报道在表3中，为OVA-诱导的气道嗜酸性细胞增多症的减少百分比。在本文报道的研究中，气雾化OVA诱导洗出液中回收的嗜酸细胞数量有288％的增加，其被作为通过吸入的干粉制剂递送的化合物1有效地抑制。
表5.化合物1对过敏原诱发的气道嗜酸性细胞增多症的作用
化合物1在类固醇抵抗型气道炎症模型中的作用
评价化合物1对通过双链RNA聚肌苷-多聚胞苷酸(Poly I：C)的合成形式诱导的气道炎症的作用。所用的模型是指模拟经证实引起类固醇抵抗型气道中性白细胞增多症的急性病毒感染的作用[Harris等人，2012，Mucosal Immunology]。为了进行该实验，用异氟烷麻醉小鼠(雄性；BALB/c；7-9周龄)，经鼻内(i.n.)施用盐水或poly I：C(30μg)，如上所述在24小时后评价气道炎症[Harris等人，2012，Mucosal Immunology]。化合物1以剂量依赖性方式抑制poly I：C-诱导的气道中性白细胞增多症(表6)。这些中性白细胞减少与洗出液中嗜中性粒细胞化学引诱物水平减少一致(表4)。
表6.化合物1对Poly I：C酸诱导的气道中性白细胞增多症的作用
DMPK数据
化合物1在大鼠、狗和短尾猴(cynos)中的药代动力学数据的特征在于低口服生物利用度和高血浆清除率(表7)。在小鼠中，其特征在于适度血浆清除率和低口服生物利用度。化合物2和3在大鼠和狗中的药代动力学的特征在于低口服生物利用度和高血清清除率(表8和9)。
表7.化合物1的关键药代动力学数据
表8.化合物2的关键药代动力学数据
参数 大鼠 狗
CL(mL/min/kg) 84.9 35
口服生物利用度(％) ＜2 4
剂量(mg/kg) 0.5(iv)，2(po) 1.0(iv)，1.0(po)
表9.化合物3的关键药代动力学数据
参数 大鼠 狗
CL(mL/min/kg) 111.2 31.4
口服生物利用度(％) 7 8
剂量(mg/kg) 0.5(iv)，2(po) 1.0(iv)，1.0(po)
已经通过举例说明和实施例的方式比较详细地描述了上述申请，以用于清楚和理解的目的。对于本领域技术人员显而易见的是，可以在后附权利要求的范围内进行改变和改进。因此，应该理解上述说明意在是举例说明性的而不是限制性的。因此，本发明的范围不应该参考上述说明书而确定，而应该参考下列后附的权利要求以及由权利要求授权的等价物的全部范围而确定。
将本申请中引用的全部专利、专利申请和出版物的全部内容通过引用并入本文作为参考以满足全部目的到这样的程度，就如同每个专利、专利申请或出版物是分别指明的一样。

Claims (5)

1.包含微粉化的6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮和微粉化的乳糖的用于治疗哮喘的制剂。
2.权利要求1的制剂，其中微粉化的乳糖是Lactohale LH 300或Respitose ML 006。
3.式I的化合物，
或其药学上可接受的盐。
4.化合物6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮，其用于通过吸入治疗哮喘。
5.化合物6-叔丁基-2-[2-羟基甲基-3-(5-{5-[(2-甲氧基-乙基氨基)-甲基]-吡啶-2-基氨基}-6-氧代-1，6-二氢-吡啶-3-基)-苯基]-3，4-二氢-2H-异喹啉-1-酮在制备用于通过吸入治疗哮喘的药物中的用途。
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