CN104962580A

CN104962580A - 一种重组植物弹状病毒载体及其构建方法

Info

Publication number: CN104962580A
Application number: CN201510371509.1A
Authority: CN
Inventors: 李正和; 马晓楠; 王强; 钱莎莎; 孙凯; 周雪平
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2015-10-07
Anticipated expiration: 2035-06-30
Also published as: CN104962580B

Abstract

本发明公开了一种重组植物弹状病毒载体及其构建方法。重组植物弹状病毒载体，包括：a）一个修饰的植物弹状病毒基因组；b）一个新引入的转录单元，它被插入植物弹状病毒基因组中表达异源的核酸序列；c）一个异源核酸序列，它被置换到所述的重组植物弹状病毒的糖蛋白转录单元，其中所述的重组植物弹状病毒具有复制和侵染能力，所述的异源核酸序列编码一个抗原性多肽或其它蛋白。本发明病毒表达载体是第一个能在植物上表达外源蛋白的负义RNA病毒载体，具有表达量高，表达稳定性好，可以插入较长的外源基因片段，且插入的外源基因片段不易丢失等方面的特点，可以用于表达多种外源蛋白，也可以用于制备动物疫苗，具有广阔的应用价值和应用前景。

Description

一种重组植物弹状病毒载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程和病毒分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种植物负义RNA弹状病毒——苦苣菜黄网病毒重组病毒表达载体的构建方法及用于表达外源基因的方法。

背景技术

随着植物基因工程的发展，利用植物作为生物反应器生产外源蛋白越来越受到人们的关注，近年来的研究证实，植物系统具有表达活性哺乳动物蛋白的能力，而且在产品质量、成本和安全方面已显现出明显优势。在植物中表达外源基因主要有两种途径：一种是用转基因的方法将外源基因整合入植物基因组进行稳定表达，另一种是将外源基因插入病毒基因组，利用植物病毒载体系统进行外源蛋白的表达。

与转基因方法相比较，利用植物病毒表达载体表达外源蛋白具有简单快速、成本低廉、外源蛋白随病毒复制而得到高水平表达的特点，因此，自从20世纪80年代初期提出利用植物病毒载体系统制作植物生物反应器以来，目前已发展出了多个植物病毒载体系统，包括DNA病毒表达载体系统和植物正链RNA病毒表达载体系统 (彭燕, 2002)。由于RNA较DNA难操作，最初用于植物病毒载体系统的多是DNA病毒，如花椰菜花叶病毒（cauliflower moscia virus，CaMV），但随后发现DNA病毒复制的复杂性使其并不适于高水平表达外源蛋白(Porta 等, Biotechnol Genet Eng Rev, 2002, 19:245-291)。随着逆转录酶的发现及广泛应用，使得RNA的操作变得容易，正链RNA病毒也被用于病毒表达载体的研究，如烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、豇豆花叶病毒（Cowpea mosaic virus，CPMV）、马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）等 (Gleba 等，Cur Opin Plant Biol, 2004, 7:182-188.)。

虽然利用植物正链RNA病毒病毒载体表达外源蛋白有很高的利用价值，但其应用仍有一定的局限性，主要表现在以下几个方面：一、携带外源片段的正链RNA病毒载体稳定性差，快速的基因重组是病毒表达载体不稳定并丢失外源基因的主要原因。二，外源插入片段大小受限，目前携带外源基因最大的植物病毒载体为PVX载体，所表达的外源基因为b半乳糖苷酶基因（GUS），大小为1800碱基对。三，安全性问题，病毒是植物重要的病原物之一，尽管病毒载体已被修饰，不能引起严重症状或被介体传播，但释放病毒载体仍存在一定的环境安全性隐患，因此，植物病毒表达载体的应用受到了极大的限制 (Gleba等, Curr Opin Biotechnol, 2007, 18:134-141)。

在对负链RNA病毒的研究中发现，该类病毒可能是优秀的基因导入载体，与正链RNA病毒相比，其优势主要表现在三个方面：一、该类病毒的基因组总是被衣壳蛋白包裹，从不以裸露的形式存在与细胞内，因而重组频率极低，具有很好的遗传稳定性好；二、非分阶段负链RNA病毒的基因组上的读码框呈模块化分布，易于插入外源读码框，且病毒粒子为线性，可以容纳较大的外源基因片段；三、该类病毒载体具有较高的生物安全性，已有的研究结果表明，缺失病毒包膜构成蛋白的突变体病毒在感染细胞的过程中不能形成高传播性的病毒 (Bukreyev等，J Virol, 2006, 80:10293-12306; Pfaller等, Virology , 2015, 479:331-344)。因此，如果将植物负链RNA病毒改造为病毒表达载体，建立起一种新型的植物病毒表达载体系统，有望克服植物正链RNA病毒载体目前存在的缺陷，具有重要的意义。

然而，国际上尚无植物负链RNA病毒反向遗传学的报道，无法对该类病毒进行遗传操作。

苦苣菜黄网病毒 (sonchus yellow net virus，SYNV) 属于弹状病毒科 (Rhabdoviridae) 细胞核弹状病毒属 (Nucleorhabdovirus)，是不分节段(nonsegmented)的负义RNA病毒 (Jackson等，Annu Rev Phytopathol, 2005, 43:623-660)。SYNV病毒粒子为杆状或子弹状，典型的病毒粒子长约 248 nm，直径 70 nm，病毒粒子具有明显的规则横带和轴芯，螺旋对称，病毒粒子具包膜，包膜表面具有约6 nm长的钉状突起。SYNV基因组全长约13.7 kb，编码各基因顺序依次为3'-N-P-sc4-M-G-L-5'，包括5种结构蛋白，分别是核衣壳蛋白 (Nucleocapsid, N)、磷酸化蛋白 (Phosphoprotein, P)、基质蛋白 (Matrix protein, M)、糖蛋白(Glycoprotein, G)和RNA聚合酶大亚基 (Large subunit of polymerase, L)，其中，N蛋白、P蛋白和L蛋白与基因组RNA紧密结合，组成核糖核蛋白核心复合物（ribonucleoprotein core complex, RNP），RNP核心被M蛋白包裹，而M蛋白外层被外膜包裹，外膜主要由来源于寄主细胞的脂膜和穿插分散在脂膜中的G蛋白组成。此外，该病毒还编码1个非结构蛋白sc4，推测其功能为运动蛋白。SYNV基因组的两端分别包含3'-leader和5'-trailer序列。leader和trailer序列均为非蛋白编码序列，但对于SYNV的基因组复制和mRNA转录起着重要的调控作用。在转录过程中，以病毒基因组RNA (vRNA)为模板，从3'端开始依次转录出leader mRNA和6条编码病毒蛋白的mRNA，leader mRNA不编码蛋白，6条编码mRNA从基因组的3’端到5’端依次进行转录，且转录量从N到L逐渐递减。基因组RNA的复制首先以vRNA为模板合成与其完全互补的正义链RNA（cRNA），cRNA与N、P及L三个核心蛋白结合形成包含cRNA的RNP，cRNA-RNP作为模板又用于合成vRNA。vRNA衣壳化后形成vRNA-RNP，vRNA-RNP通过与M蛋白和G蛋白相互作用，进一步组装成完整的病毒颗粒 (Jackson等，Annu Rev Phytopathol, 2005, 43:623-660)。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种重组植物弹状病毒载体及其构建方法。

一种重组植物弹状病毒载体，包括：a）一个修饰的植物弹状病毒基因组；b）一个新引入的转录单元，它被插入植物弹状病毒基因组中表达异源的核酸序列；c）一个异源核酸序列，它被置换到所述的重组植物弹状病毒的糖蛋白转录单元，其中所述的重组植物弹状病毒具有复制和侵染能力，所述的异源核酸序列编码一个抗原性多肽或其它蛋白。

所述的修饰的植物弹状病毒基因组是一个修饰的苦苣菜黄网病毒载体。

所述异源核酸序列编码绿色荧光蛋白，或编码绿色荧光蛋白与b半乳糖苷酶融合蛋白。

其中所述异源核酸序列是来源于动物病毒的抗原蛋白。

所述的异源核酸序列以独立的转录单元插入苦苣菜黄网病毒的基因间隔区。

所述的苦苣菜黄网病毒是糖蛋白基因的缺失体，而且其中所述的外源核酸序列插入到原糖蛋白基因编码框。

编码所述苦苣菜黄网病毒的反基因组的分离核酸分子是一个或一个以上基因组或反基因组源的嵌合体。

所述的重组植物弹状病毒载体，可侵染植物寄主，包括苦苣菜（Sonchus oleraceus）、莴苣（Lactuca sativa）、本氏烟（Nicotiana benthamiana）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）、克氏烟（Nicotiana clevelandii）、心叶烟和克氏烟的杂交种、百日草（Zinnia elegans）、鬼针草（Bidens pilosa）、和藜麦（Chenopodium quinoa）。

所述的重组植物弹状病毒载体可在植物细胞内表达并生产外源插入核酸序列编码的多肽。

一种构建任一项所述的重组植物弹状病毒载体的方法。

本发明的有益效果是：1）所述重组病毒接种至少一种寄主植物后可以大量产生重组的苦苣菜黄网病毒；2）所述重组病毒包含外源基因的表达框，可以随重组病毒一起转录复制，并高效稳定地表达外源蛋白，表达的外源蛋白可达94 kD；3）利用本发明提供的重组病毒表达载体能在至少一种以上的植物中表达外源蛋白，无需昂贵的仪器、操作简单、重复性好，具有广阔的应用前景。4）本发明涉及的重组病毒表达载体可同时表达至少两个外源基因，且通过增加转录单元，可表达多个外源基因。

附图说明

图１. SYNV转录载体pSYNV，SYNV重组病毒表达载体pSYNV-GFP、pSYNV-GUS-GFP、pSYNV-GFP-G/DsRed构建示意图；（A）pSYNV为SYNV cDNA转录载体，受控于35S启动子下，在cDNA的下游具有HDV_Rz 核酶，可以在将转录RNA产物3’端的非病毒序列剪切除去；重组GFP病毒载体pSYNV-GFP，GFP表达框作为独立转录单元被插在N和P基因之间；（B）重组GUS-GFP病毒载体pSYNV-GUS-GFP，融合基因GUS-GFP作为独立转录单元位于N和P之间；（C）. 同时表达GFP和DsRed的重组病毒载体pSYNV-GFP-G/DsRed，GFP位于N和P之间，而DsRed替换了病毒本身的G基因。

图2. RNP核心蛋白及沉默抑制子表达载体示意图；（A）RNP核心蛋白表达载体pGD-NPL，N、P和L受控于不同的35S启动子，三个蛋白的表达框插入同一个质粒；（B）RNA沉默抑制子表达载体pGD-HC-Pro、pGD-P19和pGD-γb，HC-Pro、P19和γb被分别插入不同的表达载体质粒。

图3. 重组病毒载体pSYNV-GFP接种本氏烟所产生的症状及GFP表达情况。左为A部分，右为B部分，（A）重组病毒克隆pSYNV-GFP和侵染性克隆pSYNV接种本氏烟后在可见光和紫外灯下的症状;（B）RT-PCR检测和western-blot分析重组病毒SYNV-GFP后代GFP的稳定性分析。

图4. 重组病毒载体pSYNV-GUS-GFP接种本氏烟所产生症状及GFP表达检测。分为ABC三部分，（A）重组病毒克隆pSYNV-GUS-GFP和pSYNV-GFP接种本氏烟后在可见光和紫外灯下的症状;（B）western-blot检测GFP表达情况。（C）重组SYNV病毒载体表达GUS-GFP融合蛋白的荧光检测和GUS活性检测。

图5. 重组病毒载体pSYNV- GFP-G/DsRed接种本氏烟所产生的病毒症状及GFP、DsRed表达检测。分为AB两部分，（A）重组病毒克隆pSYNV- GFP-G/DsRed和pSYNV- GFP接种本氏烟后在可见光和紫外灯下的症状;（B）western-blot检测GFP和RFP表达情况。

具体实施方式

本发明提供的SYNV重组病毒载体与辅助质粒载体分别导入相应农杆菌菌株，这种农杆菌菌株按特定比例混合后接种至少一种以上的寄主植物能大量产生重组苦苣菜黄网病毒，重组病毒包含一个以上的外源基因表达框，这些外源基因可以随重组病毒一起转录复制，并高效稳定地表达外源蛋白，操作简单、重复性好。

SYNV重组病毒表达载体构建是在SYNV侵染性克隆的基础上进行的，SYNV侵染性克隆包括三类质粒载体，一是含有全长基因组编码信息的cDNA转录质粒载体，二是组成RNP核心的辅助蛋白的蛋白表达质粒载体，三是来自其他病毒的RNA沉默抑制子蛋白的表达质粒载体。

SYNV重组病毒载体的构建实际上只需要在SYNV侵染性克隆cDNA转录质粒载体的基础上，进行改造，改造策略包括：1）插入单个或多个独立的外源基因表达框，2）将一个以上的基因通以独立的表达框插入SYNV基因组，3）将SYNV自身的一个或多个基因替换为外源基因，4）将外源基因通过基因融合的方式插入SYNV自身某个基因的上游或下游，例如融合在N基因的上游或下游。5）以上四种载体改造策略任意两种或两种以上策略的任意组合。

1）和2）所述插入位置可以是SYNV基因组中多个位置中的任何一个或多个位置。这些插入位置为任意一个表达框之前或之后，例如可以插在N基因表达框之前或之后，这里指的表达框为该基因的转录起始位置到转录终止位置之间的所有序列。

在SYNV基因组中，所有的蛋白编码基因均包括转录起始序列和转录终止序列，在任意两个基因之间的间隔序列为前面一个基因的转录终止序列及后一个基因的转录终止序列，另外在这两种序列中间，两个保守的胞嘧啶（CC）是任意两个基因的绝对分隔线，这两个碱基不会出现在任何一条mRNA的转录起始序列或转录终止序列中，任意两个基因间的这三种序列合称为基因间隔区。因此，外源基因在以上述1）或2）独立表达框形式插入SYNV基因组时，必须同时插入外源基因相应的序列以及额外的转录起始序列，CC，以及一个转录终止序列，即基因间隔区，这里选择N和P之间的基因间隔区（NP gene junction, NPJ）为例，但所选的基因间隔区包括但不限于NPJ，可以是SYNV基因组上的多个基因间隔区的任意一个。

另外，在转录起始序列和转录终止序列中，各自靠近CC的几个碱基相对较为保守，不可缺失，而其他非保守序列可以变换或缺失。例如，N和P之间的基因间隔区就包括N基因的转录终止序列，CC以及P基因的转录起始序列（即从N的终止密码子之后到P起始密码子之前的一段序列）一共是119 nt，但只有16个碱基的保守序列（tataagaaaaaCCaac）在任意两个基因间都是绝对保守一致的。因此在选择插入的基因间隔区中，必须至少包括这些保守的序列，而其他序列可以突变，截短或加长。

总之，要使插入的外源基因表达框遵守SYNV基因组本身的基因编码策略。

以独立插入一个外源基因（例如GFP基因）表达框至N和P基因之间（插入GFP基因的同时插入一个NPJ）为例，SYNV重组病毒表达载体的构建过程如下：

1）将扩增的SYNV全长基因组cDNA克隆至植物表达载体，得到SYNV cDNA转录载体质粒pSYNV；

2）将外源基因（如GFP基因，包括一个NPJ）插入pSYNV载体中，得到包含外源基因表达框的重组载体（如pSYNV-GFP）;

3）构建SYNV 核糖核蛋白RNP核心蛋白N、P和L的植物表达载体；

4）构建来自其他病毒的RNA沉默抑制子蛋白的植物表达载体；

5）通过电击的方法将上述2）~4)中所述载体质粒分别导入农杆菌菌株GV3101；

6）接种前的菌液处理：包含上述载体质粒的农杆菌接种20 mL YEP液体培养基（含25 μg/mL 利福平，50 μg/mL 卡那霉素，25 μg/mL 庆大霉素），28℃ 220rpm摇菌培养至OD₆₀₀为0.8-1.2，经12,000 rpm 1min离心，弃上清，用含10 mM MgCl2，10 mM MES，200 mM 乙酰丁香酮的浸润缓冲液重新悬浮菌体，调整OD₆₀₀为1.0左右，静置2-3小时；

7）农杆菌组合：按照所需将特定农杆菌按所需浓度比例混合；

8）浸润接种：选用4-6叶充分展开的苗龄期的植株，利用不带针头的1 ml注射器在3-4周的植物叶片背面进行浸润，一株植物一般接种3-4片叶子；

9）接种植株置于25℃隔离温室培养，20天后观察接种植株的症状，采集产生病毒症状和没有产生病毒症状的植株的系统心叶进行RT-PCR检测，鉴定是否有病毒侵染。

10）提取发病植株总蛋白，利用western blot等方式检测外源基因的蛋白表达水平。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实施例1. SYNV cDNA转录载体构建

SYNV基因组为单链负义RNA，长约13.7 kb。从感染了SYNV的本氏烟叶片提取总RNA，并以之为模板进行反转录PCR，得到全长基因组cDNA。将全长cDNA克隆到植物表达载体pCB301，即得到SYNV cDNA转录载体，命名为pSYNV，pSYNV通过电击导入农杆菌GV3101。

感染pSYNV转录载体的构建过程包括如下步骤：

1）从感染SYNV的本氏烟叶片中提取总RNA：

取0.1 g叶片，加液氮研磨成粉末；将粉末快速转移至预冷的1.5 mL离心管，迅速加入预冷的1 mL TRIzol抽提液；上下混匀，充分裂解，室温放置5 min；加入0.2 mL氯仿，盖紧离心管盖，剧烈震荡15 sec，室温放置2 min；4℃，12,000 rpm离心15 min，取上清并加入等量体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min；4℃，12,000 rpm离心10 min；弃上清；加入1 mL 75%乙醇，涡旋清洗沉淀；4℃，7,500 rpm离心5 min；弃上清，剩余白色沉淀即为初提的叶片总RNA，让RNA沉淀物在室温下干燥；加入30 μL无RNA酶的水使RNA沉淀全部溶解。

2）全长cDNA扩增

设计引物SYNV/1F和SYNV/1R（引物序列见表1），并以提取的叶片总RNA为模板扩增SYNV全长基因组cDNA。两条引物的5’端各带有15个碱基（小写字母），这些碱基分别可以与载体的35S启动子和HDV_Rz核酶互补配对，相应扩增的cDNA产物两端分别带有这些碱基，带有这些额外碱基序列的cDNA可以通过In－Fusion克隆反应被插入到载体pCB301，插入的位置在35S启动子和HDV_Rz核酶之间，得到的转录载体质粒命名为pSYNV （图1.A）。

3）筛选阳性克隆

利用限制性内切酶进行酶切鉴定，对酶切鉴定无误的克隆进行测序，确定SYNV基因组全长为13726 nt；

4）通过电击的方法将pSYNV导入农杆菌菌株GV3101。

实施例2. RNP核心蛋白表达载体构建

SYNV的核糖核蛋白RNP核心包括N、P和L三种蛋白，这三种蛋白被同时插入同一个表达载体中，得到pGD-NPL，在这个表达载体中，三个蛋白由不同的35S启动子和NOS转录终止子控制，也就是说同一个表达载体上含有三个表达框，分别表达N、P和L（图2.A）。

上述四个表达载体被分别电击导入农杆菌GV3101。

实施例3. 病毒RNA沉默抑制子蛋白表达载体构建

三个来自其他病毒所编码的RNA沉默抑制子：烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus, TEV) Hc-Pro基因、番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus, TBSV) P19基因和大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV) γb基因。这三个沉默抑制子被分别插入pGD载体，得到三个表达载体：pGD-Hc-Pro、pGD-P19和pGD-γb（图2.B）。

上述三个沉默抑制子表达载体被分别电击导入农杆菌GV3101。

实施例4. SYNV-GFP重组病毒载体构建

将GFP以独立表达框的形式插入SYNV基因组中，插入位置可以是SYNV基因组上多个位置中的任意一个，但插入位置一定是在SYNV任意一个编码基因的上游或下游。

以将GFP表达框插入N和P基因之间为例，详述pSYNV-GFP的构建过程。N和P之间为NP基因间隔区（NP gene junction, NPJ），为了遵循上述SYNV基因编码策略，插入GFP的同时额外插入一个NPJ。这里选择NPJ为例，但所选的基因间隔区包括但不限于NPJ，可以是SYNV基因组上的多个基因间隔区的任意一个，且这些基因间隔区可以突变或截短或加长。

以SYNV-GFP-DsRed minireplicon（Genbank Accession：JN038403）为模板，设计引物GFP-NPJ/NcoI/F和GFP-NPJ/NcoI/R（引物序列见表1）扩增GFP到NP gene junction之间的序列，两条引物各自带有NcoI，扩增产物经NcoI酶切后插入经相同酶切处理的pSYNV载体中。pSYNV中的NcoI位于P基因的起始密码子处，所以GFP-NPJ片段插入此处后使GFP的前后各有一个NPJ，即N和GFP之间以及GFP和P之间各有一个NPJ，这样使插入的GFP表达框遵循着SYNV自身的基因编码策略（图1.A）。

筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，对酶切鉴定无误的克隆进行测序，确定GFP表达框以正确的方向插入N和P基因之间；

通过电击的方法将pSYNV-GFP导入农杆菌菌株GV3101；

实施例5. pSYNV-GUS-GFP重组病毒载体的构建

将GUS与GFP以融合基因的形式（GUS-GFP）插入SYNV基因组，插入位置可以是SYNV基因组上多个位置中的任意一个，但插入位置一定是在SYNV任意一个编码基因的上游或下游。

以GUS-GFP插入N和P基因之间为例，详述pSYNV-GUS-GFP的构建过程。同样，插入GUS-GFP融合基因也需要同时插入一个基因间隔区，这里选择NPJ为例，但所选的基因间隔区包括但不限于NPJ，可以是SYNV基因组上的多个基因间隔区的任意一个，且这些基因间隔区可以突变或截短或加长。

设计引物GUS/NcoI/F和GUS/R（引物序列见表1，其中GUS/R的5’末端进行加磷反应，GUS/NcoI/F带有NcoI酶切位点），扩增GUS。设计引物GFP/F和GFP-NPJ/NcoI/R（引物序列见表1，其中GFP/F的5’末端进行加磷反应，GFP-NPJ/NcoI/R带有NcoI酶切位点），以SYNV-GFP-DsRed minireplicon（Genbank Accession：JN038403）为模板，扩增GFP到NPJ之间的序列。两段PCR产物直接进行体外连接反应，以连接产物为模板，并以GUS/NcoI/F和GFP-NPJ/NcoI/R进行PCR扩增，产物（即GUS-GFP-NPJ）用NcoI酶切，插入经NcoI酶切过的pSYNV载体中，得到pSYNV-GUS-GFP。pSYNV中的NcoI位于P基因的起始密码子处，所以GUS-GFP-NPJ片段插入此处后使GUS-GFP的前后各有一个NPJ，即N和GUS-GFP之间以及GUS-GFP和P之间各有一个NPJ，这样使插入的GUS-GFP表达框遵循着SYNV自身的基因编码策略（图1.B）。

筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，对酶切鉴定无误的克隆进行测序，确定GUS-GFP表达框以正确的方向插入N和P基因之间；

通过电击的方法将pSYNV-GUS-GFP导入农杆菌菌株GV3101；

实施例6. pSYNV-GFP-G/DsRed

在实施例4所述pSYNV-GFP的基础上将重组病毒的G基因替换成DsRed基因。G蛋白是一种糖蛋白，在对番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus, TSWV）的研究中发现，G蛋白上一个非同义突变（C1375A）不影响TSWV的系统侵染，但是不能被介体蓟马传播，说明植物负义RNA病毒的G蛋白可能参与昆虫介体对病毒的传播。

在本实施例中，将G蛋白替换成DsRed后所形成的重组病毒依然能够系统地侵染至少一种以上的寄主植物，但重组病毒很可能不能有效地被昆虫介体传播，限制了重组病毒在自然界的扩散能力，有效地提高了重组病毒载体的生物安全性。

具体构建过程如下：

设计引物G/DsRed/F1和G/DsRed/R1（引物序列见表1），以pSYNV为模板扩增PCR片段S1，设计引物G/DsRed/F2和G/DsRed/R2并以pSYNV为模板扩增PCR片段S2，设计引物DsRed/F和DsRed/R扩增DsRed基因，三个PCR产物回收后与经PmlI和BstBI酶切处理的pSYNV-GFP进行In-Fusion融合一步法连接，即得到最终的载体pSYNV-GFP-G/DsRed（图1.C）。

筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，对酶切鉴定无误的克隆进行测序，确定G基因已经被DsRed正确替换；

通过电击的方法将pSYNV-GFP-G/DsRed导入农杆菌菌株GV3101；

实施例7. 农杆菌培养及接种前预处理

包含上述cDNA转录载体质粒或蛋白表达载体的农杆菌分别接种3 mL YEP液体培养基（含25 μg/mL 利福平+50 μg/mL 卡那霉素+25 μg/mL 庆大霉素），28℃ 220rpm摇菌培养过夜至OD600为0.8-1.2；经12000 rpm 1分钟离心，弃上清，用含10 mM MgCl2，10 mM MES，200 mM 乙酰丁香酮的浸润缓冲液重新悬浮菌体，调整OD600为1.0左右，静置2-3小时；

实施例8. 农杆菌浸润接种植物

按照表2中的农杆菌组合及所需农杆菌浓度混合后，分别浸润接种本氏烟，接种植株选用4-6叶期为宜。浸润接种使用不带针头的1 ml一次性注射器在4-6叶期植物叶片进行叶背浸润，每株植物浸润3-4片叶片，接种后植株置于25℃隔离温室培养。

实施例9. 重组苦苣菜黄网病毒表达GFP基因

pSYNV侵染性克隆（农杆菌接种组合一）接种的本氏烟在20天左右表现出病毒症状，症状包括心叶严重下卷，叶面密布上凸的耳突（图3A）。采集重组病毒载体pSYNV-GFP接种并表现病毒症状的系统叶，提取叶片总蛋白，分别用SYNV多克隆抗体和GFP单克隆抗体进行Western Blot分析，结果表明SYNV-GFP重组病毒在系统叶中的积累量与野生型病毒SYNV没有明显差异，而且在接种重组病毒载体pSYNV-GFP的本氏烟叶片中还可检测到特异的GFP条带（图3B）。为了探明SYNV重组病毒表达载体中外源基因插入片段在病毒持续侵染和传代后的稳定性，采集重组病毒载体pSYNV-GFP接种并表现病毒症状的系统叶进行摩擦传代，结果发现，经过5次连续传代后，GFP依然稳定存在于SYNV基因组中，且得到稳定表达（图3B）。

实施例10. 重组苦苣菜黄网病毒表达GFP-GUS融合基因

重组病毒载体pSYNV-GFP （农杆菌接种组合二）和pSYNV-GUS-GFP（农杆菌接种组合三）本氏烟，所形成的病毒症状与pSYNV侵染性克隆接种产生的症状没有显著差异（图4A）。采集重组病毒载体pSYNV-GUS-GFP接种并表现病毒症状的系统叶，提取叶片总蛋白，用GFP单克隆抗体进行Western Blot分析，结果表明接种重组病毒载体pSYNV-GUS-GFP的本氏烟叶片中可检测到94 kD大小的GUS-GFP融合蛋白条带，而对照pSYNV-GFP接种的本氏烟叶片中可检测到27 kD大小的GFP条带（图4B）。为了检测GUS的表达情况，选取症状明显的系统叶进行染色分析，发现系统叶的主脉和次级脉周围细胞中均可出现GUS染色反应，且与GFP的表达模式是一致的（图4C）。

实施例10. 重组苦苣菜黄网病毒同时表达GFP和DsRed基因

同时表达GFP和DsRe的重组病毒SYNV- GFP-G/DsRed克隆（接种组合四）接种本氏烟植物，所形成的病毒症状与pSYNV-GFP侵染性克隆接种产生的症状没有显著差异（图5A）

采集重组病毒载体pSYNV-GFP-G/RFP接种并表现病毒症状的系统叶，提取叶片总蛋白，用GFP单克隆抗体和RFP单克隆抗体分别进行Western Blot分析，结果表明接种重组病毒克隆pSYNV-GFP-G/RFP的本氏烟叶片中可同时检测到GFP和RFP条带，而对照pSYNV-GFP接种的本氏烟叶片中仅能检测到GFP条带（图5B）。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种重组植物弹状病毒载体及其构建方法

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SYNV/1F

<400> 1

tttcatttgg agaggagaga cagaaactca gaaaatacaa t 41

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> SYNV/1R

<400> 2

atgccatgcc gacccagaga caaaagctca gaacaatccc tat 43

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFP-NPJ/NcoI/F

<400> 3

catgccatgg tgagcaaggg cgag 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFP-NPJ/NcoI/R

<400> 4

catgccatgg cctagacaaa taatac 26

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GUS/NcoI/F

<400> 5

catgccatgg tgttacgtcc tgtagaaacc 30

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GUS/R

<400> 6

ttgtttgcct ccctgctg 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GFP/F

<400> 7

atggtgagca agggcgagga 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G/DsRed/F1

<400> 8

aacgacgtag gtcacgtgtc agtc 24

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G/DsRed/R1

<400> 9

ctcggaggag gccattacga aaagttctta ataataaact atcaaag 47

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G/DsRed/F2

<400> 10

cacctgttcc tgtaaatcca ccccataaac acgacc 36

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> G/DsRed/R2

<400> 11

gatgtgacac caacgttcga at 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DsRed/F

<400> 12

atggcctcct ccgagaacgt 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DsRed/R

<400> 13

ttacaggaac aggtggtgg 19

Claims

1.一种重组植物弹状病毒载体，其特征在于，包括：a）一个修饰的植物弹状病毒基因组；b）一个新引入的转录单元，它被插入植物弹状病毒基因组中表达异源的核酸序列；c）一个异源核酸序列，它被置换到所述的重组植物弹状病毒的糖蛋白转录单元，其中所述的重组植物弹状病毒具有复制和侵染能力，所述的异源核酸序列编码一个抗原性多肽或其它蛋白。

2.如权利要求1所述的重组植物弹状病毒载体，其特征在于，所述的修饰的植物弹状病毒基因组是一个修饰的苦苣菜黄网病毒载体。

3.如权利要求1的重组植物弹状病毒载体，其特征在于，所述异源核酸序列编码绿色荧光蛋白，或编码绿色荧光蛋白与b半乳糖苷酶融合蛋白。

4.如权利要求1的重组植物弹状病毒载体，其特征在于，其中所述异源核酸序列是来源于动物病毒的抗原蛋白。

5.如权利要求2所述的重组植物弹状病毒载体，其特征在于，所述的异源核酸序列以独立的转录单元插入苦苣菜黄网病毒的基因间隔区。

6.如权利要求2所述的重组植物弹状病毒载体，其特征在于，所述的苦苣菜黄网病毒是糖蛋白基因的缺失体，而且其中所述的外源核酸序列插入到原糖蛋白基因编码框。

7.如权利要求2所述的重组植物弹状病毒载体，其特征在于，编码所述苦苣菜黄网病毒的反基因组的分离核酸分子是一个或一个以上基因组或反基因组源的嵌合体。

8.如权利要求1所述的重组植物弹状病毒载体，其特征在于，可侵染植物寄主，包括苦苣菜（Sonchus oleraceus）、莴苣（Lactuca sativa）、本氏烟（Nicotiana benthamiana）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）、克氏烟（Nicotiana clevelandii）、心叶烟和克氏烟的杂交种、百日草（Zinnia elegans）、鬼针草（Bidens pilosa）、和藜麦（Chenopodium quinoa）。

9.如权利要求1所述的重组植物弹状病毒载体，其特征在于，所述的重组植物弹状病毒载体可在植物细胞内表达并生产外源插入核酸序列编码的多肽。

10.一种构建如权利要求1-9任一项所述的重组植物弹状病毒载体的方法。