CN104962508A

CN104962508A - 基于毒蛋白MazF反向筛选的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

Info

Publication number: CN104962508A
Application number: CN201510294606.5A
Authority: CN
Inventors: 江波; 沐万孟; 何伟伟; 张涛
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2015-06-02
Filing date: 2015-06-02
Publication date: 2015-10-07

Abstract

基于毒蛋白MazF反向筛选的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于酶基因工程技术领域。利用载体pDGREF将毒蛋白MazF基因和抗生素抗性基因spc整合至B.subtilis 1A751染色体上，得到1A751/REF；以pDGIEF为出发载体，将梭状芽胞杆菌ATCC 35704的DPE酶基因和启动子P43构建至淀粉酶同源臂之间，得到整合载体pDGI-P43-DPE；将pDGI-P43-DPE转化至1A751/REF感受态中，在淀粉酶同源臂作用下，P43-DPE酶基因整合至1A751/REF染色体上毒蛋白MazF的位置，得到一株食品级安全的产D-阿洛酮糖3-差向异构酶重组枯草芽孢杆菌1A751-DPE，命名为枯草芽孢杆菌SK38.003，保藏号CCTCC NO: M 2015259。发酵液总酶活达到6U/mL，具有重要的工业应用价值。

Description

基于毒蛋白MazF反向筛选的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

技术领域

基于毒蛋白MazF反向筛选的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，涉及一种DPE酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达，属于酶基因工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶（DPE酶）属于D-塔格糖 3-差向异构酶（简称DTE）家族酶，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可单独或与其他酶偶联合成多种碳水化合物，被广泛的应用于化学、食品和制药等领域。目前，DPE酶可催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖。

随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研究仍是功能性甜味剂领域具有重要的经济价值的当务之急。D-阿洛酮糖是一种天然己酮糖，D-阿洛酮糖拥有蔗糖甜度的70%，能量值却只有蔗糖的0.3%，具有较高的溶解度，较低的血糖反应。因此它是一种理想的甜味剂，也是蔗糖的完美替代品。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA认定为GRAS食品。此外D-阿洛酮糖还可以减少脂肪堆积和清除活性氧等生理作用，在制药业中有很大的应用前景。

自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，近年来通过新技术开发可实现其大规模生产。D-阿洛酮糖的生产方法有化学法和生物法。化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化困难、食品安全性等问题。而通过D-阿洛酮糖 3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase , DPEase, EC 5.1.3.30)把D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖的生物转化法因具有反应简单、产物单一、纯化步骤容易等优点而逐渐吸引了众多科学家的关注，也成为D-阿洛酮糖商业化生产的热点和焦点。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局(FDA)和中国农业部等部门批准为食品级安全菌株。Bacillus subtilis表达系统没有明显的密码子偏好性，表达产物不容易形成包涵体，具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯化等后续操作，并且遗传背景研究比较清楚，并具有多年的工业生产技术基础。

发明内容

本发明目的是提供一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的食品级安全的重组枯草芽孢杆菌，并可用于转化D-果糖生成D-阿洛酮糖。对D-阿洛酮糖的食品生产具有重要的意义。

本发明的技术方案：一株基于毒蛋白MazF反向筛选的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为1A751-DPE，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.003，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015259。

所述基于毒蛋白MazF反向筛选的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，将反向筛选标记毒蛋白基因MazF整合至枯草芽孢杆菌1A751染色体上得到1A751/REF，木糖可诱导毒蛋白MazF的表达，使1A751/REF无法在添加木糖的平板上生长；然后构建整合载体pDGI-P43-DPE，其中含有来源于梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）ATCC 35704 的DPE酶基因和启动子P43；再将P43-DPE酶基因整合至B. subtilis 1A751/REF染色体上MazF的位置，获得一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751-DPE，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.003，即CCTCC NO：M 2015259。

所述的构建方法，其具体步骤为：

（1）将含有木糖启动子基因、MazF毒蛋白基因和壮观霉素spc抗生素基因的片段的整合载体pDGREF(NCBI-Gene ID: 237871515)转化至枯草芽孢杆菌1A751感受态中，涂布在含有spc抗生素平板上。然后将平板上的菌落分别对应点在含有spc及木糖的平板上。筛选能在抗生素spc平板上生长而不能在木糖平板上生长的克隆，即为B. subtilis 1A751/REF。

（2）以整合载体pDGIEF为出发载体，将pDGIEF用SalⅠ/XmaⅠ双酶切，将P43-DPE酶基因连接至相应的酶切位点，得到含有淀粉酶同源臂的整合载体pDGI-P43-DPE。

（3）将整合载体pDGI-P43-DPE转入B. subtilis 1A751/REF感受态中，涂布在木糖平板上，然后将平板上的菌落分别对应点在含有木糖及spc的平板上进行筛选，筛选能够在木糖平板上生长的阳性克隆，即为一株无抗性基因的重组枯草芽孢杆菌1A751-DPE，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.003，即CCTCC NO：M 2015259。

为增强表达，在DPE基因的上游添加启动子P43 ，P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中1-300位所示。

所述的整合载体pDGI-P43-DPE，其中含有所述SEQ ID NO.1中301-1170位所示的DPE酶基因，以及含有两端的淀粉酶同源臂。

所述的整合载体pDGREF，其中含有所述的木糖启动子诱导的反向筛选标记MazF以及含有两端的淀粉酶同源臂。

所述的重组枯草芽孢杆菌1A751-DPE的应用，可用于生产D-阿洛酮糖，在化学、食品和制药领域中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 1A751-DPE，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.003，可以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖。该重组枯草芽孢杆菌B. subtilis 1A751-DPE在化学、食品和制药领域中具有重要的应用价值。

生物材料样品保藏：一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.003，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2015259，保藏日期2015年4月28日。

附图说明

图1：整合载体pDGI-P43-DPE。

图2：利用反向筛选标记整合DPE酶基因的染色体整合过程。

图3：重组菌SK38.003的发酵及酶活曲线。

具体实施方式

实施例1：含有反向筛选标记MazF的枯草芽孢杆菌B. subtilis 1A751/REF的构建

制作宿主菌B. subtilis 1A751感受态，将质粒pDGREF（图1）用Cla I线性化后转化入宿主菌B. subtilis 1A751感受态中，涂布到LB固体培养基（含100 μg/mL spc）上，37℃培养过夜。挑取阳性克隆子，用接种环划线至含有木糖(2%)、spc(100μg/mL)的LB平板和仅含spc(100μg/mL)的LB平板，选取在spc抗性平板上生长良好而在含有木糖的培养基上生长不好甚至是不生长的菌株，即获得重组菌B. subtilis1A751/REF。

实施例2：DPE酶基因的染色体整合

将质粒pP43-DPE及pDGIEF，分别用Xma I和Sal I进行双酶切，回收基因片段，经T4连接酶连接过夜后转化入E. coli DH5α感受态细胞，涂布到LB固体培养基（含100 μg/mL Amp）上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒，进行双酶切验证。验证正确的质粒被命名为pDGI-DPE。

制作枯草芽孢杆菌重组菌B. subtilis 1A751/REF感受态，将pDGI-DPE质粒用Xho I线性化后转化入感受态中，涂布含有木糖(2%)LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性克隆子，用无菌牙签接种到含有spc(100 μg/mL)的LB抗性平板及含有木糖(2%)LB平板，选取没有spc抗性并可在含木糖的培养基上生长的阳性克隆子，即获得B. subtilis 1A751-DPE（图2）。

实施例3：重组菌的发酵酶活

1. DPE酶活测定方法：1mL的反应体系中，加入800μL的用磷酸盐缓冲液（50mM, pH7.0）溶解的100g/L的D-果糖，200μL的发酵液，55℃保温10min，然后煮沸10min以终止酶反应。

2. 用HPLC检测D-阿洛酮糖的生成量，计算酶活。酶活单位（U）：每分钟催化产生1μmol D-psicose 所需要的酶的量。

3. 用接种环从平板上挑取新鲜的菌落接种至种子培养基中，37℃、200rpm，培养12~14h。以3%的接种量接种至发酵培养基中，37℃、200rpm，并定时取样，测定OD₆₀₀酶活数据（图3）。

种子培养基：胰蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L)，NaCl(10g/L)，以纯净水配制。

发酵培养基：葡萄糖(15g/L)，酵母膏(15g/L)，NaCl(8g/L)，MgSO₄(1g/L)，Na₂HPO₄(1g/L)，pH 7.25，以纯净水配制。

<210> SEQ ID NO: 1

<211> 1170

<212> DNA

<213> 1-300位为P43启动子，301-1170为DPE酶基因

<400> 1

Tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60

taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120

tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180

aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240

gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300

atgaagcatg gtatttatta cgcgtactgg gaacaggaat gggcagcaga ttacaagcgg 360

tatgtagaga aggcggcaaa gcttggattc gatatactgg aggttggcgc ggcgccactg 420

ccggactatt ctgcgcagga ggtaaaggaa ctgaaaaaat gcgccgatga taacggtatc 480

cagctgaccg cgggatatgg tcccgccttc aatcataata tgggttcctc agatccgaag 540

atcagggaag aggcgcttca atggtataaa cgcctgttcg aggtgatggc aggccttgat 600

attcatctga ttggcggagc gctttattca tactggccgg tggactttgc cacagccaat 660

aaggaagagg actggaagca cagcgtggag ggaatgcaga ttctggcgcc catcgccagc 720

cagtatggca tcaatctggg aatggaagtc ctgaaccgct ttgagagcca tatcttaaat 780

acttcggaag aaggcgtgaa gttcgtgacg gaagtaggca tggataatgt gaaagtcatg 840

ctggatacgt tccacatgaa catcgaggaa tcgagcattg gcgacgcgat ccgccatgcc 900

gggaaacttc ttggacactt ccacaccggc gagtgcaacc gcatggtacc cggaaagggc 960

cgcaccccat ggagggagat cggggatgcc ttgcgcgaga ttgagtatga cggaaccgtg 1020

gttatggagc catttgtacg catgggcgga caggtaggct ctgatatcaa ggtctggaga 1080

gacatcagca agggcgcggg agaggaccgg ctggatgagg atgcaaggcg cgcggtagag 1140

ttccagagat acatgcttga atggaagtaa 1170

Claims

1.一株基于毒蛋白MazF反向筛选的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为1A751-DPE，分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.003，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2015259。

2.权利要求1所述基于毒蛋白MazF反向筛选的表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于将反向筛选标记毒蛋白基因MazF和抗生素抗性基因spc整合至枯草芽孢杆菌1A751染色体上得到1A751/REF；然后构建整合载体pDGI-P43-DPE，其中含有来源于梭状芽胞杆菌（Clostridium scindens）ATCC 35704 的DPE酶基因和启动子P43；再将P43-DPE酶基因整合至B. subtilis 1A751/REF染色体上MazF的位置，获得一株表达D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌1A751-DPE，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.003，即CCTCC NO：M 2015259。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体步骤为：

（1）将含有木糖启动子基因、MazF毒蛋白基因和壮观霉素spc抗生素基因的片段的整合载体pDGREF转化至枯草芽孢杆菌1A751感受态中，涂布在含有spc抗生素平板上，然后将平板上的菌落分别对应点在含有spc及木糖的平板上，筛选能在抗生素spc平板上生长而不能在木糖平板上生长的克隆，即为B. subtilis 1A751/REF；

（2）以整合载体pDGIEF为出发载体，将pDGIEF用SalⅠ/XmaⅠ双酶切，将P43-DPE酶基因连接至相应的酶切位点，得到含有淀粉酶同源臂的整合载体pDGI-P43-DPE；

（3）将整合载体pDGI-P43-DPE转入B. subtilis 1A751/REF感受态中，涂布在木糖平板上，然后将平板上的菌落分别对应点在含有木糖及spc的平板上进行筛选，筛选能够在木糖平板上生长的阳性克隆，即为无抗性基因的重组枯草芽孢杆菌1A751-DPE，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.003，即CCTCC NO：M 2015259。

4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于为增强表达，在DPE基因的上游添加启动子P43 ，P43启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中1-300位所示。

5.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于所述的整合载体pDGI-P43-DPE，其中含有所述SEQ ID NO.1中301-1170位所示的DPE酶基因，以及含有两端的淀粉酶同源臂。

6. 根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于所述的整合载体pDGREF，其中含有所述的木糖启动子诱导的反向筛选标记MazF以及含有两端的淀粉酶同源臂。

7.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌1A751-DPE的应用，其特征在于可用于生产D-阿洛酮糖，在化学、食品和制药领域中的应用。