CN104958320A - 一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法 - Google Patents
一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法，该细胞制剂主要由间充质干细胞、经过诱导分化的干细胞，富含血小板血浆以及它们的分散介质组成。与现有技术相比，该治疗骨关节炎的细胞制剂将间充质干细胞与诱导分化后的间充质干细胞混合使用，复合了富含血小板血浆成分，并且能够在关节腔内分散，既可以发挥间充质干细胞的免疫调节功能，改善整个关节腔微环境，利于炎症的缓解和损伤的修复；又能够使已分化的间充质干细胞在植入体内之后即开始组织修复过程，缩短修复进程。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学细胞治疗领域，具体涉及一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法。
背景技术
由于年龄增长、超重、免疫系统异常、关节不稳、外伤等原因所导致的关节炎已经成为影响人们正常工作生活甚至致残的重要原因。数据显示，在30岁以上的人群中，骨性关节炎的患病率超过6%，且随着年龄的增长该比例逐渐提高。据估计，中国的骨关节炎患者超过1亿人。
目前针对关节炎主要的治疗目标是：1，减轻疼痛、肿胀；2、改善肌肉力量、关节营养、血液循环、关节润滑；3、延缓关节软骨退变、保留关节功能或生活质量。
传统的治疗方法包括保守治疗和关节置换。保守治疗通常包括理疗、药物治疗等，可以短期缓解症状，但是治标不治本，并未实现损伤区域的修复，长期效果不佳，病情容易反复。
关节置换是用人工制造的关节代替疼痛且丧失关节功能的关节的方法，一般应用于较为严重的骨坏死、粉碎性骨折脱位不能复位者、疼痛及活动障碍的骨关节病、僵直或活动困难的类风湿性关节炎以及骨肿瘤等。关节置换存在假体松动、磨损或折断、深部感染、异物反应以及妨碍活动的软组织钙化等并发症。
随着组织工程与再生医学领域的发展，关于组织修复与再生的研究也逐渐增多。间充质干细胞广泛存在于骨髓、脂肪、肝脏、外周血、脐带、脐血等组织中，具有高度自我更新能力及多向分化潜能，因而被广泛开发和应用。
专利号为ZL02815834.2的中国发明专利，公开了一种用于治疗关节软骨损伤、损害或缺陷的组合物。由从脐带血分离、增殖和/或分化而来的细胞组分、培养介质和生物相容性聚合物组成。
专利申请号为201010152461.2的中国发明专利申请，公开了一种用于治疗骨损伤的细胞注射剂及其制备方法，由自体骨髓来源的间充质干细胞和温敏型凝胶及自体血液分离提取的有效营养因子组成的复合物。
上述专利或专利申请文件中记载的复合的生物相容性聚合物或温敏凝胶植入体内后形成半固体或凝胶状，不利于间充质干细胞在关节腔内的分散，阻碍了通过干细胞的免疫调节功能来改善关节腔微环境的过程；在细胞的应用上，专利申请号为201010152461.2的申请文件中仅包含了间充质干细胞或软骨细胞单一的细胞类型，单纯应用间充质干细胞具有旁分泌、调节免疫功能，但是组织修复需要通过体内的诱导分化来实现，因此治疗所需时间较长；而单纯应用诱导后的间充质干细胞细胞进行治疗，仅具有组织修复功能，并不具备抗炎因子分泌功能，不利于关节炎的修复。
专利号为ZL201210410047.6的中国专利，公开了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的方法及其在骨关节炎中的应用，该发明使用小球法诱导培养间充质干细胞分化为无支架软骨，使用时将该软骨消化制备成软骨细胞悬液进行关节内注射。该专利仍然存在使用单一诱导分化后间充质干细胞的问题，此外诱导过程所需时间长，形成的无支架软骨结构紧密，内部细胞容易出现凋亡。
综上所述，不难看出目前应用于关节炎治疗的细胞制剂细胞类型单一，不能充分发挥细胞的生物学性能，诱导分化方法效率较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有关节炎治疗制剂或方法存在细胞制剂细胞类型单一、治疗时间长、不能充分发挥细胞的生物学性能，诱导分化效率较低等不利于关节炎的恢复的问题。
为此，本发明提供了一种治疗骨关节炎的细胞制剂，该细胞制剂适用于骨关节炎疾病中炎症的缓解和受损组织的修复，实现患者症状的缓解和功能的恢复。
上述治疗骨关节炎的细胞制剂，由间充质干细胞、向软骨方向诱导分化的间充质干细胞、富含血小板血浆及分散介质组成。
上述间充质干细胞来源是骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、外周血间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脐带血间充质干细胞中的任一种。
上述细胞制剂的终细胞浓度为105～108/ml，其中，所述间充质干细胞与所述诱导分化后的间充质干细胞比例为0.25:1～4:1。
上述富含血小板血浆中血小板浓度在1～2×106/μl之间。
上述富含血小板血浆与分散介质的体积比在0.5:1～2:1。
上述分散介质是MEM、DMEM、D/F12、α-MDM、IMDM、BME、RPMI 1640和McCoy's 5A培养基中的任一种。
同时，本发明提供了一种制备上述治疗骨关节炎的细胞制剂的方法，包括以下步骤：
步骤一、间充质干细胞的分离培养：分离间充质干细胞后，接种于细胞培养基中，于37℃、体积分数为0.05%的CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞铺满瓶底80%时，用0.25%胰酶消化传代；
选用的种子细胞包括各种来源的间充质干细胞，所述间充质干细胞是骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、外周血间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞中的任一种；
步骤二：间充质干细胞的诱导分化：
取传代至2～6代的上述间充质干细胞，培养于诱导分化培养基中，隔天换液，同时，对间充质干细胞进行10～40kpa，1Hz，2～6h/d的压应力刺激，通过细胞形态改变、酶表达、组织化学染色、组织免疫染色、分子生物学检验、生化含量分析，以确定所述间充质干细胞的分化；
所述的诱导分化培养基为高糖DMEM培养基，其中含有胎牛血清（FBS）1～20%、转化生长因子（TGF-β）1～40ng/mL、维生素C（Vc）15～100μg/mL、胰岛素3～20μg/ml、转铁蛋白2～30μg/ml、丙酮酸钠1～10mmol/L、地塞米松10-7～10-5mol/L、亚油酸2～30μg/mg、牛血清白蛋白0.5～10ng/ml；
通过诱导分化培养基和压应力刺激共同作用进行间充质干细胞的诱导分化，以促进软骨相关基因的表达以及蛋白多糖的分泌，进而利于所述间充质干细胞向软骨方向的分化；
步骤三：富含血小板血浆的制备：取加入抗凝剂的静脉血，离心法浓缩血小板，获取血小板浓度为1～2×106/μl的血浆；
步骤四：细胞制剂的制备
将间充质干细胞与诱导分化的间充质干细胞消化计数待用，将富含血小板血浆与分散介质以0.5:1～2:1的体积比混合，之后以此悬浮待用细胞，调整终细胞浓度为105～108/ml，其中间充质干细胞与诱导分化后的间充质干细胞比例为0.25:1～4:1；
上述分散介质是MEM、DMEM、D/F12、α-MDM、IMDM、BME、RPMI 1640和McCoy's 5A培养基中的任一种；
培养基可以为细胞的生存和繁殖提供基础营养，而富含血小板血浆中含有丰富的生长因子，这些生长因子在细胞增殖分化，组织修复再生中发挥重要作用，将细胞、富含血小板血浆及培养基三者复合，可有效发挥各自性能，实现关节炎的症状缓解与组织修复。
与现有产品及技术相比，本发明具有以下优点：
（1）将间充质干细胞与诱导分化后的间充质干细胞混合使用，既可以发挥间充质干细胞的免疫调节功能，改善关节腔微环境，利于炎症的缓解和损伤的修复；又能够使已分化的间充质干细胞在植入体内之后即开始组织修复过程，缩短修复进程。两种细胞混合使用可以最大程度发挥各自的生物学效用，促进组织的修复与再生。此外复合了富含血小板血浆成分，其多种生长因子和活性成分利于损伤组织的修复和愈合过程。
（2）采用诱导分化培养基和压应力刺激两种方法结合来进行间充质干细胞向软骨细胞的分化，可促进软骨相关基因的表达以及蛋白多糖的分泌，提高诱导效率，缩短诱导分化所需时间，简单高效。细胞形态观察、甲苯胺蓝染色以及GAG含量检测显示诱导7天后即可生成透明软骨细胞。
（3）所制备的细胞制剂为悬液形式，关节腔内注射后能够保证细胞和各种生长因子、活性物质在整个关节腔内分散，能够改善关节腔微环境，利于关节炎的恢复。动物实验结果显示本发明制备的细胞制剂在8周时基本可以实现关节炎的修复，新生软骨表面较为光滑，组织结构较为清晰明显，而不做处理的空白对照组软骨表面粗糙不平，结构被破坏。
附图说明：
图1A为诱导分化的间充质干细胞细胞形态图。
图1B为未经诱导分化的间充质干细胞细胞形态图。
图1C为以间充质干细胞作为阴性对照，以软骨细胞作为阳性对照，分别取其上清液进行GAG含量检测结果图。
图2A为实验组8周取材组织学切片图。
图2B为正常软骨切片图。
图2C为空白对照组的组织学切片图。
具体实施方式
为了克服现有关节炎治疗制剂或方法存在细胞制剂细胞类型单一、治疗时间长、不能充分发挥细胞的生物学性能，诱导分化效率较低等不利于关节炎的恢复的问题，本实施例提供了一种治疗骨关节炎的细胞制剂，该细胞制剂适用于骨关节炎疾病中炎症的缓解和受损组织的修复，实现患者症状的缓解和功能的恢复。
治疗骨关节炎的细胞制剂，包括细胞、富含血小板血浆以及分散介质。其中涉及的细胞包括间充质干细胞和向软骨方向诱导分化的间充质干细胞两种细胞类型。
间充质干细胞来源包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、外周血间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞等。
所使用的富含血小板血浆中血小板浓度在1～2×106/μl之间。富含血小板血浆与分散介质的体积比在0.5:1～2:1之间。
分散介质是指常用的细胞培养介质，包括但不限于MEM、DMEM、D/F12、α-MDM、IMDM、BME、RPMI 1640、McCoy's 5A培养基，用于悬浮细胞和富含血小板血浆中的活性成分和各种细胞生长因子，并且提供营养。
上述治疗骨关节炎的细胞制剂的制备包括：间充质干细胞的分离培养；间充质干细胞的诱导分化；富含血小板血浆的制备；细胞制剂的制备，至此则完成对治疗骨关节炎的细胞制剂的制备，具体制备过程是：
步骤一：间充质干细胞的分离培养：
选用的种子细胞包括各种来源的间充质干细胞，该间充质干细胞可以骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、外周血间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脐带血间充质干细胞中的任一种，种子细胞的培养方法以及使用的细胞培养基可以参考相关文献（胡彬，刘晓华，赵林.骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定.中国组织工程研究与临床康复，2011,15（27）：5108～5111；王娟，陆琰，何冬梅.人脐带间充质干细胞体外分离、纯化及鉴定.暨南大学学报，2009,30（4）：367～372；张月双，卫华，马健.人脐血间充质干细胞分离培养方法的改良.同济大学学报（医学版），2010,31（1）：27～31；王冬梅，石蓓，赵然尊，等．兔外周血间充质干细胞的分离培养及冻存．遵义医学院学报，2007,30（3）：336～338.张正政，李卫平，杨睿，等.滑膜间充质干细胞分离培养、免疫表型鉴定及在混合淋巴反应体系中的抑制效应.中国组织工程研究，2012,16（19）：3515～3519）。具体是：分离间充质干细胞后，接种于细胞培养基中，于37℃、体积分数为0.05%的CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞铺满瓶底80%时，用0.25%胰酶消化传代。
步骤二：间充质干细胞的诱导分化：
取传代至2～6代的上述间充质干细胞，培养于诱导分化培养基中，隔天换液。同时，对细胞进行10～40kpa，1Hz，2～6h/d的压应力刺激。通过细胞形态改变，酶表达，组织化学染色，组织免疫染色，分子生物学检验，生化含量分析等方法确定细胞的分化。
上述诱导分化培养基为高糖DMEM培养基，其中含有胎牛血清（FBS）1～20%、转化生长因子（TGF-β）1～40ng/mL、维生素C（Vc）15～100μg/mL、胰岛素3～20μg/ml、转铁蛋白2～30μg/ml、丙酮酸钠1～10mmol/L、地塞米松10-7～10-5mol/L、亚油酸2～30μg/mg、牛血清白蛋白0.5～10ng/ml；
本步骤采用诱导分化培养基和压应力刺激共同作用进行间充质干细胞的诱导分化，可促进软骨相关基因的表达以及蛋白多糖的分泌，利于间充质干细胞向软骨方向的分化。
步骤三：富含血小板血浆的制备：
富含血小板血浆的制备可参考文献方法进行（刘景汉，欧阳锡林，石群，等．富含血小板血浆制备过程中血小板CD62p表达.中国实验血液学杂志，2002,10（3）：253～256；金哲，吕刚，王禹祥.二次离心法制备富含血小板血浆离心条件的比较.中国医科大学学报，2012,41（3）：237～240）。具体可以是：取加入抗凝剂的静脉血，离心法浓缩血小板，获取血小板浓度为1～2×106/μl的血浆。
步骤四：细胞制剂的制备
将间充质干细胞与诱导分化的间充质干细胞消化计数待用，将富含血小板血浆与分散介质以0.5:1～2:1的比例混合，之后以此悬浮待用细胞，调整终细胞浓度为105～108/ml，其中间充质干细胞与诱导分化后的间充质干细胞比例为0.25:1～4:1。所用的分散介质包括但不限于MEM、DMEM、D/F12、α-MDM、IMDM、BME、RPMI 1640、McCoy's 5A培养基。
以下通过一些实例，对上述治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备做进一步的详细说明。
实施例1：脂肪间充质干细胞为种子细胞
步骤一、脂肪间充质干细胞的分离培养
将新西兰兔常规麻醉，自腹部皮下获取脂肪组织，以PBS溶液冲洗3次，去除血管和结缔组织，剪碎，加入3倍体积的I型胶原酶，37℃消化2 h，以200 目滤网滤去未消化完全的大块脂肪组织，离心弃上清，以PBS重悬细胞，清洗3次，之后加入含10%FBS的低糖DMEM 重悬沉淀细胞，接种于平皿，于37℃、体积分数为0.05%的CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞铺满瓶底80%时，用0.25%胰酶消化传代。
步骤二、脂肪间充质干细胞的诱导分化
取P5代脂肪间充质干细胞以106/ml接种至培养皿中，诱导分化培养基为高糖DMEM培养基，含15%胎牛血清、10μg/L TGF-β1、20mg/L Vc、5mg/L胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白、5mmol/L丙酮酸钠、10-7mol/L地塞米松、5μg/mg亚油酸、2ng/ml牛血清白蛋白，隔天换液，以40Kpa，1Hz，2h/d对培养细胞施加压应力刺激，7天后完成对脂肪间充质干细胞的诱导分化。
步骤三、富含血小板血浆的制备
取外周血5ml，加入抗凝剂，以900转/分离心30分钟，轻轻分离血小板及白细胞层附近血浆获得富含血小板血浆。所得血小板浓度为1.14×106/μl。
步骤四、细胞制剂的制备
将间充质干细胞与诱导分化的间充质干细胞消化计数待用，将富含血小板血浆与MEM培养基以1:2的体积比混合，之后以此悬浮待用细胞，调整终细胞浓度为108/ml，其中间充质干细胞与诱导分化后的间充质干细胞比例为1:4。至此完成治疗骨关节炎的细胞制剂的制备。
图1显示诱导分化7天之后的脂肪间充质干细胞检测结果，细胞形态观察结果表明，通过对脂肪间充质干细胞诱导分化7天之后细胞已经呈现多边形的软骨细胞特点（参见图1A），而未做诱导分化处理的脂肪间充质干细胞仍呈纤维状螺旋分布（参见图1B）；同时取其上清液进行GAG检测，以间充质干细胞作为阴性对照，以软骨细胞作为阳性对照，结果也显示诱导分化处理的间充质干细胞可以分泌更多的糖胺聚糖，显示出软骨细胞特性（参见图1C），说明脂肪间充质干细胞已被成功诱导为软骨细胞。
图2显示的是通过上述步骤制备的治疗骨关节炎的细胞制剂修复关节炎8周取材的组织学切片，结果如图2A所示，显示试验组可以实现关节炎的修复，修复表面光滑平整，软骨结构接近图2B所示的正常软骨，而空白对照组如图2C所示，软骨表面粗糙，潮线不明显，，软骨结构受到破坏。
实施例2：人脐带间充质干细胞为种子细胞为，脐带来源于供体捐献。
步骤一、脐带间充质干细胞的分离培养：
将脐带组织从采集瓶取出，置于酒精中清洗2次转入无菌PBS去除结缔组织、淤血等，之后充分清洗，去除血污。将脐带转入大号培养皿中，剪断成3-4cm长度之后沿纵向进行分离，是脐带组织管状变为片状。将片状脐带组织进行进一步的分离，切割为2-3mm3大小的组织块，将组织块逐一种植到预先以含20%胎牛血清的D/F12培养基包被的培养皿中，置于37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱中，每24小试补加0.5ml培养基，72小时后全量换液，每周换液2次，细胞生长融合只80%左右时进行传代。
步骤二：脐带间充质干细胞的诱导分化
取P2代脐带间充质干细胞以105/ml接种至培养皿中，诱导分化培养基为高糖DMEM培养基，其中含有1%胎牛血清、30μg/L TGF-β3、80mg/L Vc、15mg/L胰岛素、20mg/L转铁蛋白、2mmol/L丙酮酸钠、10-5mol/L地塞米松、25μg/mg亚油酸、6ng/ml牛血清白蛋白，隔天换液。以10Kpa，1Hz，6h/d对培养细胞施加压应力刺激。7天之后完成诱导分化。
步骤三、富含血小板血浆的制备
取外周血5ml，加入抗凝剂，初次以1400转/分离心10分钟，之后小心吸取上部血浆进行二次离心，二次离心参数为1400转/分离心15分钟，轻轻去除上清，获得底部离心液为富含血小板血浆。所得血小板浓度为1.96×106/μl。
步骤四、细胞制剂的制备
将间充质干细胞与诱导分化的间充质干细胞消化计数待用，将富含血小板血浆与D/F12培养基以2:1的体积比混合，之后以此悬浮待用细胞，调整终细胞浓度为106/ml，其中间充质干细胞与诱导分化后的间充质干细胞比例为3:1。至此完成治疗骨关节炎的细胞制剂的制备。
Claims (9)
1.一种治疗骨关节炎的细胞制剂，其特征在于：由间充质干细胞、通过诱导分化培养基和压应力刺激共同作用下向软骨方向诱导分化的间充质干细胞、富含血小板血浆及分散介质组成。
2.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于：所述间充质干细胞来源是骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、外周血间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、脐带间充质干细胞和脐带血间充质干细胞中的任一种。
3.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于：所述细胞制剂的终细胞浓度为105～108/ml，其中，所述间充质干细胞与所述诱导分化后的间充质干细胞比例为0.25:1～4:1。
4.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于：所述富含血小板血浆中血小板浓度是1～2×106/μl。
5.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于：所述富含血小板血浆与分散介质的体积比是0.5:1～2:1。
6.根据权利要求1所述的细胞制剂，其特征在于：所述分散介质是MEM、DMEM、D/F12、α-MDM、IMDM、BME、RPMI 1640和McCoy's 5A培养基中的任一种。
7.一种权利要求1所述的治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、间充质干细胞的分离培养；
分离间充质干细胞后，接种于细胞培养基中，于37℃、体积分数为0.05%的CO2培养箱中培养，隔天换液，待细胞铺满瓶底80%时，用0.25%胰酶消化传代；
所述间充质干细胞是骨髓源间充质干细胞、脂肪源间充质干细胞、外周血源间充质干细胞、滑膜源间充质干细胞、脐带源间充质干细胞和脐带血源间充质干细胞中的任一种；
步骤二：间充质干细胞的诱导分化
取传代至2～6代的上述间充质干细胞，培养于诱导分化培养基中，隔天换液，同时，对间充质干细胞进行10～40kpa，1Hz，2～6h/d的压应力刺激，通过细胞形态改变、酶表达、组织化学染色、组织免疫染色、分子生物学检验、生化含量分析，以确定所述间充质干细胞的分化；
所述诱导分化培养基为高糖DMEM培养基，其中含有胎牛血清FBS 1～20%、转化生长因子TGF-β1～40ng/mL、维生素C15～100μg/mL、胰岛素3～20μg/ml、转铁蛋白2～30μg/ml、丙酮酸钠1～10mmol/L、地塞米松10-7～10-5mol/L、亚油酸2～30μg/mg、牛血清白蛋白0.5～10ng/ml；
通过诱导分化培养基和压应力刺激共同作用进行间充质干细胞的诱导分化，以促进软骨相关基因的表达以及蛋白多糖的分泌，进而利于所述间充质干细胞向软骨方向的分化；
步骤三：制备富含血小板的血浆，取加入抗凝剂的静脉血，离心法浓缩血小板，获取血小板浓度为1～2×106/μl的血浆；
步骤四：细胞制剂的制备
将间充质干细胞与诱导分化的间充质干细胞消化计数待用，将富含血小板血浆与分散介质以0.5:1～2:1的体积比混合，之后以此悬浮待用细胞，调整终细胞浓度为105～108/ml，其中间充质干细胞与诱导分化后的间充质干细胞比例为0.25:1～4:1。
8.如权利要求1所述的治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所述富含血小板血浆与分散介质的体积比为0.5:1～2:1。
9.如权利要求1所述的治疗骨关节炎的细胞制剂的制备方法，其特征在于，所用的分散介质是MEM、DMEM、D/F12、α-MDM、IMDM、BME、RPMI 1640和McCoy's 5A培养基中的任一种。
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