CN104955472A - 用于生长激素递送的脂肪酸酰化的氨基酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含脂肪酸酰化的氨基酸(FA-aa)的生长激素组合物，其可以用于药物组合物，诸如用于口服施用生长激素的药物组合物。

Description

用于生长激素递送的脂肪酸酰化的氨基酸

技术领域

本发明的技术领域涉及用于口服递送治疗性生长激素化合物的脂肪酸酰化的氨基酸(FA-aa)和包含此类FA-aa的药物组合物。

背景

许多由某些大分子(例如蛋白和肽)的产生的缺陷或完全失效引起的病理学状态用治疗性大分子(诸如亲水肽或蛋白)的侵袭性且不方便的胃肠外施用来治疗。其一个实例是通常通过每日一次剂量的hGH施用人生长激素(hGH)用于治疗生长激素缺陷或其中患者得益于循环生长激素的量增加的疾病或病症。相比于此，由于它的非侵袭性性质对于口服施用药物而言是期望的，且具有减少患者的与药物施用相关的不适和增加药物依从性的巨大潜力。然而，存在几个障碍；诸如在胃肠(GI)道中的酶促降解，药物流出泵，从肠粘膜的吸收的不足和变化，以及在肝脏中的首过代谢，并且迄今为止尚未发现用于口服递送治疗性亲水蛋白的产品面市。

生长激素(GH)是一种由哺乳动物垂体前叶分泌的多肽激素。根据物种，GH是一种由约190个氨基酸残基组成的蛋白，相当于约22 kDa的分子量。GH与细胞表面受体GH受体(GHR)结合，并通过GH受体信号传导。GH在促进生长、保持正常身体组成、合成代谢和脂质代谢中发挥关键作用。它还对中间代谢具有直接作用，诸如葡萄糖摄取降低、脂解作用增加以及氨基酸摄取和蛋白合成的增加。该激素还对其它组织发挥作用，包括脂肪组织、肝、肠、肾、骨骼、结缔组织和肌肉。重组hGH已经生产且可商业获得，例如：Genotropin™ (Pharmacia Upjohn)、Nutropin™ 和Protropin™ (Genentech)、Humatrope™ (Eli Lilly)、Serostim™ (Serono)、诺地托品(Norditropin)(Novo Nordisk)、Omnitrope (Sandoz)、Nutropin Depot (Genentech和Alkermes)。另外，在N末端具有额外甲硫氨酸残基的变体还作为例如Somatonorm™ (Pharmacia Upjohn/Pfizer)销售。

人生长激素被存在于胃中(胃蛋白酶)、肠腔中(糜蛋白酶、胰蛋白酶、弹性酶、羧肽酶等)和胃肠道粘膜表面中(氨肽酶、羧肽酶、肠肽酶、二肽基肽酶、内肽酶等)的多种消化酶降解。

已经探索用于获得蛋白酶稳定化的人生长激素化合物的各种途径，并且此类分子的实例描述于WO 2011/089250和WO2011/089255。随后用于获得口服治疗剂的挑战是口服施用的化合物的增加的生物利用率。

其次，口服施用的蛋白化合物必须在其进程过程中通过胃肠道吸收。空肠与十二指肠和回肠连接，并且专门吸收消化产物，诸如糖、氨基酸和脂肪酸，这得到粘膜的大表面积的帮助。

空肠和回肠内衬的上皮细胞实现了营养素的被动转运和氨基酸、小肽、维生素和葡萄糖的主动转运。上皮细胞对肽和特别大的蛋白分子的摄取因此对于生成口服药物组合物非常关键。

正在探索多种技术，且本发明涉及脂肪酸酰化的氨基酸的用途，所述脂肪酸酰化的氨基酸是来自化妆品的先前已知成分，且主要用于增加经皮吸收。

Föger等人描述了分子量对亲水肽药物的口服吸收的影响，并显示，渗透性随着此类亲水肽药物的分子量增加而降低(Amino Acids (2008) 25: 233-241, DOI 10.1007/s00726-007-0581-5)。

对具有低刺激作用的新表面活性剂的研究，已经导致了源自氨基酸的不同表面活性剂的开发(Mitjans等人, 2003; Benavides等人, 2004; Sánchez等人, 2006)。FA-aa是基于氨基酸的表面活性剂，并且因此是具有低毒性的、温和的可生物降解的表面活性剂。

US2004147578 (WO 0207506)涉及脂肪酸酰化的氨基酸，其被用作疏水分子包括疏水大分子(诸如环孢菌素)的渗透增强剂。

WO2001035998涉及酰化的氨基酸，其被用作大分子(诸如亲水肽或蛋白)的经皮和经粘膜吸收促进剂。

WO2004064758涉及一种口服组合物，其用于递送药用肽，诸如胰岛素、生长激素和GLP-1，其中活性肽在不是天然酰胺化的位点被酰胺化。所述组合物可以包含吸收增强剂，例如酰基肉毒碱，其使用PTH1-34的制剂中的月桂酰肉毒碱例举。

US2005282756涉及一种干粉组合物，其包含胰岛素和吸收增强剂。

WO2003030865涉及胰岛素组合物，其包含表面活性剂诸如离子型表面活性剂，并且还含有油或脂质化合物诸如甘油三酯，且进一步包含长链酯化的脂肪酸。

WO2004064758涉及一种用于递送药用肽的口服药物组合物，其包含吸收增强剂(诸如酰基肉毒碱、磷脂和胆汁酸)。

US2006093632涉及可注射组合物，当注入水中时，其形成沉淀，导致产生持续释放制剂。

EP0552405公开了用于化合物诸如吲哚美辛和邻氨基苯甲酸衍生物的经皮吸收促进剂。

口服施用途径对于高分子量化合物诸如生长激素是非常复杂的，并且需要进一步改进以建立适合于治疗患者的可接受的组合物，其具有生长激素化合物的有效的生物利用率。

概述

已经令人惊讶地发现，脂肪酸氨基酸(FA-aa)例如N-酰化的氨基酸增加口服施用后的生长激素化合物的吸收。

由于它们的低毒性和增加治疗性大分子(诸如亲水肽或蛋白)的口服生物利用率的作用，根据本发明的FA-aa是口服药物组合物中的有价值的成分。根据本发明的FA-aa在包含生长激素化合物的口服药物组合物中是特别有价值的。这对于需要长期施用治疗性大分子(例如生长激素)的疾病(但不限于此)而言是重要的，因为最非侵袭性的、无毒的药物施用在任何治疗中通常是有利的，对于治疗剂的偶尔施用或大批施用也是如此。

到目前为止，没有任何生长激素化合物可用作口服制剂，这主要是由于此类化合物的酶促降解和非常低的肠渗透性的巨大挑战。

本发明的一个方面是药物组合物，其包含在其α-氨基被8至18个碳的脂肪酸酰化的某些氨基酸和活性成分，诸如生长激素化合物。药物组合物的组成使得其适合于口服施用，因为观察到增加的生物利用率。

本发明涉及适合用于口服施用生长激素化合物的药物组合物，其包含充当渗透增强剂的FA-aa。

本发明还可以解决其它问题，这从示例性实施方案的公开内容来看是显而易见的。本发明涉及包含FA-aa的药物组合物，所述FA-aa适合用于增加生长激素化合物的吸收和/或生物利用率，这对于待口服施用的药物组合物特别重要。

如从本文公开内容将显而易见的是，目标化合物被描述为(脂肪酸)酰化的氨基酸或脂肪酸N-酰化的氨基酸，或简单地，简称FA-aa，其描述具有氨基酸基本结构的化合物，其中α氨基通过形成肽样键被脂肪酸酰化。

本发明的一个方面涉及包含至少一种生长激素化合物和至少一种FA-aa的药物组合物。本文所述的FA-aa包括脂肪酸部分和作为核心结构的氨基酸骨架。已经发现该化合物增加当施用于肠时生长激素化合物的生物利用率。在进一步方面，所述组合物包含FA-aa，其中脂肪酸部分具有12、14或16个碳原子。

生长激素化合物相比于人生长激素增加的稳定性对于获得可以口服和/或以足够间隔施用的制剂是有利的。在进一步的方面，组合物包含T½高于30分钟的生长激素化合物。

在进一步方面，本发明涉及用于增加生长激素化合物的生物利用率的方法，其包括在生长激素化合物的药物组合物中包括FA-aa的步骤。本发明的其他方法旨在增加生长激素化合物的血浆浓度，其包括以下步骤：使个体的胃肠道暴露于包含生长激素化合物和FA-aa的药物组合物，由此在所述个体中观察到所述生长激素化合物的血浆浓度增加。其还涉及到考虑，在组合物中包括FA-aa使得施用的生长激素化合物的生物利用率或血浆浓度的增加大于当不包括至少一种FA-aa的情况下施用该化合物观察到的增加。

本发明的一个方面涉及用于治疗生长激素相关的疾病或病症的方法，其包括施用包含生长激素化合物和至少一种FA-aa的药物组合物。

附图简要说明

图1. 类似于实施例8和11中描述的程序使用有(实心标记)和没有(空心标记)C16-Glu的制剂肠内施用后随着时间的生长激素类似物GH-A2的平均血浆浓度。

图2. 从含水缓冲液中配制的化合物GH-A1的药代动力学概况测定的平均AUC。所比较的脂肪酸酰化的氨基酸的浓度为30 mg/ml。平均AUC值基于各种数量的体内研究： 无增强剂(69次研究，其中n=6)，C~12-肌氨酸盐(2次研究，其中n=6)，和C16-肌氨酸盐(14次研究，其中n=6)。

图3. 从含水缓冲液中配制的化合物GH-A2的药代动力学概况测定的平均AUC。所比较的脂肪酸酰化的氨基酸的浓度为30 mg/ml。平均AUC值基于各种数量的体内研究： 无增强剂(12次研究，其中n从6-12变化)，C10-Gly (1次研究，n=12)，C12-His (1次研究，n=12)，C12-Pro (1次研究中，n=12)，C16-肌氨酸盐(5次研究，n从6-12变化)和C16-Glu (1次研究，n=12)。

图4. 从含水缓冲液中配制的化合物GH-A3的药代动力学概况测定的平均AUC。所比较的脂肪酸酰化的氨基酸的浓度为30 mg/ml。平均AUC值基于各种数量的体内研究： 无增强剂(2次研究，其中n=6), C8-His (2次研究，其中n=6), C8-肌氨酸盐(2次研究，其中n=6), C10-Asp (2次研究，其中n=6), C10-Gln (2次研究，其中n=6), C12-Trp (2次研究，其中n=6), C12-肌氨酸盐(2次研究，其中n=6), C12-Pro (2次研究，其中n=6), C16-肌氨酸盐(7次研究，其中n=6), C16-Glu (2次研究，其中n=6)和C18=肌氨酸盐(2次研究，其中n=6)。

图5. 从含水缓冲液中配制的化合物GH-A1的药代动力学概况测定的平均AUC。缓冲液用和不用脂肪酸酰化的氨基酸C16-肌氨酸盐(30 mg/ml)且用或不用大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI (2%)制备。平均AUC值基于各种数量的体内研究： 无增强剂 (69次研究，其中n=6), C16-肌氨酸盐(14次研究，其中n=6), SBTI (1次研究，n=6)和C16-肌氨酸盐+ SBTI (1次研究，n=6)。

图6. 从含水缓冲液中配制的化合物GH-A2的药代动力学概况测定的平均AUC。缓冲液用和不用脂肪酸酰化的氨基酸C16-肌氨酸盐(30 mg/ml)且用或不用大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI (2%)制备。平均AUC值基于各种数量的体内研究： 无抑制剂(12次研究，其中n从6-12变化)，C16-肌氨酸盐(5次研究，其中n从6-12变化)，SBTI (3次研究，其中n从6-9变化)和C16-肌氨酸盐+ SBTI (5次研究，其中n从6-9变化)。

图7. 从含水缓冲液中配制的化合物GH-A3的药代动力学概况测定的平均AUC。缓冲液用和不用脂肪酸酰化的氨基酸C16-肌氨酸盐(30 mg/ml)且用或不用大豆胰蛋白酶抑制剂SBTI (2%)制备。平均AUC值基于各种数量的体内研究： 无抑制剂(2次研究，其中n=6), C16-肌氨酸盐(7次研究，其中n=6), SBTI (1次研究，n=6)，和C16-肌氨酸盐+ SBTI (1次研究，n=6)。

详述

所选定义

如本文所使用的术语“多肽”和“肽”是指通过肽键连接的至少两个氨基酸构成的化合物。

术语“氨基酸”包括遗传密码编码的氨基酸(其在本文中被称为标准氨基酸)的组。还包括的是并非由遗传密码编码的天然氨基酸以及合成氨基酸。通常已知的天然氨基酸包括γ-羧基谷氨酸、羟脯氨酸、鸟氨酸、肌氨酸和磷酸丝氨酸。通常已知的合成氨基酸包括通过化学合成制备的氨基酸，诸如Aib (α-氨基异丁酸)、Abu (α-氨基丁酸)、Tle (叔丁基甘氨酸)、β-丙氨酸、3-氨基甲基苯甲酸、邻氨基苯甲酸。

如本文所使用的术语“蛋白”是指由一个或多个多肽组成的生化化合物。

当本文中使用时，术语“药物”、“治疗剂”、“药剂”或“药品”是指药物组合物中使用的活性成分，其可以在治疗中使用。

自然界中已经描述了至少300种氨基酸，但这些中只有二十种通常作为人肽和蛋白中的组分存在。

细胞在肽生物合成中使用20种标准氨基酸，并且这些由一般遗传密码指定。所述二十种标准氨基酸是丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)。肌氨酸与甘氨酸的差异在于用–CH₃交换–H，且对于以下也被认为是氨基酸。

标准氨基酸可以分成极性氨基酸和非极性氨基酸。极性氨基酸是天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和半胱氨酸(Cys)，且非极性氨基酸是甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)。

极性氨基酸可以被细分为不带电的极性氨基酸(谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和半胱氨酸(Cys))和带电的极性氨基酸(天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His))。

非极性氨基酸可以根据疏水性区分，使得非极性且疏水中性氨基酸是甘氨酸和丙氨酸，和非极性且疏水性氨基酸是亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)。

后一组可以基于侧链是脂族(亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)和脯氨酸(Pro))或芳族(酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe))区分。

脂肪酸是具有长脂族尾(链)的羧酸。

术语“脂肪酸氨基酸”、“脂肪酸N-酰化的氨基酸”或“酰化的氨基酸”或“脂肪酸酰化的氨基酸”可互换使用，并且当本文中使用时是指在其α-氨基被脂肪酸酰化的氨基酸。该分子简称为“FA-aa”。

术语“口服生物利用率”在本文中是指，施用的药物剂量的部分，所述部分在已经口服施用之后到达全身循环。通过定义，当静脉内施用药物时，其生物利用率是100%。然而，当口服施用药物时，活性成分的生物利用率由于降解、不完全吸收和首过代谢而下降。

术语“生物活性”应当表示生长激素化合物在相关参考系统中的活性，并且可以在本领域技术人员已知的各种测定，例如，诸如实施例1中所述的BAF测定中进行测量。

如本文所使用的术语“表面活性剂”是指可以吸附在表面和界面(诸如但不限于液体-空气、液体-液体、液体-容器或液体-任何固体)处的任何物质，尤其是去污剂。

如本文所使用的术语”非离子型表面活性剂”是指可以吸附在表面和界面(如液体-空气、液体-液体、液体-容器或液体-任何固体)处的任何物质，尤其是去污剂，且其在其(一个或多个)亲水基团(有时被称为“头”)中不具有带电荷的基团。非离子型表面活性剂可以选自去污剂诸如聚山梨酯，诸如聚山梨酯-20、聚山梨酯-40、聚山梨酯-60、聚山梨酯-80、超级精制的聚山梨酯(其中术语“超级精制的”由供应商Croda针对他们的高纯度吐温产品而使用)、泊洛沙姆诸如泊洛沙姆188和泊洛沙姆407、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯衍生物诸如烷基化的和烷氧基化的衍生物(吐温，例如吐温-20或吐温-80)，

如本文所使用的术语“助表面活性剂”是指当存在第一种表面活性剂时添加至组合物或制剂中的额外表面活性剂。

如本文所使用的术语“渗透增强剂”是指促进药物的吸收的生物品或化学品。

术语“增强剂”当测试FA-aa增加给定GH化合物的AUC的能力时使用。GH化合物的AUC在测试化合物(增强剂)存在的情况下测量，并且与增强剂(测试化合物)不存在的情况下测量的AUC进行比较。

如本文所使用的术语“防腐剂”是指，加入药物组合物中以防止或延迟微生物活动(生长和代谢)的化合物。药学上可接受的防腐剂的实例是苯酚、间甲酚以及苯酚和间甲酚的混合物。

如本文所使用的术语“微乳预浓缩物”是指这样的组合物：其在口服施用后，在含水介质中(例如水中或胃肠液中)自发形成微乳或纳米乳(例如，水包油微乳或纳米乳、溶胀胶束、胶束溶液)。在含水介质中以例如1:5、1:10、1:50、1:100或更高的稀释度稀释后，所述组合物自乳化。在一个实施方案中，根据本发明的组合物形成微乳或纳米乳，其包含直径大小小于100nm的颗粒或域(domain)。如本文所使用的术语“域大小”或“粒径”是指重复散射单位，且可以通过例如小角度X-射线来测量。颗粒/微滴大小可以基于动态光散射(DLS)，其估计分散颗粒或微滴的平均直径。在本发明的一个实施方案中，所述域大小小于150nm，在另一个实施方案中，小于100nm，且在另一个实施方案中，小于50nm，在另一个实施方案中，小于20nm，在另一个实施方案中，小于15nm，诸如约12nm。

“SEDDS”(自乳化药物递送系统)在本文中被定义为亲水组分、表面活性剂、任选的助表面活性剂或脂质组分和治疗性大分子的混合物，在轻轻搅拌或将在胃肠道中遇到的消化蠕动的条件下，当暴露于含水介质时，所述混合物自发形成细微的水包油乳剂。“SMEDDS”(自微乳化药物递送系统)在本文中被定义为亲水组分、表面活性剂、任选的助表面活性剂或脂质组分和治疗性大分子的均质混合物，在轻轻搅拌或将在胃肠道中遇到的消化蠕动的条件下，当暴露于含水介质时，所述混合物快速形成水包油微乳或纳米乳。

“SNEDDS”(自纳米乳化药物递送系统)在本文中被定义为亲水组分、至少一种HLB高于10的表面活性剂、任选的助表面活性剂和任选的脂质组分和治疗性大分子的均质混合物，在轻轻搅拌或将在胃肠道中遇到的消化蠕动的条件下，当暴露于含水介质时，所述混合物快速形成纳米乳(微滴大小的直径低于20 nm，如例如通过PCS或DLS测量)。

如本文所使用的术语“乳剂”是指，当使其组分与含水介质接触时，自发地或基本上自发地形成的略不透明的、乳白色或不透明的胶体粗分散体。

如本文所使用的术语“微乳”是指，当使其组分与含水介质接触时，自发地或基本上自发地形成的澄清的或半透明的、略不透明的、乳白色的、非不透明的或基本上非不透明的胶体分散体。

微乳是动力学稳定的系统(有时称为热力学稳定系统)，并且含有例如固态或液态的均质分散的颗粒或域(例如，液体脂质颗粒或微滴)，如通过标准光散射技术(例如使用Wyatt DynaPro读板器DLS 或MALVERN ZETASIZER Nano ZS)测量，其平均直径小于150 nm。在一个实施方案中，当使根据本发明的药物组合物与含水介质接触时，形成含有平均直径小于100nm(诸如小于50nm、小于40nm和小于30nm)的均质分散的颗粒或域的微乳。因而，术语“Z平均值(nm)”是指所述微乳的颗粒或域的颗粒大小。术语“PDI”是术语“多分散性指数”的缩写，且是混合物中的分子或颗粒的大小的异质性的量度。

如本文所使用的术语“纳米乳”是指澄清的或半透明的、略不透明的、乳白色、非不透明的或基本上非不透明的胶体分散体，其具有当使其组分与含水介质接触时自发地或基本上自发地形成的直径低于20 nm (如例如通过DLS或PCS测量)的颗粒或微滴大小。在一个实施方案中，当使根据本发明的药物组合物与含水介质接触时，形成含有平均直径小于20 nm(诸如小于15 nm、小于10 nm且大于约2-4 nm)的均质分散的颗粒或域的微乳。

如本文所使用的术语“可自发分散的”当指预浓缩物时，是指这样的组合物：当用含水介质稀释时，当本发明组合物的组分与含水介质接触，例如通过用手简单摇动短时间段(例如十秒钟)时，所述组合物能够产生胶体结构(诸如纳米乳、微乳、乳剂和其它胶体系统)。在一个实施方案中，根据本发明的自发可分散的浓缩物是SEDDS、SMEDDS或SNEDDS。

包含脂肪酸氨基酸的药物组合物

本发明涉及包含至少一种生长激素化合物和至少一种脂肪酸氨基酸(FA-aa)的药物组合物。如果无法商业获得，则修饰的氨基酸可以容易地通过使用本领域已知与氨基酸的游离α-氨基反应的酰化试剂酰化氨基酸来制备。

本发明的一个方面涉及药物组合物，其包含：

a）至少一种生长激素化合物，和

b）至少一种脂肪酸氨基酸(FA-aa)或其盐。

在本发明的一个实施方案中，组合物是口服药物组合物或用于口服施用的组合物，其包含：

a）至少一种生长激素化合物，和

b）至少一种脂肪酸氨基酸或其盐。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种生长激素化合物和至少一种基于天然、合成或标准氨基酸的FA-aa。FA-aa由氨基酸残基和脂肪酸部分或链组成。当FA-aa包括与其基于的氨基酸相同的侧链时，FA-aa被称为基于所述氨基酸。非标准氨基酸可以包括氨基上的额外元件，诸如甲基，而不是氢，当FA-aa基于非标准氨基酸时，其也可以被认为是结构的部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa的氨基酸残基选自标准氨基酸和肌氨酸。

不受理论束缚，FA-aa增加治疗性蛋白的生物利用率的能力可以与FA-aa增加肠的细胞层的渗透性的能力联系起来。基于HT29-MTX (E12)细胞的体外测定可用于确定给定FA-aa是否增加细胞层对于生长激素化合物的渗透性，如实施例1 D和实施例20中所述。

在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含脂肪酸氨基酸，所述脂肪酸氨基酸增加生长激素化合物跨越HT29-MTX (E12)细胞的转运。在一个实施方案中，脂肪酸氨基酸使生长激素化合物的转运增加至少1.5倍，诸如至少1.8倍，诸如2倍。在进一步实施方案中，本发明的组合物包含的脂肪酸氨基酸使生长激素化合物的转运增加至少3、4或5倍。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa的氨基酸残基选自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种生长激素化合物和至少一种FA-aa，其中FA-aa基于极性或非极性氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种生长激素化合物和至少一种FA-aa，其中FA-aa基于选自以下的非极性氨基酸： 甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)和肌氨酸。

在本发明的一个实施方案中，非极性氨基酸选自由甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和肌氨酸(Sarc)组成的非极性疏水中性氨基酸组。

在本发明的一个实施方案中，非极性氨基酸选自由以下组成的非极性疏水氨基酸组： 亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)。

在本发明的一个实施方案中，非极性氨基酸选自由以下组成的非极性疏水脂族氨基酸组： 亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)和脯氨酸(Pro)。

在本发明的一个实施方案中，非极性氨基酸选自由以下组成的非极性疏水芳族氨基酸组： 酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种生长激素化合物和至少一种FA-aa，其中FA-aa基于选自以下的极性氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和半胱氨酸(Cys)。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种生长激素化合物和至少一种FA-aa，其中FA-aa基于选自以下的带电极性氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)。

在一个实施方案中，FA’aa基于选自以下的带电极性氨基酸： 赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)。在一个实施方案中，FA’aa基于选自以下的带电极性氨基酸： 天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种生长激素化合物和至少一种FA-aa，其中FA-aa基于选自以下的非带电极性氨基酸： 谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和半胱氨酸(Cys)。

在一个实施方案中，FA-aa基于选自以下的非带电极性氨基酸： 谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)。

在一个实施方案中，FA-aa基于选自以下的非带电极性氨基酸： 丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和半胱氨酸(Cys)。

在一个实施方案中，FA-aa基于选自以下的非带电极性氨基酸： 谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)。

在一个进一步实施方案中，FA-aa基于选自由以下组成的氨基酸组的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、肌氨酸(Sarc)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)。

在一个实施方案中，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、肌氨酸(Sarc)、甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)。

在一个实施方案中，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、肌氨酸(Sarc)、甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)。

在一个实施方案中，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、肌氨酸(Sarc)和谷氨酰胺(Gln)。

在一个实施方案中，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)和肌氨酸(Sarc)。

在一个实施方案中，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)和肌氨酸(Sarc)。

根据本发明，FA-aa包含氨基酸残基和通过所述氨基酸的α-氨基的酰化连接至所述氨基酸的脂肪酸，其产生相邻于氨基酸的α-氨基的- C(=O)-基团。衍生自脂肪酸的羰基与脂族链被统称为脂肪酸链或脂肪酸部分。

在一个实施方案中，氨基酸残基的羧基可以是羧酸(-COOH)的形式或羧酸根离子(COO^- )的形式。羧酸根离子通常形成盐，且此类复合物中的氨基酸残基的羧基基团通常表示为“-盐(–ate)”，诸如组氨酸盐、色氨酸盐和肌氨酸盐。-COOH形式被称为其游离酸的形式，而与单价阳离子复合的羧酸根离子是盐的形式。

在一个实施方案中，根据本发明的氨基酸残基是其游离酸或其盐的形式。

在一个实施方案中，根据本发明的氨基酸残基是钠(Na⁺)盐或钾(K⁺)盐的形式。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含8-18个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含10-18个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含12-18个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含12-16个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含14-18个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含14-16个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含10个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含12个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含14个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含16个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含18个碳原子的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，脂肪酸部分可以是饱和或不饱和的脂肪酸部分。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa，脂肪酸部分位于所述氨基酸的α氨基处。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa包含其游离酸形式或作为其盐的氨基酸残基。根据本发明的FA-aa可以由下述通式表示：

,

其中R1是包含8-18个碳的脂肪酸链，R2是H (即氢)或CH₃ (即甲基)，R3是H或不存在，且R4是如上所述的极性或非极性氨基酸的氨基酸侧链。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa可以由下述通式表示：

,

其中R1是包含8-18个碳原子的脂肪酸链，R2是H (即氢)或CH₃ (即甲基)，R3是H或不存在，且R4是如上所述的极性或非极性氨基酸的氨基酸侧链。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa可以由下述通式表示：

，其中

R1是–C(=O)-(CH₂)_6-16-CH₃，

R2是H(即氢)或CH3(即甲基)或当R2共价连接至R4时是价键，且

R3是H或不存在，且

当共价连接至R2(如脯氨酸中)时，R4是包括-(CH₂)₃-的氨基酸侧链。

在一个实施方案中，氨基酸残基的羧基可以是羧酸的形式或羧酸根离子的形式，这反映在这样的结构中，其中R3是H(羧酸)，或不存在，其描述了羧酸根离子。该离子将通常与阳离子诸如Na⁺络合，例如作为盐(最广泛的定义上被称为其盐)。此类络合物中的氨基酸残基的羧基被去质子化(COO^- )，通常表示为“-盐(–ate)”，诸如组氨酸盐、色氨酸盐和肌氨酸盐。

如本文上面描述的脂肪酸氨基酸(FA-aa)因此定义氨基酸样结构，其中，R1通过脂肪酸经由酰胺/肽键连接至氨基酸的氨基而获得。当起始脂肪酸是包含8-18个碳原子的饱和脂肪酸时，这导致形成–C(=O)-(CH₂)_6-16-CH₃结构。在替代实施方案中，当起始脂肪酸是不饱和脂肪酸时，具体结构将是不同的。

脂肪酸氨基酸进一步包含上述式中被称为R4的氨基酸侧链。在天然氨基酸中，脯氨酸具有特殊结构，因为侧链共价连接至氨基。在上述结构中，脯氨酸侧链通过R2是共价连接至R4(当R4是-(CH₂)₃时)的价键来定义。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa可以选自：下述所示的式(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)或(t)，其中R1是包含7-17个碳的脂族链，R2是H (即氢)或CH₃ (即甲基)，且R3是H或不存在。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa可以选自：下述所示的式(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)或(t)，其中R1是包含9-15个碳原子的脂族链，R2是H (即氢)或CH₃ (即甲基)，且R3是H或不存在。

(a),

(b),

(c),

(d),

(e),

(f),

(g),

(h),

(i),

(j),

(k),

(l),

(m),

(n),

(o),

(p),

(q),

(r)

(s)

(t)

与上述通式相反，羰基(-C(= O))是所述结构的部分，因此不是R1的部分。

除了天然氨基酸侧链以外，根据本发明的FA-aa可以衍生自氨基酸变体，诸如肌氨酸。参照上式，肌氨酸可被视为甘氨酸氨基酸残基，其具有共价结合至氮原子的额外甲基，例如R2= CH3且R4= H，并且因此定义的FA-aa的氨基酸残基等于本文作为氨基酸包括的肌氨酸的结构。

在一个实施方案中，FA-aa可以选自在脂肪酸部分中包括8个碳原子的FA-aa的组，所述组由以下组成：辛酸丙氨酸钠、N-辛酰基-L-丙氨酸、辛酸异亮氨酸钠、N-辛酰基-L-异亮氨酸、辛酸亮氨酸钠、N-辛酰基-L-亮氨酸、辛酸甲硫氨酸钠、N-辛酰基-L-甲硫氨酸、辛酸苯丙氨酸钠、N-辛酰基-L-苯丙氨酸、辛酸脯氨酸钠、N-辛酰基-L-脯氨酸、辛酸苏氨酸钠、N-辛酰基-L-苏氨酸、辛酸丝氨酸钠、N-辛酰基-L-丝氨酸、辛酸色氨酸钠、N-辛酰基-L-色氨酸、辛酸缬氨酸钠、N-辛酰基-L-缬氨酸、辛酸肌氨酸钠 和N-辛酰基-L-肌氨酸、辛酸酪氨酸钠、N-辛酰基-L-酪氨酸、辛酸甘氨酸钠、N-辛酰基-L-甘氨酸 辛酸谷氨酰胺钠、N-辛酰基-L-谷氨酰胺、辛酸天冬酰胺钠、N-辛酰基-L-天冬酰胺 辛酸天冬氨酸钠、N-辛酰基-L-天冬氨酸、辛酸谷氨酸钠、N-辛酰基-L-谷氨酸、辛酸半胱氨酸钠、N-辛酰基-L-半胱氨酸、辛酸赖氨酸钠、N-辛酰基-L-赖氨酸、辛酸精氨酸钠、N-辛酰基-L-精氨酸、辛酸组氨酸钠、N-辛酰基-L-组氨酸。

在一个实施方案中，FA-aa可以选自在脂肪酸部分中包括10个碳原子的FA-aa的组，所述组由以下组成：癸酸丙氨酸钠、N-癸酰基-L-丙氨酸、癸酸异亮氨酸钠、N-癸酰基-L-异亮氨酸、癸酸亮氨酸钠、N-癸酰基-L-亮氨酸、癸酸甲硫氨酸钠、N-癸酰基-L-甲硫氨酸、癸酸苯丙氨酸钠、N-癸酰基-L-苯丙氨酸、癸酸脯氨酸钠、N-癸酰基-L-脯氨酸、癸酸苏氨酸钠、N-癸酰基-L-苏氨酸、癸酸丝氨酸钠、N-癸酰基-L-丝氨酸、 癸酸色氨酸钠、N-癸酰基-L-色氨酸、癸酸缬氨酸钠、N-癸酰基-L-缬氨酸、癸酸肌氨酸钠 和N-癸酰基-L-肌氨酸、癸酸酪氨酸钠、N-癸酰基-L-酪氨酸、癸酸甘氨酸钠、N-癸酰基-L-甘氨酸 癸酸谷氨酰胺钠、N-癸酰基-L-谷氨酰胺、癸酸天冬酰胺钠、N-癸酰基-L-天冬酰胺 癸酸天冬氨酸钠、N-癸酰基-L-天冬氨酸、癸酸谷氨酸钠、N-癸酰基-L-谷氨酸、癸酸半胱氨酸钠、N-癸酰基-L-半胱氨酸、癸酸赖氨酸钠、N-癸酰基-L-赖氨酸、癸酸精氨酸钠、N-癸酰基-L-精氨酸、癸酸组氨酸钠、N-癸酰基-L-组氨酸。

在一个实施方案中，FA-aa可以选自在脂肪酸部分中包括12个碳原子的FA-aa的组，所述组由以下组成：月桂酰基丙氨酸钠、N-十二烷酰基-L-丙氨酸、月桂酰基异亮氨酸钠、N-十二烷酰基-L-异亮氨酸、月桂酰基亮氨酸钠、N-十二烷酰基-L-亮氨酸、月桂酰基甲硫氨酸钠、N-十二烷酰基-L-甲硫氨酸、月桂酰基苯丙氨酸钠、N-十二烷酰基-L-苯丙氨酸、月桂酰基脯氨酸钠、N-十二烷酰基-L-脯氨酸、月桂酰基苏氨酸、N-十二烷酰基-L-苏氨酸钠、月桂酰基丝氨酸钠、N-十二烷酰基-L-丝氨酸、月桂酰基色氨酸钠、N-十二烷酰基-L-色氨酸、月桂酰基缬氨酸钠、N-十二烷酰基-L-缬氨酸、月桂酰基肌氨酸钠 和N-十二烷酰基-L-肌氨酸、月桂酰基酪氨酸钠、N-十二烷酰基-L-酪氨酸、月桂酰基甘氨酸钠、N-十二烷酰基-L-甘氨酸 月桂酰基谷氨酰胺钠、N-十二烷酰基-L-谷氨酰胺、月桂酰基天冬酰胺钠、N-十二烷酰基-L-天冬酰胺 月桂酰基天冬氨酸钠、N-十二烷酰基-L-天冬氨酸、月桂酰基谷氨酸钠、N-十二烷酰基-L-谷氨酸、月桂酰基半胱氨酸钠、N-十二烷酰基-L-半胱氨酸、月桂酰基赖氨酸钠、N-十二烷酰基-L-赖氨酸、月桂酰基精氨酸钠、N-十二烷酰基-L-精氨酸、月桂酰基组氨酸钠、N-十二烷酰基-L-组氨酸。

在一个实施方案中，FA-aa可以选自在脂肪酸部分中包括14个碳原子的FA-aa的组，所述组由以下组成：肉豆蔻酰基丙氨酸钠、N-十四烷酰基-L-丙氨酸、肉豆蔻酰基异亮氨酸钠、N-十四烷酰基-L-异亮氨酸、肉豆蔻酰基亮氨酸钠、N-十四烷酰基-L-亮氨酸、肉豆蔻酰基甲硫氨酸钠、N-十四烷酰基-L-甲硫氨酸、肉豆蔻酰基苯丙氨酸钠、N-十四烷酰基-L-苯丙氨酸、肉豆蔻酰基脯氨酸钠、N-十四烷酰基-L-脯氨酸、肉豆蔻酰基苏氨酸钠、N-十四烷酰基-L-苏氨酸、肉豆蔻酰基丝氨酸钠、N-十四烷酰基-L-丝氨酸、肉豆蔻酰基色氨酸钠、N-十四烷酰基-L-色氨酸、肉豆蔻酰基缬氨酸钠、N-十四烷酰基-L-缬氨酸、肉豆蔻酰基肌氨酸钠 和N-十四烷酰基-L-肌氨酸、肉豆蔻酰基酪氨酸钠、N-十四烷酰基-L-酪氨酸、肉豆蔻酰基甘氨酸钠、N-十四烷酰基-L-甘氨酸 肉豆蔻酰基谷氨酰胺钠、N-十四烷酰基-L-谷氨酰胺、肉豆蔻酰基天冬酰胺钠、N-十四烷酰基-L-天冬酰胺 肉豆蔻酰基天冬氨酸钠、N-十四烷酰基-L-天冬氨酸、肉豆蔻酰基谷氨酸钠、N-十四烷酰基-L-谷氨酸、肉豆蔻酰基半胱氨酸钠、N-十四烷酰基-L-半胱氨酸、肉豆蔻酰基赖氨酸钠、N-十四烷酰基-L-赖氨酸、肉豆蔻酰基精氨酸钠、N-十四烷酰基-L-精氨酸、肉豆蔻酰基组氨酸钠、N-十四烷酰基-L-组氨酸。

在一个实施方案中，FA-aa可以选自在脂肪酸部分中包括16个碳原子的FA-aa的组，所述组由以下组成：棕榈酰基丙氨酸钠、N-十六烷酰基-L-丙氨酸、棕榈酰基异亮氨酸钠、N-十六烷酰基-L-异亮氨酸、棕榈酰基亮氨酸钠、N-十六烷酰基-L-亮氨酸、棕榈酰基甲硫氨酸钠、N-十六烷酰基-L-甲硫氨酸、棕榈酰基苯丙氨酸钠、N-十六烷酰基-L-苯丙氨酸、棕榈酰基脯氨酸钠、N-十六烷酰基-L-脯氨酸、棕榈酰基苏氨酸钠、N-十六烷酰基-L-苏氨酸、棕榈酰基丝氨酸钠、N-十六烷酰基-L-丝氨酸、棕榈酰基色氨酸钠、N-十六烷酰基-L-色氨酸、棕榈酰基缬氨酸钠、N-十六烷酰基-L-缬氨酸、棕榈酰基肌氨酸钠 和N-十六烷酰基-L-肌氨酸、棕榈酰基酪氨酸钠、N-十六烷酰基-L-酪氨酸、棕榈酰基甘氨酸钠、N-十六烷酰基-L-甘氨酸 棕榈酰基谷氨酰胺钠、N-十六烷酰基-L-谷氨酰胺、棕榈酰基天冬酰胺钠、N-十六烷酰基-L-天冬酰胺 棕榈酰基天冬氨酸钠、N-十六烷酰基-L-天冬氨酸、棕榈酰基谷氨酸钠、N-十六烷酰基-L-谷氨酸、棕榈酰基半胱氨酸钠、N-十六烷酰基-L-半胱氨酸、棕榈酰基赖氨酸钠、N-十六烷酰基-L-赖氨酸、棕榈酰基精氨酸钠、N-十六烷酰基-L-精氨酸、棕榈酰基组氨酸钠、N-十六烷酰基-L-组氨酸。

在一个实施方案中，FA-aa可以选自包括18个碳原子的FA-aa的组，其中所述脂肪酸部分衍生自硬脂酸。FA’aa因此可以选自：硬脂酰基丙氨酸钠、N-十八烷酰基-L-丙氨酸、硬脂酰基异亮氨酸钠、N-十八烷酰基-L-异亮氨酸、硬脂酰基亮氨酸钠、N-十八烷酰基-L-亮氨酸、硬脂酰基甲硫氨酸钠、N-十八烷酰基-L-甲硫氨酸、硬脂酰基苯丙氨酸钠、N-十八烷酰基-L-苯丙氨酸、硬脂酰基脯氨酸钠、N-十八烷酰基-L-脯氨酸、硬脂酰基苏氨酸钠、N-十八烷酰基-L-苏氨酸、硬脂酰基丝氨酸钠、N-十八烷酰基-L-丝氨酸、硬脂酰基色氨酸钠、N-十八烷酰基-L-色氨酸、硬脂酰基缬氨酸钠、N-十八烷酰基-L-缬氨酸、硬脂酰基肌氨酸钠 和N-十八烷酰基-L-肌氨酸、硬脂酰基酪氨酸钠、N-十八烷酰基-L-酪氨酸、硬脂酰基甘氨酸钠、N-十八烷酰基-L-甘氨酸 硬脂酰基谷氨酰胺钠、N-十八烷酰基-L-谷氨酰胺、硬脂酰基天冬酰胺钠、N-十八烷酰基-L-天冬酰胺 硬脂酰基天冬氨酸钠、N-十八烷酰基-L-天冬氨酸、硬脂酰基谷氨酸钠、N-十八烷酰基-L-谷氨酸、硬脂酰基半胱氨酸钠、N-十八烷酰基-L-半胱氨酸、硬脂酰基赖氨酸钠、N-十八烷酰基-L-赖氨酸、硬脂酰基精氨酸钠、N-十八烷酰基-L-精氨酸、硬脂酰基组氨酸钠、N-十八烷酰基-L-组氨酸。

在一个实施方案中，FA-aa可以选自包括18个碳原子的FA-aa的组，其中所述脂肪酸部分衍生自油酸。FA’aa因此可以选自：油酰基丙氨酸钠、N-(E)-十八碳(octadec)-9-烯酰基-L-丙氨酸、油酰基异亮氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-异亮氨酸、油酰基亮氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-亮氨酸、油酰基甲硫氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-甲硫氨酸、油酰基苯丙氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-苯丙氨酸、油酰基脯氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-脯氨酸、油酰基苏氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-苏氨酸、油酰基丝氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-丝氨酸、油酰基色氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-色氨酸、油酰基缬氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-缬氨酸、油酰基肌氨酸钠 和N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-肌氨酸、油酰基酪氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-酪氨酸、油酰基甘氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-甘氨酸 油酰基谷氨酰胺钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-谷氨酰胺、油酰基天冬酰胺钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-天冬酰胺 油酰基天冬氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-天冬氨酸、油酰基谷氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-谷氨酸、油酰基半胱氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-半胱氨酸、油酰基赖氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-赖氨酸、油酰基精氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-精氨酸、油酰基组氨酸钠、N-(E)-十八碳-9-烯酰基-L-组氨酸。

在一个实施方案中，其中FA-aa在脂肪酸部分中具有12个碳原子，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、肌氨酸(Sarc)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(trp)。

在一个实施方案中，其中FA-aa在脂肪酸部分中具有14个碳原子，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、D-谷氨酸(D-Glu)、亮氨酸(Leu)、缬氨酸(Val)和肌氨酸(Sarc)。

在一个实施方案中，其中FA-aa在脂肪酸部分中具有16个碳原子，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、D-谷氨酸(D-Glu)、天冬氨酸(Asp)、D-天冬氨酸(D-Asp)和肌氨酸(Sarc)。

在一个实施方案中，其中FA-aa在脂肪酸部分中具有16个碳原子，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和肌氨酸(Sarc)。

在一个实施方案中，其中FA-aa在脂肪酸部分中具有16个碳原子，FA-aa基于选自以下的氨基酸： 谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)和肌氨酸(Sarc)。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa的氨基酸残基是不是由遗传密码编码的氨基酸。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa的氨基酸残基是肌氨酸。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa的氨基酸残基是不是由遗传密码编码的氨基酸的游离酸或盐形式。

在一个实施方案中，根据本发明的FA-aa的氨基酸残基在是游离酸肌氨酸或肌氨酸盐形式的盐。

在本发明的一个实施方案中，口服药物组合物包含至少一种生长激素化合物和至少一种FA-aa。

生长激素化合物

如本文所使用的术语“生长激素化合物”意指这样的生长激素分子，其保留SEQ ID NO 1标识的人生长激素的至少一些功能性和包括连接生长激素变体中的C53与C165和C182与C189或相应的氨基酸残基的两个分子内二硫键的其整体结构。生长激素蛋白的结构由三个环(L1-3)连接的四个螺旋(螺旋1-4)和C末端片段构成。在人生长激素中，螺旋1由AA残基6-35定义，螺旋2由AA残基71-98定义，螺旋3由AA残基107-127定义，且螺旋4被定义为AA残基155-184。

BAF测定频繁用于测定生长激素蛋白或化合物(参见下文)的生物活性。

如本文所使用的术语“生长激素变体”和“生长激素类似物”意指这样的生长激素蛋白，其具有衍生自天然存在的生长激素的结构、例如由SEQ ID NO 1标识的人生长激素的结构的氨基酸序列。该术语因此用于生长激素蛋白，其中所述生长激素序列的一个或多个氨基酸残基已经被其他氨基酸残基取代和/或其中一个或多个氨基酸残基已经从生长激素缺失和/或其中一个或多个氨基酸残基已经被添加和/或插入至生长激素。

如本文所使用的术语“生长激素衍生物”是指经化学修饰的生长激素蛋白或其类似物，其中所述修饰是酰胺、碳水化合物、烷基、酯、聚乙二醇化等的连接形式。

根据本发明的生长激素衍生物是经以下修饰的天然存在的生长激素或生长激素类似物：例如，通过在生长激素骨架的一个或多个位置上化学引入侧链，或者通过氧化或还原生长激素中氨基酸残基的基团，或者通过将游离羧酸基团转化成酯基或酰胺基。其他衍生物通过酰化经由生长激素序列中的单个氨基酸突变引入的游离巯基而获得。本文中，术语“酰化的生长激素”覆盖通过将一个或多个亲脂性取代基任选经由接头连接至生长激素蛋白而对生长激素的修饰。

“亲脂性取代基”在本文中理解为由连接至生长激素蛋白或类似物(任选经由接头)的脂肪酸或脂肪二酸组成的侧链。

生长激素衍生物因此是人生长激素或人生长激素类似物，其包含至少一个连接至一个或多个氨基酸的共价修饰，诸如连接至生长激素或生长激素变体或类似物的一个或多个氨基酸侧链中的共价修饰。

术语“生长激素融合体”在本文中用于这样的蛋白分子，其包括借助肽键连接至第二蛋白序列的生长激素序列，其通常通过使用重组表达载体表达融合蛋白而获得，所述重组表达载体连接编码所述生长激素序列的DNA序列与编码所述第二蛋白的DNA序列，任选地包括接头序列。生长激素融合体包括，但不限于，包含一个或多个抗体Fc区和/或白蛋白蛋白的融合体。

如本文所使用的术语“生长激素化合物”统指基本上保留人生长激素的功能特征的生长激素分子。所述化合物因此可以是生长激素、生长激素融合蛋白、生长激素变体或类似物或生长激素衍生物，还包括酰化的生长激素。

在一个实施方案中，根据本发明的生长激素类似物相对于人生长激素包含小于8个修饰(取代、缺失、添加)。

在一个实施方案中，生长激素类似物相对于人生长激素包含小于7个修饰(取代、缺失、添加)。在一个实施方案中，生长激素类似物相对于人生长激素包含小于6个修饰(取代、缺失、添加)。

在一个实施方案中，生长激素类似物相对于人生长激素包含小于5个修饰(取代、缺失、添加)。在一个实施方案中，生长激素类似物相对于人生长激素包含小于4个修饰(取代、缺失、添加)。在一个实施方案中，生长激素类似物相对于人生长激素包含小于3个修饰(取代、缺失、添加)。在一个实施方案中，生长激素类似物相对于人生长激素包含小于2个修饰(取代、缺失、添加)。

在一系列实施方案中，生长激素的生长激素类似物与SEQ ID NO:1标识的人生长激素至少95、96、97、98或99％相同。

生长激素化合物优选具有相比于野生型人生长激素增加的血浆T_1/2。这可以由本领域技术人员已知的各种方式提供，诸如稳定蛋白免于降解的点突变。生长激素化合物的循环时间也可以通过共价或非共价地连接至血清蛋白而获得。血清白蛋白可以通过直接缀合(任选地包括接头)或通过与生长激素或其变体的蛋白融合而使用。或者，化学连接至白蛋白以及与抗体Fc区的融合或连接也可以同样进行考虑。非共价结合至白蛋白可以通过使用白蛋白结合剂诸如共价键合至生长激素的酰基来获得。

在一个实施方案中，所述生长激素化合物具有相比于人生长激素增加的T ½，其中所述T ½在静脉内(i.v.)或皮下(s.c.)施用于大鼠后测量，如实施例1.C.中所述。注意到，野生型人生长激素在所述测定中具有约12-14分钟的T ½。在一个实施方案中，所述生长激素化合物具有高于30分钟的T ½。在进一步实施方案中，T ½高于60分钟或1小时，诸如高于2小时或优选高于4小时。

在一个实施方案中，生长激素化合物是这样的生长激素衍生物，其是在生长激素蛋白中的一个或多个氨基酸被酰化的生长激素或其变体。

在一个实施方案中，生长激素化合物是这样的生长激素变体，其针对蛋白水解降解是稳定化的(通过特定突变)，并且此类变体可以在生长激素蛋白中的一个或多个氨基酸被进一步酰化。

针对蛋白水解降解稳定化(通过特定突变)的生长激素蛋白的非限制性实例可以例如在WO2010/084173和WO 2011/089250中找到。

进一步指出且下面还描述的是，生长激素化合物的稳定化也可以通过在制剂中包括蛋白酶抑制剂来获得。

蛋白酶稳定化的生长激素蛋白变体包括其中引入额外二硫键的变体。额外二硫键优选将L3连接至螺旋2。这可以通过引入两个额外的Cys aa残基来获得，在优选的实施方案中，其取代对应于SEQ ID No. 1的H2中的AA84或AA85和L3中的AA143或AA144的位置的野生型aa残基。根据本发明的生长激素变体因此可以优选包含对应于SEQ ID No.1中的L73C/S132C、L73C/F139C、R77C/I138C、R77C/F139C、L81C/Q141C、L81C/Y143C、Q84C/Y143C、Q84C/S144C、S85C/Y143C、S85C/S144C、P89C/F146C、F92C/F146C 或F92C/T148C的突变对。在进一步实施方案中，生长激素变体包含对应于SEQ ID No.1中的L81C/Y143C、Q84C/Y143C、S85C/Y143C、S85C/S144C或F92C/T148C的突变对。

在一个实施方案中，生长激素化合物是生长激素衍生物，诸如只具有一个连接至生长激素蛋白中的内部氨基酸残基的酰化基团的单取代的化合物，或其变体，诸如上述蛋白酶稳定化的生长激素变体。

适用于本发明的药物组合物的酰化的生长激素化合物的非限制性列表可以例如在WO2011/089255中找到。

包括如测量的T ½的示例性化合物在下文列出。

在本发明的一个实施方案中，将所述生长激素化合物溶解，并将所得溶液的pH调节至目标pH值的值，所述值比生长激素化合物的pI高或低1个单位，可替换地2个单位，且可替换地2.5个pH单位，然后将所述得到的溶液冷冻或喷雾干燥。在一个实施方案中，用非挥发性的酸或碱进行所述pH调节。

所述生长激素化合物可以以下述量存在于根据本发明的药物组合物中：总药物组合物的至多约20重量%，诸如至多约10重量%，或从约0.1重量%，诸如从约1重量%。在本发明的一个实施方案中，所述生长激素化合物以总组合物的约0.1重量%至约20重量%的量存在，在另一个实施方案中，以总组合物的约0.1重量%-15重量%、0.1重量%-10重量%、1重量%-8重量%或约1重量%-5重量%的量存在。但是，意图根据药学领域众所周知的因素，可以选择生长激素化合物的特定水平，所述因素包括：生长激素在溶剂(例如水溶液、极性有机溶剂)中的溶解度，或使用的任选的亲水组分或表面活性剂或其混合物，施用模式，以及患者的大小和状况。

每个单位剂量将合适地含有1 mg至200 mg生长激素化合物，例如约1 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、50 mg、80 mg、90 mg、100 mg、150 mg、200 mg 生长激素化合物，例如5 mg至200 mg生长激素化合物。在本发明的一个实施方案中，每个单位剂量含有10 mg至200 mg生长激素化合物。在另一个实施方案中，单位剂型含有10 mg至100 mg生长激素化合物。

在本发明的一个实施方案中，单位剂型含有20 mg至80 mg生长激素化合物。在本发明的另一个实施方案中，单位剂型含有30 mg至60 mg生长激素化合物。

在本发明的另一个实施方案中，单位剂型含有30 mg至50 mg生长激素化合物。此类单位剂型适合于每天施用1-5次，这取决于特定治疗目的。

多肽和肽(诸如生长激素)的生产是本领域众所周知的。通常，生长激素蛋白通过这样的方法生产，所述方法包括：在合适的营养培养基中，在允许肽表达的条件下，培养宿主细胞，所述宿主细胞含有编码(多)肽的DNA序列且能够表达所述(多)肽。对于包含非天然氨基酸残基的(多)肽，应当修饰重组细胞，使得非天然氨基酸被掺入(多)肽中(例如通过使用tRNA突变体)。

药物组合物的配制

因此，本发明的一个目标是提供包含治疗活性量的生长激素化合物的药物制剂。浓度可以在溶液中0.25 mg/ml至250 mg/ml变化，或在固体剂型中2.5 mg/g至250 mg/g变化。

同样，FA-aa的浓度可以类似地在溶液中0.25 mg/ml至250 mg/ml变化，或在固体剂型中2.5 mg/g至250 mg/g变化。

在一个实施方案中，生长激素化合物和FA-aa的相对量是10:1至1:10 (W:W)，诸如5:1至1:5 (W:W)，2:1至1:2 (W:W)，或诸如约1:1 (W:W)。

优选的是，所述制剂具有2.0至10.0的pH。所述制剂可以进一步包括缓冲系统、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和/或表面活性剂，以及其各种组合。药物组合物中使用防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂对于技术人员是众所周知的。可参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版，1995。

在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物是液体。

在一个实施方案中，药物制剂是含水制剂。此类制剂通常是溶液或悬浮液，但也可以包括胶体、分散体、乳液和多相材料。术语“含水制剂”被定义为包含至少50% w/w水的制剂。同样地，术语“水溶液”定义为包含至少50% w/w水的溶液，术语“含水悬液”定义为包含至少50% w/w水的悬液。

在另一个实施方案中，药物制剂是冷冻干燥的制剂，医生或患者在使用之前向其中添加溶剂和/或稀释剂。

在另一个实施方案中，药物制剂是冷冻干燥的制剂，其填充到胶囊中。

在一个进一步实施方案中，药物制剂可以是半固体或固体制剂。

在一个实施方案中，口服药物组合物是液体。该液体可以不-较少包封等，使得口服药物组合物在与胃肠系统的内部接触之前吞下。这可以是肠溶包衣的形式。如本文所使用的术语“肠溶包衣”是指，控制口服剂型的崩解和释放的聚合物包衣。液体剂型的崩解和释放的部位可以根据期望在其中吸收治疗性蛋白的靶向区域的pH进行设计。因此还包括抗酸的保护性包衣和具有肠溶性能的任何其它包衣。

当在本文中使用时，术语“肠溶软或硬胶囊技术”是指这样的软或硬胶囊技术：其包含至少一种具有肠溶特性的要素，诸如至少一层肠溶包衣。如本文所使用的术语“延迟释放包衣”是指，在口服施用之后以延迟方式释放API的聚合物包衣。延迟释放可以通过pH依赖的或pH不依赖的聚合物包衣实现。

不依赖于制剂类型，组合物中可以包括蛋白酶抑制剂。实例包括SBTI、BBI和糜蛋白酶抑素作为蛋白酶抑制剂的实例，尽管替代的抑制剂可期望用作药物组合物。

在一个实施方案中，FA-aa可以在含水液体制剂中使用，此类液体制剂不包含任何有机溶剂或包含低于10％的有机溶剂。此类制剂是优选缓冲制剂，pH为约4.0-10.0，诸如5.0-9.0，诸如5.5-8.5。缓冲剂可以选自组氨酸、tris、HEPES、磷酸盐、甘氨酸和碳酸盐缓冲液及其混合物。缓冲剂可以选自磷酸盐、甘氨酸和碳酸盐缓冲液及其混合物。

在进一步实施方案中，所述制剂可以是pH约6.0-8.0的磷酸盐缓冲的含水液体或pH约8.0-8.5的甘氨酸/碳酸氢钠缓冲的含水液体。

缓冲液的浓度可取决于所用的缓冲剂，甚至可以针对待根据本发明配制的个别化合物进行改变。磷酸盐缓冲液可以5-100 mM，诸如5-25 mM的浓度使用。根据本发明，甘氨酸可以5-50 mg/ml，优选20 mg/ml的浓度使用，而碳酸氢钠以2.0-50 mg/ml，诸如2.0-5.0 mg/ml且优选2.4 mg/ml的浓度使用。

在一个实施方案中，组合物中包括甘露醇；D-甘露醇可以1-10 mg/ml，优选约2 mg/ml的浓度使用。

根据本发明的口服药物组合物可包含其他赋形剂。可参考Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第19版，1995。

在一个实施方案中，所述制剂可以是非含水的，所述术语在本文中当是指在制备药物组合物的过程中不添加任何水的组合物时使用。本领域技术人员已知，在不添加水的情况下已经制备的组合物可在药物组合物处理过程中从环境(例如用来包封组合物的软胶囊或硬胶囊)吸收少量水。此外，在制备根据本发明的药物组合物之前，药物组合物中的生长激素化合物和/或一种或多种赋形剂可具有与之结合的少量水。因此，根据本发明的非含水的药物组合物可含有少量水。在一个实施方案中，根据本发明的非含水的药物组合物包含小于10%(w/w)的水。在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含小于5%(w/w)的水。在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含小于4%(w/w)的水，在另一个实施方案中，小于3%(w/w)的水，在另一个实施方案中，小于2%(w/w)的水，且在另一个实施方案中，小于1%(w/w)的水。在一个实施方案中，所述组合物包含0%(w/w)的水。

在一个实施方案中，所述制剂可以是“半非含水的”，这意味着在制备药物组合物的过程中添加少量水，如例如浓缩的GH储存溶液添加至非含水制剂。在一个实施方案中，根据本发明的“半非含水”药物组合物包含小于50％水。在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含小于40%(w/w)的水。在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含小于30%(w/w)的水。在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含小于20%(w/w)的水。在另一个实施方案中，根据本发明的组合物包含小于15%(w/w)的水。在一个实施方案中，根据本发明的组合物包含小于10%(w/w)的水。

所述药物组合物可以包含植物油诸如芝麻油。

根据进一步实施方案的药物组合物包含中性油，诸如Miglyol 810、Miglyol 829 或Miglyol 840。

根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含表面活性剂诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、lauroglycol、capryol和/或labrasol。

在一个实施方案中，FA-aa可以在基于油和表面活性剂的递送系统中使用。在一个实施方案中，FA-aa可以在基于表面活性剂的制剂中使用。所述制剂可以包括聚山梨酯20(吐温 20)、聚山梨醇酯80(吐温 80)、lauroglycol、capryol、labrasol和/或司盘80作为表面活性剂。

在一个实施方案中，FA-aa可以在基于表面活性剂的递送系统中使用。在一个实施方案中，FA-aa可以在基于液体或半固体液体和表面活性剂的递送系统中使用。在一个实施方案中，FA-aa可以在基于固体表面活性剂的递送系统中使用。在一个实施方案中，FA-aa可以在基于固体油和表面活性剂的递送系统中使用。

在一个实施方案中，FA-aa可以在自乳化药物传递系统(也被称为SEDDS、SMEDDS或SNEDDS组合物)中使用。

在一个实施方案中，FA-aa可以在基于液体、半固体或固体表面活性剂的递送系统(诸如SEDDS、SMEDDS或SNEDDS)中使用。

包含根据本发明的FA-aa的液体或半固体SEDDS、SMEDDS或SNEDDS可以用任何可利用的软或硬胶囊技术包封，以产生固体口服药物剂型。因此，如本文所使用的术语“固体”是指在软或硬胶囊技术中包封的液体组合物，但是也是指片剂和多微粒(multi-particulate)。

包含根据本发明的FA-aa的液体或半固体SEDDS、SMEDDS或SNEDDS可以包封入多孔微粒。多孔微粒可以填充到胶囊中，或将其配制成片剂。胶囊或片剂可以进行肠溶包衣用于受控递送。

包含根据本发明的FA-aa的液体或半固体SEDDS、SMEDDS或SNEDDS可以用任何可用的软或硬胶囊技术包封，导致产生固体口服药物剂型。在本发明的一个实施方案中，药物组合物是SEDDS、SMEDDS或SNEDDS，其包含至少一种生长激素化合物和至少一种FA-aa。在进一步实施方案中，组合物可以包含丙二醇和任选的额外组分。在一个实施方案中，额外组分可以是至少一种脂质和/或至少一种表面活性剂。

在一个实施方案中，FA-aa可以在基于液体或半固体液体和/或表面活性剂的递送系统(诸如SEDDS、SMEDDS或SNEDDS)中使用。

在一个实施方案中，FA-aa可以在基于固体表面活性剂的递送系统(诸如SEDDS、SMEDDS或SNEDDS)中使用。

在一个实施方案中，药物组合物是包含根据本发明的FA-aa的液体或半固体SEDDS、SMEDDS或SNEDDS，且用任何可利用的软或硬胶囊技术包封，以产生固体口服药物剂型。

在一个实施方案中，用于包封根据本发明的组合物的软胶囊技术是无明胶的。在一个实施方案中，将在商业上基于名称Vegicaps®(来自Catalent®)已知的无明胶的软胶囊技术用于根据本发明的药物组合物的包封。

在一个实施方案中，根据本发明的液体或半固体制剂用任何可利用的软或硬胶囊技术包封，以产生固体口服药物剂型，所述剂型进一步包含肠溶包衣或延迟释放包衣。

在一个实施方案中，根据本发明的液体或半固体制剂用任何可利用的肠溶软或硬胶囊技术包封，以产生固体口服药物剂型。

在一个实施方案中，包含根据本发明的FA-aa的液体或半固体SEDDS、SMEDDS或SNEDDS用任何可利用的软或硬胶囊技术包封，以产生固体口服药物剂型，所述剂型进一步包含肠溶包衣或延迟释放包衣。在一个实施方案中，包含根据本发明的FA-aa的液体或半固体SEDDS、SMEDDS或SNEDDS用任何可利用的肠溶软或硬胶囊技术包封，以产生固体口服药物剂型。

在一个实施方案中，包含根据本发明的FA-aa的液体或半固体SEDDS、SMEDDS或SNEDDS用任何可利用的软或硬胶囊技术包封，以产生固体口服药物剂型。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物是制剂，其包含至少一种生长激素蛋白或化合物和至少一种FA-aa和丙二醇。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种生长激素蛋白或化合物和至少一种FA-aa和丙二醇。

在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物是包含至少一种肽或蛋白和至少一种FA-aa、丙二醇的SEDDS、SMEDDS或SNEDDS。

在一个实施方案中，所述口服药物组合物包含5-25%的丙二醇。

在一个实施方案中，所述口服药物组合物包含至少一种FA-aa、丙二醇和至少一种非离子型表面活性剂。

在一个实施方案中，所述口服药物组合物包含至少一种FA-aa、丙二醇、聚山梨酯20和助表面活性剂。聚山梨酯20是一种聚山梨酯表面活性剂，其稳定性和相对无毒性允许它在许多家庭应用、科学应用和药理学应用中用作去污剂和乳化剂。数字20是指在分子中存在的氧乙烯-(CH₂CH₂O)-基团的总数。

在本发明的一个实施方案中，所述口服药物组合物包含至少一种FA-aa、丙二醇、聚山梨酯20和聚甘油脂肪酸酯。

在一个实施方案中，所述口服药物组合物包含至少一种FA-aa、丙二醇、聚山梨酯20和助表面活性剂。

在一个实施方案中，所述口服药物组合物包含至少一种FA-aa、丙二醇、聚山梨酯20和聚甘油脂肪酸酯诸如单辛酸二甘油酯。

在本发明的某些实施方案中，所述药物组合物可以包含在药物组合物中常用的额外赋形剂，此类赋形剂的实例包括、但不限于抗氧化剂、抗微生物剂、酶抑制剂、稳定剂、防腐剂、矫味剂、甜味剂和在下述文献中描述的其它组分：Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe等人, Eds., 4th Edition, Pharmaceutical Press (2003)，其在此通过引用并入。

这些额外赋形剂可以以总药物组合物的约0.05-5重量%的量存在。抗氧化剂、抗微生物剂、酶抑制剂、稳定剂或防腐剂通常提供总药物组合物的至多约0.05-2.5重量%。甜味剂或矫味剂通常提供总药物组合物的至多约2.5重量%或5重量%。

根据本发明的口服药物组合物可以配制为固体剂型。

根据本发明的口服药物组合物可以配制为固体剂型，且可以选自：胶囊、片剂、糖衣丸、丸剂、锭剂、粉剂、挤出物或注射模具和颗粒剂。

根据本发明的口服药物组合物可以配制为固体剂型，且可以选自：胶囊、片剂、糖衣丸、丸剂、锭剂、粉剂、和颗粒剂。

根据本发明的口服药物组合物可以配制为多微粒剂型。

根据本发明的口服药物组合物可以配制为多微粒剂型，且可以选自：丸剂、微粒、纳米粒、在软或硬胶囊中的液体或半固体填充制剂、肠溶包衣的软或硬胶囊。

在一个实施方案中，所述口服药物组合物可以用一种或多种包衣诸如肠溶包衣制备，或者可以根据本领域众所周知的方法配制为延迟释放制剂。

药物组合物的用途

在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物用于制备药物。

在一个实施方案中，根据本发明的药物组合物用于制备药物，所述药物用于治疗或预防儿童和成人中的生长激素缺乏。其中循环生长激素的浓度增加可以有帮助的其它疾病或病症也可以使用本发明的药物组合物进行治疗或预防。在一个实施方案中，本发明的药物组合物用于治疗其中观察到可获益于循环生长激素的量增加的疾病或状态。此类疾病或状态包括生长激素缺乏(GHD)；特纳综合征；普-韦综合征(Prader-Willi syndrome, PWS)；努南综合征；唐氏综合征；慢性肾病、幼年型类风湿性关节炎、囊性纤维化；接受HAART治疗的儿童HIV感染(HIV/HALS儿童)；短于胎龄(SGA)出生的矮小儿童(short children)；以极低出生体重(VLBW)出生、但非SGA的儿童的身材矮小症；骨骼发育不良；软骨发育不良；软骨发育不全；特发性身材矮小症(ISS)；成人GHD；长骨骨折，所述长骨诸如胫骨、腓骨、股骨、肱骨、桡骨、尺骨、锁骨、掌骨(matacarpea)、跖骨(matatarsea)和指骨(digit)；海绵骨诸如头骨(scull)、手腕骨(base of hand)和脚底骨(base of food)的骨折；例如手、膝或肩中的腱或韧带手术后的患者；经历或进行牵引成骨作用(distraction oteogenesis)的患者；髋关节置换或关节盘置换(discus replacement)、半月板修复、脊柱融合或诸如在膝、髋、肩、肘、腕或颚中的假体固定后的患者；其中已固定骨接合材料(诸如钉、螺钉和板)的患者；骨折不愈合或畸形愈合的患者；例如胫骨或第一脚趾骨解剖(osteatomsia)后的患者；移植物植入后的患者；创伤或关节炎引起的膝关节软骨退化；特纳综合征患者中的骨质疏松症；男性骨质疏松症；长期透析的成年患者(APCD)；APCD中营养不良相关的心血管疾病；APCD中的恶病质逆转；APCD中的癌症；APCD中的慢性阻塞性肺病；APCD中的HIV；具有APCD的老年人；APCD中的慢性肝病、APCD中的疲劳综合征；克罗恩病(Chron’s disease)；肝功能受损；患有HIV感染的男性；短肠综合征；向心性肥胖；HIV相关脂肪营养不良综合征(HALS)；男性不育症；重大选择性手术、酒精/药物解毒或神经创伤后的患者；衰老；虚弱的老年人；骨关节炎；创伤性损伤的软骨；勃起功能障碍；纤维肌痛；记忆障碍；抑郁；创伤性脑损伤；蛛网膜下腔出血；极低出生体重；代谢综合征；糖皮质激素性肌病；或儿童中由于糖皮质激素治疗导致的身材矮小症。生长激素还可用于加速肌肉组织、神经组织或创伤的愈合；加速或改善血液流到受损组织；或降低受损组织的感染率。

在一个实施方案中，本发明涉及治疗上述疾病或状态的方法，其中生长激素化合物的活性可用于治疗所述疾病或状态。施用此类化合物导致与患者中循环生长激素化合物的量的增加相关的治疗益处。在一个实施方案中，所述方法包括向患者施用有效量的生长激素化合物的药物组合物，由此改善所述患者的症状。

在一个实施方案中，本发明涉及一种方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的治疗有效量的包含生长激素化合物的根据本发明的药物组合物。本发明因此提供用于治疗这些疾病或状态的方法，所述方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的根据本发明的药物组合物中的生长激素化合物。

如本文所使用的本发明得化合物的“治疗有效量”意指足以治愈、减轻或部分抑制给定疾病及其并发症的临床表现的量。将足以实现这一目的的量定义为“治疗有效量”。对每一目的而言，有效量将取决于例如疾病或损伤的严重性以及主体的体重、性别、年龄和总体状态。应当理解，使用常规实验可以实现确定合适的剂量，这都在受过训练的医师或兽医的普通技术范围之内。

在一个实施方案中，本发明提供生长激素化合物或其缀合物在制备用于治疗上述疾病或状态的药物中的用途。

在进一步方面，本发明涉及本文上面所述的药物组合物的方法。所述药物组合物的优点是实现与使用不包含任何FA-aa的生长激素组合物的摄取相比生长激素化合物的跨肠壁摄取增加。所述组合物被认为增加肠道内细胞层的渗透性。

用于增加生长激素化合物的血浆浓度的方法包括使个体的胃肠道暴露于本文上面所述的药物组合物的步骤，其导致所述个体中所述生长激素化合物的血浆浓度增加。如上所述，除了生长激素化合物以外，所述口服药物组合物包含至少一种FA-aa。

用于增加生长激素化合物的摄取的方法包括以下步骤： 使个体的胃肠道暴露于生长激素化合物和至少一种FA-aa，由此，与不包括至少一种FA-aa的暴露相比，所述个体中所述生长激素的血浆浓度增加。

如本文所述，暴露可以通过施用除了生长激素化合物以外包含至少一种FA-aa的口服药物组合物来实现。

本发明的一个进一步方面涉及用于增加生长激素化合物的生物利用率的方法。

根据本发明的一个进一步方法涉及用于增加生长激素化合物跨越胃肠道的上皮细胞层的摄取的方法。

根据本发明的进一步方法涉及用于增加生长激素化合物跨越个体中的肠壁的摄取的方法。

进一步方法是用于增加生长激素化合物的吸收，其还涉及上述施用生长激素化合物和至少一种FA-aa的步骤。在进一步实施方案中，本文所述的药物组合物可以在任何所述方法中使用。

本发明通过以下实施方案进一步说明，但不限于此。

1. 药物组合物，其包含：

a. 生长激素化合物，和

b. 至少一种脂肪酸氨基酸(FA-aa)或其盐。

2. 根据实施方案1的药物组合物，其中所述组合物是口服药物组合物。

3. 根据实施方案1和2的药物组合物，其中至少一种脂肪酸氨基酸(FA-aa)具有通式：

其中

R1是包含10至18个碳原子的脂肪酸链，

R2是H(即氢)、CH3(即甲基)或当R2共价连接至R4时是价键，且

R3是H或不存在，且

R4是氨基酸侧链，包括-(CH₂)₃-，此时共价连接至R2。

4. 根据实施方案3的药物组合物，其中所述氨基酸R4选自：

i. 极性氨基酸侧链，

ii. 非极性氨基酸侧链。

5. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa是盐的形式(R3不存在)。

6. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa是具有一价阳离子(诸如Na⁺或K⁺)的盐的形式。

7. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa是其游离酸的形式(R3是H)。

8. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的脂肪酸部分具有至少12个碳原子。

9. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的脂肪酸部分具有多至18个碳原子。

10. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa包含12-18个碳原子的脂肪酸部分。

11. 根据前述实施方案中任一项的口服药物组合物，其中所述脂肪酸部分是衍生自棕榈酸的棕榈酰基。

12. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的氨基酸残基基于选自以下的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、肌氨酸(Sarc)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)。

13. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的氨基酸残基基于选自以下的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、肌氨酸(Sarc)、甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)。

14. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的氨基酸残基基于选自以下的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、肌氨酸(Sarc)、甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)。

15. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的氨基酸残基基于选自以下的氨基酸： 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)和肌氨酸(Sarc)。

16. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述氨基酸侧链R4是- H(甘氨酸)。

17. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述氨基酸残基是肌氨酸(R4= - H (作为甘氨酸)且R1=-CH3)。

18. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述脂肪酸氨基酸是N-棕榈酰基-肌氨酸钠。

19. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述脂肪酸氨基酸增加HT29-MTX (E12)细胞的渗透性。

20. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述生长激素化合物，其中所述蛋白序列与人生长激素(SEQ ID NO 1)至少95％相同。

21. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述生长激素化合物具有高于30分钟的T ½。

22. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述生长激素化合物包含额外的二硫键。

23. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述生长激素化合物是生长激素衍生物。

24. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述生长激素化合物是包括额外二硫键的化学修饰的生长激素变体。

25. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述生长激素化合物是化学修饰的生长激素，其中所述衍生物连接至内部氨基酸残基。

26. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述生长激素化合物是包含酰基衍生的化学修饰的生长激素。

27. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物是液体。

28. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物是含水制剂。

29. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含少于10% (w/w)水。

30. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含其它药物赋形剂。

31. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含丙二醇。

32. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含油，诸如植物油或中性油。

33. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含油和表面活性剂的混合物。

34. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物进一步包含表面活性剂诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、lauroglycol、capryol或labrasol。

35. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物是SEDDS、SMEDDS或SNEDDS制剂。

36. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物是半固体组合物。

37. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其中所述组合物是固体口服组合物，诸如片剂或胶囊的形式。

38. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其进一步包含包衣，诸如肠溶或延迟释放包衣。

39. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其进一步包含蛋白酶抑制剂。

40. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其进一步包含蛋白酶抑制剂。

41. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其用作药物。

42. 根据前述实施方案中任一项的药物组合物，其用于治疗生长激素相关的疾病或病症。

43. 用于增加生长激素化合物的生物利用率的方法，其包括在施用于个体的生长激素化合物的药物组合物中包括FA-aa的步骤。

44. 用于增加生长激素化合物的血浆浓度的方法，其包括以下步骤：使个体的胃肠道暴露于包含生长激素化合物和FA-aa的药物组合物，导致所述个体中所述生长激素化合物的血浆浓度增加。

45. 实施方案44的方法，其中所述暴露通过口服施用所述药物组合物来实现。

46. 用于增加生长激素化合物的摄取的方法，其包括以下步骤：使个体的胃肠道暴露于生长激素化合物和至少一种FA-aa，由此，与不包括至少一种FA-aa的暴露相比，所述个体中所述生长激素的血浆浓度增加。

47. 用于治疗生长激素相关的疾病或病症的方法，其包括施用包含生长激素化合物和至少一种FA-aa的药物组合物。

48. 用于增加生长激素化合物跨越肠壁的摄取的方法，其包括以下步骤：将包含生长激素化合物和至少一种FA-aa的药物组合物施用于个体，由此，与当所述生长激素组合物不包括至少一种FA-aa时获得的所述生长激素化合物的摄取相比，获得所述生长激素化合物的增加摄取。

49. 实施方案44-48的方法，其中所述药物组合物通过实施方案2-39中任一项进行描述。

方法和实施例

实施例1

A. 用于制备 GH 化合物的通用方法

将编码生长激素多肽的基因重组插入质粒载体中。随后使用质粒载体转化合适的大肠杆菌(E. coli)菌株。可表达具有N端甲硫氨酸的hGH或GH变体，或hGH或GH变体可作为MEAE融合体表达，随后将MEAE序列从其切割下来。

对于本文所述的实例，在25%甘油中制备细胞储液，并储存在-80℃下。将甘油储液菌株接种至LB板中，随后在37℃下孵育过夜。各板的内容物用LB培养基洗涤，并稀释到500ml LB培养基中用于表达。在220 rpm振荡下，在37℃孵育培养物直到达到OD₆₀₀ 0.6。使用0.2mM IPTG在25℃下进行随后的诱导6小时。最后通过离心收获细胞。

随后将细胞悬浮于10 mM Tris-HCl(pH = 9.0)，其含有0.05% 吐温20, 2.5 mM EDTA, 10 mM半胱胺和4M尿素，并使用细胞破碎仪在30kPSI下破碎。通过离心收集上清液，随后进行层析纯化。

使用离子交换层析和疏水相互作用进行纯化，随后使用从CHO细胞表达的人二肽基肽酶I (hDPPI)去除肽标签。最后的纯化通过等电沉淀(isoprecipitation)和离子交换层析法实现。

纯化还可通过使用以下技术(但不限于这些技术)来实现：离子交换层析法、疏水作用层析法、亲和层析法、大小排阻层析法和本领域技术人员已知的基于膜的分离技术。

B. 用于测试 GH 化合物的生物活性的通用方法 (BAF 测定 )

在基于细胞的受体效价增殖测定(即BAF测定)中，测量GH化合物的生物活性。BAF-3细胞(源自骨髓的鼠前-B淋巴样细胞系)的生长和存活是IL-3依赖性的。IL-3活化JAK-2和STAT，它们是hGH在刺激后活化的相同介体。

用含有hGH受体的质粒转染BAF-3细胞。在hGH刺激后能够增殖的克隆变成hGH依赖性的细胞系，下文称作BAF3-GHR。所述细胞系以剂量相关生长模式对生长激素做出响应，因此相对于hGH，可在增殖测定中用来评价不同GH化合物的作用。

使BAF-3GHR细胞在饥饿培养基(不含hGH的培养基)中在37℃、5% CO₂下生长24小时。将细胞离心，去除培养基，并将细胞重新悬浮于饥饿培养基中至2.22x10⁵个细胞/ml。将多份90 μL细胞上清液接种到微量滴定板(96孔NUNC-clone)中。将不同浓度的给定生长激素化合物加入细胞中，将板在37℃、5% CO₂下孵育72小时。

AlamarBlue^TM (BioSource目录号Dal 1025)是一种氧化还原指示剂，其被细胞代谢固有的反应还原，并因此提供活细胞数目的间接量度。将AlamarBlue^TM稀释6倍(5 μL AlamarBlue^TM + 25 μL饥饿培养基)，并将30 μL稀释的AlamarBlue^TM加到每个孔中。然后再将细胞孵育4小时。最后，使用544 nM的激发滤光片和590 nM的发射滤光片，在荧光读板仪中，测量细胞的代谢活性。给定化合物的结果表示为所述化合物的EC₅₀和平行运行的wt hGH的EC₅₀之间的比率。

C. 用于评估生长激素化合物的药代动力学参数的通用方法

在雄性Sprague Dawley大鼠中，在静脉内(i.v.)和皮下(s.c.)单剂量施用后，研究实施例的化合物的药代动力学。

将测试化合物在由甘氨酸20 mg/mL、甘露醇2 mg/mL、NaHCO₃ 2.5 mg/mL组成的稀释缓冲液（调节pH至8.2）中稀释至1 mg/mL的终浓度。

在重为250 g的雄性Sprague Dawley大鼠中研究测试化合物。用25 G针以诸如0.1 ml体积中的15 nmol/大鼠(浓度150 nmol/ml)或60 nmol/kg体重的预定剂量，在尾静脉i.v.或在颈部s.c.单次注射施用测试化合物。

对于各测试化合物，可以根据下表2提供的时间表进行采血。

表2. 用于研究生长激素化合物的药代动力学的示例性血液采样时间表。

表1中的值使用替代血液采样时间表获得，包括在给药前、0.08 h、0.5 h、1h、2h、4h、7h、18h、24h、48h、72h和96h的采样。

在各采样时间，使用25 G针从尾静脉抽取0.25 ml血液。将血液采样入EDTA包被的试管中，储存在冰上，直到在4℃下以1200 x G离心10分钟。将血浆转移至Micronic管中，并储存在-20℃下直到分析。

使用豚鼠抗hGH多克隆抗体作为捕捉剂(catcher)，和生物素化的 hGH结合蛋白(人GH受体的可溶性部分)作为检测剂，通过夹心ELISA测定测试化合物浓度。测定的检测限值为0.2 nM。

使用WinNonlin Professional (Pharsight Inc.，Mountain View，CA，USA)，对各测试化合物的平均浓度-时间概况进行非房室药代动力学分析。计算终末半衰期(t_½)和平均滞留时间(MRT)的药代动力学参数估计值。

D. 用于使用 E12 细胞的单层测量体外生长激素化合物的跨上皮转运的方法

细胞培养

使HT29-MTX (E12)细胞(Pharm Res.2001;18(8):1138-45和Pharm Res.2007;24(7):1346-56)在补充10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素、1％L-谷氨酰胺和1％非必需氨基酸的Dulbecco改良的Eagle培养基中生长。对于转运测定，将E12细胞以每孔10⁵个细胞的密度接种到12-孔Transwell®板(1.13 cm2, 0.4 μm孔径)中组织培养物处理的聚碳酸酯滤器上。将细胞在37℃在5% CO₂的气氛中培养，并且每隔一天更换培养基。转运实验在培养14-18天后进行。

跨上皮转运

测量从供应室(顶侧)转运至接受室(基底侧)的GH化合物的量。

在实验前，将E12细胞在上皮的两侧用转运缓冲液平衡60 min。然后去除缓冲液，并且通过将测试溶液添加至供应室且将对应的转运缓冲液添加至接受室而起始实验。供应样品(20 µl)在实验的0 min和结束时获取。接受样品(200 µl)定期(诸如每15 min)获取。研究通常在摇动板(30 rpm)上在37℃在5% CO₂-95% O₂的气氛中进行。

表观渗透率(Papp)被测量为相对于初始浓度和膜面积在一定期间内跨膜转移的GH的量(通量/(面积*初始浓度)。可以使用豚鼠抗hGH多克隆抗体作为捕捉剂，和生物素化的hGH结合蛋白(人GH受体的可溶性部分)作为检测剂，通过夹心ELISA测定GH化合物的浓度。测定检测限为0.2 nM.测定。

可以使用闪烁计数器测量[3H]甘露醇(细胞旁路转运的标志物)的转运，以验证上皮的完整性。

在实验之前和实验过程中，监测细胞单层的跨上皮电阻(TEER)。TEER用连接至筷针(Chopsticks)的EVOM™上皮伏欧表测量。

实施例2

白蛋白结合剂的制备

4-(1H-四唑-16-基-十六烷酰基氨磺酰基)丁酰基-OEG-γGlu-γlGlu-OEG-N ^Ɛ(C(O)CH₂Br)Lys-OH

化合物I

采用标准Fmoc-肽化学法在ABI433合成仪上，以1mM规模在固体支持物上合成化合物I。使用Fmoc-OEG-OH和Fmoc-Glu-OtBu保护的氨基酸，在Fmoc-Lys(MTT)-Wang树脂上装配肽。将4-(16-1H-四唑-5-基-十六酰基氨磺酰基)丁酸与DCM/NMP中的DIC/NHS(2当量)手动偶联过夜，TNBS测试显示反应完成。然后，树脂以穿流布置(flow through arrangement)用50 mL DCM/TFA/TIS/水(94:2:2:2)处理直到黄色消失，约20分钟，随后用DIPEA/DMF洗涤并中和。溴乙酸(4 mM)/DCM/NMP (1:1)用1 mM HONSu和DIC的混合物活化，过滤，将其添加至树脂，再添加1 mM DIPEA。1小时后，反应完成。树脂用80 mL TFA/TIS/水(95:2.5:2.5)处理1小时。用N₂流蒸发，通过添加Et₂O而沉淀，用Et₂O洗涤并干燥。粗产物在制备型HPLC (2次运行)上纯化，用针对0.1% TFA/水的30-80% 0.1 TFA/MeCN的梯度。收集级分，与约50% MeCN一起冻干，得到化合物I。

TOF-MS: 质量1272.52 (M+1)。

实施例3

白蛋白结合剂的制备：

以与上面实施例2中所述类似的方式，使用Fmoc-Lys(Mtt)-OH和Wang树脂制备以下化合物。

化合物II

TOF-MS：质量983.01 (M+1)。

实施例4

白蛋白结合剂(化合物II)与hGH(Q84C Y143C L101C)的缀合

通过在环境温度下混合向310 ml 20 mM三乙醇胺, 0.1 M NaCl, pH 8.5中的4.9 mg/ml hGH(Q84C Y143C L101C)-半胱胺的溶液中添加387 mg TSPP (Tris(3-磺酸酯苯基)膦水合物钠盐)。使反应运行两小时。

将白蛋白结合剂化合物II溶解在20mM三乙醇胺, 2 mM EDTA pH 8.5中至10 mg/ml。将溶解的白蛋白结合物以3:1的比率添加至脱保护的hGH[Q84C Y143C L101C]。将NaCl添加至溶液中以获得0.4 M的NaCl的最终浓度。将反应在环境温度下运行2.5小时，随后放置在4摄氏度过夜，直到进行最后纯化，得到化合物GH-A3。

实施例5

白蛋白结合剂(化合物I)与hGH(Q84C Y143C L101C)的缀合以与如实施例4中所述类似的方式进行，得到化合物GH-A2。

实施例6

缀合的化合物的GH-A2和GH-A3随后使用离子交换层析纯化，随后如渗滤进行缓冲液交换。纯化还可通过使用以下技术(但不限于这些技术)来实现：离子交换层析法、疏水作用层析法、亲和层析法、大小排阻层析法和本领域技术人员已知的基于膜的分离技术。

生长激素化合物1 (GH-A1): GH(Q84C Y143C)

生长激素化合物2 (GH-A2): GH(Q84C Y143C L101C)与白蛋白结合剂

GH-A2的白蛋白结合剂

R1= hGH (Q84C Y143C L101C)中L101C的S

生长激素化合物3 (GH-A3): GH(Q84C Y143C L101C)与白蛋白结合剂

GH-A3的白蛋白结合剂

R1= hGH[Q84C Y143C L101C)中L101C的S。

实施例7

纯化的生长激素化合物的蛋白化学表征

采用MALDI-MS分析完整的纯化蛋白。实测质量等于自氨基酸序列推导的理论质量。在二硫键用DTT还原之前和之后，通过采用胰蛋白酶和AspN消化，随后对消化物进行MALDI-MS分析对肽作图，来表明连接二硫键。

纯化的生长激素化合物的浓度测定

使用Vydac 218TP54 4.6 mm x 250 mm 5 µm C-18硅胶柱(The Separations Group, Hesperia)，在Agilent 1100系统上进行RP-HPLC分析。在214 nm处通过UV检测。柱用0.1%三氟乙酸/H₂O平衡，样品通过0-90%乙腈针对0.1%三氟乙酸/H₂O的合适梯度洗脱。使用已知浓度的hGH标准品的校准曲线计算hGH化合物样品的浓度。

采用NanoDrop ND-1000 UV-分光光度计，通过在280 nm处测量吸光度，来估算蛋白浓度。

大小排阻层析在使用TSK2000 SWXL 7.5 x 300 mm柱(Tosoh)的Agilent 1100系统上进行。检测通过215 nm的UV。该柱用含有3％异丙醇(30 ml至1l流动相)的0.063 M磷酸盐缓冲液(7.77 g Na2HPO4 2H2O和5.28 g NaH2PO4 H20至1l流动相)pH7.0(用磷酸调节)平衡，所述磷酸盐缓冲液也用作洗脱缓冲液。对于每个样品，将20 ul注射在柱上。使用已知浓度的hGH标准品的校准曲线用于计算hGH化合物样品的浓度。单体、二聚体和多聚体蛋白的量被确定为曲线下总面积的百分比。

所用化合物的短名称、长名称和IUPAC名称的列表在下面提供。

实施例8

GH化合物向大鼠的肠道内施用和血液样品的分析

生长激素化合物(129/130、150或300 nmol/大鼠)根据实施例9-19配制，且结果呈现在表 A-K和图1-7中。将每种组合物制备为100 μl剂量，所述剂量注射到完全麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠(n = 6、9或18)的空肠中段。将GH与FA-aa的浓度比调整至约1:1 (W:W)，但包括6:1至1:2的变化。

在每一取样时间，用25 G针从尾静脉抽取0.25 mL血液。 采样时间为： 给药前和给药后0.25、0.5、1、2、4 和6小时。将血液采样到EDTA包被的试管中，并储存在冰上，直至4°C 1200 x G离心10 min。将血浆转移至Micronic管并储存于-20°C直至分析。

使用豚鼠抗hGH多克隆抗体作为捕捉剂，生物素化hGH结合蛋白(人GH受体的可溶性部分)作为检测剂，通过夹心ELISA测定测试化合物浓度。该测定的检测限值为0.2 nM。

使用WinNonlin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)对每种测试化合物的平均浓度-时间概况进行非房室型药代动力学分析。计算终末半衰期(t_½)和平均保留时间(MRT)的药代动力学参数估计值。

采用化学发光氧通道免疫测定法(Luminescence Oxygen Channeling Immunoassay，LOCI)（基于均质珠粒的测定法）分析样品。LOCI试剂包括两种乳胶珠粒试剂和生物素化的GH结合蛋白，其是夹心的一部分。珠粒试剂之一是通用试剂(供体珠粒)，用链霉抗生物素包被并含有光敏染料。第二珠粒试剂(受体珠粒)用构成夹心的抗体包被。在测定过程中，三种反应物与分析物组合形成珠粒-聚集体-免疫复合物。照射复合物从形成通往受体珠粒的通道的供体珠粒上释放单线态氧，并引发化学发光，其在EnVision读板仪中测量。所产生的光的量与hGH衍生物浓度成比例。药代动力学概况从所得记录进行检索。

此类药代动力学曲线的实例显示于图1中。显示实施例中测试的增强剂是C16-Glu，并且生长激素化合物2(GH-A2)的血浆浓度在有或没有如上所述的增强剂的情况下施用后进行测量。

GH吸收程度基于药代动力学概况被定量为AUC(曲线下面积)。在以下实施例中，增强的程度已被计算为在增强制剂存在的情况下的AUC除以在增强制剂不存在的情况下的AUC。如图1中显示的C16-Glu的效果也被实施例11覆盖。

实施例9

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物1(GH-A1)(300 nmol/大鼠)溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸的10 mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠(n = 6)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况，并计算增强的程度。结果显示在表A中。

表 A

实施例10

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物GH-A1 (300 nmol/大鼠)溶解于缓冲液： 20mg/ml甘氨酸, 2 mg/ml D-甘露醇, 2.4mg/ml碳酸氢钠, pH=8.2，存在脂肪酸酰化的氨基酸。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠(n = 6)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表B中。额外研究使用相同的FA-aa和GH化合物使用替代缓冲液(包括例如20mg/ml甘氨酸, 2 mg/ml D-甘露醇, 2.4mg/ml碳酸氢钠, pH=8.2；50 mM磷酸钠缓冲液 pH 7.5；10 mM磷酸钠缓冲液 pH 6.5和50 mM磷酸钠缓冲液 pH 6)来进行。获得结果的平均值呈现在图2中。

表 B

实施例11

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物GH-A2 (150 nmol/大鼠)溶解于缓冲液： 20mg/ml甘氨酸, 2 mg/ml D-甘露醇, 2.4mg/ml碳酸氢钠, pH=8.2，存在脂肪酸酰化的氨基酸。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠(n = 6)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表C中。额外研究使用相同的FA-aa和GH化合物使用替代缓冲液(包括例如20mg/ml甘氨酸, 2 mg/ml D-甘露醇, 2.4mg/ml碳酸氢钠, pH=8.2和10 mM磷酸钠缓冲液 pH 6.5)来进行。获得结果的平均值呈现在图3中，而图1包括来自实验重复(n=18)的数据。

表 C

实施例12

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物GH-A3 (300 nmol/大鼠)溶解于缓冲液： 20mg/ml甘氨酸, 2 mg/ml D-甘露醇, 2.4mg/ml碳酸氢钠, pH=8.2，存在脂肪酸酰化的氨基酸。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠(n = 6)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表D中。额外研究使用相同的FA-aa和GH化合物使用替代缓冲液进行。获得结果的平均值呈现在中。额外研究使用相同的FA-aa和GH化合物使用替代缓冲液(包括20mg/ml甘氨酸, 2 mg/ml D-甘露醇, 2.4mg/ml碳酸氢钠, pH=8.2；50 mM磷酸钠, 50 mM NaCl, pH 8；和10 mM磷酸钠缓冲液 pH 6.5)来进行。获得结果的平均值呈现在图4中。

表 D

来自实施例9-12的体内数据表明，与在增强剂不存在的情况下测量的GH化合物的AUC相比，所有增强剂都增加GH化合物的AUC。该数据进一步表明，GH化合物吸附的程度受脂肪酸酰化的氨基酸的身份影响。对于具有较长脂肪酸链的FA-aa观察到最强效果，并且所述效果进一步，在一定程度上，取决于具体氨基酸。

实施例13

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸和蛋白酶抑制剂的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物GH-A2 (150 nmol/大鼠)溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸和大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI) 2%的10 mM磷酸钠缓冲液(pH 8.2)中。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠(n = 12)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表E中。

表 E

实施例14

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸和蛋白酶抑制剂的生长激素的含水制剂。将生长激素化合物GH-A1、GH-A2和GH-A3 (150 nmol/大鼠)溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸和大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI) 2%的10 mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠(n = 6-12)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表F中。额外研究使用相同的FA-aa和GH化合物使用替代缓冲液进行。测试的含水缓冲液包括20mg/ml甘氨酸, 2 mg/ml D-甘露醇, 2.4mg/ml碳酸氢钠, pH=8.2；10 mM磷酸钠, pH 8.2和10 mM磷酸钠, pH 6.5。使用GH-A1、GH-A2和GH-A3、FA-aa和抑制剂获得的结果的平均值分别呈现在图5、图6和图7中。

表 F

体内数据表明，脂肪酸酰化的氨基酸(此处为C16-肌氨酸)的GH吸附增强效果受酶抑制剂的存在显著改善。如图5、6和7中所见，添加蛋白酶抑制剂(SBTI)与FA-aa增强剂的组合的效果大于所有三种GH化合物的累加效果。

实施例15

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素的非含水制剂。植物油和表面活性剂的重量比为30-50 wt%油和50-70 wt%表面活性剂的混合物用作在脂肪酸酰化的氨基酸存在的情况下的生长激素化合物2的溶剂。将组合物(150 nmol/大鼠)注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠(n = 8)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表G中。

表 G

总之，FA-aa同样在非含水制剂中作为GH的吸收增强剂也是有功能的。

实施例16

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸和蛋白酶抑制剂的生长激素的非含水制剂。双甘油单辛酸酯、吐温 20和丙二醇(45wt%、30wt%、15wt%、10%水)的混合物用作在脂肪酸酰化的氨基酸和蛋白酶抑制剂存在的情况下的生长激素化合物2的溶剂。将组合物(150 nmol/大鼠)注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠(n = 9)的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表H中。

表 H

该数据表明，除了SBTI以外的其他蛋白酶抑制剂可以有效增强FA-aa的效果。

实施例17

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸的生长激素含水制剂。将生长激素化合物GH-A2 (129 nmol/大鼠)溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸的10 mM磷酸钠缓冲液(pH 8.2)中。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。AUC值是所有测试动物中的平均值。结果显示在表I中。

表 I

实施例18

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸和蛋白酶抑制剂的生长激素含水制剂。将生长激素化合物GH-A2 (129 nmol/大鼠)溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸的100 mM磷酸钾缓冲液(pH 8.2)中。将组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠的空肠中段，并且如实施例8中所述检索药代动力学概况并计算增强的程度。AUC值是所有测试动物中的平均值。结果显示在表J中。

表 J

实施例19

测试含有脂肪酸酰化的氨基酸且有和没有蛋白酶抑制剂的含水制剂。将人生长激素(129 nmol/大鼠)溶解于存在脂肪酸酰化的氨基酸的100 mM磷酸钾缓冲液(pH 8.2)中。将有或没有抑制剂的组合物注射到麻醉的过夜禁食的Sprague-Dawley大鼠的空肠中段，并且检索药代动力学概况并计算增强的程度。结果显示在表K中。AUC值是所有测试动物中的平均值。

表 K

实施例20

在E12单层测定中测量含有脂肪酸酰化的氨基酸的含水制剂中GH化合物的跨上皮转运。

转运研究如通用方法D(实施例1)中所述进行。测试通过将400 µl测试溶液(转运缓冲液中的100µM GH A1化合物、0.5 mM脂肪酸酰化的氨基酸和0.4 µCi/µl [3H]甘露醇)添加至供应室且将1000 µl转运缓冲液添加至接受室而起始。在添加GH-A1或GH-A2化合物之后，将由含有10 mM HEPES, 0.1%的Hank氏平衡盐水溶液组成的转运缓冲液调节至pH 7.4。测量在不同的FA-aa存在的情况下生长激素化合物的渗透(Papp)，并且计算与单独的生长激素化合物相比的增加(或减少)倍数。

表L包括GH-A1和各种脂肪酸酰化的氨基酸的测试组合的结果。

表 L

基于相对于单独的GH A1的增加倍数，显示与C16-Gln或C16-Glu的组合对GH A1转运具有最大效果，而C14-aa和C12 FA-aa的使用具有中间效果。

在进一步系列的渗透实验中，GH-A2的转运使用如上所述的相同程序进行评估。表M包括GH-A2和各种脂肪酸酰化的氨基酸的测试组合的结果，其显示相对单独的GH A2的增加倍数。

表M

如上述，对于GH A2的转运，与C16-Gln或C16-Glu的组合被显示具有最大效果，而与C14-和C12 FA-aa的组合具有中等效果，且与C10-和C12 FA-aa的组合几乎没有效果。

结果因此对于GH-A1和GH-A2是类似的，其表明C16-Glu和C16-Gln对于生长激素化合物具有优异的渗透效果。C14和C12脂肪酸氨基酸对于生长激素化合物具有中等效果，而C8和C10对于生长激素化合物的跨上皮转运具有非常温和(modest)的效果(如果有任何效果的话)。

发现体外数据与体内数据相当一致：其显示渗透增强取决于脂肪酸链长度，并且在一定程度上取决于脂肪酸氨基酸的氨基酸残基。

序列表

Claims (15)

1.药物组合物，其包含：

a. 生长激素化合物，和

b. 至少一种脂肪酸氨基酸(FA-aa)或其盐，其中所述FA-aa的脂肪酸部分具有12-18个碳原子。

2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述组合物是口服药物组合物。

3.根据权利要求1和2的药物组合物，其中至少一种脂肪酸氨基酸(FA-aa)具有通式：

其中

R1是包含10-18个碳原子的脂肪酸链，

R2是H (即氢)、CH3 (即甲基)或当R2共价连接至R4时是价键，且

R3是H或不存在，且

R4是氨基酸侧链，包括-(CH₂)₃-，此时共价连接至R2。

4.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的脂肪酸部分具有至少14个碳原子。

5.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的脂肪酸部分具有多至16个碳原子。

6.根据前述权利要求中任一项的口服药物组合物，其中所述脂肪酸部分是衍生自棕榈酸的棕榈酰基。

7.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述FA-aa的氨基酸残基基于选自以下的氨基酸：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、肌氨酸(Sarc)、甘氨酸(Gly)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)。

8.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述氨基酸残基是谷氨酰胺、谷氨酸或肌氨酸。

9.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述脂肪酸酰化的氨基酸为N-棕榈酰基-谷氨酸钠或N-棕榈酰基-肌氨酸钠。

10.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其中所述生长激素化合物具有高于30分钟的T ½。

11.用于增加生长激素化合物的生物利用率的方法，其包括在所述生长激素化合物的药物组合物中包括FA-aa的步骤。

12.用于增加生长激素化合物的血浆浓度的方法，其包括以下步骤：使个体的胃肠道暴露于包含生长激素化合物和FA-aa的药物组合物，导致所述个体中所述生长激素化合物的血浆浓度增加。

13.用于增加生长激素化合物的摄取的方法，其包括以下步骤：使个体的胃肠道暴露于生长激素化合物和至少一种FA-aa，由此，与不包括至少一种FA-aa的暴露相比，所述个体中所述生长激素的血浆浓度增加。

14.用于治疗生长激素相关的疾病或病症的方法，其包括施用包含生长激素化合物和至少一种FA-aa的药物组合物。

15.权利要求11-14的方法，其中所述药物组合物通过权利要求1-10中任一项进行描述。