CN104945496B - 一种多肽及其在制备与纯化对ehd2特异的抗体中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种多肽及其在制备与纯化对EHD2特异的抗体中的应用，所述多肽氨基酸序列为SEQ ID NO：1。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是EHD2的表达与亚细胞定位与乳腺癌患者的生存具有显著相关性，可以作为乳腺癌恶性度诊断和预后预判的一个分子指标。
背景技术
乳腺癌是女性常见恶性肿瘤。全世界每年有一百万妇女患病，自20世纪70年代末开始、我国乳腺癌的发病率一直居女性肿瘤的首位。北美、北欧原是乳腺癌的高发区，现在我国的发病率也从五年前的十万分之十七增加到去年的十万分之五十二，呈快速上升趋势，而且发病年龄也越来越年轻化，年龄最小的只有十四岁。引发乳腺癌的因素是多方面的，除遗传因素外还有环境因素、精神因素及工作压力太大等因素。而且经济越发达的城市发病率越高于农村。目前世界各国投入较大的精力和物力来研究该病的发生、发展，以便采取积极的预防措施。
目前在临床上对肿瘤的恶性度判别主要还是基于在组织病理水平对肿瘤组织和肿瘤细胞进行常规形态学观察，它对癌细胞的分化程度和侵犯特性有较强的辨别能力，准确率可达50%-75%。然而，这种基于形态学的解读一方面受病理医师经验等人为因素影响，另一方面缺乏更深层次的与病人个体发病因素相关的分子依据，因此亟需与现代分子技术相结合，才能提高判断的准确性和特异性，特别是为个体化治疗路径与方案的选择提供理论依据。
虽然肿瘤的发生与多种因素相关，但最终的根源主要来自于基因水平的异常变化，包括基因的扩增、突变、缺失、异位等等，导致维持细胞正常生理状态所需的多个功能蛋白在表达水平的高低、生化活性的强弱、甚至亚细胞结构分布等方面产生变化，当这种变化赋予了细胞无限增殖能力及转移能力，并不能被体内外保护机制逆转或杀灭时，便产生了肿瘤。因此，对肿瘤恶性本质的深刻认识和有效控制的前提是明确这些功能蛋白分子的异变情况，这需要借助免疫组织化学的手段。
免疫组织化学技术应用免疫学抗原抗体反应基本原理，通过抗体对体内蛋白质分子抗原的特异性识别，以及化学标记(荧光素、酶、金属离子、同位素等)的第二抗体的显色等作用来检测组织细胞内目标抗原(多肽和蛋白质)的表达量及其亚细胞定位。近年来，随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的成功研发，更主要的是对肿瘤分子机制认识的不断深入，免疫组化在肿瘤诊断与鉴别中的应用价值受到了普遍的认可。比如雌激素受体ER、孕激素受体PR和表皮生长因子受体家族的Her2已经被广泛用于乳腺癌的临床分子病理诊断，它对乳腺癌的病理分类和临床用药起到了积极的指导作用。这些成果离不开肿瘤基础研究的进步，并期待新的分子指标被进一步揭示和纳入临床应用，不断提高肿瘤诊治水平。EHD2基因及其编码蛋白即可能是这种新的分子指标。
EHD2(Epsin homology(EH)-domain-containing proteins)属于EHD蛋白的一种，是一类新型膜转运调控蛋白，含有高度保守的EH结构域，此EH结构域是一个含有约一百个氨基酸残基的片段，早先发现于EGFR的激酶底物Eps15(Epdemal Growth Factor ReceptorPathway Substrate Clone15)。EHD2参与胞膜转运的各步调控，包括内转及前、后内含体的过渡和调控循环通路；膜及膜蛋白的各路调节，包括消化降解及循环再生。是整个胞膜转运机制的必不可少的重要环节，对在各种细胞活动中维护物料传输信号传导的动态平衡起着关键的作用，它的失调将导致信号应答失当，细胞功能紊乱，并可能进而引发疾病。
中国文献“EHD2干扰影响永生化乳腺上皮细胞的增殖和迁移”（王洪玉等，中国肿瘤临床，2011年第38卷第11期，）公开了在乳腺肿瘤中EHD2的基因表达失调下降，提示该基因可能是一个新的乳腺抑癌基因。然而在进一步免疫组化研究中我们发现，虽然EHD2在总体表达量上呈现下降的趋势，但这种趋势主要在核中；相反，细胞浆中的表达却有升高的趋势。而且，EHD2在核中的表达水平与患者的生存情况密切相关。因此对EHD2进行免疫组化检测将更客观准确地反映肿瘤的异化本质和患者个体的临床预后情况。
现有的商业化EHD2抗体有十余种，由主流抗体试剂公司Santa Cruz和Abcam等提供，但是均属于基础研究用试剂，没有依据表明这些抗体可以和我们的抗体一样具有合格的特异性并可用于免疫组化检测，特别是目前尚没有任何其它EHD2抗体经过大量组织标本的免疫组化验证并显示出可以通过对EHD2的亚细胞异常定位检测来达到对肿瘤的恶性度及患者生存情况进行预后预判的目的。与本专利申请抗体相比它们有如下缺陷：
1、根据本领域公知常识,能够用于免疫组化（IHC）的抗体会在其使用说明中作出明确标识和注明，按这些抗体的说明所示，大多数都不能用于免疫组化（IHC）检测。虽然个别抗体标明可用于免疫组化（IHC），但仔细研究发现并非如此。一个是南京森贝伽公司代理的EHD2抗体，但是注明了只能检测膜定位。另一个是Proteintech公司的货号为11440-1-AP的抗体，然而此抗体的特异性存在问题：首先免疫印迹检测得到的主要信号位置明显小于60kD，而70kD的正常位置信号却很弱，说明虽然可以检测到EHD2，但更多检测到的是其它未知分子；其次从公司发表的该抗体对肺癌组织的免疫组化图中可见染色信号为明显的基质成分的非特异性着色。
2、这些抗体均为研究用试剂，没有经过大样本临床病例试验或验证，没有关键的对EHD2的核定位检测能力，因此也就没有“通过对EHD2的亚细胞异常定位检测来达到对肿瘤的恶性度及患者生存情况进行预后预判的目的”的前提条件与基础。
3、均没有经过严格的免疫印迹特异性验证，特别是与EHD2蛋白的同源蛋白EHD1、EHD3、EHD4的交叉反应的免疫印迹实验验证，而这些验证对EHD2的免疫组化检测方法来说尤其重要，因为它们之间具有很高的同源性（>70%）。
中国文献“EHD2下调促进乳腺上皮细胞转化的研究”（田刚等，现代医学检验杂志，2012年第27卷第1期，49-51）公开了一种由其自制的EHD2抗体，这一抗体是采用我们的没有经过抗原纯化的抗体，可以用于免疫印迹检测，但不能满足免疫组化检测的高度特异性要求。
发明内容
我们在免疫组化研究中发现，正常上皮细胞中EHD2主要分布在细胞核，同时细胞浆与膜中也有少量表达。但在乳腺癌组织中，EHD2的定位发生异变，核分布显著下降，浆与膜分布却出现升高的趋势。临床因素分析结果表明，EHD2的核分布情况与患者预后紧密相关，核表达越弱则患者的生存情况越差。这些发现表明乳腺癌的恶性度与癌组织细胞中EHD2蛋白的表达位置和表达水平发生异变的程度密切关联，而免疫组化技术是检测这种表达紊乱程度的唯一可靠手段。因此提供一种检测EHD2基因的表达产物在癌细胞内部不同位置特别是核中的表达情况的方法为现有技术中需要解决的问题。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术手段和方案：
一种对人EHD2蛋白特异的抗体，其特征是所述抗体能特异性识别人EHD2蛋白，所述识别位点的氨基酸序列为：503-SEQ ID NO：1-543。
基因EHD2及其编码蛋白在乳腺癌免疫组织化学法诊断和预后预判中的应用，所述基因EHD2的GeneBank国际通用序列编号为：NM_014601，所述基因EHD2编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_055416。
所述基因EHD2及其编码蛋白在乳腺癌免疫组织化学法诊断和预后预判中的应用，其特征是采用了前述抗体。
基因EHD2及其编码蛋白在制备乳腺癌免疫组织化学法诊断和预后预判试剂中的应用，所述基因EHD2的GeneBank国际通用序列编号为：NM_014601。
所述基因EHD2及其编码蛋白在制备乳腺癌免疫组织化学法诊断和预后预判试剂中的应用，其特征是采用了前述抗体。
一种多肽，其特征是所述多肽氨基酸序列为SEQ ID NO：1，。
所述多肽，优选以前述多肽氨基酸序列为核心序列对其进行修饰，所述修饰为在多肽N端连接一个半胱氨酸。
所述多肽在制备前述抗体中的应用。所述应用优选为作为抗原对动物进行免疫以制备EHD2抗体。
所述多肽在制备对EHD2特异的抗体中的应用。所述应用优选为对抗体进行抗原纯化。
一种用于乳腺癌诊断和预后判断免疫组化试剂，其特征是采用前述对人EHD2蛋白特异的抗体作为一抗或核心抗体。
本发明说明书中所采用的术语：
“基因EHD2的编码蛋白“即“EHD2蛋白”。本领域技术人员应该了解，当说明书中提及“EHD2的表达”时，即是指“基因EHD2及其编码蛋白的表达”。
“核心序列”为人EHD2蛋白（genebank蛋白号NP_055416)的第503至543位氨基酸序列，该核心序列对应的多肽片段在化学合成后或重组表达后经或不经修饰可用于免疫以产生对EHD2特异的抗体。
“修饰”为对上述核心序列对应的多肽片段用化学方法或重组DNA等常规方法进行添加氨基酸、偶联化学基团或纯化介质，目的是用于免疫产生抗体或对抗体进行抗原纯化。
我们在研究中发现，基因EHD2的表达产物在乳腺上皮细胞癌变时表达分布出现紊乱趋势，其紊乱程度尤其是核表达情况与患者的生存情况密切关联，而采用免疫组化技术进行检测并对结果进行人工判读是了解这种基因在细胞内不同位置表达紊乱程度的唯一可靠手段。但现有的EHD2抗体，多不能用于免疫组化检测，而声称能够用于免疫组化检测的抗体并没有免疫印迹证据显示合格的特异性，特别是不能排除对EHD2的同源蛋白的交叉反应性，且在实际应用中发现或者仅能对细胞膜中的EHD2蛋白产生反应而不能识别重要的核中EHD2蛋白，或者检测到的只是对间质成分的非特异性信号。而且现有抗体均没有在组织水平进行大样本检测和统计分析显示具有识别EHD2核表达定位的特性并用于预后预判的作用。我们提供了一种对EHD2特异的经抗原纯化的抗体及其在制备免疫组织化学检测试剂中的应用。本发明提供的EHD2抗体具有合格的特异性，经免疫印迹方法测试可以特异识别EHD2蛋白而不能识别高度同源的其它蛋白，可以采用免疫印迹方法进行EHD2蛋白定量检测，还可以制备成免疫组化试剂，直接用于判断组织细胞中EHD2的表达以及定位情况，尤其是可以用于监测细胞核中EHD2的表达定位情况，从而可以更好的用于乳腺癌的诊断和预后判断。
附图说明
图1为特异性检测实施例1中得到的免疫印迹图；
图2为免疫组化检测实施例1中正常组织细胞的免疫组化图；
图3为免疫组化检测实施例1中乳腺癌细胞的免疫组化图；
图4为免疫组化检测实施例1中乳腺癌细胞的免疫组化图；
图5为免疫组化检测实施例1中乳腺癌细胞的免疫组化图；
图6为免疫组化检测实施例1中的260例样本的无进展生存曲线图。
具体实施方式:
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
抗体制备实施例1：对EHD2特异抗体的制备
（1）实验材料来源
新英格兰大白兔购于上海强耀生物；
多肽CDEEFALASHLIEAKLEGHGLPANLPRRLVPPSKRRHKGSAE（该多肽是以氨基酸序列为SEQ ID NO：1的多肽为核心序列进行修饰得到的，其修饰方法为在N端连接一个半胱氨酸。）由天津赛尔生物技术有限公司定制并与KLH偶联；
CNBr活化的凝胶珠、弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂购自Invitrogen公司。
（2）动物免疫
取4月龄新西兰大白兔3只，将100ug抗原多肽溶于0.2ml0.1M PBS(pH7.2),与等体积弗氏完全佐剂充分混匀，腹部皮下多点注射。第一次免疫后第15和29天，分别用100ug多肽/0.2mlPBS与等体积弗氏不完全佐剂充分混合后加强免疫。
（3）EHD2抗血清的制备
于免疫结束后一周颈动脉取血，37℃静置3小时后离心取血清。
（4）抗原凝胶珠制备
CNBr活化的凝胶珠于1mM HCl中浸泡30分钟，用偶联缓冲液（含0.1MNaHCO3pH8.3，和0.5M NaCl）清洗，按1mg多肽加1ml凝胶的比例混合反应体系，4度偶联过夜，1M乙醇胺浸泡3小时后用清洗液1（含50mM Tris,1M NaCl，pH8.0）和清洗液2（含50mM甘氨酸,1M NaCl，pH3.5）交叉清洗八遍，PBS清洗一遍。
（5）EHD2抗体的纯化
血清与上述抗原凝胶珠按体积比为20:1的混合，加与混合后体系等体积的PBS，混匀1小时后离心，用PBS清洗凝胶珠，用pH3柠檬酸钠溶液洗脱联在凝胶珠上的抗体，调pH至6.5-7.5，得到纯化后的EHD2抗体。
检测实施例1：对EHD2抗体采用免疫印迹法进行特异性检测
（1）实验材料来源：
293T细胞购于美国American Type Culture Collection(ATCC)公司；RPMI1940培养液、BSA、HRP标记抗兔二抗、Lipo2000转染试剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂、ECL化学发光检测试剂等购于Invitrogen公司；EHD1、EHD2、EHD3、EHD4表达质粒为自制。
（2）细胞培养
293T细胞培养于RPMI1940培养液中，37℃、5%CO2培养贴壁生长；细胞传代时先弃去培养液，再用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）洗两遍，加入0.05%胰蛋白酶消化2分钟，加入培养基终止消化。细胞保持良好状态，两天传一代。转染时分别加入表达EHD1、EHD2、EHD3、EHD4的质粒及转染试剂，2天后收取细胞做免疫印迹实验。
（3）免疫印迹方法
将各种细胞预留足够数量至离心管中，离心后RIPA裂解液裂解细胞，煮样，再离心。制得样品后，使用BCA检测试剂进行蛋白浓度的测定。每个样品分别取80ug蛋白总量进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶上蛋白电转到PVDF膜上，室温5%牛奶封闭1小时。洗涤后，与一抗（实施例1中制备的抗体以1:2000加入PBS和5%BSA)在室温孵育1小时。然后与1:5000稀释的抗兔二抗室温孵育1小时。最后用化学发光检测试剂检测，检测结果见图3。从中可以看出，本发明提供的对EHD2特异的抗体能够特异识别EHD2蛋白，而对同源的其它EHD蛋白不能识别。
（4）结果：抗EHD2抗体具有对EHD2蛋白的特异免疫识别能力，并对其它同源蛋白不产生交叉反应。检测结果图片见图1，图中：样品Ve为空表达载体，无信号；样品1过表达EHD1蛋白，无信号；样品2过表达EHD2蛋白，在对应分子量70kd位置呈一条主带，信号清晰，并没有其它明显背景条带；样品3过表达EHD3蛋白，无信号；样品4过表达EHD4蛋白，无信号。综上，本实施例提供的抗体在正常位置70kd处具有强烈的信号，而且在其他位置均无信号，结果表明本发明提供的抗体具有很好的特异性。
免疫组化检测实施例1：EHD2免疫组织化学检测
（1）实验材料来源：
乳腺癌切片取自天津市肿瘤医院肿瘤组织标本库，常规脱蜡，样本数量为260。一抗稀释液、辣根过氧化物酶（HRP）标记的通用二抗、二氨基联苯胺（DAB）底物、底物稀释液等购自中杉金桥。
（2）免疫组化检测试剂组配条件及样本组织中EHD2表达与定位的检测方法：
方法主要步骤为：组织切片脱蜡至水，抗原修复，內源过氧化物酶阻断，以1:200滴加实施例（1）制备得到的抗体作为一抗，4℃孵育过夜。缓冲液洗3次每次5min。滴加通用HRP酶标二抗，在室温下孵育30分钟。缓冲液洗3次每次5min。DAB显色，复染，脱水封片后显微镜下观察染色情况。
（3）结果：
正常组织中EHD2在上皮细胞核中表达阳性，浆或膜表达弱阳性。癌组织中，EHD2表达发生紊乱，且核表达趋弱。典型免疫组化图见图2～图5，图2为正常组织的免疫组化图，显示出正常细胞EHD2在上皮细胞核表达，图3～图5为不同乳腺癌组织标本的免疫组化图，图3所示乳腺癌组织标本中EHD2在癌细胞核与浆中均有表达，图4所示乳腺癌组织标本中EHD2在癌细胞核中不表达，浆中强表达；图4所示乳腺癌组织标本中EHD2在乳腺癌细胞中表达整体缺失，表明EHD2在癌细胞中表达发生紊乱且核表达减弱。260例样本的无进展生存曲线图见图6，该图图例：0为核表达阴性；1为核表达阳性，censored表示死亡。横坐标为无进展生存月数，竖坐标为无进展生存病例百分数。从图中可以看出核表达阴性的病例其预后明显较核表达阳性的差。
以上实验结果表明，采用本发明提供抗体为核心的免疫组化检测方法，能很好地检测乳腺癌组织细胞中EHD2的表达量和表达位置，便于从免疫组化图中直接判读EHD2在癌组织细胞核中的定位和表达情况以预判乳腺癌恶性度和患者生存前景。
Claims (1)
1.一种多肽在制备一种对人EHD2蛋白特异的抗体中的应用，其特征在于，所述多肽氨基酸序列为：SEQ ID NO.1的第503-543位，所述应用为多肽作为抗原对动物进行免疫以制备EHD2抗体。
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