CN104945406B

CN104945406B - 氮杂非那烯‑3‑酮的衍生物、其制备方法及其作为parp抑制剂的应用

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Publication number: CN104945406B
Application number: CN201510267732.1A
Authority: CN
Inventors: 储玉平; 徐卫良; 王玲; 徐炜政
Original assignee: SUZHOU KANGRUN PHARMACEUTICALS Inc
Current assignee: SUZHOU KANGRUN PHARMACEUTICALS Inc
Priority date: 2015-05-25
Filing date: 2015-05-25
Publication date: 2017-10-10
Anticipated expiration: 2035-05-25
Also published as: EP3305793A4; EP3305793A1; EP3305793B1; CN104945406A; US10106550B2; US20180134722A1; WO2016188307A1

Abstract

本发明公开了一种氮杂非那烯‑3‑酮的衍生物、其制备方法及其作为PARP抑制剂的应用，氮杂非那烯‑3‑酮衍生物的结构式为：

Description

氮杂非那烯-3-酮的衍生物、其制备方法及其作为PARP抑制剂的应用

技术领域

本发明属于涉及药物合成技术领域，具体涉及一种氮杂非那烯-3-酮化合物衍生物及其作为PARP抑制剂的应用。

背景技术

聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose)-polymerase,PARP)存在于哺乳动物细胞和大多数真核细胞中，是一类催化聚ADP核糖化的细胞核酶。PARP与许多生理过程密切相关，包括染色体的稳定、DNA损伤的识别和修复、基因的转录以及细胞的凋亡和坏死等。PARP自发现以来,其在DNA损伤修复和维持基因组的稳定性方面的重要作用已经引起广泛关注。在各类DNA损伤中，DNA单链损伤发生最为频繁，而其一系列的修复途径所采用的酶就是PARP。PARP作为DNA缺口的感受器，在DNA损伤后被激活，依赖N-端DBD的两个锌指结构识别并结合到DNA缺口，使其催化活性提高10-500倍。

现有的化疗药物和放疗均是通过直接或间接攻击DNA，造成DNA损伤从而对肿瘤细胞产生细胞杀伤作用。然而，在肿瘤细胞中DNA修复酶过度表达的话，会激活自身的DNA损伤修复机制，进而在药物治疗和放疗过程中产生抗性。研究发现，PARP抑制剂可以阻断DNA修复通路，降低肿瘤细胞的自我修复能力，因此将PARP抑制剂与放化疗联合应用可以有效增强抗肿瘤效果。研究还发现，PARP抑制剂单药对BRCA1/2基因缺失或突变的乳腺癌及卵巢癌也有明显的抑制作用。

综上所述，PARP抑制剂在在抗肿瘤方面方面具有广阔的研究和应用前景。因此本发明拟在前期研究的基础上，设计、合成一系列全新的基于呔嗪酮母核的氮杂非那烯-3-酮化合物衍生物，并对其活性进行筛选和初步研究，为研发出活性更好的抗肿瘤药物提供基础。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提出一种氮杂非那烯-3-酮的衍生物、其制备方法及其作为PARP抑制剂的应用，本发明的氮杂非那烯-3-酮衍生物具有很高的抑制PARP酶的活性，给发展氮杂非那烯-3-酮化合物作为用于PARP抑制剂从而达到肿瘤治疗目的的新药研究提供了良好的基础。

如式(Ⅰ)所示的氮杂非那烯-3-酮衍生物：

其中R为氢，甲基，乙基，异丙基，苄基或者3-甲基-3-丁烯基。

上述氮杂非那烯-3-酮化合物的合成路线为：

(1)以3-硝基邻苯二甲酸(化合物1)为原料，在乙酸酐(Ac₂O)的作用下与甲基叔丁基醚反应生成3-硝基邻苯二甲酸酐(化合物2)；

(2)化合物2在硫酸(H₂SO₄)存在下与甲醇(MeOH)反应生成3-硝基邻苯二甲酸二甲酯(化合物3)。

(3)化合物3通过催化氢化还原得到3-氨基邻苯二甲酸二甲酯(化合物4)；

(4)化合物4在三氯氧磷存在下与N-苄氧羰基-4-哌啶酮缩合生成化合物5；

(5)化合物5在Boc₂O存在下催化氢化得到化合物6；然后化合物6与水合肼缩合生成化合物7。化合物7脱除保护剂得到化合物8(R＝H)；

(6)化合物5催化氢化脱除苄氧羰基保护基(Cbz)得到化合物9，然后该化合物9的氨基进行烷基化得到化合物10，化合物10在乙醇(EtOH)中和水合肼(Hydrazine hydrate)发生缩合得到一系列氮杂非那烯-3-酮衍生物(12-16,R依次为乙基、甲基、异丙基，苄基或者3-甲基-3-丁烯基)。上述氮杂非那烯-3-酮的衍生物作为PARP抑制剂抑制剂的应用。

通过对本发明所制备的氮杂非那烯-3-酮衍生物的活性进行筛选和初步研究，发现其对PARP酶具有明显的抑制作用，可用于制备PARP抑制剂。

附图说明

图1是SD大鼠分别单次静脉给予5mg/kg的A1、A3、A6后的平均血药浓度-时间曲线图；

图2是SD大鼠分别单次经口灌胃给予10mg/kg的A1、A3、A6后的平均血药浓度-时间曲线图。

具体实施例

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例1氮杂非那烯-3-酮衍生物的合成

(1)3-硝基邻苯二甲酸酐(化合物1)的合成

将3-硝基邻苯二甲酸(48.5g，0.23mol)加到乙酸酐(45mL)后混合，所得混合物搅拌回流1h。反应结束后，降温至80℃，加入100mL的甲基叔丁基醚后反应液继续搅拌直到降温至15℃。混合物过滤，固体用甲基叔丁基醚淋洗后在40℃烘干得到白色产物(36.7g，82％)；

(2)3-硝基邻苯二甲酸甲酯(化合物3)的合成

将步骤(1)合成的3-硝基邻苯二甲酸酐(15g，77.7mmol)溶于200mL甲醇中并加入5mL浓硫酸。混合液加热回流16h。待反应液冷却至室温后倒入冰水中。混合物过滤，固体用水淋洗后烘干得产物(13.1g，71％)；

(3)3-氨基邻苯二甲酸甲酯(化合物4)的合成

将步骤(2)得到的3-硝基邻苯二甲酸甲酯(18.1g,75.7mmol)溶于400mL乙醇并加入10％Pd/C(50％含水量，1.8g)。反应液在氢气环境下搅拌反应过夜。反应液过滤，滤饼用乙醇淋洗后有机相旋干得黄色固体产物(14.2g，90％)；

(4)化合物5的合成

将3-氨基邻苯二甲酸甲酯(化合物4)(8.3g，40mmol)，N-苄氧羰基-4-哌啶酮(10.31g,44mmol)和三氯氧磷(12.27g，7.3mL,)依次加到1,4-二氧六环中(280mL)后混合物在80℃下搅拌反应2h。混合物旋干后将油状粗品经柱层析纯化得到产物(14.6g，93％收率)；

(5)化合物6的合成

将化合物5(3.93g，10mmol)，Boc₂O(2.4g，11mmol)以及10％Pd/C(50％含水量，0.4g)的甲醇溶液(280mL)在氢气环境下搅拌反应过夜。反应液过滤，滤饼用甲醇醇淋洗后有机相旋干。粗产品经柱层析纯化，得黄色油状产物(3.52g，98％)；

(6)化合物7的合成

将化合物6(1.9g，5.3mmol)加入10mL无水乙醇后再加入一水水合肼(85％，4mL)。混合物回流搅拌直至反应完，待反应液冷却至室温后加入水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)并搅拌5分钟。有机层分离并干燥后旋干。粗产品经柱层析纯化后得到灰白色固体(0.20g，11％)；

(7)化合物8的合成

将化合物7(0.20g,0.6mmol)加入氯化氢甲醇溶液(4M，10mL)中后混合液在常温下搅拌反应4小时。将混合液旋干后得到灰白色固体产物(0.15g，92％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝12.08(s,1H),7.82-7.94(m,2H),7.63(d,J＝8.0Hz,1H),3.63-4.25(m,6H)。

(8)化合物12的合成

将步骤(4)得到的化合物5(6.0g，15.2mmol)以及10％Pd/C(50％含水量，0.6g)的甲醇溶液(80mL)在氢气环境下搅拌反应过夜。反应液过滤，滤饼用甲醇淋洗后有机相旋干。粗产品经柱层析纯化，得黄色油状产物9(2.8g，71％)；

化合物9(1.48g，5.7mmol)，碳酸钾(1.57g，11.4mmol)，碘乙烷(1.78g，11.4mmol)和乙腈(30mL)的混合物室温搅拌过夜。混合物过滤，滤液有经干燥后旋干，粗产物经柱层析纯化后得黄白色固体产物(1.10g，67％)。

将该产物(1.9g，5.3mmol)加入20mL无水乙醇后再加入一水水合肼(85％，4mL)。混合物回流搅拌直至反应完。待反应液冷却至室温后加入水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)并搅拌5分钟。有机层分离并干燥后旋干。粗产品经柱层析纯化后得到灰白色固体产物12(0.20g，14.6％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝9.71(s,1H),7.99(m,J＝8.0Hz,1H),7.82(m,1H),7.60(d,J＝8.0Hz,1H),3.83(m,2H),3.64(s,2H),2.94(m,2H),2.63(m,2H),1.22(t,J＝7.2Hz,3H)。

(9)化合物13-16的合成

化合物9(1.70g，6.5mmol)，甲醛水溶液(37％，6mL)，氰基硼氰化钠(4.24g，20mmol)，乙酸(0.5mL)和乙腈(30mL)的混合物室温搅拌1.5h。混合物过滤，滤液有经干燥后旋干，粗产物经柱层析纯化后得黄白色固体产物(1.32g，74％)。

将该产物(1.25g，4.57mmol)加入20mL无水乙醇后再加入一水水合肼(85％，4mL)。混合物回流搅拌直至反应完。待反应液冷却至室温后加入水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)并搅拌5分钟。有机层分离并干燥后旋干。粗产品经柱层析纯化后得到灰白色固体产物化合物13(0.18g，15.4％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝11.90(s,1H),7.72-7.86(m,2H),7.51-7.54(m,1H),3.49-3.71(m,4H),2.86(t,J＝5.6Hz,2H),2.37(s,3H)。

(10)化合物14的合成

化合物9(3.0g，11.57mmol)，碳酸钾(2.07g，15mmol)，溴代异丙烷(8.54g，69.4mmol)和DMF(30mL)的混合物在80℃搅拌5小时。混合物过滤，滤液有经干燥后旋干，粗产物经柱层析纯化后得黄白色固体产物(1.84g，53％)；将该产物(1.80g，5.97mmol)加入30mL无水乙醇后再加入一水水合肼(85％，5mL)。混合物回流搅拌直至反应完。待反应液冷却至室温后加入水(30mL)和乙酸乙酯(30mL)并搅拌5分钟。有机层分离并干燥后旋干。粗产品经柱层析纯化后得到白色固体产物-化合物14(0.27g，15.9％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝11.89(s,1H),7.72-7.86(m,2H),7.50(d,J＝7.6Hz,1H),3.61-3.66(m,4H),2.86-2.95(m,3H),1.07(d,J＝6.4Hz,6H)。

(11)化合物15的合成

化合物9(1.29g，5mmol)，碳酸钾(1.38g，10mmol)，氯化苄(0.83g，6.5mmol)和乙腈(20mL)的混合物室温搅拌5小时。混合物过滤，滤液有经干燥后旋干，粗产物经柱层析纯化后得黄白色固体产物(1.25g，71.5％)。

将该产物(1.24g，3.55mmol)加入20mL无水乙醇后再加入一水水合肼(85％，4mL)。混合物回流搅拌直至反应完。待反应液冷却至室温后加入水(30mL)和乙酸乙酯(30mL)并搅拌5分钟。有机层分离并干燥后旋干。粗产品经柱层析纯化后得到白色固体产物-化合物15(0.22g，18.7％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝11.92(s,1H),7.71-7.84(m,2H),7.31-7.49(m,6H),3.70(m,4H),3.52(s,2H),2.91(m,2H)。

(12)化合物16的合成

化合物9(4.0g，15.4mmol)，碳酸钾(4.28g，31mmol)，3-甲基-3-丁烯基甲磺酸酯(3.8g，23.1mmol)和乙腈(40mL)的混合物在在60℃搅拌5小时。混合物过滤，滤液有经干燥后旋干，粗产物经柱层析纯化后得黄白色固体产物(3.12g，62％)。

将该产物(3.10g，9.47mmol)加入50mL无水乙醇后再加入一水水合肼(85％，6mL)。混合物回流搅拌直至反应完。待反应液冷却至室温后加入水(40mL)和乙酸乙酯(40mL)并搅拌5分钟。有机层分离并干燥后旋干。粗产品经柱层析纯化后得到白色固体产物-化合物16(0.45g，15.4％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝11.88(s,1H),7.71-7.85(m,2H),7.52(m,1H),4.76(m,2H),3.57-3.69(m,4H),2.94(s,2H),2.62(d,J＝7.2Hz,2H),2.28(d,J＝8.4Hz,2H),1.75(s,3H)。

实施例2氮杂非那烯-3-酮衍生物的活性检测

1.PARP1抑制活性的测定

1.1材料和方法

通用PARP比色法分析试剂盒(美国Trevigen公司)

1.2PARP1抑制活性测定结果

2.A1、A3、A6在SD大鼠体内的初步药代动力学研究

参考化合物对PARP酶抑制率的IC₅₀值，选取A1、A3和A6(其中：A1＝化合物8；A2＝化合物12；A3＝化合物13；A4＝化合物14；A5＝化合物15；A6＝化合物16)三个受试化合物进行药代动力学实验。

2.1材料和方法

2.1.1仪器

Agilent 1200液相色谱仪，API 4000Qtrap三重四级杆液质联用仪

2.1.2受试动物

健康SPF级SD雄性大鼠，18只，体重180～220g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号为：SCXK(沪)2013-00016。

2.1.3实验过程

实验设置静脉组、灌胃组，实验前动物禁食12-14h，考察受试化合物在静脉血中的浓度，静脉血通过眼眶采血，EDTAK2抗凝；血液样本采集后置于冰上，并于30分钟之内离心分离血浆(离心条件：5000转/分钟，10分钟，室温)。分析前存放于–80℃。

静脉组通过尾静脉注射单次给予5mL/kg的受试化合物；灌胃组单次口服给予10mL/kg的受试化合物。静脉组血样采集时间点为：给予受试化合物前(0hr)和给予受试化合物后15min，30min，1h，2h，4h，6h，8h和24h；灌胃组采集时间点为：给予受试物前(0hr)和给予受试物后30min，1h，2h，4h，6h，8h和24h。

2.1.4测定条件

液相条件：色谱柱：Agilent Eclipse plus-C18(4.6×150mm,5.0μm)，流动相：0.1％甲酸水溶液(A)/0.1％甲酸乙腈溶液(B)；梯度洗脱，流速：1.00mL/min(分流v:v＝1:1)；进样量10μL。

质谱条件：选用电喷雾离子源(ESI)，选用正离子模式(Postive)下多重离子反应监测(MRM)。

2.1.5标准品溶液配制

精密称取A1、A3、A6适量，分别用DMSO配制成1.00mg/mL储备液。储备液按梯度稀释后获得浓度分别为10000,5000,2000,1000,500,100,50.0,20.0ng/mL的标准工作液，质控工作液浓度为低(30ng/mL)、中(500ng/mL)、高(8000ng/mL)。

2.1.6血浆样品处理方法

取血浆样品10μL，加入100μL维拉帕米内标溶液，涡旋60秒后离心(12000rpm,3min)；取上清液70μL移至装有等体积水的96孔进样板上，LC-MS/MS进样分析，进样量为10μL。

2.1.7数据处理

数据采用WinNonlin 6.3药动学计算软件，以非房室模型计算主要药动参数。

2.2方法学验证

按照化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则对SD大鼠血浆进行方法学验证，分别从方法专属性、标准曲线线性、精密度和准确度、定量下限、大鼠血浆稀释十倍准确性、基质效应及提取回收率等方面进行了考察,均符合生物样本分析要求。

2.3药代动力学结果

图1SD大鼠分别单次静脉给予5mg/kg的A1、A3、A6后的平均血药浓度-时间曲线图；图2SD大鼠分别单次经口灌胃给予10mg/kg的A1、A3、A6后的平均血药浓度-时间曲线图。

表1 SD大鼠分别单次静脉给予5mg/kg的A1、A3、A6后的药动参数

表2 SD大鼠分别单次经口灌胃给予10mg/kg的A1、A3、A6后的药动参数

从图1、图2，表1、表2的药时曲线图和药动参数结果可知，化合物A1、A3、A6在SD大鼠体内的暴露量水平(AUC_0-t)均较高，灌胃给药后，在15min内均可检测到受试化合物，吸收迅速(t_max较短，仅需0.25-0.5h即可达到血药浓度峰值)且作用时间长，特别是化合物A1，其口服生物利用度为67.5±9.5％。

本发明合成了一系列氮杂非那烯-3-酮衍生物衍生物，通过核磁共振波谱仪进行了结构鉴定,并进行PARP酶的活性测定。结果说明，所得氮杂非那烯-3-酮衍生物具有很高的抑制PARP酶的活性。

Claims

1.如式(Ⅰ)所示的氮杂非那烯-3-酮的衍生物：

2.权利要求1所述的氮杂非那烯-3-酮的衍生物的制备方法，其特征在于工艺如下：

3.权利要求2所述的氮杂非那烯-3-酮的衍生物的制备方法，其特征在于：

(1)以3-硝基邻苯二甲酸为原料，在乙酸酐的作用下反应生成3-硝基邻苯二甲酸酐；

(2)3-硝基邻苯二甲酸酐在硫酸存在下与甲醇反应生成3-硝基邻苯二甲酸二甲酯；

(3)3-硝基邻苯二甲酸二甲酯通过催化氢化还原得到3-氨基邻苯二甲酸二甲酯；

(4)3-氨基邻苯二甲酸二甲酯在三氯氧磷存在下与N-苄氧羰基-4-哌啶酮缩合生成化合物5；

(5)化合物5在Boc₂O存在下催化氢化得到化合物6；然后化合物6与水合肼缩合生成化合物7；化合物7脱除保护基得到化合物8；

(6)化合物5催化氢化脱除苄氧羰基保护基Cbz得到化合物9，然后化合物9的氨基进行烷基化得到化合物10，化合物10在乙醇中和水合肼发生缩合得到一系列氮杂非那烯-3-酮的衍生物。

4.权利要求1所述的氮杂非那烯-3-酮的衍生物用于制备作为PARP抑制剂治疗肿瘤的药物的用途。