CN104936616A - 针对登革病毒的疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
疫苗组合物，其包含至少一种基于登革病毒(DV)衣壳蛋白的抗原和标识为SEQ ID NO.1的寡核苷酸。包含由DV2的衣壳与相同血清型的包膜蛋白的结构域III形成的融合蛋白(添加有标识为SEQ ID NO.1的寡核苷酸)的疫苗组合物在小鼠中产生最高水平的细胞免疫应答和保护作用，相比于用添加有先前所报道的具有潜在辅佐能力的寡核苷酸的相同抗原的制剂所产生的那种而言。在非人灵长类中证明了包含SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的组合物的效力。这些组合物可以是单价的、二价的和四价的，并且可以在各种不同的免疫接种制度中进行组合以用于诱导针对四种病毒血清型的功能性免疫应答。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和制药工业领域，特别地涉及针对登革病毒(DV)的疫苗制剂的获得，所述疫苗制剂基于重组的蛋白质抗原和具有确定序列的寡核苷酸。
现有技术
登革热是影响人群体的由最广泛散布的节肢动物所传播的病毒性疾病。每年报告5千万至1亿个登革热病例，其中500,000个导致该疾病的更严重的形式，其称为登革出血热(Guzman等人,Lancet Infect.Dis.,2002,2:33-42)。该疾病的致病因子为DV，其属于黄病毒科(Flaviviridae)，黄病毒属(flavivirus)。DV是由四种血清型形成的病毒复合体。它是一种有包膜病毒，其脂质膜包含其三种结构蛋白中的两种：包膜蛋白和膜蛋白。该脂蛋白性质的包膜围绕由其结构蛋白中的第三种即衣壳蛋白所构成的二十面体核衣壳(Leyssen等人,Clin.Microbiol.Rev.,2000,13:67-82)。
在最近几十年中，这些病毒的感染的全球扩张已使得开发有效疫苗成为公众健康的迫切问题。该目标受到多种因素的限制。首先，被一种血清型感染不诱导针对其余血清型的长期交叉保护(Leyssen等人,Clin.Microbiol.Rev.,2000,13:67-82)，并且同时，异型继发感染对于该疾病的严重形式的发展来说是主要的风险因素(Guzman等人,Lancet Infect.Dis.,2002,2:33-42；Mongkolsapaya等人,Nat.Med.,2003,9:921-927)。因此，理想的针对DV的疫苗应当诱导针对四种病毒血清型(DV1、DV2、DV3和DV4)的长期保护性免疫。
目前处于最先进开发阶段的疫苗候选物经由通过在细胞培养物中连续传代而减毒的病毒毒株或经由重组方式来建立。这些候选物的根本限制为在四价制剂中四种血清型之间的病毒干扰，因此使得控制诱导出等价的免疫应答非常复杂，并且必须在它们之间以长的时间间隔施用疫苗剂量(Bhamarapravati等人,Vaccine,2000,18:44-47；Kanesa-Thasan等人,Vaccine,2001,19:3179-3188；Morrison等人,J.Infect.Dis.,2010,201:370-377)。此外，由于其作为活病毒的性质，不可能在小于1岁的儿童中施用它们。
作为具有吸引力的备选方案，已展开了一系列基于亚单位疫苗的临床前研究。该分析研究具有三个相对于用减毒活病毒进行疫苗接种而言的根本优点：1)其是潜在地安全的疫苗；2)由于免疫原的非复制性性质，不应当发生病毒干扰现象；和3)可以提出短的疫苗接种方案，这与在施用减毒活病毒时所发生的相反，后者在疫苗剂量之间需要长的间隔以取得增强效果。
最具有前景的亚单位疫苗候选物之一是由Hawaii Biotech/Merck公司所开发的那种(Hombach,Rev.Panam.Salud Publica.,2007,21:254-260)。它是由在昆虫细胞中表达的病毒包膜的四种蛋白形成的候选物。已经在小鼠和猴子中评价了单价和四价制剂，其中具有与用减毒活病毒所获得的相当的免疫原性结果(Clements等人,Vaccine,2010,28:2705-2715)。然而，在单价制剂的情况下，需要强有力的尚未被批准用于在人中使用的佐剂，以取得适当的免疫应答。而在非人灵长类中试验的四价制剂，除了具有在人中尚未被批准的佐剂外，还包含与人内皮细胞具有可能的同源性的DV2的NS1蛋白，并且可能引起自身免疫现象。另外，不存在关于诱导出细胞介导的免疫应答的数据，细胞介导的免疫应答是最近鉴定出的具有针对登革热的保护作用的免疫系统分支(Gil等人,Viral Immunol.,2009,22:23-30；Yauch等人,J.Immunol.,2009,182:4865-4873；Yauch等人,J.Immunol.,2010,185:5405-5416)。
通过保持与亚单位疫苗相关的优点并同时寻找使用氧化铝作为基础佐剂的更具免疫原性的制剂，一组古巴研究者开发出了基于DV的衣壳蛋白和包膜蛋白的结构域III(DomIII)的工作方针(Guzman等人,Exp.Rev.Vaccines,2010,9:137-147)。
DV的衣壳蛋白经证明在病毒粒子的装配中是必不可少的，并且其主要功能为保护病毒基因组。其分子量为9至12kDa(112-127个氨基酸)，并且其具有明显的碱性特征，因为其氨基酸的25％是精氨酸和赖氨酸。该蛋白质完全位于病毒粒子的结构的内部，没有任何暴露的区域(Kuhn等人,Cell,2002,108:717-725)，这使得其对于成为疫苗的一部分来说是极具吸引力的，因为从理论上讲，它不应当是免疫放大性抗体的靶标。另一方面，在其序列中已描述了数个关于人的CTL表位，这使得能够诱导针对该病毒的有效的细胞免疫应答(Gagnon等人,J.Virol.,1996,70:141-147；Gagnon等人,J.Virol.,1999,73:3623-3629)。
虽然存在几项对于该蛋白质的结构特征的研究，但是直到2007年才首次在小鼠中评价了DV的衣壳蛋白的免疫原性。在该研究中，通过重组方式在大肠杆菌(Escherichia coli)中获得了DV2的衣壳蛋白。在半纯化过程之后，在小鼠中实施免疫接种方案，并且在用感染性DV2进行颅内攻击后在小鼠中获得了部分保护，其中没有检测到中和抗体(Lazo等人,Vaccine,2007,25:1064-1070)。然后，以实验室规模开展了所述分子的纯化和体外聚集过程，并且再重新在小鼠中进行试验以测量保护性免疫应答，以及与其功能性有关的免疫学机制(Lopez等人,Arch.Virol.,2009,154:695-698)。免疫原性分析揭示了通过干扰素γ(IFN-γ)分泌所测量的细胞免疫应答的诱导，所述干扰素γ分泌来自接受了所述蛋白质的聚集形式的小鼠的脾细胞。所述分泌依赖于CD4+和CD8+细胞。而在用感染性DV2进行攻击后，在用所述蛋白质的聚集变化形式进行免疫接种的动物中获得了显著的保护，并且所述保护也依赖于CD4+和CD8+细胞(Gil等人,Int.Immunol.,2009,21:1175-1183)。基于上面所描述的结果，那么提出了在同一个遗传构建体中将DV2的衣壳蛋白与相同病毒血清型的包膜蛋白的DomIII区域相组合。DomIII已被广泛地描述为牵涉与细胞受体结合的区域(Chen等人,J.Virol.,1996,70:8765-8772)，并且另外，已证实了在用包含所述区域的融合蛋白进行免疫接种的小鼠中诱导了中和性和保护性免疫应答(Crill等人,J.Virol.,2001,75:7769-7773；Hermida等人,J.Virol.Methods,2004,115:41-49；Simmons等人,Am.J.Trop.Med.Hyg.,2001,65:159-161)。而于在非人灵长类中进行的研究之中证实了唯有通过使用弗氏佐剂诱导了功能性的保护性免疫应答(Hermida等人,Vaccine,2006,24:3165-3171)。
病毒的衣壳区域与病毒包膜的DomIII的联合允许在同一个分子中存在两个潜在保护性的区域，其能够同时诱导中和抗体(DomIII)和细胞免疫应答(衣壳)。如此，获得了命名为DIIIC-2的遗传构建体(与衣壳蛋白的N-末端区域相融合的DomIII，血清型2)，其在大肠杆菌中进行表达；并且以实验室规模纯化了所得的蛋白质，并使其经历用具有未知序列的寡核苷酸的混合物进行聚集的过程。在于小鼠中施用三个剂量后，可以检测到抗病毒的和中和性的抗体的存在。类似地，可以在经免疫接种的动物的脾细胞中测量到IFN-γ分泌，其中在接受了聚集变化形式的动物中检测到显著的水平。与细胞免疫应答相一致，在颅内攻击后获得了显著的保护，并且所述保护依赖于在免疫接种过程期间所诱导的CD4+和CD8+细胞(Valdes等人,Virology,2009,394:249-258)。这些结果整体地允许选择蛋白DIIIC-2的聚集形式用于下面的在非人灵长类中的研究。
第一项在非人灵长类中的研究在事先用DV2进行感染的动物中进行，以认识该蛋白质的增强能力。正如所预期的那样，通过在病毒感染之后三个月施用蛋白DIIIC-2，动物发展出了高水平的对于同源病毒的抗病毒中和抗体，这表明在所述重组蛋白中存在功能性表位(Valdes等人,Clin.Vaccine Immunol.,2011,18:455-459)。
在本发明之前已经知晓，添加寡核苷酸以形成蛋白DIIIC-2的聚集变化形式有利于在小鼠中的细胞免疫应答和针对同源病毒的保护(Valdes等人,Virology,2009,394:249-258)。然而，不知道所使用的寡核苷酸的序列是否影响所诱导的免疫应答的质量。
根据前面所提及的基础知识，开发能够诱导针对该病原体的四种血清型的安全且有效的免疫应答的针对DV的疫苗是一个尚未解决的问题。本发明正是旨在该目标。
发明描述
本发明通过提供疫苗组合物而解决了上面提出的问题，所述疫苗组合物的特征在于，其包含：a)至少一种包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的抗原，和b)标识为SEQ ID NO.1的寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，所述疫苗组合物的特征在于，所述包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的抗原为包含所述蛋白质的氨基酸1至99的重组抗原。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包含嵌合抗原，所述嵌合抗原包含衣壳蛋白的氨基酸1至99和病毒包膜蛋白的DomIII区域的氨基酸286至426。在一个特别的实施方案中，所述重组抗原选自SEQ ID NO.5(抗原DIIIC-1)、SEQ ID NO.6(抗原DIIIC-2)、SEQ ID NO.7(抗原DIIIC-3)和SEQ ID NO.8(抗原DIIIC-4)。
为了证实是否依赖于用于蛋白质聚集的寡核苷酸的类型才诱导了最佳的免疫应答，选择相应于血清型2的组合物作为模型。为此，在几种在现有技术中所描述的具有已知序列的寡核苷酸存在下，使蛋白DIIIC-2(包含DV2的病毒包膜蛋白的DomIII和衣壳蛋白的氨基酸1至99的嵌合抗原)沉淀。已知这些寡核苷酸中的一些具有辅佐能力(Klinman,Int.Rev.Immunol.2006,25:1-20；Vollmer,Int.Rev.Immunol.,2006,25:125-134)。此外，还包括通过所提及的寡核苷酸中的两种的融合而形成的新的寡核苷酸(Krug等人,Eur.J.Immunol.,2001,31:2154-2163；Verthelyi等人,J.Immunol.,2001,166:2372-2377)。在小鼠中评价了免疫原性之后，可以证明新的寡核苷酸(SEQ ID NO.1)有利于最佳的细胞应答(通过IFN-γ分泌来测量)，因此选择其用于在病毒性脑炎的小鼠模型中测定针对致死性同源病毒攻击的保护能力。作为结果而获得了，通过存活百分比和通过在脑中病毒血症水平的降低，佐以氧化铝的具有SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的DIIIC-2制剂均在小鼠中产生了强有力的保护性免疫应答。
因此，在本发明中首次证实，寡核苷酸的性质在细胞效应免疫应答的诱导方面并因此在重组蛋白的保护能力方面是关键性的。虽然试验了数种寡核苷酸，但其中仅一种(其序列被标识为SEQ ID NO.1的寡核苷酸)经证明在诱导细胞免疫应答和保护方面是最好的。测试了数种具有各种不同序列的合成寡核苷酸，其包含或不包含CpG基序并且在其结构中具有磷酸二酯键。该最后一个要素不同于在文献中所描述的具有免疫增强活性的寡核苷酸，因为用于合成这些寡核苷酸的键是硫代磷酸酯类型的，目的是保护其免于被核酸外切酶降解。另外，测试了数种大小，例如19、20和39个碱基。该最后一个具有39个碱基的寡核苷酸包含许多CpG基序，并且这些CpG基序在该序列内处于这样的布置中，所述布置不允许将该寡核苷酸包括在现有技术中对于具有免疫增强活性的寡核苷酸所描述的分类之中。
另一方面，在所有情况下，将这些分子用于重组抗原的聚集，因此添加最小数量的所述分子。这构成了相对于用作免疫系统刺激剂的寡核苷酸而言的另一个差异要素，因为对于行使该功能来说需要大量的寡核苷酸(Riedl等人,J.Immunol.,2002,168:4951-4959)。
如在前面所说明的，在小鼠中的免疫学评价之后，证实了，出人意料地，其序列被标识为SEQ ID NO.1的寡核苷酸显著地增强了用重组蛋白DIIIC-2所诱导的细胞的和保护性的免疫应答，其中相对于其余所使用的寡核苷酸而言具有明显的差异。
紧接着，着手在登革热阴性的非人灵长类中检验该构思。为此，动物接受四个剂量的佐以氧化铝的具有SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的DIIIC-2聚集制剂。另外，包括一组用重组抗原进行免疫接种的动物，所述重组抗原包含DV2的衣壳蛋白的氨基酸1至99，并且通过与SEQ ID NO.1所示寡核苷酸一起温育而形成核衣壳样颗粒(NLPs-2)。测定了抗病毒的和抗重组蛋白的抗体应答(除了该应答的功能性外)，这通过借助于病毒噬斑数目减少的中和试验来进行，其中使用各种不同的DV2毒株和各种不同的细胞系用于该试验。另一方面，通过在用感染性DV2体外刺激外周血单核细胞(PBMC)后测定IFN-γ分泌水平，评价了所产生的细胞应答。然后，用DV2攻击动物，并且测定在血液中病毒的存在。作为结果而获得了，该蛋白质在猴子中诱导了具有稳固的中和活性的抗体应答(其通过六个不同的系统来测量)(100％的血清转变)，以及适当的细胞应答(其通过IFN-γ分泌来测量)，在用该病毒进行攻击之前和之后。与免疫原性的结果相一致，经疫苗接种的动物显著地受到针对病毒攻击的保护，因为在三只经免疫接种的动物中的两只之中，在攻击后的任何一天都未分离出病毒，并且第三只仅具有一天的病毒血症，其中具有低于10个噬斑形成单位/毫升(pfu/mL)的值。
在先前为登革热阴性的非人灵长类中进行的该研究是关于包含DV的病毒衣壳区域的重组蛋白的保护能力的首次研究。该发现使得能够将这些条件外推至其余的所获得的相应于血清型1、3和4的嵌合蛋白。
紧接着，设计并获得了相应于血清型1、3和4的重组蛋白，它们分别被命名为DIIIC-1、DIIIC-3和DIIIC-4。所有这些分子都以适当的表达百分比在大肠杆菌中获得。而它们进行了纯化，并被针对同源血清型的特异性鼠类多克隆抗体所识别。另外，可以测定在每种蛋白质中二硫桥的正确形成，这通过质谱法(对于DIIIC-1、DIIIC-2、DIIIC-3和DIIIC-4)和通过在DomIII的链内二硫桥的半胱氨酸的还原-羧甲基化之后针对鼠类多克隆血清的识别的丧失(对于DIIIC-1、DIIIC-2和DIIIC-4)来进行。
在本发明中所包括的研究之中，可以证实这些血清型(1、3和4)的DIIIC嵌合蛋白(其是首次描述的)也在小鼠中诱导针对同源血清型的功能性和保护性的免疫应答。另外，证明了事先用SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行配制的并佐以氧化铝的所述四种嵌合蛋白的混合物在小鼠中诱导了对于所述四种血清型的细胞的和体液的保护性应答，而不存在抗原竞争现象。
通过添加SEQ ID NO.1所示寡核苷酸而使得四种嵌合蛋白DIIIC-1、DIIIC-2、DIIIC-3和DIIIC-4聚集，然后在氧化铝存在下进行辅佐，以用于其后来的在小鼠中的评价。在施用三个剂量后，在100％的经免疫接种的动物中可以检测到针对所述四种血清型的抗病毒抗体的存在。类似地，在这些小鼠的血清中检测到针对所述四种血清型而测量的中和活性。与该结果相一致，通过用血清型1和4进行颅内病毒攻击，在这两种情况下都获得了显著的保护，这因此在小鼠中通过所试验的单价和四价制剂的功能性而证明了该构思。
四价制剂还能够在猴子中诱导功能性免疫应答(体液和细胞类型的)。为了评价该制剂的免疫原性，着手在登革热阴性的非人灵长类中进行第二个试验。动物按照研究组通过各种不同途径以三次接受四价制剂，并且在最后一个剂量后一个月测定所诱导的体液和细胞免疫应答。作为结果而获得了，在100％的猴子中产生了针对所有病毒血清型的中和抗体的抗病毒免疫应答。细胞免疫应答试验也揭示了在所有所研究的动物中阳性应答的诱导。
该工作整体地证实了用SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行聚集的四种DIIIC蛋白的针对DV的四种血清型的保护能力。
本发明还包括疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的嵌合抗原中的两种。本发明的目标还在于疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含标识为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8的四种嵌合抗原。
在另一个方面，本发明提供了核酸，其特征在于标识为SEQ IDNO.1的序列。正如在本发明中所充分证明的，所述核酸对于增加针对包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的疫苗抗原的免疫应答来说是有用的。在本发明的一个实施方案中，证实了标识为SEQ ID NO.1的核酸用于增加针对包含DV衣壳蛋白的氨基酸1至99的重组抗原的免疫应答的用途。在一个特别的实施方案中，揭示了标识为SEQ ID NO.1的核酸用于增加针对标识为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8的嵌合抗原的免疫应答的用途。
另外，本发明的目标还在于用于诱导针对DV的免疫应答的方法，其特征在于，向受试者施用疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：a)至少一种包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的抗原，和b)标识为SEQID NO.1的寡核苷酸。在一个方面，本发明提供了用于诱导针对DV的免疫应答的方法，其特征在于，施用包含重组抗原的组合物，所述重组抗原包含所述蛋白质的氨基酸1至99。在所述方法的一个实施方案中，所述重组抗原为具有选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7和SEQ ID NO.8的氨基酸序列的嵌合抗原。
在本发明中，在小鼠中进行了研究，目的是降低在免疫接种方案中每种DIIIC蛋白的总剂量。为此，施用各种不同的二价制剂(其顺次地进行施用)，并且施用第三个加强剂量。作为结果而获得了，对于4种病毒血清型中的任何一种，在所试验的组之间不存在统计学上显著的差异，这表明通过顺次施用二价制剂并用包括SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的DIIIC四价制剂进行加强，可能获得与当施用三个剂量的具有SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的DIIIC四价制剂时相同的免疫原性水平。因此，本发明的目标还在于用于诱导针对DV的免疫应答的方法，其中在二价组合物中顺次施用包含标识为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的嵌合抗原的疫苗组合物。本发明还提供了这样的方法，其中另外还施用一个加强剂量，其包括标识为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8的四种嵌合抗原的四价组合物。
正如在实施例中所证实的，包含至少一种包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的抗原和标识为SEQ ID NO.1的寡核苷酸的组合物通过各种不同的途径是免疫原性的，因此在本发明的方法中，所述疫苗组合物通过本领域技术人员所熟知的途径(例如，皮下、真皮内或肌内途径)来进行施用。
附图简述
图1.其为在经免疫接种的动物中抗病毒抗体应答的图。在Y轴上显示了log抗-DV2滴度，和在X轴上显示了接受各种不同变化形式的DIIIC-2制剂的动物组。借助于放大的捕获ELISA来测定滴度，其中使用病毒作为抗原。借助于Kruskal-Wallis检验来进行统计学分析和借助于Dunn检验来进行后验多重比较。不同的字母指明了在组之间的显著的统计学差异。数据呈现为平均值±标准偏差。
图2.其为这样的图，所述图显示了在体外刺激与DV2或与阴性对照制备物(模拟物)一起培养的来自用各种不同DIIIC-2制剂进行免疫接种的小鼠的脾细胞后，通过ELISA测量的IFN-γ浓度。在Y轴上显示了IFN-γ的浓度(pg/mL)。在X轴上显示了接受各种不同DIIIC-2制剂的组。在每套点上面所显现的百分比表示应答动物的百分比。虚线指明了这样的值，在所述值以上被认为是阳性应答。使用单分类ANOVA来进行统计学分析，并且为了组之间的多重比较，进行Tukey检验。不同的字母指明了在组之间的显著的统计学差异。数据呈现为平均值±标准偏差(n＝8)。
图3.其为这样的图，所述图显示了针对DV2的保护试验。A.在用DV2的致死性毒株进行颅内攻击后，经免疫接种的小鼠的存活曲线。Y轴表示存活百分比和X轴表示在颅内攻击后的观察时间。B.在攻击后7天，从被感染的脑开始进行测量的在VERO细胞中的病毒定量。Y轴表示在将被感染的小鼠的脑匀浆物涂铺在VERO细胞上后获得的pfu数目/mL。X轴表示研究组。对于存活曲线，按照Log-rank存活检验来进行统计学分析。不同的字母指明了在组之间的显著的统计学差异。数据代表了两个独立的实验(n＝10)。对于病毒载量，借助于Kruskal-Wallis检验来进行统计学分析和借助于Dunn检验来进行后验多重比较。不同的字母指明了在组之间的显著的差异。数据呈现为平均值±标准偏差(n＝5)。虚线指明了100pfu/ml。
图4.其为这样的图，所述图显示了通过ELISA测量的在猴子中产生的抗-DIIIC-2抗体的动力学。在Y轴上显示了Log滴度，和在X轴上显示了在试验期间以天计的时间。黑色箭头指明了每次免疫接种的时刻。
图5.其为这样的图，所述图显示了在用安慰剂制备物(A)、用聚集的蛋白DIIIC-2(B)或用NLPs-2(C)进行免疫接种的猴子中通过捕获ELISA测量的抗-DV抗体的动力学。Y轴显示了log 1/滴度，和在X轴上显示了在试验期间以天计的时间。黑色箭头指明了每次免疫接种的时刻，和虚线箭头指明了病毒攻击的那一天。
图6.其为这样的图，所述图显示了在体外刺激来自接受了安慰剂制备物或蛋白DIIIC-2的猴子的外周血单核细胞后，通过ELISA测量的IFN-γ浓度。在Y轴上显示了IFN-γ的浓度(pg/mL)，和在X轴上显示了试验进行的时间。将来自经免疫接种的猴子的PBMC与DV2或与阴性对照制备物(模拟物)一起进行培养。数据呈现为平均值±标准偏差(n＝3)。虚线指明了这样的值，在所述值以上被认为是阳性应答。
图7.其为这样的图，所述图显示了通过直接涂铺在VERO细胞上来测量的在用安慰剂制剂(A)、聚集的蛋白DIIIC-2(B)或NLPs-2(C)进行免疫接种的组的猴子的血清中存在的病毒载量。右边的轴相应于在猴子2、5和9中检测到的载量(虚线)。左边的轴相应于在其余动物中检测到的载量。在X轴上显示了攻击后的时间(以天计)。
图8.用于获得遗传构建体pDIIIC-1、pDIIIC-2、pDIIIC-3和pDIIIC-4的克隆策略。
图9.其为这样的图，所述图显示了通过由ELISA测定的在还原和非还原条件下DIIIC嵌合蛋白被具有高的对于同源血清型的中和滴度的小鼠的多克隆抗体识别的水平。在Y轴上显示了吸光度值，和在X轴上显示了所试验的蛋白质。
图10.其为在最后一次免疫接种后15天时测量的在经免疫接种的动物中抗病毒抗体应答的图。在Y轴上显示了log抗-DV滴度，和在X轴上显示了接受每种制剂的动物组。(A)抗-DV1抗体应答，(B)抗-DV2抗体应答，(C)抗-DV3抗体应答，和(D)抗-DV4抗体应答。借助于放大的捕获ELISA来测定滴度，其中使用每种病毒作为抗原。借助于Kruskal-Wallis检验来进行统计学分析，和借助于Dunn检验来进行后验多重比较。不同的字母指明了在组之间的统计学上显著的差异。数据呈现为平均值±标准偏差(n＝10)。
图11.其为这样的图，所述图显示了在体外刺激来自用DIIIC单价和四价制剂(其包括SEQ ID NO.1所示寡核苷酸)或用安慰剂制剂进行免疫接种并且用每种DIIIC蛋白进行刺激的小鼠的脾细胞后，通过ELISA测量的IFN-γ浓度。在Y轴上显示了IFN-γ的浓度(pg/mL)。在X轴上显示了研究组。数据呈现为平均值±标准偏差。
图12.其为这样的图，所述图显示了在用DV1病毒(A)和DV4病毒(B)的致死性毒株进行颅内攻击后，经免疫接种的小鼠的存活曲线。Y轴表示存活百分比，和X轴表示在颅内攻击后的观察时间。按照Log-rank存活检验来进行统计学分析。不同的字母指明了在组之间的显著的统计学差异。数据代表了两个独立的实验(n＝9)。
图13.其为这样的图，所述图显示了通过使用皮下(SC)、真皮内(ID)和肌内(IM)途径，在非人灵长类中在三个剂量的具有SEQID NO.1所示寡核苷酸的DIIIC四价制剂后，借助于捕获ELISA测定的针对DV的四种血清型的抗病毒抗体应答。在Y轴上显示了Log抗-DV滴度，和在X轴上显示了动物组。
图14.其为这样的图，所述图显示了在非人灵长类中在三个剂量的具有SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的DIIIC四价制剂后，从用DIIIC重组蛋白进行体外刺激的外周血淋巴细胞开始的产生IFN-γ的细胞的频率。自Y轴上显示了以“点数/mL”表示的产生IFN-γ的细胞的频率。在X轴上显示了动物组。
图15.其为在最后一次免疫接种后15天时测量的在经免疫接种的动物中抗病毒抗体应答的图。在Y轴上显示了log抗-DV滴度，和在X轴上显示了接受每种制剂的动物组。(A)抗-DV1抗体应答，(B)抗-DV2抗体应答，(C)抗-DV3抗体应答，和(D)抗-DV4抗体应答。借助于放大的捕获ELISA来测定滴度，其中使用每种病毒作为抗原。借助于Kruskal-Wallis检验来进行统计学分析，和借助于Dunn检验来进行后验多重比较。不同的字母指明了在组之间的统计学差异。数据呈现为平均值±标准偏差(n＝10)。
图16.其为这样的图，所述图显示了在体外刺激来自用每种DIIIC蛋白进行免疫接种和刺激的小鼠的脾细胞后，通过ELISA测量的IFN-γ浓度。在Y轴上显示了IFN-γ的浓度(pg/mL)。在X轴上显示了研究组。数据呈现为平均值±标准偏差(n＝5)。
实施方式的详细描述/实施例
实施例1.用各种不同的具有确定序列的寡核苷酸进行聚集的蛋白DIIIC-2在小鼠中的免疫原性的评价
基于通过使用被随机选择用于蛋白质聚集的具有未知序列的大约50b的寡核苷酸的混合物用蛋白DIIIC-2在小鼠中进行构思检验(Valdes等人,Virology,2009,394:249-258)，试验了各种不同的具有确定序列的寡核苷酸。与在文献中关于具有辅佐能力的寡核苷酸所报道的不同，在本研究中所试验的寡核苷酸仅通过磷酸二酯键形成。此外，还包括两种长度为39个碱基的寡核苷酸，其按照文献中的定义并不归类于发挥辅佐活性的寡核苷酸之中。
所试验的寡核苷酸为下列那些：
寡核苷酸K3(SEQ ID NO.2)：
ATCGACTCTCGAGCGTTCTC，20聚体(其包含对于人和猴子的CpG基序；磷酸二酯键的主链)；
寡核苷酸2216(SEQ ID NO.3)：
GGGGGACGATCGTCGGGGG，19聚体(其包含对于小鼠和猴子的CpG基序；磷酸二酯键的主链)；
混合型寡核苷酸(SEQ ID NO.1)：
ATCGACTCTCGAGCGTTCTCGGGGGACGATCGTCGGGGG，39聚体(其包含寡核苷酸K3和2216的序列；磷酸二酯键的主链)；
寡核苷酸OriC(SEQ ID NO.4)：
CATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTG，39聚体(磷酸二酯键的主链)；
poly I:C，RNA主链：
ICICICICICICICICICICICICIC，26聚体(磷酸二酯键的主链)；
poly I:C，DNA主链：
ICICICICICICICICICICICICIC，26聚体(磷酸二酯键的主链)。
采用允许50％的蛋白质沉淀的蛋白质质量与寡核苷酸质量的比例来进行聚集反应，从而以便将下述参数作为常量：在制剂中相等量的可溶性的蛋白质和聚集的蛋白质。
在BALB/c小鼠中评价了用各种不同的寡核苷酸进行聚集的蛋白DIIIC-2。组为下列那些：
组1：可溶性的DIIIC-2(未聚集的并且没有寡核苷酸)(20μg蛋白质)；
组2：DIIIC-2与混合型寡核苷酸(SEQ ID NO.1)(20μg蛋白质+2μg寡核苷酸)；
组3：DIIIC-2与寡核苷酸poly I:C,RNA(20μg蛋白质+2μg寡核苷酸)；
组4：DIIIC-2与寡核苷酸poly I:C,DNA(20μg蛋白质+2μg寡核苷酸)；
组5：DIIIC-2与寡核苷酸2216(SEQ ID NO.3)(20μg蛋白质+2μg寡核苷酸)；
组6：DIIIC-2与寡核苷酸K3(SEQ ID NO.2)(20μg蛋白质+2μg寡核苷酸)；
组7：DIIIC-2与寡核苷酸OriC(SEQ ID NO.4)(20μg蛋白质+2μg寡核苷酸)；
组8：经加热的DIIIC-2(没有寡核苷酸的沉淀对照)(其包含：一半为沉淀出的蛋白质(10μg)和另一半为可溶性的蛋白质(10μg))；
组9：安慰剂与混合型寡核苷酸(SEQ ID NO.1)(2μg)；
组10：102pfu的感染性DV2。
所有变化形式都以氧化铝作为基础佐剂来进行配制，并且以三个剂量(每个15天)的方案通过腹膜内途径接种给动物。在第三个剂量后，借助于捕获ELISA来测定对于DV2具有反应性的抗体的检测，由此通过这些动物的血清的终点稀释度来测定滴度。如在图1中所看出的，对于所有经试验的组均检测到高的抗病毒抗体滴度，在它们之间没有统计学差异(p>0.05)，这表明嵌合蛋白DIIIC-2的聚集不影响抗病毒抗体应答。
为了测定通过免疫接种而产生的抗体的功能性，还进行了体外病毒中和试验。在表1中显示了针对DV2的中和滴度。中和滴度被定义为这样的最大稀释度，在处于该稀释度时达到噬斑数目减少50％。如可以看出的，所有组的动物都是在中和方面阳性的，其中具有100％的血清转变和具有大于1:70的几何平均滴度(GMT)。
表1.在经试验的组中针对DV2的中和抗体的发展
在该方案中还评价了用各种不同的寡核苷酸进行聚集的蛋白DIIIC-2产生细胞介导的免疫应答的能力。为此，提取用每种变化形式进行免疫接种的动物的脾细胞，并且在用感染性DV2进行刺激后测量在脾细胞培养物上清液中的IFN-γ分泌。在图2中描述了每个组的细胞因子分泌的值，以及应答动物的百分比。尽管在所有组中均获得了可以察觉的分泌水平，但只有采用用SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行聚集的蛋白质进行免疫接种的组显示出相对于阴性对照组而言统计学上显著的差异。此外，在该组中，100％的动物作出阳性应答。考虑到在细胞免疫应答试验中应答动物的百分比以及IFN-γ浓度的平均值，选择用下列寡核苷酸进行聚集的蛋白DIIIC-2的制剂用于保护试验：混合型(SEQ ID NO.1)、2216(SEQ ID NO.3)、K3(SEQ IDNO.2)和OriC(SEQ ID NO.4)。
为了该研究，形成下列的组(具有15只小鼠)：
组1：DIIIC-2与混合型寡核苷酸(SEQ ID NO.1)(5μg蛋白质+0.5μg寡核苷酸)；
组2：DIIIC-2与寡核苷酸2216(SEQ ID NO.3)(5μg蛋白质+0.5μg寡核苷酸)；
组3：DIIIC-2与寡核苷酸K3(SEQ ID NO.2)(5μg蛋白质+0.5μg寡核苷酸)；
组4：DIIIC-2与寡核苷酸OriC(SEQ ID NO.4)(5μg蛋白质+0.5μg寡核苷酸)；
组5：安慰剂与混合型寡核苷酸(SEQ ID NO.1)(0.5μg)；
组6：102pfu的感染性DV2。
所有变化形式都以氧化铝作为基础佐剂来进行配制，并且以三个剂量(每个15天)的方案通过腹膜内途径接种给动物。在免疫接种方案开始后两个月，用50个半数致死剂量(LD50)的神经适应性同源病毒攻击每个组的10只动物，并且观察21天以测量存活率。图3A描述了所获得的存活百分比。如所观察到的，超过80％的接受了具有SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的DIIIC-2制剂的小鼠在病毒攻击下存活，相对于用DV2进行免疫接种的阳性对照组而言没有统计学差异(p>0.05)。而只有10％的阴性对照组动物在病毒攻击下存活，相对于用DIIIC-2和SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行免疫接种的组而言和相对于阳性对照而言具有统计学上显著的差异(p<0.05)。另一方面，用包含寡核苷酸2216、K3和OriC的制剂进行免疫接种的动物未达到相对于安慰剂组而言具有统计学上显著的差异的存活水平。
每个组的其余五只动物接受500LD50的相同病毒，并且在该病毒攻击后七天，处死所有动物以提取脑，并且在VERO细胞上定量病毒载量。与在图3A中所观察到的存活率相一致，用具有SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的DIIIC-2制剂进行免疫接种的小鼠在脑中具有低的病毒载量(<102pfu/mL)，相对于阳性对照组而言没有统计学差异(p>0.05)，然而接受了安慰剂制剂的组的小鼠展示出大于作为平均值的104pfu/mL的病毒载量(图3B)。用包含寡核苷酸2216、K3和OriC的制剂进行免疫接种的动物展示出在用DIIIC-2与SEQ IDNO.1所示寡核苷酸的制剂和用安慰剂制剂所取得的那些之间的中间病毒载量水平，在它们之间没有统计学上显著的差异。
实施例2.在用蛋白DIIIC-2的聚集体和从DV2的重组衣壳蛋白开始而获得的核衣壳样颗粒进行免疫接种的非人灵长类中的构思检验
基于在小鼠中的临床前研究，着手在对于DV来说阴性的非人灵长类中评价用SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行聚集并佐以氧化铝的蛋白DIIIC-2。此外，还包括接受NLPs-2(其包含SEQ ID NO.1所示寡核苷酸)的组。而安慰剂组接受这样的制剂，所述制剂包含最大量的在重组蛋白的聚集过程中所使用的并佐以氧化铝的SEQ ID NO.1所示寡核苷酸。在所有的方案组中，都包括3只动物。
所选择的剂量为：对于DIIIC-2，100μg蛋白质和10μg SEQ IDNO.1所示寡核苷酸；和对于NLPs-2，50μg蛋白质和10μg SEQ IDNO.1所示寡核苷酸。猴子以每两个月这样的间隔通过皮下途径接受四个剂量。在施用每个剂量的时刻和在其后十五天抽取血液，以测量所诱导的体液免疫应答。在图4中显示了抗-DIIIC-2抗体出现的动力学。如可以看出的，在接受了DIIIC-2制剂的猴子中，在施用首个剂量后15天开始检测到抗体。在接种第二个剂量后滴度增加至大于10000的值。在第三个剂量后，滴度轻微增加，和在第四个剂量后，滴度保持在相同的水平(平均值：80000)。在用NLPs-2进行免疫接种的组中，抗衣壳抗体应答的表现相似(图4)。
借助于捕获ELISA来测定对于DV2具有反应性的抗体的检测，由此通过这些动物的血清的终点稀释度来测定滴度。在图5中显示了抗病毒抗体的发展的动力学研究结果。在接受了具有SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的DIIIC-2制剂的猴子中，在施用第二个剂量后15天开始检测到抗病毒抗体(平均值：6000)，并且在第三个剂量的时刻，即在接受了第二次免疫原接种后2个月，下降至不可检测的值。紧接着，在施用第三个剂量后，滴度增加至与在第二个剂量后15天所获得的值相似的值；然而，在该情形下，在第四个剂量的时刻(其相应于在施用第三个剂量后两个月)，滴度仍然是可检测的(平均值：800)。再次地，在接受了第四次接种后，动物发展出了抗体，其中具有比在施用的时刻所检测到的值轻微更高的值，并且这些值保持直至病毒攻击的时刻，其中具有5000的平均值。当施用病毒剂量时，可以在攻击后20和27天时检测到抗体滴度的轻微增加，其中具有12000的平均值。
在该研究中还测量了中和抗体应答，因为中和抗体是针对该病毒的保护的可能关联物。表2显现了通过使用Vero细胞系和DV2毒株SB8553在所示时间对于每个样品所获得的值。
如可以观察到的，在施用第二个剂量的DIIIC-2后开始检测到中和抗体。在第三次接种后十五天，检测到更高的滴度，其保持至第四次施用的时刻。在15天后，滴度增加，这证明了明显的加强效应。而在最后一个剂量后一个月，在病毒攻击的时刻，对于所有的用DIIIC-2进行免疫接种的动物均检测到最高的中和抗体水平。在接受了NLPs-2的组的情况下，如所预期的，在病毒攻击前在所评价的任何时间都未检测到中和应答(中和滴度低于10，结果未显示)。安慰剂组的表现相似，其中具有低于10的中和滴度(结果未显示)。
表2.在用聚集的蛋白DIIIC-2和NLPs-2在猴子中进行免疫接种的方案期间，针对DV2的中和抗体的发展
在最后一个剂量后一个月，对于DIIIC-2的组，还通过使用不同的三种病毒毒株和三种细胞系测定了中和抗体。在所有情况下都检测到了100％的血清转变，这表明诱导出了稳固的中和应答(表3)。
表3.通过使用不同的三种细胞系和三种病毒毒株，在攻击的时刻，由用SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行聚集的蛋白DIIIC-2所诱导的中和抗体滴度
独立地显现了每只动物的中和滴度，以及显现了GMT和血清转变的％，其用所采用的实验系统而取得。
细胞免疫应答是在本研究中所测量的另一个参数。用感染性DV2刺激在下列四个点处分离的外周血淋巴细胞：第四个剂量的那一天、第四个剂量后15天、病毒攻击的那一天和病毒攻击后27天，并且测量在培养物上清液中的IFN-γ分泌。在图6中显示了在每个所试验的点处获得的值。在用DIIIC-2和SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行免疫接种的三只动物中，一只动物(猴子6)在病毒攻击前的所分析的三个点处诱导了IFN-γ分泌。而在感染后在第27天，该组的另一只猴子经证明也是阳性的，这表明测量到了记忆细胞应答。
另一方面，在接受了NLPs-2的三只动物中，其中两只在病毒攻击的那一天对于IFN-γ分泌来说是阳性的。而在感染后在第27天，该组的三只猴子经证明是阳性的，这表明在该情况下也测量到了记忆细胞应答。重要的是特别指出，没有在接受了安慰剂制剂的动物中检测出抗病毒细胞因子的分泌，甚至在病毒攻击后也没有。
为了测量针对DV2的保护，在最后一个剂量后一个月，用感染剂量的DV2攻击该研究的所有动物。通过在VERO细胞系中的直接定量来测定在血液中病毒的存在。在图7中显示了所获得的结果。接受了安慰剂制剂的动物在作为平均值的3.6天内发展出病毒血症，并且具有102pfu/mL的平均病毒载量。相反地，在接受了具有SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的蛋白DIIIC-2的制剂的猴子中的两只未发展出病毒血症，并因此被归类为完全受到保护。在一只动物(猴子5)中，仅在第5天检测到病毒，并且具有非常低的病毒载量值(<10pfu)，这也表明了可以察觉的保护水平。
对于接受了NLPs-2的组的情况，在所有猴子中均检测到病毒的存在，然而病毒载量相比于在对照组中所检测到的而言更低。事实上，猴子9具有非常低的病毒载量(<10pfu)，这也表明了可以察觉的保护水平。
总之，可以肯定，用SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行聚集的基于病毒衣壳的蛋白质在猴子中诱导了保护性应答。
实施例3.蛋白DIIIC-1、DIIIC-3和DIIIC-4的获得和表征
将BamHI/HindIII基因片段克隆到质粒pET28的多克隆位点处，所述基因片段包含与相同病毒的衣壳蛋白相融合的血清型1、3和4的DV的包膜蛋白的DomIII(氨基酸286-426)。该表达载体事先进行了修饰，其中去除了在NcoI和BamHI位点之间的基因序列，除了组氨酸尾标外，目的是去除与所克隆的蛋白质不相关的氨基酸的翻译。质粒的遗传构建显示在图8中。
在所有情况下，蛋白质均在其N-末端处融合至组氨酸尾标，并且在T7lac启动子的调控下表达。这允许，一旦被表达，就开展所述蛋白质的纯化过程，通过将离子交换层析和金属螯合亲和层析相组合。该相同的方法被用于纯化前面所获得的蛋白DIIIC-2。一旦纯化了这四种重组蛋白质，就着手对它们进行表征。首先，分析它们中的每一个对于来自用每种病毒制备物进行免疫接种的小鼠的多克隆血清，尤其是抗每种血清型的DV的超免疫腹水(HMAF)的反应性。如在图9中所显示的，通过ELISA获得了每种蛋白质对于同源病毒血清型的HMAF的反应性，这表明正确呈现了处于衣壳背景中的DomIII区域，因为大多数针对病毒包膜蛋白而产生的抗体是构象型的。
另一方面，研究了应当存在于每种嵌合分子中的在DomIII区域内的二硫桥(S-S)的状态。首先，通过质谱法验证每种蛋白质，并且包括所述桥的正确形成。然后，基于S-S桥直接牵涉DomIII对于抗-DV多克隆血清的反应性这一事实，在还原和非还原条件下再次分析所述重组蛋白中的每一种对于同源血清型的HMAF的反应性。如在图9中所观察到的，对于蛋白DIIIC-1、DIIIC-2和DIIIC-4，当通过烷基化而不可逆地减少了蛋白质时，观察到对于同源HMAF的反应性的降低。在DIIIC-3的情况下，也观察到降低，尽管比在其余蛋白质中明显更少。这些结果确证了S-S桥的正确形成，以及还有其在DomIII对于抗-DV多克隆抗体的反应性中的可能作用。
实施例4.单价DIIIC制剂和四价制剂Tetra DIIIC在小鼠中的免疫学评价
在BALB/c小鼠中评价了事先用SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行聚集的每一种嵌合蛋白，以及已经聚集的所述四种分子的四价混合物。所有制备物都以氧化铝作为基础佐剂来进行配制，并且以每15天进行施用的三个剂量的方案通过腹膜内途径接种给动物。作为阳性对照，包括了四个用每种病毒血清型进行免疫接种的组。作为阴性对照，一个组接受安慰剂制备物，其具有与包含在四价制剂中的相同的量的并佐以氧化铝的寡核苷酸。用于四价制剂的蛋白质的量为20μg每种蛋白质，和总共8μg SEQ ID NO.1所示寡核苷酸。单价制剂包含20μg蛋白质和2μg SEQ ID NO.1所示寡核苷酸。
在第三个剂量后，借助于捕获ELISA来测定对于每种病毒具有反应性的抗体的检测(图10)，由此通过这些动物的血清的终点稀释度来测定滴度。在接受了单价制剂的动物中，在血清型1、2和3的情况下，检测到高的抗病毒抗体滴度；而用DIIIC-4进行免疫接种的动物未发展出针对同源血清型(DV4)的滴度。然而，接受了四价制剂TetraDIIIC的动物却发展出了针对DV4的抗体，尽管具有相对于其余血清型而言更低的滴度。该结果表明，这四种蛋白质的混合物有利于诱导针对DV4的抗体，这可能是通过一定水平的与其余血清型的交叉反应性。
为了测定通过用四价制剂Tetra DIIIC进行免疫接种而产生的抗体的功能性，进行了针对血清型1、2、3和4的体外病毒中和试验(表4)。该试验按照世界卫生组织的指南来进行，并且使用了参照株。在用蛋白DIIIC-1、DIIIC-2和DIIIC-3进行免疫接种的小鼠中，诱导了高的针对同源病毒的中和抗体滴度，其与在病毒对照组的小鼠中用复制型病毒所诱导的相当。在用蛋白DIIIC-4进行免疫接种的动物的情况下，没有如此表现，其中与在抗病毒应答中所获得的结果相一致，未检测到针对DV4的中和抗体。然而，除了诱导了针对血清型1、2和3的中和抗体外，四价制剂还诱导了针对DV4的功能性抗体。
表4.在用DIIIC嵌合蛋白的单价和四价制剂进行免疫接种的小鼠中的中和抗体滴度
在所有情况下，分析了小鼠的血清混合物。(-)：未测定。
细胞免疫应答是在该研究中所测量的另一个参数。为此，在最后一个剂量后30天，提取用四价制剂Tetra DIIIC进行免疫接种的动物的脾细胞，并且在用所述四种重组蛋白进行刺激后测量在脾细胞培养物上清液中的IFN-γ分泌。作为阴性对照，使用用安慰剂制剂进行接种的小鼠的脾细胞。所获得的结果显示在图11中。如所看出的，在用所述四种重组蛋白进行刺激后检测到高的IFN-γ分泌水平，这表明了在对于每种血清型所获得的细胞免疫应答方面的等价性。
最后，在病毒性脑炎的小鼠模型中进行保护试验。对于该实验，选择了用四价制剂Tetra DIIIC、用单价制剂DIIIC-1和DIIIC-4进行免疫接种的动物，阳性对照动物(分别用DV1和DV4进行免疫接种)，和用安慰剂制剂进行免疫接种的动物。而待使用的攻击病毒为能够引起动物死亡的DV1和DV4。如在图12中所看出的，在所有情况下，无论用单价制剂还是用四价制剂，均获得了高的针对血清型1和4的保护水平，相对于病毒对照组而言没有统计学差异(p>0.05)。这些结果表明了基于用SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行聚集的DIIIC蛋白的所试验的制剂针对血清型1和4的保护能力。
实施例5.四价制剂Tetra DIIIC在非人灵长类中的免疫学评价
在非人灵长类中类似地评价了在小鼠中所试验的四价制剂TetraDIIIC。形成三个研究组，每组三只动物，以用于通过三种不同的抗原施用途径来接受所述四价制剂：组1：皮下；组2：真皮内；和组3：肌内。在组1和3中，施用50μg的事先用5μg SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行聚集的每种嵌合蛋白，其中将所有成分混合并佐以氧化铝。在通过真皮内途径接受免疫原的组2中，接种十分之一的通过其他两种途径所施用的剂量，即5μg每种蛋白质和总共2μg SEQ ID NO.1所示寡核苷酸，其中将所有成分混合并佐以氧化铝。此外，还包括一个安慰剂组，其接受与组1和3相同的量的SEQ ID NO.1所示寡核苷酸，其被佐以氧化铝并通过肌内途径进行施用。在每个剂量的时刻和在其后一个月抽取血液，以测量所诱导的体液和细胞免疫应答。
借助于捕获ELISA来测定对于每种病毒血清型具有反应性的抗体的检测，由此通过这些动物的血清的终点稀释度来测定滴度。在图13中显示了在三个剂量的包括SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的制剂Tetra DIIIC之后，在猴子中所产生的抗病毒抗体应答。如可以看出的，不依赖于抗原施用途径，在猴子中产生了能够在捕获ELISA系统中识别所述四种病毒血清型的抗体应答。此外，该应答对于所述四种DV显示出同质模式，这对于开发针对该人病原体的疫苗(其中需要平衡的免疫应答)来说是重要的结果。
在VERO细胞上并且使用病毒毒株DV1Jamaica、DV2SB8553、DV3Nicaragua和DV4Dominica，通过借助于噬斑数目减少的中和技术来进行中和抗体的测量。在第三次免疫接种后所获得的值显现在表5中。
表5.在用包括SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的四价制剂Tetra DIIIC进行免疫接种的非人灵长类中的中和抗体滴度
所有用制剂Tetra DIIIC进行免疫接种的动物都产生了能够在体外中和病毒感染的抗体应答，而不依赖于抗原施用途径。以100％的对于所述四种病毒血清型作出应答的动物来产生中和体液应答，目前在开发针对登革热的疫苗中是先决条件。在安慰剂组的情况下，在所有经免疫接种的动物中中和滴度均低于20。
细胞免疫应答是另一个所测量的参数。用每一种DIIIC重组蛋白刺激PBMC，并且通过ELISPOT试验测量产生IFN-γ的细胞的频率。在图14中显示了所获得的值。在施用三个剂量的四价制剂TetraDIIIC后，在面对用重组蛋白进行刺激时在动物中产生了能够分泌抗病毒细胞因子的细胞，该应答在通过肌内途径进行免疫接种的动物中相对更高。在所有经试验的组中都获得了100％的对于四种所试验的蛋白质作出应答的动物。
实施例6.以敏化-加强制度的DIIIC蛋白与SEQ ID NO.1所示寡核苷酸的二价和四价制剂的联合施用在小鼠中的免疫学评价
为了以相同的免疫接种方案仅施用两个剂量的每种DIIIC蛋白制剂，施行下列实验设计：
顺次I组：
剂量1：二价制剂DIIIC-1/DIIIC-2
剂量2：二价制剂DIIIC-3/DIIIC-4
剂量3：四价制剂Tetra DIIIC
顺次II组：
剂量1：二价制剂DIIIC-1/DIIIC-3
剂量2：二价制剂DIIIC-2/DIIIC-4
剂量3：四价制剂Tetra DIIIC
Tetra DIIIC组：所有剂量均为四价制剂Tetra DIIIC。
混合事先用SEQ ID NO.1所示寡核苷酸进行聚集的DIIIC嵌合蛋白，以形成二价制剂以及四价制剂。免疫原包含20μg每种蛋白质和4μg SEQ ID NO.1所示寡核苷酸/二价制剂。用于四价制剂的蛋白质的量为20μg每种蛋白质，和总共8μg SEQ ID NO.1所示寡核苷酸。所有变化形式都以氧化铝作为基础佐剂来进行配制，并且每15天通过腹膜内途径进行接种。
仅接受了四价制剂Tetra DIIIC的组用作阳性对照，和安慰剂组用作阴性对照。
在第三个剂量后，借助于捕获ELISA来测定对于每种病毒具有反应性的抗体的检测(图15)，由此通过这些动物的血清的终点稀释度来测定滴度。作为结果而获得了，对于4种病毒血清型中的任何一种，在所试验的组之间不存在统计学上显著的差异，这表明通过顺次施用二价制剂并用四价制剂Tetra DIIIC进行加强，可能获得与当用四价制剂来施用三个剂量时相同的免疫原性水平。
另外，还测量了细胞免疫应答。在最后一个剂量后30天，提取每个试验组的经免疫接种的动物的脾细胞，并且在用所述四种重组蛋白进行刺激后测量在脾细胞培养物上清液中的IFN-γ分泌。作为阴性对照，使用用安慰剂制剂进行接种的小鼠的脾细胞。所获得的结果显示在图16中。如所看出的，在所有组中(除了在安慰剂组中外)在用所述四种重组蛋白进行刺激后检测到高的IFN-γ分泌水平，这表明了在所获得的细胞应答方面的等价性，而不依赖于所采用的免疫接种制度和在头两个剂量中所施用的二价制剂。
Claims (15)
1.疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含：a)至少一种包含登革病毒(DV)衣壳蛋白序列的至少50％的抗原，和b)标识为SEQ ID NO.1的寡核苷酸。
2.权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，所述包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的抗原为包含所述蛋白质的氨基酸1至99的重组抗原。
3.权利要求2的疫苗组合物，其特征在于，所述包含衣壳蛋白的氨基酸1至99的重组抗原为选自SEQ ID NO.5(抗原DIIIC-1)、SEQ ID NO.6(抗原DIIIC-2)、SEQ ID NO.7(抗原DIIIC-3)和SEQ ID NO.8(抗原DIIIC-4)的嵌合抗原。
4.权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的嵌合抗原中的两种。
5.权利要求1的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包含标识为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的四种嵌合抗原。
6.核酸，其特征在于标识为SEQ ID NO.1的序列。
7.标识为SEQ ID NO.1的核酸的用途，所述用途为用于增加针对包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的疫苗抗原的免疫应答。
8.权利要求7的用途，其中所述包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的抗原为包含所述蛋白质的氨基酸1至99的重组抗原。
9.权利要求8的用途，其中所述包含DV衣壳蛋白的氨基酸1至99的重组抗原为选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的嵌合抗原。
10.用于诱导针对DV的免疫应答的方法，其特征在于，向受试者施用疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：a)至少一种包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的抗原，和b)标识为SEQ ID NO.1的寡核苷酸。
11.权利要求10的方法，其中所述包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的抗原为包含所述蛋白质的氨基酸1至99的重组抗原。
12.权利要求11的方法，其中所述包含衣壳蛋白的氨基酸1至99的重组抗原为具有选自SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的氨基酸序列的嵌合抗原。
13.权利要求12的方法，其中在二价组合物中顺次施用所述标识为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的嵌合抗原。
14.权利要求13的方法，其中另外还施用一个加强剂量，其包括标识为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的四种嵌合抗原的四价组合物。
15.权利要求10的方法，其中通过皮下、真皮内或肌内途径来施用所述疫苗组合物，所述疫苗组合物包含：a)至少一种包含DV衣壳蛋白序列的至少50％的抗原，和b)标识为SEQ ID NO.1的寡核苷酸。
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