[go: up one dir, main page]

CN104928263B - 一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶、其编码基因及其应用 - Google Patents

一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶、其编码基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104928263B
CN104928263B CN201410105875.8A CN201410105875A CN104928263B CN 104928263 B CN104928263 B CN 104928263B CN 201410105875 A CN201410105875 A CN 201410105875A CN 104928263 B CN104928263 B CN 104928263B
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
hydroxylase
polypeptide
cells
steviol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410105875.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104928263A (zh
Inventor
王勇
熊智强
汪建峰
李诗渊
刘巧霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Original Assignee
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS filed Critical Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority to CN201410105875.8A priority Critical patent/CN104928263B/zh
Priority to PCT/CN2015/074344 priority patent/WO2015139599A1/zh
Publication of CN104928263A publication Critical patent/CN104928263A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104928263B publication Critical patent/CN104928263B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30—Artificial sweetening agents
    • A23L27/33—Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
    • A23L27/36—Terpene glycosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13079—Ent-kaurenoic acid oxidase (1.14.13.79)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶、其编码基因及其应用。本发明人首次从甜叶菊中克隆到一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶基因，并成功地将其应用于甜菊糖的异源生物合成。本发明为重构甜菊糖苷的微生物异源合成途径和植物细胞遗传改造打下基础。

Description

一种新的贝壳烯酸-13α-羟化酶、其编码基因及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学与生物工程领域，提供了一种新的甜叶菊来源的贝壳烯酸-13α-羟化酶(KAH)基因及在甜菊糖苷生物合成中的应用。
背景技术
随着肥胖和高血压等心血管疾病对人类健康的威胁加剧，人类对新型甜味剂的需求越来越迫切。甜菊糖苷是一种产自菊科植物甜叶菊(Stevia RebaudianaBertoni)中的二萜类糖苷化合物，具有高甜度、低热能的特点，其甜度是蔗糖的200-300倍，热值仅为蔗糖的1/300。甜菊糖在南美和东亚地区被广泛地作为药草和代糖已经有几百年历史，经常食用甜菊糖可预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症。随着欧美等国对甜菊糖安全性的逐渐认可，甜叶菊作为新型甜味剂和功能性食品添加剂将具有越来越大的市场。
目前有关甜菊糖苷生物合成途径研究相对比较清楚。作为典型的二萜类化合物，甜菊糖苷主要由萜类的通用前体——3个异戊烯焦磷酸(Isopentyl diphosphate，IPP)和1个二甲基丙烯基焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)单元经牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS)，ent-柯巴基焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CDPS)，贝壳烯合成酶(Kaurene synthase，KS)形成二萜骨架贝壳烯。随后贝壳烯经两步细胞色素P450酶，即贝壳烯氧化酶(Kaurene oxidase，KO)和贝壳烯酸-13α-羟化酶(13α-kaurenoic acid hydroxylase，KAH)，分别在二萜骨架的C19和C13位形成羧基和羟基，形成重要中间体甜菊糖醇。最后甜菊醇经四步糖基化反应，最终形成甜菊糖莱鲍迪甙A(Rebaudioside A)，如图1所示。
目前甜菊糖合成途径中所有酶的基因均已经获得了报道，并为植物细胞遗传改造提高甜菊糖产量和微生物异源合成甜菊糖苷的研究打下了基础。作为催化贝壳烯酸到甜菊醇的第二个细胞色素P450酶KAH，虽已经有多个甜叶菊来源的序列被报道，而且部分序列已经在植物中过表达以改善甜菊糖苷合成或酵母细胞中进行生物转化研究，但其目前仍是甜菊糖生物合成的限速步骤，而且仍然未有能够在原核宿主中活性表达KAH的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的贝壳烯酸-13α-羟化酶、其编码基因及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种分离的贝壳烯酸-13α-羟化酶，其选自下组：
(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；
(c)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的蛋白片段；或
(d)具有(a)多肽功能的且与(a)多肽具有90%以上(较佳地95%以上；更佳地98%以上；更佳地99%以上)氨基酸序列相同性的多肽。
在一个优选例中，所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶来源于甜叶菊。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其编码如所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶。
在一个优选例中，提供该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示(密码子优化序列)。
在本发明的第一方面，提供一种重组载体，它含有前面任一所述的多核苷酸。
在本发明的第一方面，提供一种宿主细胞，它含有所述的重组载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞或植物细胞；所述的真菌细胞包括酵母细胞(Yeast)，如毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Saccharomyces cerecisiae)等。所述的原核细胞包括：肠杆菌属(Enterobacter)，如大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌属(Bacillus)，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，链霉菌属(Streptomyces)，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)等，糖多胞菌属(Saccharopolyspora)，如红霉糖多胞菌(Saccharopolyspora erythraea)。
在本发明的第一方面，提供一种所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶的制备方法，该方法包含：(a)培养所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶。
在本发明的第一方面，提供所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶的用途，用于将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇；较佳地，在存在细胞色素P450氧化还原蛋白的情况下贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。
在一个优选例中，所述的将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇在植物细胞或非植物细胞中进行；较佳地，所述的非植物细胞包括细菌细胞、真菌细胞；所述的真菌细胞包括酵母细胞(Yeast)，如毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Saccharomyces cerecisiae)等。所述的原核细胞包括：肠杆菌属(Enterobacter)，如大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌属(Bacillus)，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，链霉菌属(Streptomyces)，天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)、委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuelae)等，糖多胞菌属(Saccharopolyspora)，如红霉糖多胞菌(Saccharopolyspora erythraea)。
在本发明的第一方面，提供一种制备甜菊糖醇的方法，该方法包含：利用所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。
在一个优选例中，所述方法包括：
(1)培养所述的宿主细胞，从而表达所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶；
(2)在存在细胞色素P450氧化还原蛋白(CPR)的情况下，利用步骤(1)所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。
在另一优选例中，所述的细胞色素P450氧化还原蛋白由步骤(1)所述的宿主细胞表达。
在另一优选例中，步骤(1)所述的宿主细胞中包含的重组载体中还包括：细胞色素P450氧化还原蛋白的编码基因。
在本发明的另一方面，提供一种组合物，它含有安全有效量的所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶以及食品学或工业上可接受的载体。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、甜菊糖苷类化合物的生物合成途径。
图2、KAH基因片段的PCR扩增。泳道1-4分别是应用引物对8-40-3US/8-40-4DS，8-40-2DS/8-40-3US，8-40-1US/8-40-4DS，8-40-1US/8-40-2D进行PCR扩增获得的扩增产物的电泳图。
图3、KAH全长DNA的PCR扩增。
图4、质粒pSY183图谱。
图5、质粒pET21a-srcpr图谱。
图6、质粒pSY198图谱。
图7、KAH S2蛋白表达SDS-PAGE分析。M：蛋白分子量标记；1：未诱导全菌蛋白；2：未诱导上清蛋白；3：16℃诱导5h全菌蛋白；4：16℃诱导5h上清蛋白；5：16℃诱导16h全菌蛋白；6：16℃诱导16h上清蛋白；7：28℃诱导5h全菌蛋白；8：28℃诱导5h上清蛋白；9：28℃诱导16h全菌蛋白；10：28℃诱导16h上清蛋白。
图8、静息细胞生物转化贝壳烯酸合成甜菊醇质谱分析。a，对照菌株DH10B(DE3)的生物转化结果；b，菌株DH10B(DE3)pSY183的生物转化结果；c，甜菊糖醇标准品(SteviolStandard)的检测结果。
图9、静息细胞生物转化贝壳烯酸合成甜菊醇质谱峰分子离子峰。a，菌株DH10B(DE3)pSY183的目标峰的分子离子峰；b，甜菊糖醇标准品(Steviol Standard)的目标峰的分子离子峰。
图10、毕赤酵母表达系统KAHS2活性检测HPLC检测色谱图。
图11、毕赤酵母表达系统KAHS2活性MS检测结果。
具体实施方式
本发明人经过大量的研究和筛选，首次从甜叶菊中克隆到一种新的贝壳烯酸-13α-羟化酶(KAH)基因，并成功的将其应用于甜菊糖的异源生物合成。
如本文所用，所述的“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或来自不同来源的蛋白(或核酸)与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“异源的”。
如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的蛋白”或“KAH多肽(蛋白)”可互换使用，都指具有贝壳烯酸-13α-羟化酶氨基酸序列(SEQ ID NO:2或其变异形式或衍生物)的蛋白或多肽。
如本文所用，术语“本发明的基因(多核苷酸)”或“KAH基因”指编码所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶的多核苷酸。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物、重组表达的产物或是化学合成的产物。
所述的KAH的片段、衍生物和类似物也包含在本发明中。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然KAH相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“KAH多肽”包括具有KAH活性的SEQ ID NO:2序列的多肽，也包括具有与KAH多肽相同功能的、SEQ ID NO:2序列编码多肽的的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽功能；又比如，仅表达该多肽的部分结构域也能获得和完整多肽同样的催化功能。因此该术语还包括KAH多肽的活性片段和活性衍生物。
发明还提供KAH蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然KAH多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。
在本发明中，“KAH蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val;Leu;Ile Val
Arg(R) Lys;Gln;Asn Lys
Asn(N) Gln;His;Lys;Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro;Ala Ala
His(H) Asn;Gln;Lys;Arg Arg
Ile(I) Leu;Val;Met;Ala;Phe Leu
Leu(L) Ile;Val;Met;Ala;Phe Ile
Lys(K) Arg;Gln;Asn Arg
Met(M) Leu;Phe;Ile Leu
Phe(F) Leu;Val;Ile;Ala;Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr;Phe Tyr
Tyr(Y) Trp;Phe;Thr;Ser Phe
Val(V) Ile;Leu;Met;Phe;Ala Leu
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明的KAH核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或KAH蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的KAH多肽。一般来说有以下步骤：(1).用本发明的编码KAH多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，KAH多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含KAH编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：原核细胞如大肠杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。作为本发明的优选方式，所述的宿主细胞是原核细胞或酵母细胞。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。
本专利报道了一种新的甜叶菊来源的KAH基因，将其在微生物细胞中进行了活性表达，并进行了贝壳烯酸到甜菊醇的生物转化研究，为微生物细胞中甜菊糖苷全合成途径的构建打下了基础。
重组的KAH可被应用于甜菊糖醇的生物转化，包括：将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。现有技术中，很难实现在异源宿主(如原核宿主或酵母宿主)中活性表达KAH，使得贝壳烯酸向甜菊糖醇的转化成为限速步骤。而本发明人克隆到的所述KAH能够在微生物中实现异源表达，显然这是具有显著进步意义的。
在获得了本发明的KAH酶后，根据本发明的提示，本领域人员可以方便地应用该酶来实施贝壳烯酸向甜菊糖醇的生物转化。作为本发明的优选方式，还提供了一种形成生物转化方法，该方法包括：将所述的KAH转化宿主细胞；在存在细胞色素P450氧化还原蛋白(CPR)的情况下，利用KAH将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。其中，CPR可以是各种物种来源的CPR(如甜叶菊、黄花蒿、暗球腔菌、藤仓赤霉、阿拉伯芥等来源)，只要其能发挥KAH的伴侣蛋白的功能(有助于反应过程中电子传递)。
作为本发明的优选方式，所述的细胞色素P450氧化还原蛋白由步骤(1)所述的宿主细胞表达。较佳地，在一个重组载体中同时包括：贝壳烯酸-13α-羟化酶的编码基因的表达盒和细胞色素P450氧化还原蛋白的编码基因的表达盒，转化宿主，表达产物用于进行贝壳烯酸向甜菊糖醇的生物转化。另一种方式，当宿主(如酵母细胞)内源存在细胞色素P450氧化还原蛋白时，将贝壳烯酸-13α-羟化酶的编码基因的表达盒转化该宿主，借助细胞内源存在的细胞色素P450氧化还原蛋白，进行贝壳烯酸向甜菊糖醇的生物转化。
表达盒的建立目前已经是本领域技术人员熟悉的技术。因此，在得知了所需选择的酶之后，本领域技术人员易于进行表达盒的建立。编码酶的基因序列可以被插入到不同的表达盒(如表达载体)中，也可以被插入到同一表达盒中，只要在转入到细胞后酶能够被有效地表达即可。制备表达盒所需的启动子或终止子可以是任何适用的启动子或终止子，并不限于本发明具体所记载的那些。适用的启动子或终止子的选择是本领域技术人员可以进行的，可以根据宿主细胞的种类而定。例如，当应用于酵母重组表达时，现有技术已经揭示了一些酵母启动子或终止子，从而易于作出选择。
针对原核细胞和真核细胞，本领域已知适合的表达载体是哪些，因此人们易于选择到合适的表达载体作为克隆编码基因的骨架载体，例如，当所述的细胞为细菌细胞时，采用pET系列表达载体或pSY系列载体来重组表达各酶；当所述的细胞为酵母细胞，采用pSY系列表达载体。
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的KAH多肽以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：水、缓冲液、甘油、乙醇、及其组合。
本发明的有益效果是：
(1)本发明获得了一种新的贝壳烯酸-13α-羟化酶(KAH)基因，为甜菊糖生物合成途径的进一步解析打下基础。
(2)本发明实现了贝壳烯酸-13α-羟化酶(KAH)基因在原核宿主中活性表达，成功地实现了贝壳杉烯酸到甜菊醇的生物转化，为植物细胞代谢工程改造和甜菊糖生物合成途径的重建打下基础。
以下实施例对本发明中克隆一种新的甜叶菊来源的贝壳烯酸-13α-羟化酶(KAH)基因，并以微生物大肠杆菌宿主进行了贝壳杉烯酸到甜菊醇的生物转化研究进行详细阐述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、KAH基因的获得
1、甜叶菊mRNA的抽提
选取处于成熟期的甜叶菊叶片约100mg，放入研钵中，加入液氮研磨，将磨碎后的粉末转入1.5ml的离心管中，加入700μl的提取缓冲液(2%CTAB(W/V)，2%PVPK30(W/V)，100mMTris-HCl(pH8.0)，20mM Na2EDTA(pH8.0)，1.4mM NaCl，2%β-巯基乙醇)，漩涡振荡混匀。50℃水浴20min，中间混合2-3次，使RNA充分析出。12000g离心10min，将上清吸至新的离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，混匀后，12000g离心10min。吸取上清至离心管中后，用等体积氯仿再次重复抽提上清一次后。往上清中加入2倍体积的预冷无水乙醇，冰浴放置30min，12000g离心10min。弃上清后，往沉淀中加入75%乙醇再次洗涤，自然干燥后，加入60μl RNase-Free的水溶解，用于逆转录PCR扩增。
2、KAH基因的RT-PCR扩增和测序鉴定
以甜叶菊的mRNA为模板，采用宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒合成cDNA。参考美国专利US7927851，合成引物8-40-1US，8-40-2DS，8-40-3US和8-40-4DS。然后用PrimstarDNA聚合酶，以cDNA为模板，分别用引物对8-40-1US/8-40-2DS，8-40-1US/8-40-4DS，8-40-2DS/8-40-3US，8-40-3US/8-40-4DSPCR扩增KAH基因片段，扩增产物电泳结果如图2。对以上四种PCR产物进行测序，序列拼接后，获得了全长的KAH序列。然后根据全长的KAH序列，设计引物KAH F/KAH R。以KAH-XbaIF/KAH-BamHI R为引物和cDNA为模板，用Primestar DNA聚合酶PCR扩增全长的KAH基因，扩增产物电泳结果如图3。胶回收KAHPCR产物，然后用XbaI和BamHI分别酶切回收后的KAH PCR产物与pET21a(+)质粒(Novagen)，将两者连接后构建质粒pSY183，如图4。
同时，本发明人还优化了当用于大肠杆菌表达时的KAH密码子，优化后的KAH基因序列如SEQ ID NO:5。
表1
下划线为限制性内切酶位点，黑色粗体的“ACTAGT”序列代表“SpeI”位点。序列“aataattttgtttaactttaagaaggagatatacat”代表pET21a质粒中XbaI和NdeI位点之间的序列。
3、甜叶菊细胞色素P450氧化还原蛋白基因的密码子优化与合成
选取甜叶菊的细胞色素P450氧化还原蛋白(CPR，ABB88839)，对其基因序列进行密码子优化后，获得基因序列SEQ ID NO:3，并命名为srcpr；其编码SrCPR的氨基酸序列SEQID NO:4。将优化好的srcpr基因克隆到pET21a(+)的NdeI和BamHI酶切位点上，获得质粒pET21a-srcpr(图5)。然后用XbaI和HindIII双酶切质粒pSY183，用SpeI和HindIII酶切质粒pET21a-srcpr，分别回收含KAH基因的DNA片段和pET21a-srcpr载体，将两者连接后构建质粒pSY198(图6)。
实施例2、KAH在大肠杆菌中的表达
将质粒pSY183转化BL21(DE3)，涂布平板后，37℃培养过夜。挑取单菌落与2ml液体LB培养基(氨苄青霉素100mg/L)，220r/min，37℃培养过夜后作为种子液。按1%接种量将种子液接种到新的2ml LB培养基中，220r/min，37℃培养至OD600约为0.3-0.5后，加入终浓度为0.1mM的IPTG，220r/min置于16℃或28℃诱导培养5h或者16h后，收集样品，进行SDS-PAGE分析。
结果如图7，可以看到，在16℃诱导16h时，KAH的表达非常明显，而且蛋白可溶性较好。此外，在28℃诱导时KAH也能够正常表达，但可溶性相比16℃诱导时稍差。
实施例3、利用原核表达的KAH进行贝壳烯酸到甜菊醇的生物转化
将质粒pSY198转化菌株DH10B(DE3)，涂布含100mg l-1氨苄青霉素抗性平板后，37℃培养过夜。挑取单克隆于2ml含100mg l-1氨苄青霉素液体LB培养基中，37℃培养过夜。然后以1%接种量转接到新的LB培养基中，37℃培养2h至OD600约为0.6，加入IPTG至终浓度0.1mM，16℃诱导培养16h。4℃，6000g离心收集菌体，用等体积的M9盐/磷酸缓冲体系(4.2mMNa2HPO4；2.2mM KH2PO4；0.9mM NaCl；1.9mM NH4Cl)洗涤两次。然后用加入一定体积的生物转化缓冲体系重悬(M9盐/磷酸缓冲体系+50mg l-1酵母抽提物)，重悬之后控制菌体湿重约为4g l-1。取以上的菌体悬液4ml，5×NADPH再生体系1ml(5mM NADP，25mM6-磷酸葡萄糖和5Unit/ml的6-磷酸葡萄糖脱氢酶)，100g/L的贝壳烯酸母液30μl于100ml的摇瓶中，置于摇床上，28℃，150r/min反应16h。往反应液中加入等体积乙酸乙酯萃取，吸取有机相进行HPLC-MS分析。
结果如图8-9，可以看出，样品中成功的检测到了甜菊糖醇，而且其分子离子峰为317.2，与甜菊糖醇标准品(Steviol Standard)一致。
实施例4、利用酵母表达的KAH进行贝壳烯酸到甜菊醇的生物转化
1、酵母表达系统pSY220重组质粒的构建
以pSY220F和pSY220R为引物，以pSY183为模板PCR扩增KAHS2基因。PCR产物经胶回收后，用BglII/NotI酶切，然后再次回收酶切产物，将其连接到用BamHI/NotI处理的pPIC3.5k载体(购自Invitorgen)上，获得质粒pSY220(pPIC3.5k-KAHS2)。
pSY220F(SEQ ID NO:14)：GGAAGATCTATGAAATTCAAAAAGTTTTCTTGTACCCAC(下划线为BamHI酶切位点)；
pSY220R(SEQ ID NO:15)：ATAAGAATGCGGCCGCTTAGAGTTTGTGTAAAATCAAGTGAGCACC(下划线为NotI酶切位点)。
2、重组毕赤酵母表达方法
毕赤酵母自身含有的细胞色素P450氧化还原蛋白就能够为外源P450氧化酶提供电子传递的作用，因此本实施例中不需要额外表达异源CPR基因就可以使KAHS2在毕赤酵母中进行活性表达。
将质粒pSY220用SalI酶切，回收线性化的DNA片段，然后将其电击转化毕赤酵母菌株KM71(购自Invitrogen)，涂布MD平板(13.4g/L酵母基本氮源(YNB)；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖)，28℃培养3天后，经PCR验证获得重组菌株。将重组菌株接种到2ml YPD培养基中，28℃，250r/min，培养24h后，以其为种子，按1%接种量，接种到含有50ml BMGY(2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB，4×10-5%生物素，0.5%甘油)培养基的500ml摇瓶中，共两瓶，继续培养24h。用50ml离心管收集菌液，共2管，2000r/min，离心5min，弃尽培养基上清。分别用5mlBMMY(2%蛋白胨，1%酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34%YNB，4×10-5%生物素，0.5%甲醇)培养基悬浮沉淀细胞，将菌体悬液合并后，共10ml，转移到100ml摇瓶中，250r/min，22℃，每24h添加50μl的甲醇，诱导培养72h。
3、活性检测
4℃，2000g离心收集菌体，用等体积的M9盐/磷酸缓冲体系(4.2mMNa2HPO4；2.2mMKH2PO4；0.9mM NaCl；1.9mM NH4Cl)洗涤两次。然后用加入一定体积的生物转化缓冲体系重悬，重悬之后控制菌体湿重约为4g/L。取以上的菌体悬液4ml，5×NADPH再生体系1ml(5mMNADP，25mM6-磷酸葡萄糖和5Unit/ml的6-磷酸葡萄糖脱氢酶)，100g/L的贝壳烯酸母液30μl于100ml的摇瓶中，置于摇床上，28℃，150r/min反应16h。往反应液中加入等体积乙酸乙酯萃取，吸取有机相进行HPLC-MS分析。
毕赤酵母表达系统KAHS2活性检测HPLC检测色谱图如图10；MS检测结果如图11。由图可以看出，样品中成功的检测到了甜菊糖醇，而且其分子离子峰为317.2。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种分离自甜叶菊的贝壳烯酸-13α-羟化酶，其特征在于，其选自下组：
(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；
(b)具有(a)多肽功能的且与(a)多肽具有99％以上氨基酸序列相同性的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种重组载体，其特征在于，它含有权利要求2-3任一所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的重组载体，或其基因组中整合有权利要求2-3任一所述的多核苷酸。
6.一种权利要求1所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)培养权利要求5所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出权利要求1所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶。
7.权利要求1所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶的用途，用于将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇在植物细胞或非植物细胞中进行；所述的非植物细胞包括原核细胞、真菌细胞。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的真菌细胞包括酵母细胞(Yeast)；所述的原核细胞包括：肠杆菌属(Enterobacter)细胞，芽孢杆菌属(Bacillus)细胞，链霉菌属(Streptomyces)细胞，糖多胞菌属(Saccharopolyspora)细胞。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的酵母细胞包括：毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Saccharomyces cerecisiae)。
11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的肠杆菌属包括大肠杆菌(Escherichia coli)；所述的芽孢杆菌属包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；所述的链霉菌属包括天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、委内瑞拉链霉菌(Streptomycesvenezuelae)；所述的糖多胞菌属包括红霉糖多胞菌(Saccharopolyspora erythraea)。
12.一种制备甜菊糖醇的方法，其特征在于，该方法包含：利用权利要求1所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶；
(2)在存在细胞色素P450氧化还原蛋白的情况下，利用步骤(1)所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶将贝壳烯酸转化为甜菊糖醇。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的细胞色素P450氧化还原蛋白由步骤(1)所述的宿主细胞表达。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的宿主细胞中包含的重组载体中还包括：细胞色素P450氧化还原蛋白的编码基因。
16.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的贝壳烯酸-13α-羟化酶以及食品学或工业上可接受的载体。
CN201410105875.8A 2014-03-20 2014-03-20 一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶、其编码基因及其应用 Active CN104928263B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410105875.8A CN104928263B (zh) 2014-03-20 2014-03-20 一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶、其编码基因及其应用
PCT/CN2015/074344 WO2015139599A1 (zh) 2014-03-20 2015-03-17 新的贝壳烯酸-13α-羟化酶、其编码基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410105875.8A CN104928263B (zh) 2014-03-20 2014-03-20 一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶、其编码基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104928263A CN104928263A (zh) 2015-09-23
CN104928263B true CN104928263B (zh) 2018-03-23

Family

ID=54115690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410105875.8A Active CN104928263B (zh) 2014-03-20 2014-03-20 一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶、其编码基因及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN104928263B (zh)
WO (1) WO2015139599A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4043558A3 (en) * 2015-10-05 2022-11-16 DSM IP Assets B.V. Kaurenoic acid hydroxylases
US10760085B2 (en) 2015-10-05 2020-09-01 Dsm Ip Assets B.V. Kaurenoic acid hydroxylases
SG11202111698SA (en) * 2019-05-03 2021-11-29 Amyris Inc Kaurenoic acid 13-hydroxylase (kah) variants and uses thereof
CN118166046A (zh) * 2022-12-09 2024-06-11 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 新型对映-贝壳杉烯羟化酶及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011019875A2 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Melaleuca, Inc. Antioxidant dietary supplement compositions
CN102220398A (zh) * 2010-04-16 2011-10-19 Cj第一制糖株式会社 通过循环利用由甜叶菊甙a制造方法产生的副产物来以高产率制造甜叶菊甙a的方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7927851B2 (en) * 2006-03-21 2011-04-19 Vineland Research And Innovation Centre Compositions having ent-kaurenoic acid 13-hydroxylase activity and methods for producing same
WO2012075030A1 (en) * 2010-11-30 2012-06-07 Massachusetts Institute Of Technology Microbial production of natural sweeteners, diterpenoid steviol glycosides
CN104203005A (zh) * 2012-01-23 2014-12-10 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 二萜的生产

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011019875A2 (en) * 2009-08-12 2011-02-17 Melaleuca, Inc. Antioxidant dietary supplement compositions
CN102220398A (zh) * 2010-04-16 2011-10-19 Cj第一制糖株式会社 通过循环利用由甜叶菊甙a制造方法产生的副产物来以高产率制造甜叶菊甙a的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin;C. J. Paddon等;《Nature》;20131010;第496卷(第7446期);528-532 *
复杂天然产物合成人工生物系统的设计与构建;汪建峰等;《生物工程学报》;20150825;第29卷(第8期);1146-1160 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104928263A (zh) 2015-09-23
WO2015139599A1 (zh) 2015-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2902410B1 (en) Method for producing stevioside compounds by microorganism
JP7504946B2 (ja) 一連の糖鎖伸長を触媒するｕｄｐ－糖転移酵素およびその使用
CN113136373B (zh) 碳苷糖基转移酶及其应用
CN104312996B (zh) α‑L‑鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用
CN104928263B (zh) 一种新的贝壳烯酸‑13α‑羟化酶、其编码基因及其应用
WO2021164673A1 (zh) 双功能碳苷糖基转移酶及其应用
CN107435049A (zh) 一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用
KR102418138B1 (ko) 글리코실트랜스퍼라제, 돌연변이체 및 이의 응용
CN113862290B (zh) 一种来源于甘草的异黄酮4′-o-甲基转移酶及其应用
CN108300726A (zh) α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株
CN103243083B (zh) 一种新的倍半萜合成酶及其用途
CN112831481B (zh) 糖基转移酶以及催化糖链延伸的方法
WO2023006109A1 (zh) 鼠李糖高度专一的糖基转移酶及其应用
CN113667655B (zh) 一种仙茅糖基转移酶Co84A-471基因及在制备苔黑酚葡萄糖苷中的应用
CN110283806A (zh) 一种紫色红曲霉酯合成酶lip05-50、编码基因及其应用
CN114277024B (zh) 一种新型三萜合酶及其应用
CN112553175B (zh) 糖基转移酶ugt76g1突变体的制备及其应用
CN108866142A (zh) 细胞色素p450、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素p450还原酶及其应用
CN113755464B (zh) 一种参与桂叶苷B和毛蕊花糖苷生物合成的LrUGT2蛋白及其编码基因与应用
CN113444703B (zh) 催化糖链延伸的糖基转移酶突变体及其应用
CN109868265B (zh) 新型糖基转移酶及其应用
CN113755458B (zh) 一种参与紫草素和/或阿卡宁生物合成的cyp82ar2蛋白及其编码基因与应用
CN119082198A (zh) 三尖杉烷二萜合成酶、其制备方法及其应用
CN115975827A (zh) 用于甜茶素生产的宿主细胞及方法
CN116987683A (zh) 一种催化欧芹酚生成蛇床子素的o-甲基转移酶及其编码基因与应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200610

Address after: 200032 building 4, No. 300 Fenglin Road, Xuhui District, Shanghai

Patentee after: Center for excellence and innovation in molecular plant science, Chinese Academy of Sciences

Address before: 200031 Yueyang Road, Shanghai, No. 319, No.

Patentee before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES