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CN104919045A - 球形节杆菌生产的酮糖3-差向异构酶 - Google Patents

球形节杆菌生产的酮糖3-差向异构酶 Download PDF

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CN104919045A
CN104919045A CN201380069857.2A CN201380069857A CN104919045A CN 104919045 A CN104919045 A CN 104919045A CN 201380069857 A CN201380069857 A CN 201380069857A CN 104919045 A CN104919045 A CN 104919045A
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ketose
epimerase
enzyme
psicose
fructose
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何森健
P·K·古洛帕利
新谷知也
吉川谅
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Matsutani Chemical Industries Co Ltd
Rare Sugar Production Technical Research Laboratories LLC
Original Assignee
Matsutani Chemical Industries Co Ltd
Rare Sugar Production Technical Research Laboratories LLC
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Abstract

本发明提供一种能够在食品产业中使用的安全性高的差向异构酶以及酮糖的制造方法。本发明提供一种可以由属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物得到的具有序列表中的序列号1所示的氨基酸序列和下述底物特异性的酮糖3-差向异构酶：(1)将D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖；(2)在D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。以及，一种酮糖3-差向异构酶，其将序列表中的序列号3或序列号4所示的D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖。

Description

球形节杆菌生产的酮糖3-差向异构酶
技术领域
本发明涉及一种具有特定的氨基酸序列的酮糖3-差向异构酶、以及使用该酶制造酮糖的方法，具体而言，涉及具有特定的氨基酸序列的，可以由球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30(保藏编号NITEBP-1111)得到的，并且具有下述(A)和(B)的底物特异性的酮糖3-差向异构酶，进一步涉及使用了该酶的酮糖的制造方法。
(A)将D-或L-酮糖的3位进行差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖；
(B)在D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。
背景技术
D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，在甜味的强度和种类方面与D-果糖极其相似。但是D-阿洛酮糖与D-果糖不同，在体内吸收时几乎不被代谢，热量贡献低。在专利文献1中记载了能够将D-阿洛酮糖作为低卡路里甜味剂有利地利用于低卡路里饮食品的制造中。即，D-阿洛酮糖可以作为减肥食品的有效成分使用。被作为非砂糖甜味剂广泛利用的糖醇类如果摄取超过规定量，则会引起腹泻等的副作用，但是D-阿洛酮糖这样的副作用少。进一步，由于D-阿洛酮糖在人体内几乎不被代谢，因此，热量值大致接近零，通过抑制脂质合成酶的活性而具有减少腹部脂肪的功能。因此，D-阿洛酮糖也可以作为有益于体重减少的甜味剂使用(例如，参照非专利文献1和2)。另外，在专利文献2中记载了由于D-阿洛酮糖具有抑制血糖上升作用，因此，可以有利地用于健康食品、糖尿病患者用饮食品、瘦身用饮食品等中。从这样的观点出发，D-阿洛酮糖集中了作为健康食品、减肥甜味剂的多个关注点，在食品产业中，对于高效且安全地生成D-阿洛酮糖的方法的开发的必要性提高。
另一方面，在非专利文献3中公开了来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)ST-24的D-酮糖3-差向异构酶，并且记载了可以通过利用该酶由D-果糖来制造D-阿洛酮糖。然而，正如该酶的别名被称为D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase)那样，已知其对D-塔格糖的特异性最高，对D-果糖的作用比较弱。另外，菊苣假单胞菌是植物病原性微生物，D-酮糖3-差向异构酶生产能力非常低，因此，还不能说其适合利用于工业上。因此寻求与属于假单胞菌属的微生物不同的、酮糖3-差向异构酶产生能力高且在食品生产中在安全性上没有问题的微生物，以及对D-果糖的特异性高且适于D-阿洛酮糖的制造的新型酮糖3-差向异构酶。
因此，在专利文献3中，以提供一种新型的酮糖3-差向异构酶及其制造方法、编码该酶的DNA、含有该DNA的重组DNA以及转化体、以及使用了该酶的酮糖的制造方法为课题，并通过提供能够由属于根瘤菌属(Rhizobium)的微生物得到的酮糖3-差向异构酶及其制造方法、编码该酶的DNA和含有该DNA而成的重组DNA以及转化体、以及利用该酶将D-或L-酮糖的3位差向异构化，并制造对应的D-或L-酮糖的方法，从而解决了上述课题。另外，在专利文献4中开发了使用来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的D-阿洛酮糖差向异构酶(以下称为阿洛酮糖3-差向异构酶)的D-阿洛酮糖的生成方法。
如上所述，为了处理上述问题，对使用D-果糖作为底物，用酶生成D-阿洛酮糖的方法进行了研究。然而，至今开发的方法在用于作为食品的D-阿洛酮糖的生成中，在安全性方面问题点还很多。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2001-011090号公报
专利文献2：日本特开2005-213227号公报
专利文献3：WO2007/058086号公报
专利文献4：日本特表2008-541753号公报
非专利文献
非专利文献1：Matsuo,T.,Y.Baba,M.Hashiguchi,K.Takeshita,K.Izumori and H.Suzuki,Asia Pac.J.Clin.Nutr.,10:233-237(2001)
非专利文献2：Matsuo,T.and K.Izumori,Asia Pac.J.Clin.Nutr.,13:S127(2004)
非专利文献3：Ken Izumori et al,Biosci.Biotech.Biochem.,57,1037-1039(1993)
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供从作为在制造食品时使用被认可的、收录于现有添加物名册收录清单中的菌种并且几乎没有毒性的菌种中，以高收率取得催化从D-果糖向D-阿洛酮糖的异构化的新型酮糖3-差向异构酶，以及使用了该酶的酮糖的制造方法。
本发明者们每次有机会就采集各地的土壤，从其中分离微生物，持续探索具有酮糖3-差向异构酶产生能力的属于假单胞菌属的微生物以外的微生物。除了上述日本现有添加物名册收录清单以外，还着眼于在欧洲和美国作为食品使用被认可的清单中记载的菌种中几乎没有毒性的菌种，持续专门探索。
其结果，在大量分离的菌株中发现了产生新型的酮糖3-差向异构酶的属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物。另外，来自该微生物的新型的酮糖3-差向异构酶具有作用于D-或L-酮糖的3位，催化向对应的D-或L-酮糖进行差向异构化的广泛的底物特异性，并意外地发现其在D-或L-酮糖中，对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高，适于由D-果糖制造D-阿洛酮糖。从而确立了能够通过属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物得到的新型酮糖3-差向异构酶及其制造方法，并且确立利用了该酶的酮糖的转换方法以及酮糖的制造方法，从而完成了本发明。
即，本发明的目的在于提供一种能够由属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物得到的酮糖3-差向异构酶，并且提供一种利用该酶将D-或L-酮糖的3位进行差向异构化，制造对应的D-或L-酮糖的方法。
属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物的新型酮糖3-差向异构酶产生能力比较高，并且和菊苣假单胞菌不同，不具有植物病原性。另外，能够由该微生物得到的本发明的酮糖3-差向异构酶尤其能够良好地催化D-阿洛酮糖和D-果糖间的相互转换，因此，对于由D-果糖制造D-阿洛酮糖有用。
解决课题的技术手段
本发明以下述(1)至(5)中记载的酮糖3-差向异构酶为要点。
(1)一种酮糖3-差向异构酶，其中，所述酮糖3-差向异构酶来自作为球形节杆菌M30(保藏编号为NITE BP-1111)的微生物，作为部分氨基酸序列，包含序列表中的序列号1所示的氨基酸序列，具有下述(A)、(B)的底物特异性，并且具有下述(A)～(B)的物理化学性质：
(A)将D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖；
(B)在D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。
(2)如上述(1)所述的酮糖3-差向异构酶，其中，具有下述(a)～(f)的物理化学性质，
(a)分子量：
通过SDS-PAGE测定的亚单位的分子量为约32kDa，通过凝胶过滤法测定的分子量为120kDa，是亚单位的分子量为32kDa的同源四聚体(homotetramer)结构；
(b)最佳pH：
在30℃下、反应30分钟、20mM的镁(Mg2+)存在下的条件下为6至11；
(c)最佳温度：
在pH7.5下、反应30分钟、20mM的镁(Mg2+)存在下的条件下为60至80℃；
(d)pH稳定性：
在4℃、保持24小时的条件下至少在pH5至11的范围内稳定；
(e)热稳定性：
在pH7.5、保持1小时、4mM的镁离子(Mg2+)存在下的条件下，在约50℃以下稳定。在镁离子(Mg2+)不存在的条件下，在约40℃以下稳定；
(f)通过金属离子的活化，
通过二价锰离子(Mn2+)、二价钴离子(Co2+)、钙(Ca2+)以及镁离子(Mg2+)进行活化。
(3)如上述(1)或(2)所述的酮糖3-差向异构酶，其中，具有下述的底物特异性1.～8.，
1.将D-果糖作为底物时的相对活性为43.8％；
2.将D-阿洛酮糖作为底物时的活性为100％；
3.将D-山梨糖作为底物时的相对活性为1.13％；
4.将D-塔格糖作为底物时的相对活性为18.3％；
5.将L-果糖作为底物时的相对活性为0.97％；
6.将L-阿洛酮糖作为底物时的相对活性为21.2％；
7.将L-山梨糖作为底物时的相对活性为16.6％；
8.将L-塔格糖作为底物时的相对活性为44.0％，
其中，将D-阿洛酮糖的差向异构化活性作为100时对各酮糖的活性作为相对活性来表示。
另外，本发明以用下述所记载的碱基序列特定的基因编码的酮糖3-差向异构酶为要点。
(4)一种酮糖3-差向异构酶，其中，所述酮糖3-差向异构酶由序列表中的序列号3或序列号4所示的碱基序列、或者序列表中的序列号3或序列号4所示的碱基序列中在保持编码的酶的活性的范围内缺失、置换或加成有1个或2个以上的碱基序列而成的碱基序列、或者与其互补的碱基序列编码的，将D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖。
(5)如上述(7)所述的酮糖3-差向异构酶，其中，酮糖3-差向异构酶是D-阿洛酮糖异构酶。
进一步，本发明以下述(6)所记载的酮糖的转换方法、以及下述(7)所记载的酮糖的制造方法为要点。
(6)一种酮糖的转换方法，其特征在于，使上述(1)～(5)中任一项所述的酮糖3-差向异构酶作用于含有选自D-或L-酮糖中的1种以上的溶液，将该酮糖的3位差向异构化。
(7)一种酮糖的制造方法，其特征在于，使上述(1)～(5)中任一项所述的酮糖3-差向异构酶作用于含有选自D-或L-酮糖中的1种以上的溶液，将该酮糖的3位差向异构化，生成对应的酮糖并采集该酮糖。
发明的效果
本发明产生以下的效果。
1.作为将来自球形节杆菌的本酶用于食品产业中的最大优势在于菌的安全性。
2.对于D-阿洛酮糖生产菌的最佳pH，假单胞菌属(Pseudomonas)为7～9，根瘤菌属(Rhizobium)为9～9.5，土壤杆菌属(Agrobacterium)为7～8。另一方面，通过本菌株得到的酶的最佳pH在6～8之间，在着色少的7以下的pH下也能够生产D-阿洛酮糖。
3.根据测定了30分钟的酶活性的结果，报告了根瘤菌属(Rhizobium)通过Mn2+、Mg2+会增加活性，土壤杆菌属(Agrobacterium)通过Co2+、Mn2+会增加活性。在本酶的情况下，确认了通过Mn2+和Co2+会增加活性。另外，通过Mg2+、Ca2+也会增加活性。
4.与现有的酶比较可以在宽的温度带进行反应。
5.由L-塔格糖向L-山梨糖的反应活性大。
6.即使培养基中添加的D-阿洛酮糖少至0.15％也可以得到具有活性的菌体。
7.在水中也有酶活性，进行由果糖向阿洛酮糖的反应。
8.繁殖速度大于菊苣假单胞菌。
9.包含序列表中的序列号3或序列号4所示的碱基序列的酮糖3-差向异构酶具有30～37倍左右的酶活性。
根据本发明，可以由作为在制造食品时使用被认可的、现有添加物名册收录清单中收录的菌种的几乎没有毒性的菌种以高收率取得能催化由D-果糖向D-阿洛酮糖的异构化的新型酮糖3-差向异构酶。进一步，可以提供使用了该酶的制造酮糖的方法。
即，本发明可以提供能够由属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物得到的酮糖3-差向异构酶，并且能够提供利用该酶将D-或L-酮糖的3位差向异构化并制造对应的D-或L-酮糖的方法。能够由该微生物得到的本发明的酮糖3-差向异构酶尤其能够良好地催化D-阿洛酮糖和D-果糖之间的相互转换，因此，对于由D-果糖制造D-阿洛酮糖有用。
附图说明
图1是表示使用了无机盐培养基的各种碳源对酶生产量的影响的图。
图2是表示在各种培养基中对酶生产量的影响的图。
图3是表示金属离子对D-PE活性的影响的图。
图4是表示最佳温度的图。
图5是表示热稳定性的图。
图6是表示最佳pH的图。
图7是表示pH稳定性的图。
图8是表示通过离子交换色谱进行的分离洗脱的图。
图9是表示通过疏水色谱进行的分离洗脱的图。
图10是用于确认纯度的SDS-PAGE照片。
图11是表示最佳pH的范围的图。
图12是表示最佳温度的范围的图。
图13是表示稳定的pH范围的图。
图14是表示稳定的温度范围的图。
图15是表示泳动距离(migration distance)与分子量的关系的图。
图16是表示标准蛋白质的移动距离的关系图与分子量的关系的图。
图17是表示使用了大肠杆菌表达体系的AgM30菌株DPE基因产物的分析结果的图。
图18是表示使用了大肠杆菌表达体系(pQE载体)的AgM30菌株DPE基因产物的分析结果的图。
具体实施方式
本发明涉及一种能够由属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物得到的，具有下述底物特异性的酮糖3-差向异构酶，在能够用于食品工业的菌的安全性、低最佳pH、热稳定性以及金属要求性方面有特点。
[安全性]
对于本酶，作为在食品产业中使用的球形节杆菌的最大优势在于菌的安全性。该菌种首先在美国由FDA作为“来自固定化球形节杆菌的葡萄糖异构酶(Glucose isomerase from immobilized arthrobacterglobiformis)”被收录于EAFUS(Everything Added to Food in the UnitedStates)：食品添加物数据库(A Food Additive Database)中。该使用方法是将菌体直接固定化，因此，证明了菌体本身的安全性非常高。
另外，在欧洲，由EFFCA(欧洲食品与饲料菌种协会(The Europeanfood&feed cultures association))和IFD(国际屋面联合会(InternationalFederation for the Roofing Trade))在《有文献记载的用于食品的微生物名单(Inventory of Microorganisms with a documented history of use infood)》中记载了其作为“柑橘发酵以除去柠檬苦素并减少苦味(Citrusfermentation to remove limonin and reduce bitterness)”被使用的要点。这显示与酵母等同样，将该菌种用于发酵中，并显示安全性极高。在日本，节杆菌属作为“α-淀粉酶、异麦芽糖葡聚糖酶(isomaltodextranase)、蔗糖酶(invertase)、尿素酶、葡聚糖酶、α-葡萄糖基转移酶、果糖基转移酶等酶基原微生物或者作为海藻糖或维生素K(甲萘醌)生产菌而被收录于食品添加物清单中。
这样尽管在日美欧有很长的使用实际成绩，但是令人惊讶地是还没有发现由该菌种产生的差向异构酶。
另一方面，作为至今已知的D-阿洛酮糖的生产酶，有通过假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)等产生的酶。这些没有被收录于上述美欧的清单中，也有作为机会致病菌或植物细胞感染等的报告。
另外，由作为糖质酶的代表性的酶的葡萄糖异构酶产生的葡萄糖到果糖的生产中报告有许多的菌株(60种以上)，但是实用化的菌株只不过是链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、游动放线菌属(Actinoplanes)、节杆菌属等少数的属中的应用。这样，节杆菌属是具有食用实际成绩的安全性高的菌种。
[最佳pH和金属要求性]
进一步，作为本发明的优势在于以下的事项。
对于D-阿洛酮糖生产菌的最佳pH，假单胞菌属为7～9，根瘤菌属为9～9.5，土壤杆菌属为7～8。另一方面，由本菌株产生的酶的最佳pH在6～8之间，即使在着色少的7以下的pH也能够生产D-阿洛酮糖。
另外，根据测定30分钟的酶活性得到的结果，报告了根瘤菌属时用Mn2+、Mg2+会增加活性，土壤杆菌属时用Co2+、Mn2+会增加活性。在本酶的情况下，发现通过Mn2+和Co2+会增加活性。另外，由于通过Mg2+、Ca2+也会增加活性，因此，通过使用了Mg2+等的本菌株而能够生产D-阿洛酮糖。
[菌株的来源和鉴定]
本发明者们在许多分离的菌种中发现了产生新型酮糖3-差向异构酶的微生物M30株，M30株通过基于16SrRNA基因碱基序列同源性的系统分析，判定属于球形节杆菌。
菌株的鉴定
(1)16SrRNA基因碱基序列同源性
分析16SrRNA基因区域，并确定碱基数为734。
(2)同源性检索
对于该菌株的16SrRNA基因的碱基序列，通过BLAST检索(日本DNA数据库)进行与已知菌种的同源性检索。根据相对于上述确定了碱基数为734的碱基序列同源性为97％以上的菌株名称和同源性(％)的值确定了M30株的微生物为球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)。
本发明的作为具有酮糖3-差向异构酶活性的菌株的球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30在2011年6月22日保藏在位于千叶县木更津市上总镰足2-5-8的独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心，首先以受理编号NITE AP-1111受理，再作为保藏编号NITE P-1111保藏。
本发明中所说的酮糖是具有酮糖结构的六碳糖，具体来说，是指果糖、阿洛酮糖、塔格糖以及山梨糖，D-或L-酮糖是指它们的D-体和L-体。
本发明的酮糖3-差向异构酶具有将D-或L-酮糖的3位差向异构化从而生成对应的D-或L-酮糖的活性，并催化D-或L-果糖与D-或L-阿洛酮糖之间的相互转换、以及D-或L-塔格糖与D-或L-山梨糖之间的相互转换。本发明的酮糖3-差向异构酶是在D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高的酶。本发明的酶可以由后述的属于节杆菌属的微生物得到。
本发明的酮糖3-差向异构酶可以通过培养属于节杆菌(Arthrobacter)属并具有酮糖3-差向异构酶产生能力的微生物，从在培养液中繁殖的菌体中采集酮糖3-差向异构酶来进行调制。作为属于节杆菌(Arthrobacter)属的微生物，例如可以有利地利用球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30(保藏编号NITE BP-1111)株以及它们的变异株等。M30株的酮糖3-差向异构酶的产生能力比较高，在得到本发明的酶方面优选。M30株于2012年5月2日请求从2011年6月22日原保藏于日本独立行政法人制品评价技术基础机构专利生物保藏中心(日本千叶县木更津市东上总镰足2-5-8)的NITE P-1111移管至基于布达佩斯条约的保藏，并以保藏编号为NITE BP-1111进行国际保藏。
[精制前的本酶的物理化学性质]
精制前的酶、酮糖3-差向异构酶的活性可以通过将D-果糖作为底物并测定D-阿洛酮糖的生成量来进行测定。具体来说，酶反应液组成使用50mM tris-HCl缓冲液(pH7.0)200ml、0.2M D-果糖375μl、酶液100μl、10mM氯化锰75μl，在55℃下反应30分钟，煮沸2分钟以停止反应，通过HPLC测定反应后的液体组成。1单位的酶活性定义为在上述条件下将D-果糖差向异构化，在1分钟内生成1μmol的D-阿洛酮糖的酶量。对于作为逆反应的由D-阿洛酮糖差向异构化为D-果糖的酶单位也在同样的条件下进行测定并同样地定义。
本发明的酮糖3-差向异构酶存在具有下述物理化学性质的情况。
(a)最佳pH
在55℃下反应30分钟，1mM的二价钴离子(Co2+)存在下的条件下，为6.0～10。
(b)最佳温度
在pH7.0下反应30分钟，1mM的二价钴离子(Co2+)存在下的条件下，为约50℃至约70℃。
(c)pH稳定性
在4℃下保持24分钟，至少在pH5.5至11的范围内稳定。
(d)热稳定性
在pH7.0下保持10分钟，在1mM的二价钴离子(Co2+)存在的条件下，在约70℃以下稳定；在1mM的二价钴离子(Co2+)不存在的条件下，在约60℃以下稳定。
(e)通过金属离子的活化
通过二价锰离子(Mn2+)或二价钴离子(Co2+)进行活化。
酮糖的转换反应通常在以下的条件下进行。底物浓度为1至60％(w/v)，优选为约5至50％(w/v)；反应温度为10至70℃，优选为约30至60℃；反应pH为5至10，优选为约7至10；酶活性每1克底物为1单位以上，优选为选自50至5,000单位的范围。反应时间可以适当选择，由于与经济性的关系，在分批反应的情况下，通常选择5至50小时的范围。
这样使之转换得到的反应溶液含有原料的酮糖和新生成的酮糖，可以有利地实施将其直接用作甜味剂、保湿剂、结晶析出防止剂、酱油糖汁赋予剂等。通常反应溶液可以按照常用方法使用活性碳进行脱色，使用H型和OH型离子交换树脂进行脱盐、浓缩，从而得到糖浆状产品。
如果需要也可以进一步将该浓缩液通过使用例如碱金属型或碱土金属型强酸性阳离子交换树脂的柱色谱来分离精制新生成的酮糖和原料酮糖，将高浓度含有新生成的酮糖的成分浓缩，并得到糖浆状产品，进一步，在能够结晶化的酮糖的情况下，可以有利地实施使之结晶析出从而得到结晶产品。另外，也可以有利地实施将该分离后的原料的酮糖再次用于转换反应的原料。
这样得到得酮糖优选作为甜味剂，可以有利地用于饮食物、饲料、饵料、牙膏、口香片、舌下片、内服药等经口摄取物的甜味赋予、嗜好性提高等。另外，也可以有利地用作发酵用碳源、试剂、化学品·医药品的原料、中间体等。
以下通过实验来详细地说明本发明。另外，在以下的实验中，通过上述的活性测定法测定将D-阿洛酮糖转换为D-果糖的D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性，记为酮糖3-差向异构酶活性。
另外，本发明不仅包含由序列表中序列号3或序列号4所示的碱基序列编码的，将D-或L-酮糖的3位差向异构化生成对应的D-或L-酮糖的酮糖3-差向异构酶，还包含由在保持编码的酶的活性的范围内序列表中序列号3或序列号4所示的碱基序列缺失、置换或加成有1个或2个以上的碱基序列而成的碱基序列，或者与其互补的碱基序列编码的，将D-或L-酮糖的3位差向异构化生成对应的D-或L-酮糖的酮糖3-差向异构酶。
<实验1：球形节杆菌M30(保藏编号NITE BP-1111)株的培养>
在将0.2％D-阿洛酮糖作为碳源且将硫酸铵作为氮源的无机盐培养基中无菌地添加球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30(保藏编号NITE BP-1111)株的种培养液1％(v/v)，一边通气搅拌一边在30℃下培养16小时。得到的培养液中的酮糖3-差向异构酶活性为约14单位/100ml培养液。
<实验2：球形节杆菌M30(保藏编号NITE BP-1111)株的培养和粗酶的提取>
通过离心分离从培养液中回收菌体。回收的菌体使用1mM tris-HCl缓冲液(pH7.0)进行清洗。接着，将菌体悬浊于10ml的1mM tris-HCl缓冲液(pH7.0)中之后，将该菌体悬浊液在冰水中冷却并且用超声波均质器(SONICS&MATERIALS Inc.)进行细胞破碎。将破碎物以12000rpm离心20分钟，将该离心上清液作为粗酶。
<实验3：粗酶的透析>
在纤维素酯透析膜(Cellulose Ester Dialysis Membrane)(SPECTRUM Laboratory Corporation)中加入粗酶，将膜整体浸渍在含有20mM的EDTA的10mM tris-HCl缓冲液中12小时进行透析。将膜用10mM tris-HCl(pH7.0)缓冲液清洗2次之后，从膜中取出粗酶液。
<实验4：酶活性的检测>
通过下述的反应条件分别使之反应之后，通过煮沸停止反应。通过离子交换树脂对反应液进行脱盐，进行过滤器处理从而调制了HPLC样品。样品在HPLC系统(Tosoh Corporation)中使用CK08EC(三菱化学)进行色谱分析。从色谱图的峰面积值算出生成的各种糖。
<试验结果>
<实验5：酮糖3-差向异构酶的性质>
1.碳源及其浓度对活性的影响
在含有0.05-1％的D-阿洛酮糖(D-p)、1％的D-果糖(D-f)、1％的D-塔格糖(D-t)、0.1％果糖(D-f)以及0.1％D-阿洛酮糖(D-p)、1％D-阿洛酮糖(D-p)以及0.1％D-塔格糖(D-t)的MSM培养基中培养球形节杆菌M30(保藏编号NITE BP-1111)株，并调查用与上述同样的操作得到的粗酶的各活性。
其结果(图1)，由于在D-阿洛酮糖存在时产生本菌的酶，因此，明显为由D-阿洛酮糖的诱导酶，在D-阿洛酮糖浓度为0.2％时显示最高活性。
2.培养基对酶活性的影响
用3种不同的培养基(无机盐最少的(MSM)培养基、TSB培养基、以及酵母提取物(YE)培养基)在30℃下培养16小时，通过与上述同样的方法得到了粗酶。
其结果(图2)可知通过在最廉价且无机盐最少的培养基中添加D-阿洛酮糖，酶的酶活性最高。
3.金属离子对D-PE活性的影响
使用实验3中所示的对含有EDTA的缓冲液进行了透析的酶液，在以下的表1所示的反应条件下测定酶活性。将得到的结果示于图3中。
通过对EDTA进行透析从而活性消失显示本酶要求金属离子。测定了金属离子对酶活性产生的影响，结果通过添加MnCl2、CoCl2从而酶活性增大了。由此确认了本酶要求Mn2+或Co2+。
[表1]
4.温度对D-PE活性的影响(最佳温度)
在10～80℃的各种温度下进行反应。求得最佳温度的反应条件示于表2中。将测定结果示于图4中。在50℃至70℃的温度范围内存在最佳温度。
[表2]
5.温度对D-PE活性的影响(热稳定性)
对于热稳定性，对钴离子存在的情况和钴离子不存在的情况进行了探讨。在1mM的钴离子的存在下，在pH7.0下以10-80℃进行10分钟热处理，测定了残留活性。将其结果示于图5中。可知这样在钴离子存在的情况下直至70℃稳定，在钴离子不存在的情况下直至60℃稳定。
6.pH对D-PE活性的影响(最佳pH)
进行各种pH下的酶反应，求得最佳反应pH。各个pH下使用的缓冲液如下所示。使用了pH3-6的50mM柠檬酸缓冲液、pH6.0-8.0的50mM磷酸缓冲液、pH7.0-9.0的tris-HCl缓冲液、以及pH9.0-11.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。反应条件示于表3中。将得到的结果示于图6中。可知最佳pH为6～10的范围。
[表3]
7. pH对D-PE活性的影响(pH稳定性)
在4℃下将酶保持于各个pH24小时，并在55℃下反应30分钟从而求得残留的酶活性。将其结果示于图7中。本酶显示约pH6至pH11的宽范围的pH稳定性。
8. D-PE的底物特异性
使用8种六单糖(酮糖)对精制前的本酶的底物特异性进行研究。酶反应组成如表4所示以各底物0.2M 350μl、酶液350μl(Tris缓冲液pH7.0)在55℃下反应30分钟，并通过HPLC的分析来测定由各糖被差向异构化生产的酮糖。其结果如下所述。将D-阿洛酮糖的差向异构化反应作为100，将对各酮糖的活性作为相对活性来表示。将D-果糖(D-fructose)、D-阿洛酮糖(D-psicose)、D-山梨糖(D-sorbose)、D-塔格糖(D-tagatose)、L-果糖(L-fructose)、L-阿洛酮糖(L-psicose)、L-山梨糖(L-sorbose)、D-塔格糖(D-tagatose)、L-果糖(L-fructose)、L-阿洛酮糖、L-塔格糖(L-tagatose)作为底物将活性作为相对活性示于表5中。对D-阿洛酮糖的活性最强，其次为D-果糖。这些的底物特异性如果与其它游离的酮糖3-差向异构酶相比，则可以称为D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)，显示与菊苣假单胞菌的D-塔格糖3-差向异构酶(DTE)明显不同的特异性。
[表4]
[表5]
底物 相对活性(％)
D-果糖(D-fructose) 58.14
D-阿洛酮糖(D-psicose) 100*
D-山梨糖(D-sorbose) 1.25
D-塔格糖(D-tagatose) 5.42
L-果糖(L-fructose) 12
L-阿洛酮糖(L-psicose) 12
L-山梨糖(L-sorbose) 8
L-塔格糖(L-tagatose) 12.5
[酶的精制与物理化学性质的测定]
接下来，将本发明的酶进一步精制为纯净的状态，测定物理化学性质。
[酶精制时和精制酶的活性测定以及蛋白质的测定]
对于酶活性的测定，使用表6所记载的酶反应液组成进行了酶反应。在30℃下进行30分钟酶反应，并将该条件下在1分钟内生成1μmole的D-果糖的酶量作为1单位。反应后，将反应液置于沸腾液中3分钟以停止反应，脱离子处理之后，通过HPLC分析测定了生成的D-果糖。另外，对于蛋白质的测定，通过Bradford法相对于250μl Bradford液添加5μL酶液，均匀搅拌之后进行测定。
[表6]
判定精制后的本酶为同源四聚体(homotetramer)结构的差向异构酶，其中，通过SDS-PAGE测定的亚单位的分子量为约32kDa，通过凝胶过滤法的分子量为120kDa。
[菌体的培养]
[菌的前培养]
将本菌接种于表7所示的培养基中进行前培养。在500ml三角烧瓶中加入100ml培养基，在30℃下以200rpm振荡培养了12小时。
[表7]
[主培养]
将前培养的生长培养基100mL接种于表8所示的主培养10L中，在30℃下以通气量2ml/min、300rpm进行24小时通气搅拌培养。
[表8]
[酶的提取]
从10L主培养中得到活菌体230g。将其悬浊于1L的缓冲液(10mMTris-HCl pH7.5+1mM MgCl2)中，使用高压均质机将菌体破碎，提取了酶。在破碎条件为20000psi下进行。通过离心分离(10000rpm，20min，4℃)除去不溶物，得到粗酶液1150ml。在酶的精制中使用该粗酶液的130ml。
[酶的精制]
[通过PEG(聚乙二醇)的分离]
在粗酶液130ml中添加26g PEG6000(浓度20％)，在低温下进行搅拌溶解。通过离心分离(10000rpm，20min，4℃)分离生成的沉淀和上清液。将沉淀溶解于30mL的缓冲液中。测定活性，其结果在沉淀中不存在活性。接着，在上清液中添加PEG 26g(终浓度为40％)，同样地分为生成的沉淀和上清液，并测定了活性。其结果在沉淀中没有发现活性。在上清液中发现有活性。
[PEG除去的方法]
即使PEG浓度为40％酶也不会沉淀，而存在于上清液中。为了对上清液的酶进行以下的精制过程，需要除去PEG。利用PEG不吸附于离子交换树脂的性质来除去PEG。具体来说，使酶吸附于离子交换树脂并冲洗PEG，其后，用高浓度的NaCl从树脂中洗脱吸附的酶，由此除去PEG。
将PEG除去的具体方法示于以下。
在用缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5+10mM MgCl2)平衡化后的Q-Sepharose Fast Flow 58mL中加入含有PEG40％的酶液，慢慢搅拌10分钟，从而使酶吸附。将该树脂装入柱(容积约50ml)中，用150ml缓冲液(1M NaCl+10mM Tris-HCl pH7.5+10mM MgCl2)进行洗脱。每次分离10ml并回收具有活性的部分。将其相对于缓冲液(10mMTris-HCl pH7.5+10mM MgCl2)进行一夜透析从而除去NaCl，得到PEG分离酶液。
[通过离子交换色谱进行的精制]
通过离子色谱分离法对PEG分离酶液进行精制。使用的柱为Q-Sepharose High Performance，使用AKTA系统在流速1.5ml/min下以1M NaCl的浓度梯度从35％到60％每次分别分离5ml的成分。图8所示的箭头的组分中酶活性被洗脱。将其回收通过离子交换色谱分离得到精制酶。在图8中显示离子交换色谱分离洗脱图。由于在蛋白质洗脱的图8的中央部用箭头表示的部分存在酶活性，因此回收了该部分。
对通过离子交换色谱分离精制得到的酶利用疏水色谱分离法进一步进行精制。使用的柱是RESOURCE PHE 6ml。在酶液中加入硫酸铵溶解至其成为2M。以流速3ml/min将2M的硫酸铵浓度从100％降低至0％进行洗脱，每次分离5mL。在图9的箭头的大峰处酶活性被洗脱。将该成分透析除去硫酸铵并得到了疏水色谱分离精制酶。在蛋白质的洗脱的第二大峰处存在活性。图9的箭头表示回收的成分。
[精制表]
对于酶的精制过程，将粗酶、PEG分离酶、离子交换色谱分离精制酶、疏水色谱精制酶的各个蛋白质量、酶活性等综合作为精制示于表9中。通过该精制得到收率为12％、精制倍率为31.5倍的精制酶。
[表9]
[精制酶的纯度]
按照常用方法使用SDS PAGE(凝胶浓度15％)确认了精制酶的纯度。在图10中，左边是标准的蛋白质，后面的2道是使用疏水色谱精制后的酶。该结果在29～45kDa之间确认有单一的带。由此确认了酶被纯净地精制。
[精制后的酶的性质]
对精制后的酶的性质进行了研究。
[反应最佳pH]
如图11所示，在pH6～11内显示活性，活性最高的pH为7.5。
在测定时，对于反应的最佳pH，使用D-阿洛酮糖作为底物，使用pH4～11的各种缓冲液在30℃下反应30分钟，使用HPLC测定来求得生成的D-果糖。将反应液组成示于表10中，将使用的缓冲液示于表11中。
[表10]
[表11]
[反应最佳温度]
从显示反应温度和测定总体活性得到的结果的图12可知，本酶的最佳温度在添加Mg2+离子时为70℃。在Mg2+离子不存在下最佳温度为60℃，在Mg2+离子存在下最佳温度显著变高，在60℃至80℃显示高活性。在图12中，用以在Mg2+离子存在下显示最高活性的70℃作为100时的相对活性来表示。反应条件如表12所示，将精制酶在pH7.5下以各温度反应30分钟，测定生成的D-果糖的量。对添加Mg2+离子的情况和不添加Mg2+离子的情况(添加水替代MgCl2)进行了研究。反应在20、30、40、50、60、70、80、90、100℃下进行30分钟。
[表12]
[pH稳定性]
研究了精制酶的pH稳定性的结果，如图13所示，可知直至pH5～11为止稳定。
测定条件为，在各pH下保持4℃24小时，通过pH7.5将该酶进行反应。残留活性的测定在pH7.5、30℃下进行了30分钟。使用的缓冲液使用与最佳pH下使用的同样的缓冲液。
在图13中，将柠檬酸缓冲液pH6的情况下的残留活性作为100，将各个pH下的残留活性作为相对活性来表示。
[热稳定性]
对于精制酶的热稳定性，对在Mg2+离子存在下或者不存在下进行了研究。在Mg2+离子存在的情况下和Mg2+离子不存在的情况下，热稳定性变化较大，Mg2+离子使酶的热稳定性增大。在Mg2+离子存在下在50℃下在1小时内稳定。另一方面，在Mg2+离子不存在的情况下，作为整体为低约10℃的热稳定性。另外，显示最佳反应温度为70℃，根据该结果显示本酶由于底物的存在而稳定性增加。即，认为显示ES复合体的稳定性高。图14中以将没有热处理的酶的活性作为100的相对活性来表示。
作为热处理条件，精制酶液40μl、缓冲液(10mM、Tris-HCl、pH7.5)160μl、4mM MgCl2(不添加Mg2+离子的情况下为水)100μl的总量为300μl，将其在各温度下保持1小时后，在冰水中冷却10分钟之后，按照通常的方法测定残留的酶活性。
[金属离子的影响]
对于酶的金属离子要求性进行了研究。在含有1mM EDTA的10mM Tris-HCl pH7.5中对精制酶进行2小时透析。其后，在不含EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液pH7.5中透析一昼夜，得到EDTA处理酶。使用该酶，在含有1mM各种金属离子的条件下将D-阿洛酮糖作为底物测定对其活性的影响。对于其结果，将无添加的酶活性作为100，以相对活性表示各金属离子添加时的活性，并且示于表13中。
确认了在Mg2+、Co2+、Mn2+的各离子存在下活性成为1.3倍以上，在Mg2+离子存在下为最高的活性。根据该结果，本酶可以通过Mg2+离子而被活化。如果考虑到热稳定性中Mg2+离子的大的影响，则可知在本酶反应中Mg2+离子是重要的。
[表13]
金属离子 相对活性(％)
Co2+ 130
Mn2+ 137
Mg2+ 150
Ca2+ 110
Ni2+ 87
Fe2+ 32
Zn2+ 0
Cu2+ 0
K+ 117
Na+ 120
无 100
[底物特异性]
对全部己酮糖都针对本酶的反应性进行了研究。反应液组成示于表14中。其结果，在表中以将D-阿洛酮糖作为100的相对活性来进行整理。本酶对全部己酮糖都显示活性，但是对D-阿洛酮糖显示最高的活性，明确为D-阿洛酮糖3-差向异构酶。对于底物特异性综合于表15中。D-山梨糖、L-果糖是在70℃下使之反应120分钟，除此之外都在70℃下使之反应20分钟求得初速度。
[表14]
[表15]
底物 相对活性(％)
D-阿洛酮糖 100
D-果糖 43.8
L-塔格糖 44.0
L-阿洛酮糖 21.2
D-塔格糖 18.3
L-山梨糖 16.6
D-山梨糖 1.13
L-果糖 0.97
[Km和Vmax]
测定了本酶的D-阿洛酮糖和D-果糖的Km和Vmax。测定在30℃、Mg2+离子存在下的酶活性测定的条件下进行。对于其结果D-阿洛酮糖，Vmax＝168U/mg，Km＝30.1mM，对于D-果糖，Vmax＝68.5U/mg，Km＝31.5mM。
[酶的分子量]
[亚单位的分子量]
通过SDS-PAGE(凝胶浓度为15％)来测定精制酶的移动距离和分子量标记的移动距离。其结果可知，本酶的亚单位的分子量为约32kDa。
图15中示出泳动距离与分子量的关系。图15显示标记蛋白质的泳动距离cm与分子量kDa之间的关系。从精制酶的移动距离为约4.1cm可以推定本酶的亚单位为约32kDa。另外，泳动图示于图10中。
[酶的分子量]
使用凝胶过滤色谱测定本酶的分子量。即，求得标准蛋白质与移动距离的关系图16，从本酶的移动距离来计算。其结果可知，酶的分子量为约120kDa。
在分子量的测定中，凝胶过滤色谱的柱使用了Superdex 200pg16/600。使用的电泳缓冲液(running buffer)组成为10mM Tris-HClpH7.5、200mM NaCl、1mM MgCl2。
使用标准蛋白质(标记)使用以下的5种。
由于本酶洗脱在72.5ml，因此，根据移动距离与分子量的关系进行计算，可知本酶的分子量为约120kDa。通过SDS-PAGE测定的亚单位的分子量为约32kDa，使用了凝胶过滤法的本酶的分子量为约120kDa。由此可以认为本酶为亚单位的分子量为32kDa的同源四聚体结构。
[与其它的DPE、DTE的比较]
将一直以来报告的D-塔格糖3-差向异构酶以及D-阿洛酮糖3-差向异构酶的性质综合于表16中。本菌株生产的酶与起源于其它微生物的己酮糖3-差向异构酶相比较，一大特点为最佳温度高。
[表16]
本发明的酮糖3-差向异构酶与其它的差向异构酶或异构酶同样是不需要辅酶的异构化反应。因此，能够将酶固定化来利用，可以通过各种固定化方法来得到活性高的固定化酶。通过使用固定化酶，能够连续地进行大量的差向异构化反应。通过能够工业地进行固定化，可以大量生产作为目标的酮糖。
[精制酶的推测氨基酸序列]
对通过上述得到的精制酶的氨基酸序列进行分析。用胰蛋白酶处理精制酶蛋白质(约0.1～0.2μg)，利用Bruker公司的UltraflxtremeMALDI-TOF MS分析片段的氨基酸序列。将其结果作为序列1(序列表序列号1)示于以下。
[序列1]
(其中，G：甘氨酸、A：丙氨酸、V：缬氨酸、L：亮氨酸、I：异亮氨酸、M：蛋氨酸、F：苯丙氨酸、W：色氨酸、Y：酪氨酸、P：脯氨酸、C：半胱氨酸、E：谷氨酸、D：天冬氨酸、Q：谷氨酰胺、N：天门冬酰胺、K：赖氨酸、R：精氨酸、H：组氨酸、S：丝氨酸、T：苏氨酸)
实施例1
使本微生物在以D-阿洛酮糖作为碳源的无机盐最少的培养基中繁殖，使用从繁殖菌体中得到的酶，对D-阿洛酮糖与D-果糖的平衡比进行研究。反应液组成使用50mM Tris缓冲液200μl、0.2M D-阿洛酮糖或者D-果糖、酶液100μl、10mM CoCl275μl。反应温度为50℃，反应24小时。反应结束后使用HPLC测定反应液中的D-果糖和D-阿洛酮糖的量。
其结果，以D-阿洛酮糖作为底物的情况和以D-果糖作为底物的情况都达成相同的平衡比。
平衡比D-阿洛酮糖:D-果糖＝27:73
该结果显示：如果使用D-果糖进行反应则其27％能够转换为D-阿洛酮糖，为明确显示能够由D-果糖生产D-阿洛酮糖的结果。
实施例2
使用精制后的酶对D-阿洛酮糖和D-果糖间的差向异构化的平衡进行研究。其结果，平衡状态下的D-阿洛酮糖:D-果糖在40℃下为25:75，在70℃下为30:70。
实施例3
[AgM30菌株通过全基因组分析的DPE基因碱基序列的特定]
根据上述试验的结果，AgM30菌株的DPE与已知的DPE完全不同，认为使用PCR扩增的方法或已知的蛋白质数据库可以进行分离。因此，确定AgM30菌株的全基因组序列并进行其蛋白质数据库的构筑。使用Qiagen公司的DNeasy Blood&Tissue试剂盒从AgM30菌株中分离、精制DNA，将其中19.58μg委托给TAKARA BIO INC.DragonGenomics Center的高速序列分析。其结果，得到了总分析碱基数为513569410bp且22个4kb以上的重叠群。由于该22个重叠群为约5.1Mb，因此，认为能够覆盖球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30的全基因组序列。
[AgM30菌株的蛋白质数据库的构筑]
基于得到的约5.1Mb的基因序列使用GeneMarkS程序推测4798个ORF，对于各个ORF推测氨基酸序列。将该4798氨基酸序列作为AgM30菌株的蛋白质数据库。
[AgM30菌株发现有DPE活性的蛋白质的再鉴定]
使用上述的蛋白质数据库，登录作为蛋白质鉴定系统的MASCOT服务器(Matrix Science K.K.)，进行发现有DPE活性的蛋白质的再鉴定。其结果，由下述序列2(序列表序列号2)构成的氨基酸序列中与带有下划线表示的氨基酸序列发现有52％的相似性，因此，强烈地启示了本蛋白质为AgM30菌株的DPE。
[序列2]
(序列2使用AgM30菌株的蛋白质数据库鉴定的氨基酸序列下划线部分所示的氨基酸序列为与用MALDI-TOF MS得到的峰一致的序列。)
[AgM30菌株的DPE基因的分离]
从氨基酸序列中获取基因组基因信息，设计扩增用的PCR引物(AglDPE_F：5'-ATGAAAATTGGTTGCCATG-3'，AglDPE_R：5'-TTAGTGCAGTTCGATGGT-3')，通过AgM30菌株的基因组对DPE基因进行扩增。进行其PCR产物的序列分析，结果得到了下述的序列11(序列表序列号3)所示的870bp的基因序列、以及由序列12(序列表序列号4)的带下划线所示的第15个的胞嘧啶(C)被置换为胸腺嘧啶(T)的序列构成的基因序列这2个碱基序列。
[序列3(序列表序列号3)]
ATGAAAATTGGTTGCCATGGCCTGGTTTGGACCGGCCACTTCGACGCTGAAGGCATTCGCTACTCCGTCCAGAAAACCAGGGAAGCCGGTTTCGACCTCGTTGAGTTCCCGCTCATGGATCCGTTCTCCTTCGATGTGCAGACGGCCAAGTCCGCACTGGCCGAACATGGGCTGGCGGCCTCGGCATCTCTGGGACTCTCGGACGCCACTGACGTAAGCAGCGAAGATCCCGCCGTCGTGAAGGCAGGGGAGGAGCTGCTCAACCGCGCCGTGGATGTTCTGGCCGAACTGGGTGCGACGGATTTCTGCGGCGTGATTTATAGCGCCATGAAGAAGTACATGGAGCCGGCAACTGCTGCCGGGCTGGCCAACAGCAAGGCAGCCGTCGGGCGGGTCGCGGACCGGGCATCGGATCTGGGGATCAATGTTTCGCTGGAGGTCGTCAACAGGTACGAAACCAACGTACTGAACACCGGACGTCAGGCCCTTGCCTACTTGGAGGAGCTCAACCGGCCGAACCTGGGCATCCACCTGGACACTTACCACATGAACATTGAGGAATCGGACATGTTCTCCCCGATCCTGGACACCGCGGAGGCCCTGCGGTACGTCCATATCGGCGAAAGCCACCGCGGCTACCTCGGCACGGGAAGCGTTGACTTCGACACTTTCTTCAAGGCCCTCGGCCGCATCGGCTATGACGGACCCGTTGTCTTCGAATCGTTCTCCTCCTCCGTCGTGGCACCGGATCTGAGCCGGATGCTCGGCATCTGGCGCAACCTGTGGGCCGACAACGAGGAACTGGGTGCGCACGCGAATGCCTTCATCCGCGACAAGCTCACCGCGATCAAGACCATCGAACTGCACTAA
(序列3(序列表序列号3)通过AgM30菌株的基因组DNA扩增的DPE基因序列。)
[序列4(序列表序列号4)]
ATGAAAATTGGTTGTCATGGCCTGGTTTGGACCGGCCACTTCGACGCTGAAGGCATTCGCTACTCCGTCCAGAAAACCAGGGAAGCCGGTTTCGACCTCGTTGAGTTCCCGCTCATGGATCCGTTCTCCTTCGATGTGCAGACGGCCAAGTCCGCACTGGCCGAACATGGGCTGGCGGCCTCGGCATCTCTGGGACTCTCGGACGCCACTGACGTAAGCAGCGAAGATCCCGCCGTCGTGAAGGCAGGGGAGGAGCTGCTCAACCGCGCCGTGGATGTTCTGGCCGAACTGGGTGCGACGGATTTCTGCGGCGTGATTTATAGCGCCATGAAGAAGTACATGGAGCCGGCAACTGCTGCCGGGCTGGCCAACAGCAAGGCAGCCGTCGGGCGGGTCGCGGACCGGGCATCGGATCTGGGGATCAATGTTTCGCTGGAGGTCGTCAACAGGTACGAAACCAACGTACTGAACACCGGACGTCAGGCCCTTGCCTACTTGGAGGAGCTCAACCGGCCGAACCTGGGCATCCACCTGGACACTTACCACATGAACATTGAGGAATCGGACATGTTCTCCCCGATCCTGGACACCGCGGAGGCCCTGCGGTACGTCCATATCGGCGAAAGCCACCGCGGCTACCTCGGCACGGGAAGCGTTGACTTCGACACTTTCTTCAAGGCCCTCGGCCGCATCGGCTATGACGGACCCGTTGTCTTCGAATCGTTCTCCTCCTCCGTCGTGGCACCGGATCTGAGCCGGATGCTCGGCATCTGGCGCAACCTGTGGGCCGACAACGAGGAACTGGGTGCGCACGCGAATGCCTTCATCCGCGACAAGCTCACCGCGATCAAGACCATCGAACTGCACTAA
(序列4(序列表序列号4)通过AgM30菌株的基因组DNA扩增的DPE基因序列由下划线部分所示的第15个的胞嘧啶(C)被置换为胸腺嘧啶(T)而成的序列构成。)
[使用了大肠杆菌表达体系的DPE基因产物的分析]
基于序列11(序列表序列号3)的序列进行大肠杆菌表达体系的构筑。在pET载体(Clontech公司)中嵌入来自AgM30菌株的DPE基因，转化表达用大肠杆菌。其结果，如图17所示在可溶性组成中确认有衍生蛋白质。另外，也可以确认有DPE活性，但是其活性在每1mL培养液中与野生型相同程度。
进一步，为了提高大肠杆菌表达体系中的活性，在pRSET载体(Invitrogen公司)和pCold载体(TAKARA BIO INC.)中嵌入来自AgM30菌株的DPE基因，制作大肠杆菌转化体。测定了在这些体系中生产的DPE的活性，结果为，每1mL培养液中在pRSET载体的体系中显示与野生型相同程度的活性，在pCold载体的体系中显示野生型的10倍左右的活性。
[使用了枯草杆菌表达体系的DPE基因产物的分析]
构筑了有报告称基因重组蛋白质的生产量多于大肠杆菌体系的枯草杆菌体系。在作为宿主的枯草杆菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)转化用pHT01载体(MoBiTec公司)中嵌入来自AgM30菌株的DPE基因，序列分析之后，进行了转化。其结果，能够得到许多获取了抗生素耐药性的转化体，因此，进行DPE基因诱导实验，但是没有发现产生DPE基因产物，也不能测定其活性。
[使用了大肠杆菌表达体系的DPE基因产物的大量生产]
由于在枯草杆菌体系中不能大量生产DPE基因产物，因此，再次使用大肠杆菌体系尝试大量生产来自AgM30菌株的DPE基因产物。因为在一直以来使用的载体的体系中以简便地进行重组蛋白质的精制的方式在N末端侧添加有His-tag或添加用于使之增溶的增溶化tag等，因此，认为会对重组蛋白质的生产量、酶活性有影响。在此使用在重组蛋白质中没有添加tag等的pQE载体(Qiagen公司)的体系。在pQE60载体(Qiagen公司)中嵌入来自AgM30菌株的DPE基因，转化作为其宿主的大肠杆菌M15[pREP4](Qiagen公司)，并对其表达产物进行分析。如果通过SDS-PAGE(凝胶浓度12％)进行电泳，则如图18所示，在显示与野生型的蛋白质大致相同分子量的约30kD附近的可溶性组分中确认有作为表达产物的蛋白质。另外，测定了1mL培养液的DPE酶活性，结果为55.2U(μmol/min)。由于从现有的球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M30菌株中粗精制得到的DPE的酶活性为每1mL培养液为1.5～1.8U(μmol/min)，因此，发现酶活性上升30～37倍左右。
产业上利用的可能性
本发明的酮糖3-差向异构酶作用于游离的D-或L-酮糖、D-或L-戊酮糖，将这些酮糖的3位差向异构化，从而容易地生成对应的D-或L-酮糖、D-或L-酮糖。该反应开拓了以各种酮糖、尤其是D-果糖为原料大量生产D-阿洛酮糖的道路。进一步，本发明的酮糖3-差向异构酶可以通过各种的固定化方法来得到活性高的固体化酶，通过使用固定化酶能够连续地进行大量的差向异构化反应。通过能够工业地进行固定化，从而可以大量生产作为目标的酮糖。
因此，本发明的酮糖3-差向异构酶及其制造方法的确立不仅在制糖产业中，而且在与其关联的食品、化妆品、医药品产业中的工业意义极大。
作为将生产本酶的球形节杆菌用在食品产业中的最大特征在于菌的安全性。该菌种在美国被FDA收录于EAFUS中，这证明了菌体自身的安全性非常高。作为至今已知的D-阿洛酮糖的生产酶，有来自假单胞菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属等的酶，但是不仅没有被收录于美欧的清单中，而且还有作为机会致病菌或植物细胞感染等的报告，是确认安全性需要很多劳力的微生物。本发明中能够使用菌体本身的安全性非常高的菌是较大的技术进步。

Claims (7)

1.一种酮糖3-差向异构酶，其中，
所述酮糖3-差向异构酶来自作为球形节杆菌M30的微生物，作为部分氨基酸序列包含序列表中的序列号1所示的氨基酸序列，具有下述(A)、(B)的底物特异性，并且具有下述(A)～(B)的物理化学性质，其中，所述球形节杆菌M30的保藏编号为NITE BP-1111，
(A)将D-或L-酮糖的3位差向异构化，生成对应的D-或L-酮糖；
(B)在D-或L-酮糖中对D-果糖和D-阿洛酮糖的底物特异性最高。
2.如权利要求1所述的酮糖3-差向异构酶，其中，
具有下述(a)～(f)的物理化学性质，
(a)分子量：
通过SDS-PAGE测定的亚单位的分子量为约32kDa，通过凝胶过滤法测定的分子量为120kDa，并且为亚单位的分子量为32kDa的同源四聚体结构；
(b)最佳pH：
在30℃下反应30分钟，20mM的镁(Mg2+)存在的条件下为6至11；
(c)最佳温度：
在pH7.5下反应30分钟，20mM的镁(Mg2+)存在的条件下为60至80℃；
(d)pH稳定性：
在4℃下保持24小时的条件下至少在pH5至11的范围内稳定；
(e)热稳定性：
在pH7.5下保持1小时，4mM的镁离子(Mg2+)存在的条件下在约50℃以下稳定，在镁离子(Mg2+)不存在的条件下，在约40℃以下稳定；
(f)通过金属离子的活化：
通过二价锰离子Mn2+、二价钴离子Co2+、钙离子Ca2+以及镁离子Mg2+活化。
3.如权利要求1或2所述的酮糖3-差向异构酶，其中，
具有下述底物特异性1.～8.，
1.将D-果糖作为底物时的相对活性为43.8％；
2.将D-阿洛酮糖作为底物时的活性为100％；
3.将D-山梨糖作为底物时的相对活性为1.13％；
4.将D-塔格糖作为底物时的相对活性为18.3％；
5.将L-果糖作为底物时的相对活性为0.97％；
6.将L-阿洛酮糖作为底物时的相对活性为21.2％；
7.将L-山梨糖作为底物时的相对活性为16.6％；
8.将L-塔格糖作为底物时的相对活性为44.0％，
其中，将D-阿洛酮糖的差向异构化活性作为100，将对各个酮糖的活性作为相对活性来表示。
4.一种酮糖3-差向异构酶，其中，
所述酮糖3-差向异构酶由序列表中的序列号3或序列号4所示的碱基序列、或者序列表中的序列号3或序列号4所示的碱基序列中在保持编码的酶的活性的范围内缺失、置换或加成1个或2个以上的碱基序列而成的碱基序列或者与其互补的碱基序列编码，
该酮糖3-差向异构酶将D-或L-酮糖的3位差向异构化从而生成对应的D-或L-酮糖。
5.如权利要求7所述的酮糖3-差向异构酶，其中，
酮糖3-差向异构酶是D-阿洛酮糖异构酶。
6.一种酮糖的转换方法，其特征在于，
使权利要求1～5中任一项所述的酮糖3-差向异构酶作用于含有选自D-或L-酮糖中的1种以上的溶液，将该酮糖的3位差向异构化。
7.一种酮糖的制造方法，其特征在于，
使权利要求1～5中任一项所述的酮糖3-差向异构酶作用于含有选自D-酮糖或L-酮糖中的1种以上的溶液，将该酮糖的3位差向异构化，使对应的酮糖生成并采集。
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