CN104911197B

CN104911197B - 酶的自然变异体的获取方法及超耐热性纤维二糖水解酶

Info

Publication number: CN104911197B
Application number: CN201510106938.6A
Authority: CN
Inventors: 须田汀; 大熊二郎; 山口明日香; 广濑佳嗣; 近藤康弘
Original assignee: Honda Motor Co Ltd
Current assignee: Honda Motor Co Ltd
Priority date: 2014-03-13
Filing date: 2015-03-11
Publication date: 2018-11-06
Anticipated expiration: 2035-03-11
Also published as: BR102015004964A2; US9944914B2; JP6340647B2; US20150259659A1; CN104911197A; JP2015173602A

Abstract

一种有选择性地获取具有活性的酶的自然变异体的方法，包括1)从由环境微生物菌丛宏基因组DNA碱基序列组成的基因组数据库中，检测具有酶活性的蛋白质ORF序列；2)使用基于该ORF序列而设计的引物，对至少一个环境微生物菌丛宏基因组DNA进行PCR克隆，获得至少一个由该ORF序列的全长、该ORF序列的部分序列、或编码该ORF序列所编码的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列的碱基序列所组成的PCR克隆；3)对在工序2)中得到的各PCR克隆，确定碱基序列及该碱基序列所编码的氨基酸序列；4)测定在工序2)中得到的各PCR克隆所编码的蛋白质的酶活性，选择具有活性的酶的自然变异体。

Description

酶的自然变异体的获取方法及超耐热性纤维二糖水解酶

技术领域

本发明涉及一种酶的自然变异体的获取方法，以及通过该方法获得的超耐热性纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)。

本申请要求2014年3月13日在日本提出的特愿2014-050083号申请的优先权，并将其内容引用在本申请中。

背景技术

在地球上存在有丰富的木质纤维素生物质，人们期待以将其作为原料的乙醇等生物燃料来替代化石燃料成为运输用能源。将木质纤维素转变成乙醇，需要纤维素、半纤维素的糖化。在纤维素糖化中，有硫酸糖化和酶糖化两种方法。通常，基于统称为纤维素酶的糖苷水解酶的糖化与硫酸糖化相比，具有不产生硫酸淤渣、能源投入量少以及不会引起过分解、收率高等优点。

另一方面，构成植物细胞壁的纤维素，其具有相互由坚固的氢键连接的结晶结构，因此几乎不溶于水，基于酶的纤维素水解为固液反应。固液反应是在固体表面上进行结晶性纤维素的水解，因此，基于酶的糖化效率非常低。例如，作为主要的纤维素水解酶的纤维二糖水解酶(CBH)与其它多糖类分解酶相比，水解速度要慢一位数至两位数左右，因此，纤维素生物质的糖化需要大量的酶，这形成纤维素类生物燃料的主要的成本因素。为了降低纤维素乙醇的成本，需要格外提高纤维素酶的糖化效率。

提高酶效率的一种方法为提高酶蛋白质的耐热性。为了提高酶蛋白质的耐热性，人们尝试了随机替换氨基酸序列的定向进化(directed evolution，DE)法、限定特定部位进行氨基酸取代的定点突变(site-directed mutagenesis，SDM)法、将多个基因在多处进行切断并通过改组制成嵌合序列的方法等导入氨基酸变异的各种酶的改良方法。

基于DE法的酶改性在理论上效率极差。其原因在于伴随点突变的数量，变异体的数量呈天文数字级增长，即会产生“组合爆炸问题”。若想得到最适合的氨基酸排列，则需要针对全部氨基酸残基的组合制作突变体库并进行功能检验，这在原理上是不可能的。此外，突变的大部分几乎为丧失功能的功能不全型(loss of function)，获得中立突变或有利的功能的功能获得型(gain of function)十分稀有，基于DE法的最优选氨基酸序列的探索效率差。

由于必须对庞大数量的突变体库进行筛查才能获得有效的突变体、没有有效的高通量(high-throughput)筛查法或稳定基因表达系统等原因(例如，参照非专利文献1。)，该基于DE法的纤维素酶的功能改良无法充分进行。

例如，中泽等提出了将木材腐朽菌里氏木霉(Trichoderma reesei)的内切葡聚糖酶EGIII通过DE法进行改良的报告(参见非专利文献2)。该EGIII为由218氨基酸残基构成的具有比较小的分子量的蛋白质。但是，即使是这种小的蛋白质，任意一处发生氨基酸取代引起的突变造成的变异体数量为4,360种(20×218)、任意两处突变造成的变异体数量为946万种(20×20×218×217÷2)，更进一步地，任意三处突变造成的变异体数量发生爆炸性组合，为136亿2413万种(20×20×20×(218×217×216÷6))。

只是获得两三处变异的变异体，就需要制作数千万～数百亿个的突变库及其功能筛查，这并不现实。中泽等人对第一代及第二代共11,000个突变体个体进行了功能筛查，但仅限于将最适温度作了+5℃的改善，并未实现耐热性的大幅提高。若突变体库的规模小，显然无法发现有效的变异体。此外，在进行功能筛查的第一代突变库9,000个群落中，只获得了46个具有CMC水解活性的变异体群落。8,954个残余的突变体被认为是氨基酸变异导致的功能丧失或基因的表达不全，因DE法的误差(error)PCR引发的随机突变大部分都导致了酶蛋白质的功能丧失。如此，DE法由于产生大量的功能丧失变异体，因此筛查效率非常差。

基因改组法，迄今为止还无法获得在耐热性上超过亲本基因的嵌合基因。例如，Heinzelman等人提出，在多处切断多个纤维二糖水解酶基因，通过改组制成嵌合基因，以谋求酶功能的改善的方法(参见非专利文献3)。根据该方法，以提高里氏木霉的内切葡聚糖酶CBH II的耐热性为目的，通过基因改组将嗜热丝状菌特异腐质霉(Humicola insolens)与嗜热毛壳菌(Chaetomium thermopHilum)的CBH II酶基因进行组合，制作嵌合酶，但所述嵌合酶的耐热性未超过作为亲本的嗜热丝状菌嗜热毛壳菌的CBH II，无法获得有效的基因改组效果。

相对于靠随机突变的氨基酸取代的DE法，SDM法则为根据酶蛋白质的三维立体结构数据而引发氨基酸取代、缺失或插入等突变的方法。虽然不需要DE法那样庞大的突变体筛查，但一般情况下难以预测出与提高酶功能相关的部位的确定，通过SDM法而使纤维素酶功能得到显著改善的例子并不多。

例如，纤维二糖水解酶在N末端和C末端上分别有环状结构，形成覆盖活性中心的洞形(tunnel)结构。人们着眼于该结构，正在尝试取代环内的氨基酸的SDM法。在张等人的报告中指出，他们尝试推算出嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的纤维二糖水解酶TfCe16B的三维立体结构，在形成活性部位的洞状结构的N末端、C末端的环上通过双重突变导入二硫键，提高耐热性，但是与期待相反，所得变异体的酶活性的半衰期温度T₅₀减少了10℃(参见非专利文献4)。张等人进一步将四处的甘氨酸残基取代为丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸，但均未获得因突变而使耐热性得到提高的纤维二糖水解酶，大部分的突变体的耐热性都降低了5～10℃。

此外，沃尔法特等人的报告中指出，他们为了提高属于丝状菌T.reesei的GH6家族的纤维二糖水解酶TfCe 16A的热稳定性，在N末端环及C末端环上和位于其附近的氨基酸残基上加入变异，制备变异体，该变异体虽然在pH7.0下热变性温度(Tm)上升，但在野生型TfCe 16A的最适pH，即pH5.0下，Tm值反而变差(参见非专利文献5)。另一方面，冯·奥斯托夫斯基(Von ostrowski)等人为了使形成属于丝状菌T.reesei的GH7家族的纤维二糖水解酶TfCe 17A活性中心的洞状环的exo-loop结构的稳定，在所述环内导入SS(二硫)键而制作变异体，但未确认出所述变异体有任何热稳定性的改善(参见非专利文献6)。如此，在形成认为与纤维二糖水解酶酶功能密切相关的环结构的C末端环上，进行了多次导入氢键或SS键的尝试，但迄今为止，耐热性的提高等、酶功能改善并不成功。

若对相同的基因进行生物种间比较，则可知具有充分保存的区域和频繁进行氨基酸变异的区域，该保存区域为赋予特定范畴的蛋白质特征的共通的序列，因此被称为“共用序列”。该共用序列中的氨基酸残基若变异则为易失去酶功能的部位，因此其能在漫长进化过程中得到良好保存。因此，在共用序列发生氨基酸变异引起突变，功能丧失的可能性高。在此，人们尝试了避开共用序列而加入突变的SDM法。但是，能适用该方法的仅限于通过X射线结晶结构解析等来确定蛋白质的三维结构的酶，而这种明确了三维结构的酶蛋白质很少。

现有技术文献

非专利文献

[非专利文献1]Himmel，et al.，Current Opinion in Biotechnology，1999，vol.10，p.358～364；

[非专利文献2]Nakazawa，et al.，Applied Microbiology and Biotechnology，2009，vol.83，p.649～657；

[非专利文献3]Heinzelman，et al.，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America，2009，vol.106，p.5610～5615；

[非专利文献4]Zhang，et al.，European Journal of Biochemistry，2000，vol.267，p.3101～3115；

[非专利文献5]Wohlfahrt，et al.，Biochemistry，2003，vol.42，p.10095～10103；

[非专利文献6]Von Ossowski，et al.，Journal of Molecular Biology，2003，vol.333，p.817～829。

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明的目的在于，提供一种高效地获取功能获得型变异体的方法。

更进一步地，本发明的目的在于，提供一种由上述方法获得的新型超耐热性纤维二糖水解酶、编码所述超耐热性纤维二糖水解酶的多聚核苷酸、用于表达所述超耐热性纤维二糖水解酶的表达载体、编入了所述表达载体的转化体，以及使用所述超耐热性纤维二糖水解酶的纤维素分解物的制备方法。

解决技术问题的技术手段

本发明人为了解决上述问题，经认真研究后发现，通过使用由高温土壤中所含的微生物菌丛的宏基因组DNA中分离出的纤维二糖水解酶的碱基序列设计的引物，对高温土壤微生物菌丛的宏基因组DNA，实施多个，例如300个以内的群落PCR，伴随多个氨基酸的取代，或能够获取具有包含静态(silent)的单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)的多个超耐热性纤维二糖水解酶活性的自然变异体，从而完成了本发明。

此外，本发明中的“自然变异体”，是指通过人为手段产生的突变体以外的一切突变体。

“超耐热性”是指酶活性的最适温度或酶蛋白质的热变性温度为80℃以上。

即，作为本发明涉及的酶的自然变异体的获取方法、酶的变异体的制备方法、超耐热性纤维二糖水解酶、编码所述超耐热性纤维二糖水解酶的多聚核苷酸、用于表达所述超耐热性纤维二糖水解酶的表达载体、编入所述表达载体的转化体、超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法、纤维素酶混合物及纤维素分解物的制备方法，可列举为如下[1]～[13]。

[1]一种选择性地获取具有活性的酶的自然变异体的方法，该方法包括以下工序：

(1)从由环境微生物菌丛宏基因组DNA的碱基序列组成的基因组数据库中，检测具有酶活性的蛋白质ORF(以下也称作开放阅读框)序列的工序；

(2)使用基于该ORF序列而设计的引物，对至少一个环境微生物菌丛宏基因组DNA进行PCR克隆，获得至少一个由该ORF序列的全长、该ORF序列的部分序列、或编码该ORF序列所编码的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列的碱基序列所组成的PCR克隆的工序；

(3)对在所述工序(2)中得到的各PCR克隆，确定碱基序列及该碱基序列所编码的氨基酸序列的工序；

(4)测定在所述工序(2)中得到的各PCR克隆所编码的蛋白质的酶活性，选择具有活性的酶的自然变异体的工序。

[2]一种具有活性的酶的变异体的制备方法，该方法包括以下工序：

(1)从由环境微生物菌丛宏基因组DNA的碱基序列组成的基因组数据库中，检测具有酶活性的蛋白质ORF序列的工序；

(4)测定在所述工序(2)中得到的各PCR克隆所编码的蛋白质的酶活性的工序；

(5)在所述工序(3)及所述工序(4)后，考察所述ORF序列编码的氨基酸序列的差异与所述酶活性的关系的工序；

(6)基于所述工序(5)中得到的氨基酸序列的差异与酶活性的关系性，通过使所述ORF序列编码的氨基酸序列至少缺失、取代或添加一个氨基酸残基，从而制备所述酶活性得到提高的变异体的工序。

[3]上述[2]所述的酶的变异体的制备方法，其中，所述环境微生物菌丛的宏基因组DNA为来自高温土壤的宏基因组DNA，所述酶为至少在70℃以上显示酶活性的耐热性酶。

[4]上述[2]或[3]所述的酶的变异体的制备方法，其中，所述酶为纤维素酶。

[5]一种具有纤维二糖水解酶催化剂区域的超耐热性纤维二糖水解酶，其中，该纤维二糖水解酶催化剂区域由下述组成：

(A)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所组成的多肽；

(B)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基(除了缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列中的88位的丝氨酸、230位的苯丙氨酸、414位的丝氨酸)的氨基酸序列所组成，且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽；

(C)由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列(88位为丝氨酸，230位为苯丙氨酸，414位为丝氨酸)所组成，且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽。

[6]一种含有对纤维二糖水解酶催化剂区域进行编码的区域的多聚核苷酸，其中，所述对纤维二糖水解酶催化剂区域进行编码的区域由下述组成：

(a)对由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所组成的多肽进行编码的碱基序列；

(b)对由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基(除了缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列中的88位的丝氨酸、230位的苯丙氨酸、414位的丝氨酸)的氨基酸序列所组成且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；

(c)对由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列(88位为丝氨酸，230位为苯丙氨酸，414位为丝氨酸。)所组成且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；

(d)对与SEQ ID NO：2所示的碱基序列具有80％以上的序列同源性且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；或

(e)对作为与SEQ ID NO：2所示的碱基序列所组成的多聚核苷酸在严格(ストリンジェンド)的条件杂交的多聚核苷酸的碱基序列且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列。

[7]一种表达载体，其编入有上述[6]所述的多聚核苷酸，在宿主细胞中，至少在80℃、pH5.5的条件下，表达具有纤维二糖水解酶活性的多肽。

[8]一种转化体，其导入有上述[7]所述的表达载体。

[9]上述[8]所述的转化体，其中，该转化体为真核微生物。

[10]一种超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法，该方法包括，在上述[8]或[9]所述的转化体内生产超耐热性纤维二糖水解酶。

[11]一种纤维素酶混合物，该混合物含有上述[5]所述的超耐热性纤维二糖水解酶或由上述[10]所述的超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法所制得的超耐热性纤维二糖水解酶，以及至少一种其它的纤维素酶。

[12]一种纤维素分解物的制备方法，该方法包括，通过使含纤维素的材料，与上述[5]所述的超耐热性纤维二糖水解酶、上述[8]或[9]所述的转化体、或由上述[10]所述的超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法所制得的超耐热性纤维二糖水解酶接触，从而生产纤维素分解物。

[13]上述[12]所述的纤维素分解物的制备方法，该方法包括使所述含纤维素材料进一步接触至少一种其它的纤维素酶。

发明效果

通过本发明涉及的酶的自然变异体的获取方法、以及利用了该获取方法的酶的变异体的制备方法，能够高效地获取功能获得型的酶的变异体。

此外，本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶在至少80℃(即，也可以是80℃以上)、pH5.5下具有纤维二糖水解酶活性。因此，该超耐热性纤维二糖水解酶适用于高温条件下的纤维素的糖化处理(saccharization).

此外，本发明涉及的多聚核苷酸、编入了该多聚核苷酸的表达载体、导入该表达载体的转化体适用于本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶的制备。

附图说明

图1为实施例1中的AR19G-166RA、AR19G-166QV、AR19G-166QA及AR19G-166RASFS的氨基酸序列校准图(Alignment Drawings)；

图2为表示实施例1中的AR19G-166基因的自然变异体编码的纤维二糖水解酶酶蛋白质的SDS-PAGE解析图；

图3为表示对实施例1中的AR19G-166基因的自然变异体编码的纤维二糖水解酶酶蛋白质的PSA水解活性进行测定的结果的图；

图4为表示实施例1中的对AR19G-166RASFS的各底物的纤维二糖水解酶活性进行测定的结果图；

图5为表示实施例1中，对AR19G-166RASFS在各温度下的PSA水解活性进行测定的结果图；

图6为表示实施例1中，对AR19G-166RASFS在各pH下的PSA水解活性(50℃、70℃或90℃)进行测定的结果图；

图7为表示实施例1中，对经过40分钟预培养后的AR19G-166RASFS的PSA水解活性减少至50％的温度T₅₀进行测定的结果图；

图8为表示实施例1中，AR19G-166RA、AR19G-166RA的氨基酸取代变异体AR19G-166RASFS的各酶蛋白质所示的伴随热变性而引发的铜染及橙染(SYPRO orange)荧光强度变化的图。

具体实施方式

[酶的自然变异体的获取方法]

本发明涉及的有选择性地获取具有活性的酶的自然变异体的方法(以下也称“本发明涉及的自然变异体获取方法”)，涉及使用根据酶基因的开放阅读框(ORF)序列而设计的引物，从由环境微生物菌丛制备的宏基因组DNA中，有选择性地获取具有所述活性的酶基因的自然变异体。

此外，所述环境微生物菌丛的宏基因组DNA的调整，例如，可通过使用DNA提取试剂盒(ISOIL Large for Beads ver.2，日本基因(NIPPON GENE)社制)的公知的方法来实施。

若能够只对功能获得型的突变进行收集并制作变异体库，则可以避免为了去除所产生的大量功能不全的突变体所做的无用筛查，通过较少数的氨基酸取代变异体的功能试验，就可以有效地获得功能得到提高的变异体。在由环境微生物菌丛制备的宏基因组DNA中，包含有许多功能获得型的自然变异体。因此，通过将所述宏基因组DNA作为母体，可以有效地获取功能获得型的变异体。

本发明中的“具有活性”意为，相对于至少一个底物，与阴性对照(negativecontrol)相比，在水解的还原末端量或显色反应中具有显著性差异。

环境微生物菌丛所制备的宏基因组DNA中包含有许多功能获得型的自然变异体的原因是基于分子进化的中立说。SNP(Single Nucleotide Polymorphism)是在基因组DNA中常见的碱基序列多态性的一种。例如，在人类基因组DNA的情况下，据说每1,000个碱基中就会出现1个碱基左右的SNP。出现在基因中的SNP若伴随氨基酸变异，则也有不伴随同义取代或内含子上的SNP等氨基酸变异的不活动变异(silent mutation)。在SNP伴随氨基酸变异的情况下，基因编码的蛋白质中可能引起某些结构上或功能上的变化。根据被广泛接受的分子进化的中立说(Kimura，Nature，1968，vol.217(5129)，P.624～626)，对功能劣化或功能不全等个体的生存值有不好影响的、引起对进化不利的氨基酸取代的遗传性变异，从集团中被排除。另一方面，突变若对进化中立或有利，则带有该变异基因的个体不会从集团中被排除，基因会传给下一代，SNP等的遗传的多样性被积累下去。根据该分子进化的中立说，认为在具有伴随氨基酸取代的SNP的自然变异体中，含有不引起功能不全的、中立或有利的变异，即，含有功能获得型的突变。

即，本发明涉及的自然变异体获取方法为一种有选择性地获取具有活性的酶的自然变异体的方法，该方法包括以下工序：

(2)使用基于该ORF序列而设计的引物，对至少一个环境微生物菌丛宏基因组DNA进行PCR克隆，获得至少一个由

所述ORF序列的全长、

所述ORF序列的部分序列、

或编码所述ORF序列所编码的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列而成的碱基序列

所组成的PCR克隆的工序；

环境微生物菌丛宏基因组DNA为对环境微生物菌丛(环境样本中含有的微生物集团)的基因组DNA物理性地进行细微片段化的物质。作为在本发明中使用的环境微生物菌丛宏基因组DNA，可以使用由土壤或污泥、湖水、海水等微生物菌丛制得的宏基因组DNA。在为了获取耐热性优异的酶变异体的情况下，优选使用由高温环境下选取的样本的微生物菌丛所制得的宏基因组DNA。作为高温环境下选取的样本，可列举出高温温泉土壤样本等。此外，在此所述的“高温温泉土壤”可列举出30～80℃的含有土、泥、微生物垫(バイオマット)、生物膜(バイオフィルム)等的温泉水等。

作为本发明涉及的获取具有活性的自然变异体的方法，首先，作为工序(1)，从由环境微生物菌丛宏基因组DNA的碱基序列组成的基因组数据库中，检测具有酶活性的蛋白质ORF序列。相对于环境微生物菌丛宏基因组DNA，所述基因组数据库由霰弹枪定序法等在长链DNA的定序解析中使用的方法制作而成。

具体而言，对于环境微生物菌丛宏基因组DNA的一部分，进行霰弹枪定序数据的汇编及注释，检测编码特定氨基酸序列的ORF序列。作为目标的具有酶活性的蛋白质的ORF序列，可以根据具有所述酶活性的碱基序列已知的基因的碱基序列，通过碱基序列的同源性(序列同一性)解析等公知的方法进行检测。例如，在同源性解析中，优选设定检测相对于具有酶活性的碱基序列已知的基因的碱基序列为30％以上相同的序列。

接着，作为工序(2)，使用基于该ORF序列而设计的引物，对至少一个环境微生物菌丛宏基因组DNA进行PCR克隆。作为使用的引物，优选设计成所述ORF序列中可至少对含有所述酶的催化剂区域(催化剂域)的区域进行PCR扩增的引物。通过宏基因组DNA进行PCR克隆，从而使得至少一个由该ORF序列的全长、该ORF序列的部分序列、或编码该ORF序列所编码的氨基酸序列中至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的氨基酸序列的碱基序列所组成的PCR克隆被克隆。

接着，对通过工序(2)得到的各PCR克隆的碱基序列进行解析，确定所述PCR克隆所编码的氨基酸序列(工序(3))。此外，制备由所述PCR克隆所编码的蛋白质，测定所述蛋白质的酶活性，选择具有活性的酶的变异体(工序(4))。由此，可有选择性地获取具有酶活性的变异体。

在本发明中，对于来源不同的多个宏基因组DNA，优选使用同一引物进行PCR克隆。不仅是作为引物设计源头的宏基因组DNA，对于来源不同的多个宏基因组DNA进行PCR克隆，并且通过将引入了包含所设计的引物的扩增片段的质粒的菌落构建成大规模(例如选取数百个以上)的PCR库，由此可得到更多的所述酶基因的氨基酸取代变异体(自然变异体)。

此外，在PCR克隆中，一般选取1～10个菌落，进行对目标基因的克隆，但在本发明涉及的自然变异体获取方法中，各宏基因组DNA样本，每个样本优选选取100个菌落进行基因克隆。由此，能够构建由含有目标酶基因的多样SNP的自然变异体所构成的库。

[酶的变异体的制备方法]

在本发明中，对于所述构建的自然变异体库，通过进行功能筛查，能够有效地进行提高耐热性等酶功能的改良，并有效地制备酶活性得到改良的新变异体。

即，本发明涉及的酶的变异体的制备方法(以下也称为“本发明涉及的变异体制备方法”。)，在所述工序(1)～(4)的基础上，还进一步包括工序(5)及(6)。

(5)在所述工序(3)及所述工序(4)后，对多个变异体，考察所述ORF序列编码的氨基酸序列与所述酶活性的关系的工序；

(6)基于所述工序(5)中得到的氨基酸序列与酶活性的关系性，通过使所述ORF序列编码的氨基酸序列至少缺失、取代或添加一个氨基酸残基，从而制备所述酶活性得到提高的变异体的工序。

这里所说的“酶活性的提高”是指，至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基的ORF序列所编码的酶的活性，高于所述氨基酸残基缺失、取代或添加之前的ORF序列所编码的酶的活性。

例如，在工序(5)中，对于氨基酸序列中的1个或2个以上的氨基酸残基不同的两个PCR克隆所编码的蛋白质，通过进行酶活性的比较可明确酶活性得到提高的氨基酸变异。接着，在工序(6)中，在由所述ORF序列组成的DNA片段或所述工序(2)中得到的PCR克隆中，进一步导入用于实现能够使酶活性进一步提高的氨基酸变异的碱基变异，通过使所述ORF序列编码的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基缺失、取代或添加，从而制备酶活性得到提高的变异体。另外，用于实现1个或2个以上的氨基酸残基的变异的碱基取代等，可通过常规方法进行。

[超耐热性纤维二糖水解酶]

本发明人如后述实施例1所示，从选自日本国内的1处、5个地点的高温温泉土壤(例如，30～80℃的、含土、泥、微生物垫、生物薄膜等的温泉水等)中制备的微生物集团的基因组DNA(宏基因组DNA)，使用各宏基因组DNA进行本发明涉及的自然变异体获取方法，得到耐热性优异的新型纤维二糖水解酶。

具体而言，首先，从一个宏基因组DNA中，得到13个与已知的纤维二糖水解酶(CBH)酶具有高的氨基酸序列同源性的(即，30％以上的同一性)开放阅读框(ORF)。基于这些ORF的碱基序列信息设计引物，通过PCR法从高温温泉土壤宏基因组DNA中克隆纤维二糖水解酶催化剂区域。将PCR克隆的DNA(PCR克隆)引入大肠杆菌中，表达所述碱基序列编码的蛋白质，通过磷酸膨润纤维素(PSA)分解活性及羧甲基纤维素(CMC)分解活性试验进行功能筛查。

在最后，从1个开放阅读框AR19G-166中获得具有PSA分解活性的新型超耐热性纤维二糖水解酶(AR19G-166RA)。

开放阅读框AR19G-166为起始密码子的蛋氨酸缺失的不完整长序列，因此由所述ORF克隆的AR19G-166RA基因为仅由GH6催化剂区域构成的部分基因。

接着，通过对5个宏基因组DNA，使用基于所述ORF序列而设计的引物进行PCR克隆，最后得到12种AR19G-166RA的氨基酸取代变异体。本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶为在AR19G-166RA的变异体中，表现最高耐热性的AR19G-166RASFS(299位的氨基酸残基为精氨酸，351位的氨基酸残基为丙氨酸，88位的氨基酸残基为丝氨酸，230位的氨基酸残基为苯丙氨酸，414位的氨基酸残基为丝氨酸的变异体)。将出现频率最高的AR19G-166QA的氨基酸序列示作SEQ ID NO：3，将编码其的碱基序列示作SEQ ID NO：4。将AR19G-166RASFS的氨基酸序列示作SEQ ID NO：1，将编码其的碱基序列示作SEQ ID NO：2。

如后述实施例1所述，AR19G-166RASFS相对于PSA显示出高的水解活性，相对于β-1,3键与β-1,4键葡聚糖组成的地衣多糖(Lichenan)或作为结晶性纤维素的Avicel(微晶纤维素)，显示出微弱的分解活性。另一方面，相对于CMC或β-1,3键与β-1,6键葡聚糖组成的地衣多糖，几乎不显示分解活性。此外，相对于公知的氨基酸序列数据库，检索AR19G-166RASFS的氨基酸序列时，序列同源性最高的氨基酸序列为已知的属于绿弯菌门中的温性好氧性细菌橙色滑柱菌(Herpetosiphon aurantiacus)DSM 785的GH6家族的糖苷水解酶(SEQ ID NO：11)，其序列同源性仅为66％。从底物特异性、PSA水解反应产物的HPLC分析以及与已知的纤维二糖水解酶的氨基酸序列的序列同源性(相同性)来看，AR19G-166RASFS为属于GH6家族的新型纤维二糖水解酶。

AR19G-166RASFS在至少80℃、pH5.5的条件下，具有纤维二糖水解酶活性。实际上，如后述实施例1＜9＞所示，AR19G-166RASFS在50～95℃的广阔温度范围内显示出纤维二糖水解酶活性。以大肠杆菌为宿主来进行表达的AR19G-166RASFS的纤维二糖水解酶活性，在50～95℃的范围内随温度变高而变高，耐热性远优于AR19G-166QA及AR19G-166QA的氨基酸取代变异体。

一般情况下，具有某些生理活性的蛋白质，在不损于其生理活性的情况下，可以缺失、取代或添加至少一个氨基酸残基。即，对于AR19G-166RASFS，在不使其失去纤维二糖水解酶活性的情况下，可以缺失、取代或添加至少一个氨基酸残基。

即，本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，其具有由下述(A)～(C)中任意一项组成的纤维二糖水解酶催化剂区域。

(A)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所组成的多肽；

(B)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基(除了至少1个氨基酸残基被缺失、取代或添加之前的氨基酸序列中的88位的丝氨酸、230位的苯丙氨酸、414位的丝氨酸)的氨基酸序列所组成，且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽；

(C)由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列(88位为丝氨酸，230位为苯丙氨酸，414位为丝氨酸)所组成，且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽。

所述(B)的多肽中，相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，被缺失、取代或添加的氨基酸残基的数量优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个。

所述(C)的多肽中，与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的序列同源性只要为80％以上则没有特别的限定，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。

此外，氨基酸序列之间的序列同源性(相同性)可以通过以下方式求得。即，使对应的氨基酸最多一致地将两个氨基酸序列并列设置，在相当于插入及缺失的部分引入空隙(gap)，求出得到的校准(Alignment)中的相对于除去空隙的氨基酸序列整体来说一致的氨基酸的比例。氨基酸序列之间的序列同源性，可使用该技术领域中公知的各种相同性检索软件求出。本发明中的氨基酸序列的序列同源性的值以根据公知的相同性检索软件BLASTP得到的校准为基础，通过计算而得到。

作为所述(B)及(C)的多肽，可以是人工设计的，也可以是AR19G-166等同源或该部分蛋白质。

所述(A)～(C)的多肽可以分别基于氨基酸序列进行化学合成，也可以使用后述本发明涉及的多聚核苷酸，通过蛋白质表达系生产。此外，所述(B)及(C)的多肽可以分别基于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的多肽，使用导入氨基酸变异的基因改组技术进行人工合成。

所述(A)～(C)的多肽在至少80℃(可以为80℃以上)、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性。由于在80～100℃下也显示出非常高的纤维二糖水解酶活性，因此通过将所述(A)～(C)中的任意一种多肽作为纤维二糖水解酶催化剂区域而具有，可获得超耐热性纤维二糖水解酶。

本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶以PSA为底物。所述超耐热性纤维二糖水解酶也可以以PSA以外的其它β葡聚糖为底物。作为所述的其它β葡聚糖，可列举出β-1,3键和β-1,4键组成的地衣多糖、微晶纤维素、结晶性细菌纤维素(Bacterialmicrocrystalline cellulose，BMCC)、滤纸等结晶性纤维素、羧甲基纤维素(Carboxymethyl cellulose，CMC)、β-1,3键和β-1,6键组成的葡聚糖、β-1,3键组成的葡聚糖、β-1,6键组成的葡聚糖、以及木聚糖等。作为本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，除了PSA，优选以β-1,3键和β-1,4键组成的葡聚糖及结晶性纤维素的至少一种作为底物，更优选以PSA、β-1,3键和β-1,4键组成的葡聚糖及结晶性纤维素作为底物。

本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶的最适pH依存于反应温度而变化，其在pH5.0～6.5的范围内。作为本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，优选至少在pH5.0～6.5的范围内显示纤维二糖水解酶活性，更优选在pH4.0～7.0的范围内显示纤维二糖水解酶活性。

本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶可以具有纤维二糖水解酶活性以外的纤维素水解活性。作为其它的纤维素水解活性，可列举出内切葡聚糖酶活性、木聚糖酶活性或β-葡糖苷酶活性等。

本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，可以是仅由所述(A)～(C)的多肽的任意一种组成的纤维二糖水解酶催化剂区域所组成的酶，也可以含有其它区域，作为该其它区域，可列举出公知的纤维二糖水解酶具有的纤维二糖水解酶催化剂区域以外的区域。例如，在本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶中，相对于公知的纤维二糖水解酶，可以含有将纤维二糖水解酶催化剂区域取代为所述(A)～(C)的多肽而得到的酶。

在本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶含有纤维二糖水解酶催化剂区域以外的区域的情况下，优选含有纤维素结合模块。纤维素结合模块可以位于纤维二糖水解酶催化剂区域的上游(N末端侧)，也可以位于下游(C末端侧)。此外，纤维素结合模块与纤维二糖水解酶催化剂区域可以直接结合，也可以通过适当长度的连接区域进行结合。作为本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，优选在纤维二糖水解酶催化剂区域的上游或下游，存在有通过连接区域连接的纤维素结合模块，更优选在纤维二糖水解酶催化剂区域的上游存在有通过连接区域连接的纤维素结合模块。

本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶含有的纤维素结合模块，只要为具有与纤维素的结合能力的区域即可，例如与PSA或结晶Avicel(结晶纤维素)的结合能力，其氨基酸序列并不受特别的限定。作为所述纤维素结合模块，例如，可以使用已知的蛋白质所具有的纤维素结合模块或对其进行适当改变的模块。此外，在本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶具有纤维二糖水解酶催化剂区域和纤维素结合模块的情况下，优选通过连接序列而结合。所述连接序列的氨基酸序列或其长度等并不受特别的限定。

本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，在其他方面，可以在N末端或C末端上，具有转移至细胞内特定区域的可局部存在的信号肽或向细胞外分泌的信号肽。作为这类信号肽，例如有质外体转移信号肽、内质网保留信号肽、核转位信号肽、分泌型信号肽等。作为内质网保留信号肽，例如有由HDEL的氨基酸序列组成的信号肽等。

此外，本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，在其他方面，为了在使用表达系而生产的情况下可进行简便提纯，例如可在N末端或C末端，添加各种标签。作为所述标签，例如可以使用His标签、血球凝集素(Hemagglutinin，HA)标签、Myc标签及Flag标签等广泛用于改组蛋白质的表达、提纯中的标签。

[编码超耐热性纤维二糖水解酶的多聚核苷酸]

本发明涉及的多聚核苷酸编码本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶。通过将编入有所述多聚核苷酸的表达载体导入至宿主中，从而能够利用所述宿主的表达系生产所述超耐热性纤维二糖水解酶。

具体而言，本发明涉及的多聚核苷酸为，含有对由下述(a)～(e)的任意一种碱基序列组成的纤维二糖水解酶催化剂区域进行编码的区域的多聚核苷酸。

(a)对SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所组成的多肽进行编码的碱基序列；

(b)对由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中，至少缺失、取代或添加了一个氨基酸残基(除了88位的丝氨酸、230位的苯丙氨酸、414位的丝氨酸)的氨基酸序列所组成，且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；

(c)对由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列(88位为丝氨酸，230位为苯丙氨酸，414位为丝氨酸)所组成，且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；

(d)对与SEQ ID NO：2所示的碱基序列具有80％以上的序列同源性，且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列；

(e)对作为与SEQ ID NO：2所示的碱基序列所组成的多聚核苷酸在严格的条件进行杂交的多聚核苷酸的碱基序列且至少在80℃、pH5.5的条件下具有纤维二糖水解酶活性的多肽进行编码的碱基序列。

此外，作为本发明及本申请说明书中的“严格的条件”，可列举如MolecularCloning-A Laboratory Manual Third Edition(Sambrook等，Cold Spring HarborLaboratory Press)中所记载的方法。可列举出在由6×SSC(20×SSC的组成：3M氯化钠、0.3M柠檬酸溶液、pH7.0)、5×邓哈特溶液(Denhardt's solution)(100×邓哈特溶液的组成：2质量％牛血清白蛋白、2质量％Ficoll、2质量％聚乙烯吡咯烷酮)、0.5质量％的SDS、0.1mg/ml鲑精子DNA，及50％甲酰胺组成的杂交缓冲液(hybridization buffer)中，通过在42～70℃下进行数小时至一夜的孵育而使其杂交的条件。此外，作为在孵育后清洗时所使用的清洗缓冲液，优选含有0.1质量％SDS的1×SSC溶液，更优选含有0.1质量％SDS的0.1×SSC溶液。

在所述(a)～(e)的碱基序列中，简并密码子，优选选择宿主的使用频率高的密码子。例如，作为所述(a)的碱基序列，也可以是SEQ ID NO：2所示的碱基序列，也可以是不变更编码的氨基酸序列，将SEQ ID NO：2所示的碱基序列改变为在宿主中使用频率高的密码子的碱基序列。密码子的改变可通过公知的基因改组技术实施。

由SEQ ID NO：2所示的碱基序列组成的多聚核苷酸可以基于碱基序列信息化学合成，也可以通过对编码AR19G-166的基因(也称作“AR19G-166基因”)的全长或含纤维二糖水解酶催化剂区域的部分区域进行基因改组技术，从而从自然界获取。AR19G-166基因的全长或其部分区域，例如，可通过以下方法获得：从自然界中获取含微生物的样本，将从所述样本中回收的基因组DNA作为模板，使用基于SEQ ID NO：2所示的碱基序列通过常规方法而设计的正向引物和反向引物进行PCR。也可以将从所述样本中回收的mRNA作为模板，将通过逆转录反应合成的cDNA作为模板。回收作为模板的核酸的样本，优选为在温泉土壤等高温环境下获取的样本。

所述(d)的碱基序列中，与SEQ IN NO：2所示的碱基序列的序列同源性，只要为80％以上则没有特别的限定，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。

此外，碱基序列间的序列同源性(相同性)可以通过以下方式求得。使对应的碱基最多一致地将两个碱基序列并列设置，在相当于插入及缺失的部分引入空隙，求出得到的校准中的相对于除去空隙的碱基序列整体来说一致的碱基的比例。碱基序列间的序列同源性，可使用该技术领域中公知的各种相同性检索软件求出。本发明中的碱基序列的序列同源性的值是以根据公知的相同性检索软件BLASTN得到的校准为基础，通过计算而得到的。

例如，由所述(b)或(c)的碱基序列组成的多聚核苷酸，可以分别通过相对于由SEQID NO：2所示的碱基序列组成的多聚核苷酸，至少缺失、取代或添加一个碱基的方式而进行人工合成。此外，作为所述(b)或(c)的碱基序列，可以是AR19G-166基因的同源基因的全长序列或其部分序列。AR19G-166基因的同源基因可通过获取碱基序列已知的基因的同源基因时所使用的基因重组技术而获取。

本发明涉及的多聚核苷酸可以只具有编码纤维二糖水解酶催化剂区域的区域，也可以在所述区域的基础上，还具有编码纤维素结合模块、连接序列、各种信号肽、各种标签等的区域。

[表达载体]

本发明涉及的表达载体编入有所述本发明涉及的多聚核苷酸，其为：在宿主细胞中，至少在80℃、pH5.5的条件下，可表达具有纤维二糖水解酶活性的多肽的表达载体。即，所述表达载体为，可表达所述本发明的超耐热性纤维二糖水解酶的状态编入所述本发明的多聚核苷酸的表达载体。具体而言，需要从上游将由具有启动子序列的DNA、所述本发明涉及的多聚核苷酸、具有终止子序列的DNA所组成的表达盒编入到表达载体中。此外，向表达载体中编入多聚核苷酸时，可使用公知的基因重组技术进行，也可以使用市面出售的表达载体制作试剂盒。

作为所述表达载体，其可以是向大肠杆菌等原核细胞导入的载体，也可以是向酵母、丝状菌、昆虫培养细胞、哺乳培养细胞、植物细胞等真核细胞导入的载体。作为这些表达载体，可以根据各自宿主，使用通常所用的任意的表达载体。

本发明涉及的表达载体，不仅可以编入所述本发明涉及的多聚核苷酸，优选进一步编入有耐药性基因等的表达载体。其原因在于，容易进行通过表达载体而形态转化的宿主与未转化的宿主的挑选。

作为所述耐药性基因，例如有卡那霉素耐性基因、潮霉素耐性基因、双丙氨膦耐性基因等。

[转化体]

本发明涉及的转化体导入有本发明涉及的表达载体。在所述转化体中，可使本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶进行表达。现有公知的纤维二糖水解酶，多为现宿主的范围狭窄，即，大多难以异种表达。对此，本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶能够在大肠杆菌、酵母、丝状菌、高等植物叶绿体等广泛的表达宿主中表达。即，作为本发明涉及的转化体，其为导入了本发明涉及的表达载体的大肠杆菌、酵母、丝状菌、高等植物叶绿体等。

使用表达载体来制作转化体的方法并没有特别的限定，可通过在制作转化体时通常使用的方法实施。作为上述方法，例如有农杆菌介导法、基因枪法、电穿孔法以及PEG(聚乙二醇)法等。其中，在宿主为植物细胞的情况下，优选通过基因枪法或农杆菌介导法来实施。

从另一方面来说，作为导入了表达载体的宿主，其可以是大肠杆菌等原核细胞，也可以是酵母、丝状菌、昆虫培养细胞、哺乳培养细胞、植物细胞等真核细胞。通过培养大肠杆菌的转化体，可以更加简便且大量地生产本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶。另一方面，由于在真核细胞内，蛋白质上施加有糖链修饰，因此可以通过使用真核细胞的转化体，生产比使用原核细胞的转化体时耐热性更加优异的超耐热性纤维二糖水解酶。特别是在所述转化体为曲霉等丝状菌或酵母等真核微生物的情况下，可比较简便地大量生产耐热性更加优异的超耐热性纤维二糖水解酶。

作为宿主，在使用原核细胞、酵母、丝状菌、昆虫培养细胞、哺乳培养细胞等的情况下，所得到的转化体通常可以采用与形态转化前的宿主相同的常规方法来进行培养。

在本发明涉及的转化体为植物的情况下，作为宿主，可使用植物培养细胞，也可以使用植物器官或植物组织。通过使用公知的植物组织培养法等，可以从形态转化的植物细胞或愈伤组织等中得到转化植物。例如，可以使用无激素的再分化培养基等来培养形态转化植物细胞，通过将所得到的出根的植物体幼苗移植至土壤等进行栽培，得到形态转化植物。

[超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法]

本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法是一种在所述本发明涉及的转化体内，生产超耐热性纤维二糖水解酶的方法。在使用不具备表达时期等的抑制能力的启动子的下游编入有所述本发明涉及的多聚核苷酸的表达载体制备的转化体内，本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶进行恒常表达。另一方面，相对于使用通过特定的化合物或温度条件等诱导表达的所谓的表达诱导型启动子而制备的转化体，通过进行适于各自表达诱导条件的诱导处理，从而使超耐热性纤维二糖水解酶在所述转化体内表达。

通过转化体所生产的超耐热性纤维二糖水解酶，可以以留存于所述转化体内的状态使用，也可以从所述转化体中提取并提纯。

从转化体中提取并提纯超耐热性纤维二糖水解酶的方法，只要是不损害超耐热性纤维二糖水解酶的活性的方法，则没有特别的限定，可通过在从细胞或生物体组织中提取多肽的情况下通常使用的方法进行提取。作为所述方法，例如可列举出将转化体浸渍于适当的提取缓冲液中，提取超耐热性纤维二糖水解酶后，将提取液从固体残渣中分离出来的方法。作为所述提取缓冲液，优选含有表面活性剂等可溶化剂的缓冲液。在转化体为植物的情况下，在浸渍于提取缓冲液之前，可以预先将所述转化体切碎或粉碎。此外，作为分离提取液与固体残渣的方法，例如，可以使用过滤方法、减压过滤方法、离心处理方法等公知的固液分离处理，也可以对处于浸渍于提取缓冲液状态下的转化体进行压榨。提取液中的超耐热性纤维二糖水解酶可使用盐析法、超过滤法、层析法等公知的提纯方法进行提纯。

使本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶以具有分泌型信号肽的状态在转化体内表达的情况下，在培养所述转化体后，从所得的培养物中回收去除转化体的培养上清液，从而可简便地得到含有超耐热性纤维二糖水解酶的溶液。此外，本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶在具有His标签等标签的情况下，通过利用所述标签的亲和层析法，能够简便地对提取液或培养上清液中的超耐热性纤维二糖水解酶进行提纯。

[纤维素酶混合物]

所述本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶或通过所述本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法所制得的超耐热性纤维二糖水解酶，可作为至少含有一种其它纤维素酶的纤维素酶混合物而使用。通过所述本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法而制得的超耐热性纤维二糖水解酶，可以是包含在转化体内的状态的超耐热性纤维二糖水解酶，也可以是从转化体中进行提取并提纯的超耐热性纤维二糖水解酶。通过将本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶作为与其它纤维素酶的混合物，用于纤维素的分解反应，能够更有效地使难分解的木质纤维素分解。

作为所述纤维素酶混合物中所含有的所述超耐热性纤维二糖水解酶以外的其它纤维素酶，只要具有纤维素的水解活性，则没有特别限定。例如，可列举出木聚糖酶、β-木糖苷酶等半纤维素酶、β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶等。作为本发明涉及的纤维素酶混合物，优选至少含有半纤维素酶和内切葡聚糖酶中的一种，更优选同时含有半纤维素酶和内切葡聚糖酶。其中，优选含有选自木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-葡糖苷酶及内切葡聚糖酶中的至少一种，更优选同时含有木聚糖酶、β-木糖苷酶、β-葡糖苷酶及内切葡聚糖酶。

所述纤维素酶混合物中所含的其它纤维素酶，优选为至少在70℃下具有纤维素酶活性的耐热性纤维素酶，更优选为在70～90℃下具有纤维素酶活性的耐热性纤维素酶。所述纤维素酶混合物中所含的所有酶为耐热性，由此，能够在高温条件下，有效地进行基于所述纤维素酶混合物的纤维素分解反应。即，在所述纤维素酶混合物只含有耐热性纤维素酶的情况下，通过将所述纤维素酶混合物用于木质纤维素糖化处理，可在糖化温度70～90℃的高温环境下进行木质纤维素水解反应。通过该高温糖化，能够显著减少酶量与糖化时间，大幅消减糖化成本。

[纤维素分解物的制备方法]

本发明涉及的纤维素分解物的制备方法，是通过本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶来分解纤维素，从而得到分解物的方法。具体而言，通过使含纤维素的材料与本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶、本发明涉及的转化体、或由本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法所制得的超耐热性纤维二糖水解酶接触，从而生产纤维素分解物。

这里所说的“纤维素分解物”，是指主要含有纤维二糖、其它纤维三糖等的纤维低聚糖。

作为含纤维素的材料，只要含纤维素，则没有特别限定。作为所述材料，例如，可列举出杂草或农业类废弃物等纤维素类生物质、废纸等。含有所述纤维素的材料在与本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶接触前，优选进行破碎或切碎等物理处理、酸碱等化学处理、浸渍于合适的缓冲液中、或溶解处理等。

本发明涉及的基于超耐热性纤维二糖水解酶的纤维素水解反应的反应条件，只要是所述超耐热性纤维二糖水解酶显示出纤维二糖水解酶活性的条件即可。例如，优选在55～100℃、pH3.5～7.0下进行反应，更优选在70～100℃、pH4.0～6.0下进行反应。可根据供水解的含纤维素的材料的种类、预处理的方法、量等条件来适当调节反应时间。例如，可以为10分钟～100小时，在分解纤维素类生物质的情况下，可以以1～100小时的反应时间来进行。

在纤维素的水解反应中，除了本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶，优选使用至少一种其它的纤维素酶。作为所述其它的纤维素酶，可以使用与所述纤维素酶混合物中所含的纤维素酶相同的物质，在至少70℃下，优选至少在70～100℃下具有纤维素酶活性的耐热性纤维素酶。此外，在所述纤维素分解物的制备方法中，可使用所述纤维素酶混合物来代替本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶、本发明涉及的转化体、或通过本发明涉及的超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法制得的超耐热性纤维二糖水解酶。

实施例

下面，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不仅限于下述实施例。

[实施例1]来自温泉土壤的新型超耐热性纤维二糖水解酶的克隆

＜1＞高温土壤宏基因组DNA的制备

从日本国内喷出高温温泉的地域中，选取含有土壤、泥、生物垫的温泉水。这些样本在选取时的温度为33～78℃、pH为7.2～8的范围。在这些温泉土壤样本内，对宏基因组DNA样本名称分别为AR19、OJS2、OJS4、OJS7、OJS9的5个样本，提取DNA。从所选取的各10g的温泉土壤样本中，使用DNA提取试剂盒(ISOIL Large For Beads ver.2，日本基因社制)提取DNA。所得到的AR19的DNA量为10μg以上，使用其中的5μg，用罗氏诊断(Roche-Diagnostics)公司制的GS FLX钛454进行宏基因组定序。剩下的DNA用于纤维素酶基因的PCR克隆。另一方面，在DNA量少(10μg以下)的试样中，使用基因组DNA扩增试剂盒(Genomiphi V2DNA Amplification Kit，通用电气医疗集团(GE Healthcare)公司制)进行基因组扩增。

＜2＞温泉土壤宏基因组数据的汇编与统计量

使用提取自温泉土壤宏基因组的基因组DNA样本之一的AR19，按照罗氏公司制454GS FLX Titanium technology(454GS FLX钛工艺)霰弹枪定序用标准手册，进行3次霰弹枪定序。通过PyroBayes(Quinlan et al.，Nature Methods，2008，vol.5，P.179-81.)，对ROCHE454的输出(sff文件)进行序时碱基响应(base call)，从而获取FASTA形式的序列文件及品质(Quality)值文件。将得到的短序列(sequence reads)的端部切断以提高品质，使用454生命科学(Life Sciences)的汇编软件Newbler版本2.3进行汇编。汇编设定为“最低可接受的重量匹配(mi)＝0.9”、“选项：-大型(对于大型或复杂的基因组，加速组装，但降低精度”(“minimum acceptable overlap match(mi)＝0.9”、“option：-large(for large orcomplex genomes，speeds up assembly，but reduces accuracy”)来进行。

Quality过滤处理的读长与100BP以上的汇编重叠群共330Mbp，该数据组用于纤维素酶基因解析。读长总数2,766,332读长中的2,040,651个读长，汇编于平均为1027bp以上的重叠群中(计为101,372重叠群)，其中，最大重叠群的长度为187,970bp。

汇编后的序列参见KEGG数据库(Kanehisa，M.Science&Technology Japan，1996，No.59，P.34-38，http://www.genome.jp/kegg/，2011/5/11(检索))，将所有重叠群及单例(シングルトン)系统共分成5类，分别为细菌、古生菌(古细菌)、真核生物、病毒、不属于任何一种的种类。汇编后的序列长(＝总重叠群长+总单例长)为330Mbp，其中符合细菌的序列长为59.9Mbp，符合古生菌的序列长为3.1Mbp，符合真核生物的序列长为25,499bp，符合病毒的序列长为384,255bp。从这些结果可知，该宏基因组数据库仅含有19.2％的已知的DNA序列。不属于任何一种的序列长为266.7Mbp，在汇编后的全部序列中占80.8％。其为来自细菌、古生菌或真核生物中的任意一种的新型序列。

＜3＞纤维二糖水解酶的开放阅读框(ORF)预测

从通用蛋白质资源(UniProt)数据库(http://www.uniprot.org/)中下载EC号为3.2.1.4(纤维素酶)、3.2.1.37(β-木糖苷酶)、3.2.1.91(cellulose1,4-β-cellobiosidase)、3.2.1.8(内切1,4-β-木聚糖酶)的序列(检索日：2009/4/13)，构建这些糖苷水解酶基因的蛋白质组局部数据库。使用注释软件Orphelia(Hoff et al.，NucleicAcids Research，2009，37(Web Server Issue:W101-W105)，由上述＜2＞中获得的重叠群序列，推定基因区域(＝开放阅读框)(Orphelia option：default(model＝NET700，maxoverlap＝60)。为了从所推定的ORF中提取糖苷水解酶基因，使用BLASTP(blastallver.2.2.18)，参照局部数据库。BLASTP的选项(option)条件为：“Filter query sequence＝false”、“Expectation value(E)＜1e^-20”，[以下，默认值：Cost to open a gap＝-1，Cost to open extended gap＝-1，X dropoff value for gapped alignment＝0，Threshold for extending hits＝0，Word size＝default]，将所符合的序列作为糖苷水解酶基因而收集。

对于以这种方式获得的纤维素酶、内切半纤维素酶、脱支酶等糖苷水解酶，以蛋白质的功能区域序列数据库pfam HMMs(Pfam version23.0and HMMER v2.3；Finn，et al.，Nucleic Acids ResearchDatabase，2010，Issue 38，P.D211-222)为标准进行功能分类。具体而言，使用应用了隐马尔可夫模型的序列同源性检索演算法HMMER(Durbin et al.，‘TheTheory behind Profile HMMS.Biological sequence analysis：Probabilistic modelsof proteins and nucleic acids’，1998，Cambridge University Press.；hmmpfam(ver.2.3.2)，E-value cutoff＜1e^-5；Database＝Pfam_fs(Models that can be used tofind fragments of the represented domains in a sequence.))，从与pfam区域数据库的相同性中，进行这些序列的糖苷水解酶(GH)家族分类。

＜4＞AR19G-166RA及AR19G-166QV的克隆

从温泉土壤宏基因组AR19中，获得13个含有GH6、GH9、GH48及其它属于GH家族的纤维二糖水解酶催化剂区域序列的ORF。对于这些ORF设计引物，通过PCR从温泉土壤宏基因组AR19中进行上述基因的克隆。最终由开放阅读框AR19G-166克隆出属于GH6家族的纤维二糖水解酶基因(AR19G-166RA及AR19G-166QV)

＜5＞开放阅读框AR19G-166

开放阅读框AR19G-166编码由474氨基酸残基组成的多肽(SEQ ID NO：5)，但其为缺失了起始密码子的长度不完整序列，仅由连接的部分序列与GH6催化剂区域构成。AR19G-166的GH6催化剂区域作为基因AR19G-166RA及AR19G-166QV而被PCR克隆，显示出与绿弯菌门中温性好氧性细菌橙色滑柱菌DSM 785的GH6糖苷水解酶(基因库：ABX04776.1)具有66％的氨基酸序列同源性。

通过使用了由SEQ ID NO：7所示的碱基序列所组成的正向引物(5’-CACCATGTTGGACAATCCATTCATCGGAG-3’：在SEQ ID NO：6所示的碱基序列的5’末端侧添加有7个碱基(CACCATG)。所述添加序列中，3’侧的ATG为起始密码子，5’侧的CACC为用于插入到载体的序列)与由SEQ ID NO：8所示的碱基序列所组成的反向引物(5’-TTAGGGTTGGATCGGCGGATAG-3’)的PCR克隆，从AR19G-166中得到了2个基因克隆(AR19G-166RA与AR19G-166QV)。在AR19G-166RA与AR19G-166QV所编码的氨基酸序列中，只有299位和351位的2个氨基酸残基不同。AR19G-166RA的299位的氨基酸残基为精氨酸，351位的氨基酸残基为丙氨酸。AR19G-166QV的299位的氨基酸残基为谷酰胺，351位的氨基酸残基为缬氨酸。

＜6＞自然变异体(natural variant)的PCR克隆

相对于所述的5个宏基因组DNA(AR19、OJS2、OJS4、OJS7、OJS9)，使用由SEQ ID NO：7所示的碱基序列所组成的正向引物和由SEQ ID NO：8所示的碱基序列所组成的反向引物，进行纤维二糖水解酶基因的PCR克隆。采用桑格测序对符合的克隆进行序列解读，各克隆的基因型与氨基酸变异示于表1及表2。通过对多个宏基因组DNA样本进行PCR克隆，共计得到46个克隆具有多个SNP的自然变异体。这些变异体表现出c6t、g51a、a69g、a201g、c259t、c433t、c450t、g456c、c531t、a627g、a896g、c1116t、c98t(A33V)、t251c(I84T)、c262t(P88S)、g497a(R166H)、c683t(T228I)、c688t(L230F)、a762t(E254D)、a761g(E254G)、c805t(R269C)、a896g(R299Q)、a916g(S306G)、c1052t(A351V)、g1078a(E360K)、g1216a(A406T)、t1241c(F414S)共计27处SNP(SNP以小文字表示，括号内表示由SNP引起的氨基酸取代)。该27处的SNP，其中的14处引起了氨基酸变异(表1、表2)。所显示的这些SNP的克隆，全部都未确认到IN/DEL突变(DNA碱基序列的插入及缺失)。

[表1]

[表2]

如此得到的46个克隆中，半数以上的29个克隆为变异体AR19G-166QA(以下略称为QA，SEQ ID NO：3)，其所编码的氨基酸序列中299位的氨基酸残基为谷酰胺、351位的氨基酸残基为丙氨酸；1个克隆为变异体AR19G-166QV(以下略称为QV，SEQ ID NO：9)其所编码的氨基酸序列中299位的氨基酸残基为谷酰胺、351位的氨基酸残基为缬氨酸；4个克隆为变异体AR19G-166RA(以下略称为RA，SEQ ID NO：10)，其所编码的氨基酸序列中299位的氨基酸残基为精氨酸、351位的氨基酸残基为丙氨酸(表1)。

其它的12个克隆为这些QA、RA或QV中的1～3个氨基酸残基变异了的变异体。12个克隆中，9个克隆为AR19G-166QA所编码的氨基酸序列中1～2个氨基酸残基发生取代的变异体(表1)。它们是：2个克隆为33位的丙氨酸取代为缬氨酸的QA/A33V；1个克隆为228位的苏氨酸取代为异亮氨酸的QA/T228I；1个克隆为269位的精氨酸取代为半胱氨酸的QA/R269C；1个克隆为254位的谷氨酸取代为甘氨酸的QA/E254G；2个克隆为306位的丝氨酸取代为甘氨酸的QA/S306G；1个克隆为166位的精氨酸取代为组氨酸、360位的谷氨酸取代为赖氨酸的QA/R166H/E360K；1个克隆为84位的异亮氨酸取代为苏氨酸、406位的丙氨酸取代为苏氨酸的QA/I84T/A406T。

此外，其它3个克隆为AR19G-166RA所编码的氨基酸序列中1个或3个氨基酸残基发生了取代的变异体，它们是：1个克隆为254位的谷氨酸取代为天门冬氨酸的RA/E254D；2个克隆为88位的脯氨酸取代为丝氨酸、230位的白氨酸取代为苯丙氨酸、414位的苯丙氨酸取代为丝氨酸的RA/P88S/L230F/F414S(也称“AR19G-166RASFS”，SEQ ID NO：1)。

图1表示AR19G-166RA、AR19G-166QV、AR19G-166QA及AR19G-166RASFS编码的氨基酸残基的序列的校准。这4种基因为：通过相同的引物试剂盒由高温土壤宏基因组的5个样本进行PCR克隆的基因。图中，“·”表示相同的氨基酸残基，被取代的氨基酸残基用背景标黑的字母表示。

出现最频繁的克隆为AR19G-166QA，5种宏基因组DNA共获得29个克隆(表2)。这29个AR19G-166QA克隆，在碱基序列中含有7处SNP(c6t、a201g、c259t、c450t、g456c、c531t、a627g)。

若与AR19G-166QA基因进行比较，AR19G-166RA基因的碱基序列有3处SNP(a51g、a201g、a896g)(表2)。其中的2处为静默突变，碱基序列51位和201位均是鸟嘌呤取代为腺嘌呤。剩下的1处为伴随氨基酸取代的SNP，896位的腺嘌呤变异为鸟嘌呤，通过该SNP，氨基酸序列中的299位氨基酸残基在AR19G-166RA中被精氨酸取代。

AR19G-166QV基因的碱基序列有1处SNP(表2)。碱基序列1052位的胞嘧啶变异为胸腺嘧啶，因此，AR19G-166QA所编码的氨基酸序列的351位的氨基酸残基在AR19G-166QV中由丙氨酸取代为缬氨酸。

在这12种AR19G-166SNP变异体中，表现出最高耐热性的AR19G-166RASFS与AR19G-166QA相比较，具有5处SNP(a201g、c262t(P88S)、c688t(L230F)、a896g(Q299R)、t1241c(F414S))(表2)。其中的4处伴随有氨基酸取代，其中的1处与AR19G-166RA相同，896位的腺嘌呤变异为鸟嘌呤，AR19G-166RASFS所编码的氨基酸序列中，299位的氨基酸残基取代为精氨酸。另外3处为262位的胞嘧啶变异为胸腺嘧啶、688位的胞嘧啶变异为胸腺嘧啶、1241位的胸腺嘧啶变异为胞嘧啶，通过这些SNP，分别地在AR19G-166RASFS所编码的氨基酸序列中，88位的脯氨酸取代为丝氨酸、230位的白氨酸取代为苯丙氨酸、414位的苯丙氨酸取代为丝氨酸。

＜7＞氨基酸取代自然变异体的表达及提纯

使用热冲击法，将由PCR克隆所得到的质粒导入至蛋白质表达用大肠杆菌Rosetta-gamiB(DE3)pLysS株(Merck社制)。将携带有目标基因的大肠杆菌接种到含100mg/L氨苄西林的LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝0.2～0.8左右后，添加IPTG(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷、Isopropyl-β-D(-)-thiogalactopyranoside)，进一步培养20小时，由此诱导目标蛋白质的表达。培养后，进行离心分离，回收大肠杆菌，加入培养液的1/20容量的200mM醋酸缓冲液(pH5.5)，进行悬浮。之后，使用超声波粉碎装置非接触式超声波破碎仪UCD-200T(BioruptorUCD-200T)(CosmoBio社制)，在进行30秒粉碎后停止30秒，重复该处理程序10次，获得含有氨基酸被取代的目标蛋白质的上清液，将其作为粗酶样本液。

通过SDS-PAGE解析，确认了粗酶样本液中的目标蛋白质。图2所示为AR19G-166基因的自然变异体所编码的纤维二糖水解酶酶蛋白质的SDS-PAGE解析(CBB染色)的结果。

将粗酶样本液填充到用50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)进行平衡化的离子交换柱HiTrap Q HP(GE HEALTHCARE社制)中，使用中高压液体层析系统AKTA design(GEHEALTHCARE社制)，以0～50％的浓度制备，通过含有1M的NaCl的50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)对蛋白质进行分级。具有纤维二糖水解酶活性的级分在集中混合后，通过离心式超过滤膜VIVASPIN 20(赛多利斯(SARTORIUS STEDIM)社制)，向含750mM硫酸铵的50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)中进行溶液交换。将溶液交换后的纤维二糖水解酶活性级分填充到用相同液体进行平衡化的疏水性相互作用分离柱HiTrap Phnenyl HP(GE HEALTHCARE社制)中，以100～0％的浓度制备，用50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)将蛋白质溶出。具有纤维二糖水解酶活性的级分在集中混合后，用VIVASPIN 20进行浓缩，直至液量为8mL左右。将浓缩的样本添加到用含有150mM的NaCl的50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)进行平衡化的凝胶过滤柱Hiload26/60superdex200PG(GE HEALTHCARE社制)中，使体积为柱体积的1～1.5倍的相同缓冲溶液以流速2～3mL/min流动，由此进行分级。具有纤维二糖水解酶活性的级分在集中混合后，向50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0)进行溶液交换并浓缩，得到最终浓度约为1mg/mL的提纯酶样本液。

＜8＞以PSA作为底物的纤维二糖水解酶活性测定(PSA水解活性)

在纤维二糖水解酶活性测定中，将磷酸膨润纤维素(PSA)用作底物。PSA按照以下方法制备：首先，在磷酸溶液中溶解Avicel粉末(微结晶性纤维素粉末，MERCK社制)，之后加入灭菌蒸馏水使其析出后，清洗至pH5.0以上。此外，在之后的实验中所使用的PSA均按此法制备。

用于PSA活性测定的反应溶液的组成是由最终浓度为0.5％的PSA溶液、50mM醋酸缓冲溶液(pH5.5)、适当进行稀释的粗酶样本液(上述＜7＞中制备的)组成，在50～90℃下使该反应溶液反应20分钟。反应完成后，通过分光光度计(540nm)测定使用3,5-二硝基水杨酸试剂(3,5-dinitrosalicylic acid reagent，DNSA)进行水解的还原端量，使用由葡萄糖制成的校正曲线来计算还原糖量，通过与对照组的差来计算出通过酶的水解而生成的还原糖量。将最高的还原糖量的值设为100，以相对值测绘各温度下的还原糖量。

PSA活性测定结果如图3所示。由高温土壤宏基因组DNA克隆的所有纤维二糖水解酶酶基因AR19G-166的氨基酸取代变异体，显示出PSA水解活性。AR19G-166QV及AR19G-166QA的氨基酸取代变异体的最适温度，比AR19G-166RA及AR19G-166RA的氨基酸取代变异体要低。在QA/T228I中为T_opt＝80℃，QA/S306G中为T_opt＝70℃，其余的AR19G-166QA的氨基酸取代变异体中为T_opt＝75℃。另一方面，AR19G-166RA及其氨基酸取代变异体RA/E254D中为T_opt＝80℃，AR19G-166RA的氨基酸取代变异体AR19G-166RASFS中显示为T_opt＞90℃。

在人为引起突变的DE法中，产生庞大数量的功能缺失变异体，徒劳性质的功能试验非常多。然而，通过本发明涉及的自然变异体获取方法克隆的多个变异体均具有酶活性，从由比较少的克隆所构成的变异体库中，可得到在15℃以上也具有高的热稳定性的纤维二糖水解酶AR19G-166RASFS。

＜9＞酶特性的探讨

对于在PSA水解活性试验中显示出最高最适温度T_opt的AR19G-166RA的3个氨基酸(P88S/L230F/F414S)变异体AR19G-166RASFS，提纯酶蛋白质，对于底物特异性、pH特性、温度特性(最适温度及热稳定性)，详细地测定了酶特性。

(底物特异性)

底物特异性通过使用PSA、Avicel粉末、羧甲基纤维素(CMC，Sigma社制)、木聚糖(from Beechwood，Sigma社制)、地衣多糖(Lichenan，MP Biomedicals社制)、海带多糖(from Laminaria digitata，Sigma社制)进行测定。反应溶液由100μl各底物的1％水溶液、50μl的200mM醋酸缓冲溶液(pH5.5)、40μl提纯水及10μl提纯酶样本液组成，使反应溶液在70℃下反应20分钟。通过与所述＜8＞相同的方法，求出通过酶的水解而生成的还原糖量，计算比活性(U/mg)。各自的计算通过三次独立的试验来进行，求出平均值和标准误差。

测定结果如图4所示。AR19G-166RASFS相对于水溶性磷酸膨润纤维素PSA显示出高的水解活性，此外，相对于β-1,3键和β-1,4键葡聚糖组成的地衣多糖，显示出分解活性(0.12553U/mg)。另一方面，相对于由CMC或β-1,3键和β-1,6键葡聚糖组成的海带多糖，几乎不显示分解活性。相对于结晶性纤维素Avicel，水解活性非常弱(0.08606U/mg)，但在2小时反应时间的试验中，显示出明显的水解活性(0.18001U/mg)。相对于木聚糖不显示水解活性(0.015U/mg)。

(温度依存性)

对基于AR19G-166RASFS的PSA水解活性的温度依存性进行考察。PSA水解活性为，以100μl 1％PSA溶液、50μl醋酸缓冲溶液(pH5.5)、40μl提纯水、10μl提纯酶样本液作为反应溶液的组成，在50、60、65、70、75、80、85、90、95或99℃下使其反应20分钟。求出由酶的水解反应而生成的还原糖量，将在1分钟内生成1μmol还原糖的酶活性计为1U，将以蛋白量除得的值作为比活性。此外，在反应溶液中，添加0.5mM钙离子或0.5mM锰离子，同样地测定PSA水解活性。

测定结果如图5所示。AR19G-166RASFS的PSA水解活性在pH5.5下为T_opt＝90℃。此外，若将0.5mM钙离子或0.5mM锰离子添加至酶-底物反应液中，则T_opt在任何情况下都上升至95℃。在所有温度域中，可判定通过添加钙离子或锰离子，能够提高PSA水解活性。尤为显著的是，通过加入锰离子，最适温度下的PSA水解活性上升了2倍左右，可确认为由于加入了二价金属阳离子，从而获得了酶蛋白质的稳定化。

(pH依存性)

对基于AR19G-166RASFS的PSA水解活性的pH依存性进行考察。在PSA水解活性的测定中，作为底物，使用0.5质量％PSA，通过McIlvaine缓冲溶液(pH3～8)将反应液调整至各pH，在50、70或90℃下测定各pH下的水解反应。测定结果如图6所示。测定在50℃、70℃及90℃下的相对于反应液的实测pH值的PSA水解活性，并进行测绘。

如图6所示，提纯的变异体AR19G-166RASFS的PSA水解反应的最适pH依存于反应温度而变化，在90℃下，pH在5～6.5的范围内显示出最高PSA水解活性。50℃及70℃下最适pH在4～6的范围。各温度下，pH在7以上时，均为低水平的PSA水解活性。

(使用了PSA水解活性的热稳定性测定)

作为涉及蛋白质的热稳定性的指标，经常使用热变性温度或解链温度Tm(Meltingtemperature)。通过一定时间的预加温(预培养)，酶活性减少至无处理区的50％时的预培养温度基本上与蛋白质的解链温度T_m相同，通过测定酶活性可求出。通过该方法求出AR19G-166RA及AR19G-166RASFS的解链温度T_m。

具体而言，在不添加底物的条件下进行40分钟的预加热，以PSA水解活性减少至50％的温度T₅₀作为指标，考察变异体AR19G-166RASFS的热稳定性。各数据通过逻辑斯谛(Logistic)函数进行近似，以近似曲线的相对活性值50％的温度为T₅₀。

测定结果如图7所示。相对于AR19G-166RA的T₅₀＝75.6℃，3个氨基酸残基被取代的变异体AR19G-166RASFS的T₅₀＝91.2℃(50℃下测定PSA活性时)，或T₅₀＝92.0℃(70℃下测定PSA活性时)，显示出比AR19G-166RA高出15℃以上的热稳定性。

(通过DSF法的热稳定性测定)

差示扫描荧光分析法(Differential scanning fluorimetry，DSF)是使用荧光色素与实时处理PCR装置对蛋白质的热变性进行测定的方法之一，可应用于各种蛋白质。SYPRO Orange等人在DSF中使用的荧光色素，在与疏水性部位结合的非极性条件下发出荧光，另一方面，在溶于水的极性条件下抑制发光。通常，蛋白质在其热变性温度下其折叠结构被打开，处于内部的疏水性部位露于蛋白质表面。若在该露出的疏水性部位上结合铜染及橙染(SYPRO Orange)，则通过波长470～480nm的激发光，发出在波长595nm附近具有峰的强荧光。以一定间隔使蛋白质溶液的温度阶段性上升，通过测定荧光强度，可计算解链温度(＝荧光强度的变化点)

具体而言，在96孔PCR板(Multiplate 96well PCR Plate MLL-9651，Bio-Rad社制)的孔中，加入2μl稀释100倍的SYPRO Orange(Lifetechnologies社制)、1μl浓度为1mg/mL的酶蛋白质、5μl的200mM醋酸缓冲溶液(pH5.5)、12μl提纯水，使各孔的容积为20μl。PCR板用Optical 8连扁形锥盖(flat cap)(Bio-Rad社制)密封，用实时处理PCR装置(CFX96Touch实时PCR系统，Bio-Rad社制)，以每次升温0.5℃、使孔的温度从30℃升温至100℃，在到达目标温度并经过30秒后，同时测定各孔的荧光强度。通过波长波段450-490nm的发光二极管(LED)激发SYPRO Orange，SYPRO Orange放射光通过560～580nm范围的带通滤波器，使用CCD照相机进行荧光强度的测定，将荧光强度变化作为温度的函数进行测绘。热变性温度(Melting temperature；Tm值)定义为：作为温度函数的荧光强度曲线的一阶微分(图8的下段图的Y轴所示的“-d(Fluorescence)/dt”的极大值。使用实时处理PCR上附带的解析软件CFX Manage(Bio-Rad社制)，进行数据解析。此外，向各反应溶液中添加3mM的钙离子，同样地进行测定。

图8示出了通过DSF法测定的AR19G-166RA、AR19G-166RAS FS的各酶蛋白质所显示的伴随热变性而引起的SYPRO Orange的荧光强度变化。图8的上段图表为实测数据，图8的下段图表示出了图8的上段图表的荧光强度变化曲线的一阶微分“-d(Fluorescence)/dt”，表3示出了通过DSF法独立地对各自的酶蛋白质的解链温度分别测定3次后所求得的平均值。

[表3]

酶	通过DSF测得的解链温度(℃，mean±se)
		AR19G-166RA	80.5±0.0(n＝3)
AR19G-166RA+3mM Ca²⁺	85.7±0.2(n＝3)
		AR19G-166RASFS	93.0±0.0(n＝3)
AR19G-16RASFS+3mM Ca²⁺	96.0±0.0(n＝3)

AR19G-166RASFS所编码的酶蛋白质的DSF荧光强度曲线在95℃附近显示出峰，热变性温度Tm＝93.0±0.0(n＝3)(表3)。该热变性温度的值显示出与通过PSA水解活性求得的该酶最适温度T_opt＞90℃、或酶活性半衰期温度T₅₀＝91.2℃及92.0℃相近的值。

另一方面，AR19G-166RA的DSF荧光强度曲线在83℃附近显示出峰，Tm值为80.5±0.0℃(N＝3)，由此可知AR19G-166RASFS热稳定性提高了12.5℃。

人们已知，一般情况下二价金属离子通过与蛋白质结合而使蛋白质的结构稳定，提高其耐热性。在AR19G-166RA中，通过加入3mMCa²⁺的，由DSF计算出的热变性温度Tm上升5.2℃，变为85.7±0.2℃(n＝3)。AR19G-166RASFS通过加入3mMCa²⁺，Tm上升5.2℃，变为96.0±0.0℃(n＝3)。该热变性温度96.0℃为迄今已知的纤维二糖水解酶中的最高值。

难分解性的结晶性纤维素主要通过3种糖苷水解酶协调作用而被水解为单糖的葡萄糖。内切葡聚糖酶(纤维素酶或内切-1,4-β-D-葡聚糖酶，EC 3.2.1.4)随机切断葡聚糖链的1,4-β糖苷键，生成具有不同长度的低聚糖。EXO型葡聚糖酶的纤维二糖水解酶(1,4-β-cellobiosidase或cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91)从葡聚糖链的还原末端(为属于GH7家族的CBH，例如TrCel7A或CBH I)或非还原末端(为属于GH6家族CBH、TrCel6A或CBH II)，由葡聚糖链的端部开始进行连续切断，生成纤维二糖。β-葡糖苷酶(β-1,4-葡糖苷酶，EC3.2.1.21)水解纤维二糖，生成葡萄糖。

综合以上结果可知，作为AR19G-166RA的3个氨基酸残基被取代的变异体的AR19G-166RASFS，其最适温度及热变性温度均显著提高，PSA水解活性减少50％的酶活性半衰期温度T₅₀及DSF引发的热变性温度Tm分别提高了10.5℃和12.5℃，该变异体的热稳定性得到显著改善。

从以热水喷出孔等极限环境作为生存圈的微生物中，分离出多个在80℃以上发挥功能的超耐热性纤维素酶，但关于对糖化效率最具影响的纤维二糖水解酶，并未获得具有足够耐热性的酶。因此，迄今为止，并未实现制备在80℃以上的高温下分解并糖化木质纤维素生物质的超耐热性酶混合液。通过使用具有极高耐热性的纤维二糖水解酶AR19G-166RASFS，可形成在高温下能进行木质纤维素酶糖化的酶混合液。

Claims

1.一种多肽，其特征在于，由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成。

2.一种多聚核苷酸，其特征在于，由对由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所组成的多肽进行编码的碱基序列构成。

3.一种表达载体，其特征在于，其编入有权利要求2所述的多聚核苷酸，在宿主细胞中，至少可在80℃、pH5.5的条件下表达具有纤维二糖水解酶活性的多肽。

4.一种转化体，其导入有权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的转化体，其特征在于，该转化体为真核微生物。

6.一种超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法，其特征在于，该方法包括在权利要求4或5所述的转化体内生产超耐热性纤维二糖水解酶。

7.一种纤维素酶混合物，其特征在于，该混合物含有权利要求1所述的多肽或由权利要求6所述的超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法所制得的超耐热性纤维二糖水解酶，以及至少一种其它的纤维素酶。

8.一种纤维素分解物的制备方法，其特征在于，该方法包括，通过使含纤维素的材料，与权利要求1所述的多肽、权利要求4或5所述的转化体、或由权利要求6所述的超耐热性纤维二糖水解酶的制备方法所制得的超耐热性纤维二糖水解酶接触，从而生产纤维素分解物。

9.根据权利要求8所述的纤维素分解物的制备方法，其特征在于，该方法包括，使所述含纤维素的材料进一步接触至少一种其它的纤维素酶。