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CN104903449A - 瘿蜂防治剂 - Google Patents

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CN104903449A
CN104903449A CN201380063286.1A CN201380063286A CN104903449A CN 104903449 A CN104903449 A CN 104903449A CN 201380063286 A CN201380063286 A CN 201380063286A CN 104903449 A CN104903449 A CN 104903449A
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Futuragene Israel Ltd
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Abstract

本发明涉及昆虫物种中双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默领域。本发明部分地基于本发明人对来自桉树入侵物种瘿蜂害虫桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小蜂(Om)的基因的测序。在某些方面，本发明提供Li和Om的核酸、其衍生物以及此类核酸和衍生物作为瘿蜂防治剂的用途。

Description

瘿蜂防治剂
序列表
本申请包含以ASCII格式通过EFS-Web提交的序列表，在此将其全部内容引入以作参考。2013年9月27日创建的所述ASCII副本命名为30407-0006WO1_SL.txt，其大小为46,878字节。
技术领域
本发明涉及昆虫物种中双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默领域。
背景技术
在南北半球均发生了桉树的瘿蜂(gall wasp)侵扰，并且对中国、澳大利亚、以色列和巴西的商业桉树种植造成威胁。防治桉树感染瘿蜂的努力包括尝试分离天然抗性植物和天然捕食者。这些努力已遇到了限制或并未成功。瘿蜂产生的瘿瘤(gall)的保护性环境使化学杀虫剂防治瘿蜂产生困难。
即使可行，化学杀虫剂防治也有劣势。化学杀虫剂潜在地对环境不利，不是选择性的，且潜在地对非目标作物和动物群有害。化学杀虫剂存留于环境中并通常代谢缓慢，或根本不代谢。化学杀虫剂在食物链中、特别是在较高等的捕食者物种内积累，它们可充当诱变剂和/或致癌物以引起不可逆且有害的遗传修饰。此外，由于相同的杀虫剂或具有相同作用模式的杀虫剂的重复使用，作物害虫可发展出对化学杀虫剂的抗性。
RNA干扰或“RNAi”是由与要下调的靶基因区域序列互补的双链RNA(dsRNA)引发的序列特异性基因表达下调的过程(也称作“基因沉默”或“RNA介导的基因沉默”)。多细胞生物体中借助RNA干扰(RNAi)手段的靶基因下调已成为完善建立的技术。美国专利申请公布US 2009/0285784 A1和US2009/0298787涉及dsRNA作为昆虫防治剂，并在此将其各自的全部内容引入于此以作参考。美国专利6,506,559号、美国专利申请公布2003/00150017 A1、国际公布WO 00/01846、WO 01/37654、WO 2005/019408、WO 2005/049841、WO 05/047300涉及RNAi保护植物抵抗昆虫的用途。在此将前述专利和公布的申请的全部内容分别引入于此以作参考。
另外的瘿蜂防治剂及其使用方法公开于2012年3月30日提交的国际公布PCT/US2012/031413，在此将其全部内容引入以作参考。
发明内容
本发明部分地基于本发明人对来自桉树入侵物种瘿蜂害虫：桉树枝瘿姬小蜂(Leptocybe invasa)(Li)和桉干瘿姬小蜂(Ophelimus maskelli)(Om)的基因的测序。在某些方面，本发明由此提供Li和Om的核酸、其衍生物以及此类核酸和衍生物作为瘿蜂防治剂的用途。
在某些方面本发明提供在高严格杂交条件(high stringency hybridizationcondition)下与SEQ ID NO:1-54和70-74中所列出的序列及其互补序列选择性杂交的分离的核酸。
在某些方面本发明提供与SEQ ID NO:1-54和70-74中所列出的序列及其互补序列的同一性(identical)为90-99.99％的分离的核酸。
在某些方面，本发明提供包括SEQ ID NO:1-54和70-74中所列出的至少17个邻接核苷酸(contiguous nucleotides)的分离的核酸。
在某些方面，本发明提供来自Li或Om的核酸，所述核酸包括如上所列出的与所述核酸的蜜蜂直向同源物(ortholog)的同一性为约80％以下的核酸。
在某些方面，本发明提供包括可操作地连接至表达调控序列(expressioncontrol sequence)的来自Li或Om的核酸或此类序列的反向互补体的载体。
在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有包括可操作地连接至表达调控序列的来自Li或Om的核酸或此类序列的反向互补体的载体的宿主细胞。
在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有包括可操作地连接至表达调控序列的来自Li或Om的核酸的载体的植物组织，例如叶组织和种子。
在某些方面，本发明提供抑制Li或Om核酸表达的分离的小抑制性核糖核酸(siRNA)分子。
在某些方面，本发明提供分离的双链核糖核酸(dsRNA)分子，所述分子包括与SEQ ID NO:1-54和70-74中的至少17个邻接核苷酸实质上同一的第一链核苷酸和与该第一链核苷酸实质上互补的第二链核苷酸。
在某些方面，本发明提供双链核糖核酸(dsRNA)分子，其与来自Li或Om的mRNA(Li或Om靶dsRNA)高度同源(大于80％)，包括与dsRNA的蜜蜂直向同源物的同一性为约80％以下的上述所列出的dsRNA分子。
在某些方面，本发明提供包括可操作地连接至作为来自Li或Om的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列的载体。
在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有载体的宿主细胞，所述载体包括可操作地连接至作为来自Li或Om的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列。
在某些方面，本发明提供转化有和/或承载有载体的植物组织，所述载体包括可操作地连接至作为来自Li或Om的dsRNA的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列。
在某些方面，本发明提供抑制Li或Om的必需基因的表达的分离的小抑制性核糖核酸(siRNA)分子。
在某些方面，本发明提供通过在植物中或者在植物的繁殖或生殖材料(reproductive material)中表达Li或Om的dsRNA来生产抗害虫植物的方法。
在某些方面，本发明提供通过在桉树中或者在桉树的繁殖或生殖材料中表达Li或Om的dsRNA来生产抗害虫桉树的方法。
在某些方面，本发明提供通过在桉树中或者在桉树的繁殖或生殖材料中表达Li或Om的靶向dsRNA来生产抗瘿蜂感染和/或侵扰的桉树的方法。
在某些方面，本发明提供抗植物病原害虫的植物的生产方法，所述方法用表达dsRNA的重组DNA构建体或构建体的组合来转化植物细胞；由转化的植物细胞再生植物；和在适于所述重组DNA构建体表达的条件下使转化的植物细胞生长。
本发明的一个或多个实施方案的细节将于下述附图和说明书中示出。从说明书和附图以及从权利要求来看，本发明的其他特征、目的和优势将显而易见。
附图说明
图1示意性描述了根据本发明的某些非限制性核酸。(A)用来自三个瘿蜂基因的序列构建的沉默构建体的示意图。转基因P1(启动子1)至T1(终止序列1)编码用于沉默瘿蜂的发夹RNA(hpRNA)，其通过将来自三个不同的瘿蜂基因(Gw1,Gw2和Gw3)的各自100bp融合、通过将所得序列合成为反向重复、并在相应的正义和反向重复序列之间插入环序列而构建。转基因P2(启动子2)至T2(终止序列2)编码具有相应的来自三个瘿蜂基因的融合的100bp序列的mRNA。由转基因P2至T2转录的mRNA是细胞质增强沉默信号(cytoplasmicenhancement of the silencing signal)的模板。(B)由转基因P1至T1转录产生的hpRNA分子的示意图。(C)由转基因P2至T2转录产生的mRNA的示意图。
图2示意性描述了根据本发明的某些非限制性核酸。(A)根据图2描述的一般方案，由来自三个Om基因的序列构建的Om沉默构建体#1(SEQ ID NO:55)的示意图。(B)由转基因P1至T1转录产生的hpRNA分子的示意图。(C)由转基因P2至T2转录产生的mRNA的示意图。定义：P1-CaMV 35S启动子(SEQID NO:57)；P2-sgFIMV启动子(SEQ ID NO:58)；T1-AtActin7终止子(SEQID NO:59)；T2-NOS终止子(SEQ ID NO:60)；L-环序列位点(SEQ ID NO:61)；Om 1-SEQ ID NO:24；Om 2-SEQ ID NO:48；Om 3-SEQ ID NO:52。
图3示意性描述了根据本发明的某些非限制性核酸。(A)根据图1描述的一般方案，由来自三个Li基因的序列构建的Li沉默构建体#2(SEQ ID NO:56)的示意图。(B)由转基因P1至T1转录产生的hpRNA分子的示意图。(C)由转基因P2至T2转录产生的mRNA的示意图。定义：P1-CaMV 35S启动子(SEQ IDNO:57)；P2-sgFIMV启动子(SEQ ID NO:58)；T1-AtActin7终止子(SEQ IDNO:59)；T2-Nos终止子(SEQ ID NO:60)；L-环序列位点(SEQ ID NO:61)；Li 1-SEQ ID NO:46；Li 2-SEQ ID NO:50；Li 3-SEQ ID NO:54。
图4示意性描述了根据本发明的某些非限制性核酸。(A)用来自单个Gw基因的序列构建的沉默构建体的示意图。转基因P1至T1编码用于沉默Gw的发夹RNA(hpRNA)，其由Gw基因的100bp、通过将该序列合成为反向重复、并在相应的正义和反向重复序列之间插入环序列而构建。转基因P2至T2编码具有来自Gw基因的100bp序列的mRNA。由转基因P2至T2转录的mRNA是细胞质增强沉默信号的模板。(B)由转基因P1至T1转录产生的hpRNA分子的示意图。(C)由转基因P2至T2转录产生的mRNA的示意图。
图5示意性描述了根据本发明的某些非限制性核酸。(A)用来自两个Gw基因的序列构建的沉默构建体的示意图。转基因P1至T1编码用于沉默Gw的发夹RNA(hpRNA)，其通过将两个不同的Gw基因的各自100bp融合、通过将所得序列合成为反向重复、并在相应的正义和反向重复序列之间插入环序列而构建。转基因P2至T2编码具有相应的来自两个Gw基因的融合的100bp序列的mRNA。由转基因P2至T2转录的mRNA是细胞质增强沉默信号的模板。(B)由转基因P1至T1转录产生的hpRNA分子的示意图。(C)由转基因P2至T2转录产生的mRNA的示意图。
各图中相同的附图标记表示相同的元件。
具体实施方式
本发明涉及使用双链RNA(dsRNA)介导的技术来防治植物的昆虫感染和侵扰。本发明人已进行了天然桉树害虫桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小蜂(Om)的转录组测序，并发掘各自的转录组来鉴定对应于Li和Om mRNA的Li和Om基因的开放阅读框。Li和Om RNA的鉴定允许设计介导Li和Om基因下调(沉默)的siRNA和dsRNA。因此，将此类siRNA和dsRNA用作生物防治剂来杀灭或抑制Li和Om的发育，并抑制由Li和Om造成的植物感染。
因此，本发明描述基于核酸来防治瘿蜂害虫的方法。活性成分为核酸，例如双链RNA(dsRNA)或可促进或导致产生dsRNA的核酸，可将其用作杀虫制剂。dsRNA可在宿主植物、植物部分(plant part)、植物细胞或种子中表达以保护植物抵抗瘿蜂。dsRNA的序列对应于瘿蜂必需基因的部分或全部，并经RNA干扰(RNA interference,RNAi)引起昆虫靶基因的下调。作为mRNA下调的结果，dsRNA阻止昆虫靶蛋白的表达并引起昆虫的死亡、生长停滞或不育。
本发明的方法发现在期望抑制瘿蜂的活力、生长、发育或生殖，或者降低昆虫的病原性或感染性的任何技术领域实际应用。本发明的方法进一步发现期望特异性地下调瘿蜂昆虫中的一种或多种靶基因表达的实际应用。特别有用的实际应用包括但不限于保护植物抵抗瘿蜂害虫侵扰。
昆虫生长的siRNA防治用于防止对昆虫侵扰敏感的细胞或植物的昆虫侵扰，该siRNA防治通过使昆虫与由退火互补链产生的dsRNA接触来起作用，所述互补链之一具有与昆虫靶基因的至少部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。dsRNA表达于被昆虫摄食的植物组织，然后由昆虫经肠吸收，从而控制生长或防止侵扰。参见Huvenne等人,2010,J Insect Physiol 56:227-35。
用于siRNA介导的干扰的瘿蜂靶基因包括优选非冗余的活力基因(vitalgene)。活力靶基因可以是受抑制时干扰昆虫生长或存活或病原性或感染性的任何基因。此类活力靶基因对于昆虫的活力、生长、发育或生殖是必需的，或者是参与昆虫病原性或感染性的任何基因，因而对靶基因的特异性抑制导致致死表型或者降低或停止昆虫侵扰。此类活力靶基因(其活性不能由其他相关基因补充)的下调导致对害虫幼虫的严重损伤，并提供针对固着(sessile)瘿蜂害虫的有效的害虫防治系统。靶基因可为在此所述的任何靶基因，例如害虫的活力、生长、发育或生殖所必需的靶基因。靶基因的实例包括，例如参与蛋白质合成和/或代谢和/或RNA合成和代谢和/或细胞过程的基因。这些靶基因的微小敲减(knockdown)将对许多其它基因和过程产生影响，最终导致对靶害虫的致死效应。此类下调的靶基因将引起昆虫的死亡，或昆虫的生殖或生长停止或延迟。此类靶基因对于昆虫活力是至关重要的，并且将其称为活力基因。
跨膜信号传导受体的适当隔离(sequestration)对细胞功能是至关重要的。内涵体货物分选(endosomal cargo sorting)利用多泡体(multivesicular bodies)的生物发生来将跨膜受体区室化(compartmentalize)并且因此调控信号转导。这归因于即使在细胞内的内化(internalization)入腔内小泡(intraluminal vesicles)之后，仍存在经过受体的细胞质结构域的活性信号转导。在多泡体的生物发生期间，当在腔内小泡中除去信号传导结构域时，任何信号转导随后中止。一旦受体处于多泡体中，小泡即与溶酶体融合，在此处完全降解(17,18,19)。最初的货物向小泡中的分选由通过Hrs-STAM复合体和负责转运的内涵体分选复合体：ESCRT(Endosomal Sorting Complex Required for Transport，转运所需的内涵体分选复合体)ESCRT-I,-II,-III的单泛素化(monoubiquitylation)调控。这些组分的突变造成货物向溶酶体的非正常转运。ESCRT蛋白家族在内涵体分选和隔离中的作用已经在酵母、果蝇和人中展示。在酵母中，这些特定的分选复合体中的突变导致货物从酵母溶酶体：液泡中排除，造成其中含有腔内小泡的多泡体缺失的表型。后生动物ESCRT活性对果蝇的发育过程有影响(17,18)。
已鉴定西方玉米根虫玉米根莹叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)中的基因，对其的RNA干扰造成统计显著的幼虫发育迟缓和死亡(17-20)。果蝇中的这些ESCRT蛋白家族成员的直向同源物包括组成ESCRT I复合体的Dmel、Vps23、Vps28、Vps37/mod(r)和Vps37b；构成ESCRT II的Vps22/Isn、Vps25和Vps36；以及组成ESCRT复合体的Vps2、Vps20、Vps24和Snf7/shrub。在玉米根虫中某些蛋白直向同源物的dsRNA的存在已示出它们相应的RNA的降低水平。承载有ESCRT复合体突变的果蝇具有明显的增殖、细胞极性丢失、凋亡激活和其它发育功能(17,18)。特定地在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)中，所有的ESCRT蛋白的突变呈现非正常内涵体和自噬体的积累。酵母的ESCRT突变展示出在非正常扩大的内涵体中水解酶和胞吞的受体的积累。
潜在的靶基因可基于与其它昆虫物种基因的同源性来鉴定。公布的全基因组RNAi介导的基因干扰文库(15,16)可用于鉴定当基于这些基因的RNAi表达并通过摄食或任何其它手段引入靶害虫生物体时对其它生物体致死的基因。因此，在果蝇或西方玉米根虫玉米根莹叶甲中鉴定为RNAi-致死的基因可用于筛选膜翅目物种的直向同源物。此类膜翅目直向同源物可进一步用于筛选用于潜在靶标的瘿蜂物种。
Li和Om是固着害虫。因此，Li和Om活力靶基因不能仅基于在非固着害虫中显示为活力基因的基因来预测。固着害虫，例如不能迁徙至替代的进食源(feed source)。在Li和Om的情形中，发育中的害虫禁闭于瘿瘤且在80-120天内以相同的来源为食。这种发育模式导致缓慢但持续吸收dsRNA的可能性，其可具有对非固着害虫不起作用的累积效应。
靶基因的实例包括但不限于多泡体亚单位12B样(Dmel)；NADH脱氢酶[泛醌]铁硫蛋白7(Vps23)；液泡蛋白分选相关蛋白28同系物(Vps28)；液泡蛋白分选相关蛋白37A样(Vps37/mod-r)；液泡蛋白分选相关蛋白37B样(Vps37b)；液泡分选蛋白SNF8样(Vps22/Isn)；液泡蛋白分选相关蛋白25样(Vps 25)；液泡蛋白分选相关蛋白36(Vps36)；带电多泡体蛋白2a样(Vps2)；带电多泡体蛋白6样(Vps20)；带电多泡体蛋白3样(Vps24)；以及带电多泡体蛋白4b样(Snf7/shrub)，SWI/SNF复合体亚单位SMARCC2(MOR)和真核翻译起始因子3亚单位I样蛋白(TIF)。瘿蜂靶基因的核苷酸序列包括，例如，SEQID NO:1-54中列出的序列，此类序列的互补体，以及在高严格杂交条件下与此类序列和互补体选择性杂交的序列。
对dsRNA介导的瘿蜂靶基因下调有用的核苷酸序列包括，例如(i)SEQ IDNO:1-54和70-74中列出的序列和此类序列的互补体；(ii)与SEQ ID NO:1-54中所列出的序列以及此类序列的互补体的同一性为至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的序列，；(iii)包含SEQ IDNO:1-54和70-74的至少17个邻接核苷酸的序列，和此类序列的互补体；以及(iv)在高严格杂交条件下与此类序列和互补体选择性杂交的序列。
本文所使用的“分离的”核酸是已从其天然环境的组分中鉴定并分离和/或回收的核酸。
本文所使用的“防治害虫”是指杀灭害虫，或防止害虫发育或生长，或防止害虫感染或侵扰。本文所使用的防治害虫还包括防治害虫的后代(卵的发育)。本文所使用的防治害虫还包括抑制害虫活力、生长、发育或生殖，或降低害虫的病原性或感染性。本文所使用的化合物和/或组合物可用于保持生物体健康并可治疗性、预防性或系统性地用于防治害虫或避免害虫生长或发育或感染或侵扰。
特别地，设想的通过本文所述方法防治的害虫为植物病原性有害昆虫。因此本文所使用的“防治昆虫”包括防治昆虫后代(例如卵的发育)。本文所使用的防治昆虫包括抑制昆虫的活力、生长、发育或生殖，或降低昆虫的病原性或感染性。如本文所使用的，防治昆虫可指抑制昆虫的生物学活性，产生一种或多种下列属性：昆虫进食减少、昆虫活力减少、昆虫死亡、昆虫的分化和发育抑制、昆虫有性生殖能力的缺失或降低。
本文所述的化合物和/或组合物可用于保持生物体健康并可治疗性、预防性或系统性地用于防治昆虫或避免昆虫生长或发育或感染或侵扰。因此，本发明可允许先前易感的生物体发展出抵抗昆虫生物体侵扰的抗性。
术语“与……的至少部分互补”是指与在遍及超过10个核苷酸上，例如在遍及至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多个邻接核苷酸上的靶标的核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。尽管有上述，但“与……的至少部分互补”还可包括在遍及超过20个核苷酸的长度上，例如在遍及至少20、21、22、23、24或更多个邻接核苷酸长度上，与靶标序列的核苷酸序列的互补大于80％的互补序列[13,14]。
在某些方面，本发明提供下调昆虫中靶基因表达的方法，所述方法包括使昆虫与dsRNA接触，其中dsRNA包括退火的互补链，互补链之一具有与要下调的昆虫靶基因的核苷酸序列至少部分互补的核苷酸序列，从而使dsRNA吸收至昆虫内，进而下调昆虫靶基因的表达。
术语“昆虫”包括所有类型和处于包括卵、幼虫或稚虫、蛹和成虫阶段的所有发育阶段的昆虫。
如本文所使用的，术语“植物”包括期望治疗以预防或降低昆虫生长和/或昆虫侵扰的任何植物材料。其包括尤其是全植物、秧苗、繁殖或生殖材料如种子、插条、接枝、外植体等，以及植物细胞和组织培养物。植物材料应表达RNA分子或具有表达RNA分子的能力，所述RNA分子包括为害虫生物体的至少一种靶基因的正义链的至少部分核苷酸序列的RNA互补体、或表示害虫生物体的至少一种靶基因的正义链的至少部分核苷酸序列的RNA等同物(equivalent)的至少一种核苷酸序列，以使RNA分子在植物-害虫相互作用时被害虫吸收，所述RNA分子能够通过RNA干扰抑制靶基因或下调靶基因的表达。
术语“基因表达下调”和“基因表达抑制”可互相替换使用，并且是指在来自靶基因的蛋白质产物和/或mRNA产物水平上，基因表达的可测量或可观察的减少，或可检测的基因表达的完全消除。dsRNA对基因表达的下调效果可计算为与正常基因表达相比时的至少30％、40％、50％、60％，优选70％、80％，或甚至更优选90％或95％。根据靶基因的性质，昆虫细胞中基因表达的下调或抑制可通过细胞或整个昆虫的表型分析，或者通过使用分子技术如RNA液相杂交(solution hybridization)、PCR、核酸酶保护、RNA杂交(Northernhybridization)、反转录、利用微阵列的基因表达监控、抗体结合、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(Western blotting)、放射免疫测定(RIA)、其他免疫测定或荧光激活细胞分析(FACS)测量mRNA或蛋白质表达来证实。
必需基因的下调导致生长抑制。取决于所使用的试验，与已用对照dsRNA处理的害虫生物体相比，生长抑制可定量为大于约5％、10％，更优选约20％、25％、33％、50％、60％、75％、80％，最优选约90％、95％，或约99％。
“靶基因”可为期望受到抑制的必需的任何基因，因为其干扰昆虫的生长或病原性或感染性。例如，如果本发明的方法被用于防止昆虫生长和/或侵扰，则优选筛选对昆虫活力、生长、发育或生殖必需的靶基因，或者参与昆虫病原性或感染性的任何基因，以致靶基因的特异性抑制导致致死表型或降低或停止昆虫侵扰。
根据一个非限制性实施方案，靶基因为当使用本发明的方法其表达下调或受抑制时昆虫死亡或者昆虫的生殖或生长停止或迟缓的此类靶基因。这种靶基因被认为是对昆虫活力所必需的，并称为必需基因。因此，本发明包括如此处所述的方法，其中所述靶基因为必需基因。
不受理论束缚，靶基因为当其下调时使得昆虫的侵扰或感染、昆虫引起的损害、和/或昆虫侵扰或感染宿主生物体和/或引起此类损害的能力降低的此类靶基因。术语“侵扰”(动词，infest)和“感染”(动词，infect)或者“侵扰”(名词，infestion)和“感染”(名词，infection)通常全文可相互替换使用。这种靶基因被认为参与昆虫的病原性或感染性。因此，本发明延伸至此处所述的方法，其中所述靶基因参与昆虫的病原性或感染性。选择后一种类型的靶基因的优势在于，阻断昆虫进一步感染植物或植物部分，并且抑制形成下一代。
在防治特定昆虫在宿主细胞或宿主生物体内或上生长或侵扰的dsRNA-介导的方法中，优选dsRNA不与任何宿主基因分享，或至少不与宿主的任何必需基因分享任何显著同源性。由此而言，优选dsRNA显示小于30％、更优选小于20％、更优选小于10％和甚至更优选小于5％的与宿主细胞的任何基因的核酸序列同一性。百分序列同一性应以贯穿dsRNA区的全长计算。如果宿主生物体的基因组序列数据是可获得的，则可使用标准生物信息学工具再确认与dsRNA的序列同一性。在一个实施方案中，在dsRNA和宿主序列之间的在遍及21个邻接核苷酸上没有序列同一性，意味着由此而言，优选dsRNA的21个邻接碱基对未出现在宿主生物体的编码序列(CDS)中。在另一实施方案中，在遍及dsRNA的24个邻接核苷酸上与来自宿主物种的任何核苷酸序列的序列同一性小于约10％或小于约12.5％。
dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与要下调的靶基因的靶核苷酸序列相对应的核苷酸序列。dsRNA的另一链能够与第一链碱基配对。
靶昆虫基因的“靶区”或“靶核苷酸序列”的表述可为基因的任何适合的区域或核苷酸序列。靶区应包括靶基因的至少17、至少18或至少19个连续核苷酸(consecutive nucleotide)，更优选靶基因的至少20或至少21个核苷酸，仍更优选靶基因的至少22、23或24个核苷酸。
优选(至少部分)dsRNA将与昆虫靶基因的靶区分享100％的序列同一性。然而，将理解，在遍及双链区全长上的100％序列同一性对于功能性RNA抑制不是必需的。相对于靶序列具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被发现对RNA抑制是有效的。
术语“对应于”或“与……互补”在此可相互替换使用，并且当这些术语用于指dsRNA与靶基因的靶区之间的序列对应性(sequence correspondence)时，它们可以相应地解读为，即不绝对要求100％的序列同一性。然而，dsRNA与靶区之间的百分序列同一性通常为至少80％或85％同一，优选至少90％、95％、96％，或更优选至少97％、98％，并仍更优选至少99％。当两条核酸链的至少85％的碱基配对时，这两条核酸链“实质上互补”。
本文所使用的术语“互补”涉及DNA-DNA互补、RNA-RNA互补和DNA-RNA互补的全部。在同此类推中，术语“RNA等同物”实质上是指在DNA序列中，碱基“T”可由核糖核酸中通常存在的相应碱基“U”所代替。
尽管dsRNA包含对应于靶基因的靶区的序列，但对应于靶区序列的整个dsRNA并不是必要的。例如，dsRNA可包含位于特异性靶序列侧翼的短的非靶区，条件是此类序列在RNA抑制中不对dsRNA的性能影响到实质性的程度(material extent)。
dsRNA可包含一种或多种置换碱基以便优化在RNAi中的性能。如何依次改变dsRNA的各碱基并(例如在适合的体外试验体系中)测试所得dsRNA的活性从而优化所得dsRNA的性能，对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
dsRNA可进一步包含DNA碱基、非天然碱基或糖-磷酸骨架的非天然骨架连接或修饰，从而例如增强保存期间的稳定性或增强被核酸酶降解的抗性。
约21bp的干扰RNA(siRNA)对于有效基因沉默是有用的。优选将dsRNA的长度增加到至少约80-100bp可提高dsRNA被害虫生物体吸收的效率。此类较长的片段可在基因沉默中更加有效，可能是由于这些长dsRNA被无脊椎动物更有效地吸收。
由具有29bp茎区(stem)和2-nt 3’突出端的27-mer平端的或短发夹(sh)RNA的RNA双链体(duplex)也可用作siRNA。因此，基于上述鉴定的靶标且为具有29bp茎区和2-nt 3’突出端的27-mer平端或短发夹(sh)RNA的靶标的分子也包括在本发明的范围内。
因此，在一个实施方案中，dsRNA片段(或区域)本身的长度将优选为至少17bp，优选18或19bp，更优选至少20bp，更优选至少21bp、或至少22b、或至少23bp、或至少24bp、25bp、26bp或至少27bp。“双链RNA片段”或“双链RNA区”的表述是指对应于靶基因(的部分)的dsRNA的小实体(entity)。
更普遍地，双链RNA优选在约17-1500bp之间、甚至更优选在约80-1000bp之间，并最优选在约17-27bp之间或在约80-250bp之间；例如约17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、27bp、50bp、80bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、450bp、500bp、550bp、600bp、650bp、700bp、900bp、100bp、1100bp、1200bp、1300bp、1400bp或1500bp的双链RNA区。
dsRNA长度的上限可取决于i)dsRNA被昆虫吸收的要求和ii)dsRNA在细胞中被加工成指导RNAi的片段的要求。所选长度还可受到RNA合成方法和RNA运送至细胞的模式的影响。优选在本发明的方法中要使用的dsRNA的长度将为小于10,000bp，更优选1000bp以下、更优选500bp以下、更优选300bp以下、更优选100bp以下。对于任何给定的靶基因和昆虫，为了有效抑制的dsRNA的最佳长度可通过实验确定。
dsRNA可完全或部分双链化。部分dsRNA可在双链部分的一端或两端包含短单链突出端，条件是RNA仍能够被昆虫吸收并指导RNAi。dsRNA还可包含内部非互补区。
本发明的方法包括向同一昆虫同时或连续供给两种或更多种不同的dsRNA或RNA构建体，以便实现多种靶基因的下调或抑制，或者实现单个靶基因更强有力的抑制。
可选地，通过提供命中多种靶序列的一种dsRNA来命中多种靶标，通过存在对应于靶基因的双链RNA片段的超过一个拷贝来更有效地抑制单个靶标。因此，在某些方面，dsRNA构建体包括多个dsRNA区，每一个dsRNA区的至少一条链包括与昆虫靶基因的靶核苷酸序列的至少部分互补的核苷酸序列。RNA构建体中的dsRNA区可与相同或不同的靶基因互补和/或dsRNA区可与来自相同或不同昆虫物种的靶标互补。
术语“命中(hit、hits和hitting)”是表示至少一条dsRNA链与靶基因或核苷酸序列互补并且其本身可结合至靶基因或核苷酸序列的可选词汇。
在一个实施方案中，双链RNA区包括与靶基因互补的核苷酸序列的多个拷贝。可选地，dsRNA命中相同靶基因的超过一个靶序列。本发明因而包括包含与昆虫靶标的核苷酸序列的至少部分互补的所述核苷酸序列的至少两个拷贝的分离的双链RNA构建体。
如本文所述的术语“多个(种)”是指至少两个(种)、至少三个(种)、至少四个(种)、至少五个(种)、至少六个(种)等。
“其它靶基因”或“至少一种其它靶基因”的表述是指例如第二种、第三种或第四种等靶基因。
开发命中超过一种上述靶标的dsRNA或者针对不同的上述靶标的不同dsRNA的组合并用于本发明的方法。
双链RNA中的dsRNA区(或片段)可如下组合：a)当靶向单个靶基因的多个dsRNA区组合时，它们可以在RNA构建体中以原始顺序组合(即，其中所述区域出现在靶基因中的顺序)；b)可选地，片段的原始顺序可忽略，以便它们以任何顺序随机或有意地打乱(scrambled)和组合入双链RNA构建体中；c)可选地，在dsRNA构建体中一个单独片段可重复多次，例如1-10次，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次，或d)dsRNA区(靶向单个或不同靶基因)可以以正义或反义方向组合。
靶向单个或不同弱基因(weak gene)的多个dsRNA区可组合来获得更强的RNAi效果。“昆虫特异性”基因或序列，例如瘿蜂特异性的、特别是Li或Om特异性基因和序列，包括当可通过生物信息学同源性检索，例如通过BLAST检索来确定时，在非昆虫生物体中不具有实质上同源的对应物(counterpart)的基因。特异性靶基因的选择产生种特异性RNAi效果，而对非靶标生物体(non-target organism)没有效果或没有实质(不利)效果。“保守基因”包括在靶标生物体和非靶标生物体之间保守(在氨基酸水平上)的基因。为了减少对非靶标物种可能的作用，分析此类有效但保守的基因，并选择来自这些保守基因的可变区的序列被RNA构建体中的dsRNA区靶向。在核酸序列水平上评价保守性。此类可变区因而至少包括保守靶基因的在核酸序列水平上的保守部分。根据本发明的RNA构建体从不同的生物学途径靶向多基因，导致广泛的细胞RNAi效果和更加有效的昆虫防治。在某些实施方案中，dsRNA由序列，例如与蜜蜂直向同源物，例如但不限于SEQ ID NO:39-44和SEQ IDNO:134-136中所列的本文所公开的Li和Om序列的蜜蜂直向同源物的序列的同一性为80％以下的Li和Om转录组的序列构建。在其它实施方案中，dsRNA由下述序列构建：例如与西方玉米根虫玉米根莹叶甲直向同源物，例如但不限于Li和Om序列的西方玉米根虫玉米根莹叶甲直向同源物的序列的同一性为等于或小于80％的Li和Om ESCRT家族蛋白序列。
在某些方面，dsRNA构建体构建有影响不同类型细胞功能的基因序列。此类细胞功能类型的实例包括，但不限于，(i)蛋白质合成和代谢，(ii)RNA合成和代谢，和(iii)细胞进程，包括但不限于多泡体生物形成和内涵体货物分选。在某些实施方案中，dsRNA构建体包括来自前述各权利要求即三种类型的序列。在某些实施方案中，dsRNA构建体包括来自前述类型中的两种类型，如蛋白质合成和代谢以及RNA合成和代谢；蛋白质合成和细胞进程；或RNA合成和代谢以及细胞进程的序列。
dsRNA区包括与本文所记载的任一种靶基因的核苷酸序列的至少部分或一部分互补的至少一条链。然而，假如双链RNA区之一包括与本文所记载的任一种靶基因的核苷酸序列的一部分互补的至少一条链，则其它双链RNA区可包括与任何其它昆虫靶基因(包括已知的靶基因)的一部分互补的至少一条链。
在某些构建体中，dsRNA可包括附加序列和任选的连接子。附加序列可包括，例如(i)促进dsRNA构建体大规模生产的序列；(ii)影响dsRNA稳定性的提高或降低的序列；(iii)允许蛋白质或其他分子结合以促进RNA构建体被昆虫吸收的序列；(iv)为结合昆虫表面上或胞质中的受体或分子以促进被昆虫吸收、胞吞和/或胞转的适配体(aptamer)的序列；或(v)催化dsRNA区加工的附加序列。在一个实施方案中，连接子为附有条件地自剪切RNA序列，优选pH敏感性连接子或疏水敏感性连接子。
dsRNA构建体的多个dsRNA区可直接连接或者通过一个或多个连接子连接。连接子可存在于RNA构建体中的位点，将dsRNA区与另一个感兴趣区分隔。dsRNA构建体的多个dsRNA区可在没有连接子的情况下连接。
当连接子存在时，其可用于断开害虫生物体中的较小的dsRNA区。有利地，在该情况下，连接子序列可在特定情况下促使长dsRNA分成较小的dsRNA区，导致在这些情况下分离的dsRNA区的释放，并由这些较小的dsRNA区产生更有效的基因沉默。适合的附有条件的自剪切连接子的实例为在高pH条件下自剪切的RNA序列。此类RNA序列的适合的实例由Borda等人记载(Nucleic Acids Res.2003年5月15日；31(10):2595-600)，将该文献引入于此以作参考。该序列源自锤头状核酶HH16的催化中心。
连接子还可定位于dsRNA构建体的位点，将dsRNA区与另一例如感兴趣的附加序列分隔，所述感兴趣的附加序列优选为RNA构建体提供某些附加功能。
dsRNA构建体可包括适配体以促进dsRNA被昆虫吸收。将适配体设计为与被昆虫吸收的物质结合。此类物质可来自昆虫或植物来源。适配体的一个具体实例为结合跨膜蛋白、例如昆虫的跨膜蛋白的适配体。可选地，适配体可结合被昆虫吸收的(植物)代谢物或营养素。
连接子可在内涵体中进行自剪切。当本发明的构建体经胞吞或胞转被昆虫吸收，并且因而在昆虫物种的内涵体中被区室化时这可以是有利的。内涵体可具有低pH环境，导致连接子的剪切。
当疏水条件下自剪切的连接子用于经细胞壁运输从一个细胞转移至另一个细胞时，例如当穿过有害昆虫生物体的细胞壁时，其在dsRNA构建体中特别有用。
内含子可用作连接子。本文所使用的“内含子”可为信使RNA的任何非编码RNA序列。
还可将范围在约1碱基对至约10,000碱基对的非互补性RNA序列用作连接子。
不希望受任何特定理论或机理的束缚，认为长dsRNA被昆虫从它们的附近环境中吸收。dsRNA被吸收进入肠并转移至肠上皮细胞，然后在细胞中通过内源核酸内切酶的作用加工成短dsRNA，称为小干扰RNA(siRNA)。所得siRNA然后通过形成称为RISC或RNA干扰沉默复合体的多组分RNase复合体来介导RNAi。
为了实现昆虫细胞内靶基因的下调，添加至细胞壁外部的dsRNA可为可吸收进入细胞，接着在细胞内加工成siRNA，进而介导RNAi的任何dsRNA或dsRNA构建体，或者添加至细胞外部本身可为可吸收进入细胞且从而指导RNAi的siRNA的RNA。
siRNA通常为长度在19-25个碱基对或20-24个碱基对范围内的短的dsRNA。在优选实施方案中，可使用对应于要下调的靶基因，具有19、20、21、22、23、24或25个碱基对、特别是21或22个碱基对的siRNA。然而，本发明不意欲限制此类siRNA的用途。
siRNA可包括在双链部分的侧翼的一端或两端的单链突出端。siRNA可包含3’突出核苷酸，优选两个3’突出胸苷(dTdT)或尿苷(UU)。如果包括在dsRNA双链部分中的序列的紧接上游靶基因序列为AA，则3’TT或UU突出端可包括在siRNA中。这使得siRNA中的TT或UU突出端与靶基因杂交。尽管3’TT或UU突出端还可位于siRNA的另一端，但是包括在siRNA双链部分中序列的靶序列的下游序列不必具有AA。由此而言，为RNA/DNA嵌合体的siRNA也是预期的。这些嵌合体包括下述siRNA，例如如上所述包括具有DNA碱基3’突出端(如，dTdT)的dsRNA，以及为其中一个或多个RNA碱基或核糖核苷酸、甚至整个链上的所有核糖核苷酸被DNA碱基或脱氧核糖核苷酸代替的多聚核苷酸的dsRNA。
dsRNA可由两个单独的(正义和反义)RNA链通过(非共价)碱基配对退火在一起而形成。可选地，dsRNA可具有折回茎-环或发夹结构，其中dsRNA的两个退火链共价连接。在该实施方案中，dsRNA的正义和反义链由部分自补的单个多核苷酸分子的不同区域形成。如果dsRNA通过在体内例如在宿主细胞或生物体中表达，或者通过体外转录来合成，则具有该结构的RNA是便利的。连接两个RNA链的“环”的确切性质和序列，除了不应损害分子的双链部分介导RNAi的能力以外，对本发明通常是不重要的。用于RNAi的“发夹”或“茎-环”RNA的特征通常是本领域已知的(例如参见WO 99/53050，将其内容引入于此以作参考)。在本发明的其他实施方案中，环结构可包括如上所述的连接子序列或附加序列。
在某些方面，本文公开的Li和Om序列及此类序列的互补体还可通过使用本领域内已知的方法表达反义RNA或过表达正义RNA来用于抑制Li或Om核酸的表达。所述已知方法，参见例如Frizzi等人，Plant Biotech J,(2010)8:655-677；Brodersen等人,Trends in Genetics,(2008)22:268-280；和美国专利5,759,829号。使用本文所述的表达元件、载体和方法，针对Li和Om靶基因的反义RNA或正义RNA在桉树植物中表达。在被Om或Li害虫摄食后，反义或正义RNA抑制靶基因的表达，从而防治害虫侵扰。
用于设计dsRNA构建体的靶核苷酸序列的长度优选至少17个，优选至少18、19、20或21个，更优选至少22、23或24个核苷酸。优选的靶核苷酸序列的非限制性实例示于实施例中。
靶序列可包括与本文所述序列同源的序列。靶基因的同源物可使用本领域普通技术人员公知的方法来发现。优选的同源物为包括与本文所公开的序列的同一性为至少约85％或87.5％、仍更优选至少约90％、仍更优选至少约95％和最优选至少约99％或99.9％的序列、或其互补体的基因。用于确定序列同一性的方法在本领域是常规的，并包括使用Blast软件和EMBOSS软件(TheEuropean Molecular Biology Open Software Suite(2000),Rice,P.Longden,I.和Bleasby,A.Trends in Genetics 16,(6)pp 276-277)。本文所使用的术语“同一性”是指核苷酸水平上序列之间的关系。“％同一性”的表述通过在比较窗口上比较例如两个或更多个最佳比对序列来确定，其中比较窗口中的序列部分可包括与序列最佳比对用参考序列相比的插入或缺失。参考序列不包括插入或缺失。参考窗口选自至少10个邻接核苷酸至约50、约100或至约150个核苷酸之间，优选选自约50和150个核苷酸之间。然后通过确定窗口中序列之间相同的核苷酸数，将相同的核苷酸数除以窗口中的核苷酸数，再乘以100来计算“百分率同一性”。
术语“选择性杂交”包括涉及在严格杂交条件下的核酸序列与特定核酸靶序列的杂交使得可检测程度大于其与非靶核苷酸序列的杂交(例如相对于背景至少2倍)，并实质上排除非靶核酸。选择性杂交序列典型地彼此具有约至少40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性，和最优选100％的序列同一性(即，互补)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括涉及在该条件下探针将与其靶序列杂交使得可检测程度大于其他序列(例如，相对于背景至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖的并且不同环境中不同。通过控制杂交的严格性和/或洗涤条件，可识别可与探针达100％互补的靶序列(同源探测)。可选地，可调整严格条件来允许序列中的某些错配从而检测较低程度的相似性(异源探测)。最佳地，探针长度为约500个核苷酸，但长度可从小于500个核苷酸至等于靶序列全长大幅变化。
典型地，严格条件将是其中在pH 7.0至8.3和温度为至少约30℃(短探针，例如10至50个核苷酸)和至少约60℃(长探针，例如大于50个核苷酸)下盐浓度为小于约1.5M Na离子，典型地约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)的那些。严格条件还可添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’s来实现。示例性低严格条件包括用在37℃下的30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交并在50至55℃下的1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性温和严格条件包括在37℃下的40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交并在55至60℃下的0.5X至1X SSC中洗涤。示例性高严格条件包括在37℃下的50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交并在60至65℃的0.1X SSC中洗涤。
特异性典型地起到后杂交洗涤的作用，关键因素为最终洗涤液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交，Tm可由Meinkoth和Wahl,(1984)Anal.Biochem.,138:267-84等式估算：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％GC为鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form为甲酰胺在杂交液中的百分比，和L为碱基对中杂交体的长度。Tm为(在确定的离子强度和pH下)其中50％的互补靶序列与优选匹配的探针杂交的温度。Tm相对于每1％的错配降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件来与期望同一性的序列杂交。例如，如果搜寻到>90％同一性的序列，Tm可降低10℃。通常，严格条件选择在确定的离子强度和pH下比特异序列及其互补体的热熔点(Tm)低约5℃。然而，非常严格条件可在比热熔点(Tm)低1、2、3或4℃下利用杂交和/或洗涤；温和严格条件可在比热熔点(Tm)低6、7、8、9或10℃下利用杂交和/或洗涤；低严格条件可在比热熔点(Tm)低11、12、13、14、15或20℃下利用杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤组成以及期望的Tm，普通技术人员将理解杂交和/或洗涤液的严格性的变化是固有描述。如果期望的错配程度产生低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，则优选增加SSC浓度以便可使用更高的温度。
对核酸杂交的全面指导见Tijssen,Laboratory Techniques in Bihemistryand Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays”，Elsevier,N.Y.(1993)；和Current Protols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人，eds,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1995)。除非另有说明，在本申请中，高严格性定义为在65℃下的4X SSC、5X Denhardt’s(500ml水中5g聚蔗糖、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸的鲑鱼精子DNA和25mM磷酸盐钠中杂交和在65℃下的0.1XSSC、0.1％SDS中洗涤。
dsRNA可通过宿主细胞或宿主生物体(例如在其中转录)来表达。宿主细胞或生物体可以是或可以不是对昆虫侵扰敏感或易受其侵害的宿主细胞或生物体。如果宿主细胞或生物体为对昆虫侵扰敏感或易受其侵害的宿主细胞或生物体，作为控制昆虫在宿主生物体内或上生长和/或防止或减少宿主生物体的昆虫侵扰的机理，可使用RNAi介导的一种或多种靶基因在昆虫中的基因沉默。因此，dsRNA在宿主生物体的细胞内的表达可因此赋予对特定昆虫或对一类昆虫的抗性。假如dsRNA命中超过一个昆虫靶基因，dsRNA在宿主生物体的细胞中的表达可赋予对超过一个昆虫或超过一类昆虫的抗性。
在优选的实施方案中，宿主生物体为植物，昆虫为植物病原昆虫。在该实施方案中，通过在受植物昆虫侵扰或对昆虫侵扰敏感或被植物昆虫摄食的植物、植物组织或植物细胞中表达dsRNA而使昆虫与dsRNA相接触。优选的植物宿主生物体为桉树。桉树的实例包括，但不限于以下物种：葡萄桉(E.botryoides)、苹果桉(E.bridgesiana)、赤桉(E.camaldulensis)、灰桉(E.cinerea)、蓝桉(E.globule)、巨桉(E.grandis)、西达桉(E.gunii)、尼克尔桉(E.nicholii)、圆叶桉(E.pulverulenta)、大叶桉(E.robusta)、野桉(E.rudis)、柳叶桉(E.saligna)、细叶桉(E.Tereticornis)、尾叶桉(E.Urophilla)、多枝桉(E.viminalis)和前述物种的任一种特别是巨桉和尾叶桉的杂交种。优选的植物病原昆虫为瘿蜂，例如Li或Om。
术语“植物”包括期望处理以防止或减少昆虫生长和/或昆虫侵扰的任何植物材料。其包括尤其是全植物、秧苗、繁殖或生殖材料如种子、插条、接枝、外植体等，以及植物细胞和组织培养物。植物材料应当表达对应于昆虫的一种或多种靶基因的dsRNA或具备表达对应于昆虫的一种或多种靶基因的dsRNA的能力。
在某些方面，本发明提供表达或能够表达至少一种dsRNA的植物，优选转基因植物、或(转基因)植物用繁殖或生殖材料、或植物细胞培养物，其中dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与昆虫的靶基因的至少部分靶核苷酸序列互补的核苷酸序列，以便使dsRNA在植物-昆虫相互作用时被昆虫吸收，所述双链RNA能够通过RNA干扰抑制靶基因或下调靶基因的表达。靶基因可为本文所述靶基因的任一种，例如昆虫活力、生长、发育或生殖所必须的靶基因。
植物可以以在一种或多种细胞、细胞类型或组织中活跃表达(转录)dsRNA的形式提供。可选地，植物可为“能够表达”的，意指其利用编码期望的dsRNA的转基因转化，但当提供该植物时(并且以其中提供植物的形式)转基因在该植物中不活跃。包括编码dsRNA或dsRNA构建体的核苷酸序列的重组DNA构建体可因而可操作地连接至至少一个调控序列。优选地，调控序列选自包括如下所述的组成型启动子或组织特异性启动子的组。
靶基因可为本文所述的任一种靶基因。优选地，调控元件为在植物细胞中活跃的调控元件。更优选地，调控元件源自植物。术语“调控序列”将在广义上理解，并指能够影响可操作地连接的序列表达的调控核酸。
前述术语包括启动子和激活或增强核酸的转录的所谓的激活子或增强子的核酸或合成融合分子或其衍生物。本文所使用的术语“可操作地连接”是指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，以使启动子序列能够起始目的基因的转录。
举例来说，编码dsRNA的转基因核苷酸序列可位于诱导型或者生长或发育阶段-特异性启动子控制下，通过添加诱导型启动子的诱导物或当达到生长或发育特定阶段时所述启动子允许dsRNA转录的开启。
可选地，编码dsRNA的转基因位于强组成型启动子如选自包括CaMV35S启动子、CaMV35S双启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、核酮糖二磷酸羧化酶(rubisco)启动子、GOS2启动子、玄参花叶病毒(Figwortmosaic virus,FMV)34S启动子、木薯叶脉(cassaya vein)花叶病毒(CsVMV)启动子的组的任一种的调控下(Verdaguer B.等人，Plant Mol.Biol.199837(6):1055-67)。
可选地，编码dsRNA的转基因位于组织特异性启动子如选自包括编码PsMTA类型III几丁质酶基因的根特异性启动子，光合组织特异性启动子如cab1和cab2、rbcS、gapA、gapB和ST-LS1蛋白的启动子，JAS启动子，查耳酮合成酶启动子和来自草莓的RJ39的启动子的组的任一种的调控下。
编码dsRNA的转基因还可位于昆虫诱导型启动子，例如马铃薯蛋白酶抑制剂II(PinII)启动子(Duan X等人,Nat.Biotechnol.1996,14(4):494-8))；或伤害诱导型启动子，例如茉莉酸(jasmonate)和乙烯诱导型启动子、PDF1.2启动子(Manners J M等人，Plant Mol.Biol.1998,38(6):1071-80)的调控下；或者防御相关的启动子，例如水杨酸诱导型启动子和植物病原相关蛋白(PR蛋白)启动子(PR1启动子(Cornelissen B J等人，Nucleic Acids Res.1987,15(17):6799-811；COMT启动子(Toquin V等人，Plant Mol.Biol.2003,52(3):495-509)下。
当使用本文所述的方法用于开发抗昆虫的转基因植物时，将编码dsRNA的核酸位于组织特异性启动子控制下可以是有益的。为了改善dsRNA从植物细胞向昆虫的转移，植物可优选在首先被植物害虫接近或破坏的植物部分表达。在植物病原性昆虫的情况下，优选的表达dsRNA的组织为叶、茎、根和种子。因此，在本文所公开的方法中，可使用植物组织-优选的启动子，例如叶特异性启动子、茎特异性启动子、韧皮部特异性启动子、木质部特异性启动子、根特异性启动子或种子特异性启动子(蔗糖转运蛋白基因(sucrosetransporter gene)AtSUC启动子(Baud S等人，Plant J.2005,43(6):824-36)、小麦高分子量麦谷蛋白基因启动子(Robert L S等人，Plant Cell.1989,1(6):569-78.))。
根特异性启动子的适合的实例为PsMTA(Fordam-Skelton,A.P.等人，1997Plant Molecular Biology 34:659-668.)和类型III几丁质酶启动子。同样被光活化的叶和茎特异性或光合组织特异性启动子的实例为来自甜菜的两种叶绿素结合蛋白(cab1和cab2)的启动子(Stahl D.J.,等人，2004BMCBiotechnology 20044:31)、由rbcS编码的核酮糖-二磷酸羧化酶(Rubisco)(Nomura M.等人，2000Plant Mol.Biol.44:99-106)、叶绿体甘油醛-3-磷酸脱氢酶A(gapA)和B(gapB)亚单位(Conley T.R.等人.1994Mol.Cell.Biol.19:2525-33；Kwon H.B.等人.1994Plant Physiol.105:357-67)、编码叶和茎特异性蛋白的马铃薯(Solanum tuberosum)基因的启动子(Zaidi M.A.等人，2005Transgenic Res.14:289-98)、茎调控的防御诱导性基因，如JAS启动子(专利公布号20050034192/US-A1)。花特异性启动子的实例为例如，查耳酮合成酶启动子(Faktor O.等人.1996Plant Mol.Biol.32:849)，果实特异性启动子的实例为例如来自草莓的RJ39(WO 9831812)。
使用用于表达dsRNA的其他启动子，其包括但不限于来自RNA Poll、RNA Poll、RNA PolIII、T7RNA 聚合酶或SP6RNA聚合酶的启动子。这些启动子典型地用于体外生产dsRNA，之后将dsRNA诱导入抗杀虫剂，例如诱导入抗杀虫液、喷雾剂或粉剂中。
本文所描述的dsRNA或RNA构建体可通过以下步骤产生：(i)使分离的核酸或重组DNA构建体与无细胞组分接触；或(ii)在允许核酸或重组DNA构建体转录的条件下将分离的核酸或重组DNA构建体导入(例如，通过转化、转染或注射)细胞中，从而产生dsRNA或RNA构建体。
任选地，还可将一种或多种转录终止序列引入重组构建体中。术语“转录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，其传导初级转录本的3’加工和多聚腺苷酰化以及转录终止的信号。可将额外的调控元件，例如转录或翻译增强子引入表达构建体中。
重组构建体可进一步包括特定的细胞类型中保持和/或复制所需的复制起点。一个实例为当需要表达构建体作为细胞中的附加型遗传元件(例如，质粒或柯斯质粒分子)保持于细菌细胞中时，优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1ori。
重组构建体可任选地包括选择标记基因。如本文所述，术语“选择标记基因”包括任一种基因，其在细胞上赋予表型，其中该基因的表达促进转染或转化有本发明的表达构建体的细胞的识别和/或选择。适合的选择标记的实例包括抗氨苄青霉素(Ampr)、四环素(Tcr)、卡那霉素(Kanr)、膦丝菌素(phosphinothricin)和氯霉素(CAT)基因的抗性基因。其它适合的标记基因提供代谢特性，例如manA。还可使用可视化标记基因，并且包括例如β-葡糖醛酸酶(GUS)、荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。
已稳定转化有编码dsRNA的转基因的植物可提供为不活跃表达dsRNA但具有活跃表达dsRNA的能力的种子、生殖材料、繁殖材料或细胞培养材料。植物可以以其中在一种或多种细胞、细胞类型或组织中活跃表达(转录)RNA分子的形式提供。可选地，植物可为“能够表达”的，意指利用编码期望的RNA分子的转基因转化，但当提供该植物时(并且以其中提供植物的形式)转基因在该植物中不活跃。许多载体可用于该目的，并且适合的载体的选择将主要取决于插入载体的核酸大小和要转化有载体的特定宿主细胞。
出于RNAi的目的在植物中表达外源dsRNA的通用技术是本领域已知的(参见Baulcombe D,2004,Nature.431(7006):356-63.RNA silencing in plants，将其内容引入于此以作参考)。更特别地，出于下调植物害虫如线虫或昆虫中的基因表达的目的而在植物中表达dsRNA的方法也是本领域已知的。类似的方法可以以类似的方式应用，从而在植物中表达dsRNA用于下调植物病原昆虫中靶基因的表达。为了实现该效果，对于植物来说，必须仅在要与昆虫接触的植物的部分表达(转录)dsRNA，由此dsRNA可被昆虫吸收。取决于昆虫的性质及其与宿主植物的关系，dsRNA的表达可发生在昆虫在其生命周期期间存在的植物细胞或组织内，或者RNA可分泌至细胞之间，例如在昆虫的生命周期期间被昆虫占据的质外体。此外，dsRNA可位于植物细胞如细胞溶胶中，或者位于植物细胞细胞器如叶绿体、线粒体、液泡或内质网中。
发育期间，瘿蜂幼虫由于摄食(例如摄食质外体)或细胞溶解而暴露于细胞外环境以及细胞内的内容物。因此，瘿蜂幼虫可暴露于存在于瘿瘤细胞中的dsRNA或由瘿瘤内部或周围的细胞分泌的dsRNA。
可选地，dsRNA可由植物细胞分泌，并由植物分泌至植物外部。由此，dsRNA可在植物表面上形成保护层。
在另一方面，本发明还提供用于预防或保护植物免受害虫侵扰的方法和组合物的组合。例如，一种手段提供使用植物转基因方法与使用dsRNA分子表达的方法和使用此类Bt杀虫蛋白表达的方法相结合。
在进一步的实施方案中，本发明涉及用于控制昆虫生长和/或防止或减少昆虫侵扰的组合物，其至少包括包含至少一种dsRNA的植物部分、植物细胞、植物组织或种子，其中所述dsRNA包括退火的互补链，其中之一具有与昆虫靶基因的至少部分核苷酸序列互补的核苷酸序列。任选地，组合物进一步包括至少一种适合的载体、赋形剂或稀释剂。靶基因可为本文所述的任何靶基因。优选地，昆虫靶基因对于昆虫的活力、生长、发育或生殖是必须的。
其中术语“一种”在“一种靶基因”的语境中使用，这是指“至少一种”靶基因。同样适用于，“一种”靶生物体是指“至少一种”靶生物体，和“一种”RNA分子或宿主细胞是指“至少一种”RNA分子或宿主细胞。
根据一个实施方案，本发明的方法依赖于存在于昆虫外部的dsRNA被昆虫吸收(如，进食)，并且不需要在昆虫细胞内表达dsRNA。此外，本发明还包括如上所述的其中昆虫与包括dsRNA的组合物接触的方法。瘿蜂幼虫典型地不在瘿瘤外部进食，因而优选经转基因植物材料将瘿蜂幼虫暴露于dsRNA。
本发明进一步提供用于下调靶生物体(其能够摄食植物、植物部分、植物细胞或种子)中至少一种靶基因表达的方法，所述方法包括向靶生物体喂养植物、植物部分、植物细胞或种子，所述植物、植物部分、植物细胞或种子表达dsRNA。
在更优选的方面，本发明提供用于下调靶生物体(其能够摄取宿主细胞或其提取物)中至少一种靶基因的方法，所述方法包括向靶生物体喂养宿主植物、植物部分、植物细胞或种子，所述宿主植物、植物部分、植物细胞或种子表达dsRNA，所述dsRNA包括与至少一种靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物互补或表示至少一种靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物的核苷酸序列，从而宿主植物、植物部分、植物细胞或种子被靶生物体的摄食引起和/或导致至少一种靶基因的表达下调。
本发明提供如本文所定义的植物、植物部分、植物细胞或种子用于下调昆虫靶基因表达的用途。在更详细的方面，本发明提供如本文所定义的宿主细胞和/或包括核苷酸序列的RNA分子用于下调靶基因表达的用途，所述核苷酸序列包括来自靶生物体的靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物的RNA互补体或表示来自靶生物体的靶基因的至少部分核苷酸序列的RNA等同物，所述包括核苷酸序列的RNA分子通过，例如在商品制造时，在植物、植物部分、植物细胞或种子中转录核酸分子来生产。
根据一个实施方案，本发明的方法依赖于遗传修饰生物体(GMO)法，其中dsRNA通过受昆虫侵扰或对昆虫侵扰敏感的细胞或生物体表达。优选地，所述细胞为植物细胞或所述生物体为植物。
对于siRNA介导的昆虫基因的下调，dsRNA直接或间接地引入和/或表达于昆虫细胞中。dsRNA可人工添加至昆虫食物或通过转基因食物来源如细菌和植物来生产[2,8]。包含昆虫基因特异性序列的反向重复RNA被转基因植物转录，可将其加工成dsRNA并稍后加工成siRNA(为沉默通路中的第一产物的小干扰RNA)。消化此类转基因植物的昆虫受植物合成的dsRNA和siRNA的影响[5]。该昆虫防治法可用于保护植物有效对抗特定的害虫[2,8]。然而，不需要在植物材料中将dsRNA加工成siRNA。dsRNA可被有害昆虫摄食并在昆虫细胞内首次加工成siRNA。
用于向植物引入外源基因的许多方法是已知的，并可用于将NT多核苷酸插入植物宿主中，包括生物学和物理植物转化法。例如，参见Miki等人，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants,”in Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology,Glick and Thompson,eds.,CRC Press,Inc.,Boca Raton,pp.67-88(1993)。所选方法根据宿主植物而变化，并包括化学转染法如磷酸钙、微生物介导的基因转移如农杆菌属菌(Agrobacterium)(Horsch等人，Science 227:1229-31(1985))、电穿孔、显微注射和生物射弹轰击(biolistic bombardment)。
用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知且可获得的。参见例如Gruber等人，“Vectors for PlantTransformation,”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,supra,pp.89-119。
分离的多核苷酸或多肽可通过一种或多种典型用于直接递送进入细胞的技术引入植物中。此类方法可取决于基因修饰所靶向的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型，即单子叶植物或双子叶植物而变化。适合的转化植物细胞的方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques 4:320-334；和U.S.Pat.No.6,300,543)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3:2717-2722)和弹道粒子加速(参见，例如Sanford,等人，美国专利号4,945,050；WO91/10725；和McCabe等人，(1988)Biotechnology 6:923-926)。还参见，Tomes等人，“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via MicroprojectileBombardment”.第197-213页，Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Fundamental Methods.eds.O.L.Gamborg&G.C.Phillips.Springer-VerlagBerlin Heidelberg N.Y.,1995；美国专利号5,736,369(分生组织)；Weissinger,等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford,等人，(1987)ParticulateScience and Technology 5:27-37(洋葱)；Christou,等人，(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；Datta,等人，(1990)Biotechnology 8:736-740(水稻)；Klein,等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305-4309(玉米)；Klein,等人，(1988)Biotechnology 6:559-563(玉米)；WO 91/10725(玉米)；Klein,等人，(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm,等人，(1990)Biotechnology8:833-839；和Gordon-Kamm,等人，(1990)Plant Cell 2:603-618(玉米)；Hooydaas-Van Slogteren&Hooykaas(1984)Nature(英国)311:763-764；Bytebierm,等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(Liliaceae)；De Wet,等人，(1985)In The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.G.P.Chapman,等人，pp.197-209.Longman,N.Y.(花粉)；Kaeppler,等人，(1990)Plant Cell Reports 9:415-418；和Kaeppler,等人，(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(晶须介导的转化)；美国专利号5,693,512(声处理)；D'Halluin,等人，(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔)；Li,等人，(1993)Plant Cell Reports12:250-255；和Christou and Ford,(1995)Annals of Botany 75:407-413(水稻)；Osjoda,等人，(1996)Nature Biotech.14:745-750；农杆菌属菌介导的玉米转化(美国专利号5,981,840)；碳化硅晶须法(Frame,等人，(1994)Plant J.6:941-948)；激光法(Guo,等人，(1995)Physiologia Plantarum 93:19-24)；声处理法(Bao,等人，(1997)Ultrasound in Medicine&Biology 23:953-959；Finer andFiner,(2000)Lett Appl Microbiol.30:406-10；Amoah,等人，(2001)J Exp Bot52:1135-42)；聚乙二醇法(Krens,等人，(1982)Nature 296:72-77)；单子叶和双子叶植物细胞的原生质可使用电穿孔(Fromm,等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824-5828)和显微注射(Crossway,等人，(1986)Mol.Gen.Genet.202:179-185)转化；将其所有引入于此以作参考。
用于将表达载体引入植物的最广泛利用的方法是基于农杆菌属菌的自然转化系统。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)为植物病原土壤细菌，其在遗传学上转化植物细胞。根癌农杆菌和毛根农杆菌的Ti和Ri质粒分别携带负责植物遗传转化的基因。参见，例如Kado,(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10:1。农杆菌属菌载体系统和农杆菌属菌介导的基因转移的方法的描述提供于Gruber,等人，上述；Miki,等人，上述；和Moloney,等人，(1989)Plant Cell Reports 8:238。
类似地，基因可插入分别来源于根癌农杆菌或毛根农杆菌的Ti或Ri质粒的T-DNA区。因此，表达盒可使用这些质粒如上构建。已知许多调控序列当其与异源编码序列结合并转化至宿主生物体中时相对于原始编码序列的组织/器官特异性在基因表达中显示保真性。参见例如Benfey和Chua,(1989)Science 244:174-81。特别适合的用于这些质粒的调控序列为在各种靶植物中的基因的组成型叶特异性表达的启动子。其它有用的调控序列包括来自胭脂碱合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2，可由美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得并指定为ATCC 67238。如果使用此类系统，则来自Ti或Ri质粒的毒性(vir)基因也必须与T-DNA部分或者经其中vir基因存在于单独载体的二元体系而存在。在其中使用的此类系统、载体和转化植物细胞的方法记载于美国专利4,658,082号；1986年10月1日提交的美国专利申请系列号913,914，参考1993年11月6日公布的美国专利5,262,306号；和Simpson,等，(1986)Plant Mol.Biol.6:403-15m，将其全部内容引入于此以作参考。
一旦构建，这些质粒可置于毛根农杆菌或根癌农杆菌中以及用于转化通常对镰刀菌属(Fusarium)或链格孢属(Alternaria)感染敏感的植物物种的细胞的这些载体中。根癌农杆菌或毛根农杆菌的选择将取决于由此转化的植物。通常根癌农杆菌是优选的转化用生物体。大多数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(如百合目(Liliales)和天南星目(Arales)的某些成员)对根癌农杆菌感染敏感。毛根农杆菌还具有广泛的宿主范围，包含大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。如今可转化单子叶植物已取得了一些成功。欧洲专利申请604 662 A1号公开了使用农杆菌属菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利申请672 752 A1号公开了使用未成熟胚胎的盾片(scutellum)利用农杆菌属菌转化单子叶植物的方法。Ishida等人讨论了通过将未成熟胚胎暴露于根癌农杆菌来转化玉米的方法(Nature Biotechnology 14:745-50(1996))。
一旦转化，这些细胞可用于再生转基因植物。例如，可通过造成植物创伤然后将载体引入伤口部位，用这些载体感染整个植物。植物的任何部分可造成创伤，包括叶、茎和根。可选地，外植体形式的植物组织，例如子叶组织或叶盘可接种这些载体，并在促进植物再生的条件下培养。通过用包含编码伏马菌素(fumonisin)降解酶基因的毛根农杆菌或根癌农杆菌接种植物组织而转化的根或嫩枝可用作植物组织来源，从而经体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马菌素-抗性转基因植物。此类用于再生植物组织的方法的实例公开于Shahin,(1985)Theor.Appl.Genet.69:235-40；美国专利号4,658,082；Simpson,等人，上述；和美国专利申请913,913和913,914号，二者均于1986年10月1日提交，参考1993年11月16日公布的美国专利5,262,306号，将其中全部公开内容引入于此以作参考。
作为农杆菌属菌-介导的转化的替代方法已开发了几种植物转化方法(统称为直接基因转移)。
植物转化的普遍适用的方法为微粒(microprojectile)-介导的转化，其中在尺寸为约1至4μm的微粒表面上携带DNA。利用将微粒加速至300至600m/s速度，足以穿透植物细胞壁和膜的生物射弹装置(biolistic device)将表达载体引入的植物组织(Sanford,等人，(1987)Part.Sci.Technol.5:27；Sanford,(1988)Trends Biotech 6:299；Sanford,(1990)Physiol.Plant 79:206；和Klein,等人，(1992)Biotechnology 10:268)。
物理递送DNA至植物的另一方法为如Zang等人描述的靶细胞的声处理((1991)BioTechnology 9:996)。可选地，脂质体或原生质体融合已用于将表达载体引入植物中。参见例如Deshayes等人，(1985)EMBO J.4:2731；和Christou,等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3962。也已报道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸将DNA直接吸收进入原生质体中。参见例如Hain等人，(1985)Mol.Gen.Genet.199:161；和Draper等人，(1982)Plant Cell Physiol.23:451。
还已记载了原生质体和整个细胞和组织的电穿孔。参见例如Donn等人，(1990)Abstracts of the VIIth Int'l.Congress on Plant Cell and Tissue CultureIAPTC,A2-38,p.53；D'Halluin等人，(1992)Plant Cell 4:1495-505；和Spencer等人，(1994)Plant Mol.Biol.24:51-61。
稳定转化后，进行植物繁殖。最常见的植物繁殖方法是通过种子。然而，通过种子繁殖的再生具有归因于杂合性而使得作物中缺少均匀性的缺陷，这是由于种子是由植物根据孟德尔法则所支配的遗传变化所产生的。基本上，每个种子在遗传学上是不同的，且每个将以其自身特有的特征生长。因此，优选转化植物以使得再生植物具有亲本转基因植物的相同特征和特性这样的方式产生。
转化植物可通过微体繁殖(micropropagation)来再生，所述微体繁殖提供转化植物的迅速、一致的生殖。微体繁殖为由所选择的亲本植物或培养植物中切离的单块组织长成新一代植物的方法。该方法允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物的规模化繁殖。所产生的新一代植物在遗传学上与原始植物同一，并具有原始植物所有的特性。微体繁殖使得优质植物材料在短时间内规模化生产，并使所选栽培植物快速增殖，保留原始转基因或转化植物的特性。克隆植物的优势为植物增殖速度和所产生植物的品质和一致性。
微体繁殖为多阶段步骤，需要在阶段之间改变培养基或生长条件。因此，微体繁殖方法涉及四个基本阶段：阶段一，初始组织培养；阶段二，组织培养增殖；阶段三，分化和植物形成；和阶段四，温室培养和强化(hardening)。在阶段一初始组织培养期间，建立组织培养并证实无污染物。在阶段二期间，繁殖初始组织培养物，直至产生足以满足生产目标数量的组织样品。在阶段三期间，将在阶段二中生长的组织样品分离并生长为单独的小植株。在阶段四中，将转化的小植株转移至温室来强化，其中植物对光的耐受性逐渐增加，从而可在自然环境中生长。
在某些方面，本发明提供抗植物病原害虫的植物的生产方法，所述方法为用重组DNA构建体或表达dsRNA的构建体的组合转化植物细胞；由转化的植物细胞再生植物；和在适于表达所述重组DNA构建体的条件下使转化植物细胞生长。
本发明的方法适用于瘿蜂物种，例如对由RNA干扰产生的基因沉默敏感且能够从其周围环境内在化dsRNA的桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小蜂(Om)。本发明适用于处于任何发育阶段的昆虫。由于昆虫具有非生命的外骨骼，它们不能以均一的速度生长，而是在通过周期性脱落其外骨骼的各阶段中生长。该过程称为蜕皮或换羽。蜕皮之间的阶段称为“龄”，且根据本发明可靶向这些阶段。另外，根据本发明还可靶向昆虫的卵或幼虫。根据本本发明可靶向包括有翅昆虫的变形在内的发育周期中的所有阶段。因此，个体阶段如幼虫、蛹、稚虫等发育阶段都可靶向。
Li和Om为桉树的害虫。因此，本文所述的核酸、dsRNA和方法对于处理或抑制Li和Om感染和侵染桉树是有用的。
在优选的方面，本发明提供RNAi介导的害虫防治以产生抗瘿蜂的转基因桉树。两种桉树瘿蜂入侵物种桉树枝瘿姬小蜂(Li)和桉干瘿姬小蜂(Om)目前已蔓延出澳大利亚分布至全世界的种植园中[6,9]。雌性可有性或孤雌生殖，且全部生命周期经历约130天。这些害虫在树的叶脉和叶表面下产下卵，诱导靶组织中瘿瘤形成来充当发育中的幼虫的宿主掩蔽所和食物储存。诱导瘿瘤形成的确切化合物或信号还未阐明。因此，化合物从卵和幼虫中而不是从母体中的分泌与瘿蜂形成相关。幼叶中的分生组织或全能细胞(omnipotentcell)受引发其增殖的化学、机械、病毒或DNA操作的诱导。瘿瘤发展与幼虫发育相对应，因此瘿瘤的大小和年龄可与幼虫发育阶段相关。Stone等人，2002,“The population biology of oak gall wasps(Hymenoptera:Cynipidae)”.Annu.Rev.Entomol.47:633-68。幼虫成熟诱导瘿瘤的进一步发展直至蛹期。当成年瘿蜂出现时，它们能够飞走并产下数百只卵，在它们死亡前的3-6天期间感染同一棵树以及附近和远处的树木。大量瘿蜂攻击引起生长停滞、叶子脱落和死亡，结果可能导致大量森林产量损失。固着发育的幼虫，在产生对活力基因有活性的RNAi的转基因植物上进食，受到持续且相对长期地吸收为沉默特定活力瘿蜂基因而定制设计的si/dsRNA分子的影响。最后沉默作用导致早期生长阶段中的幼虫死亡，由此保护宿主并使瘿蜂种群大小最小化，保护宿主植物免受损害。
瘿蜂在非转基因树中的幼虫阶段可长达130天，因此dsRNA的致死效果可在整个潜在的幼虫生长期累积。一旦幼虫死亡，瘿瘤的发展被遏止，并减少成虫数量，随后防止对该树木、邻近或远处的树木的感染。
转基因抗性树的特征在于对“瘿蜂发育规模”的如下结果中的一个或多个：
1.无瘿瘤发展。
2.与WT相比，发展小型瘿瘤(低幼虫质量测量的指标)[测量最大长度、直径、面积和/或体积]。
3.与WT相比的低幼虫质量测量：与WT相比，总幼虫重量降低。
4.与WT相比，更多的瘿瘤聚集死亡的幼虫。
5.与WT相比，更多的瘿瘤聚集死亡的蛹。
6.与WT相比，未从瘿瘤中出现成虫。
7.与WT相比，发育上受损的成虫，与在野生型树上生长的成虫相比缺乏繁殖或传播的能力。
实施例
实施例1
瘿蜂转录组测序
从来自以色列埃梅克(Emek)的感染的赤桉中收集瘿蜂感染的叶。通过在双目显微镜下用尖刀切割并打开瘿瘤来从在树叶和/或叶柄(petioles)中发现的瘿瘤中除去瘿蜂幼虫。使用来自各种幼虫发育阶段的幼虫混合物。将各批100只幼虫置于冰上的微管中。然后将管密封并立即冷冻于液氮中并保存在-80℃直至进一步处理。使用MasterPure RNA纯化试剂盒和操作手册(MRC85102-Epicentere Biotechnologies)分离总RNA。总RNA体积为50μl。然后用DNAse处理总RNA以除去任何剩余的残留DNA，接着分离多腺苷酸化(poly A)mRNA(MicroPoly(A)Purist,小规模mRNA纯化试剂盒,AM1919Ambion)。mRNA终体积为20μl。纯化的mRNA保存在-80℃直至进行454测序。根据标准操作手册进行454测序，从而提供靶害虫的转录组。组装序列，使用罗氏软件包基于与已知公开的膜翅目昆虫转录组的序列比对来注释、并使用Blast2Go程序(可于http://www.blast2go.org/获得)来注释结果。
实施例2
Li和Om靶基因和序列的鉴定
作为通常用以鉴定靶基因的方法，将使用当在果蝇中作为RNAi表达时为致死的141个基因的BLAST(NCBI)比较(15,16)用于在丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitiripines)(Nv)中鉴定127个直向同源序列。将所鉴定的Nv序列进一步用于筛选实施例1中制备的Om和Li转录组库的致死基因。参考文献18、19和20中鉴定出在ESCRT通路中起作用的基因。使用BLAST(NCBI)比对以鉴定来自丽蝇蛹集金小蜂的直向同源序列。使用鉴定的丽蝇蛹集金小蜂序列的比对进一步用于在Gw 454转录组库中筛选潜在的靶基因。潜在的Li和Om靶基因限于包括连续开放阅读框中的至少350bp或预测的基因全长的至少50％的Gw 454转录组序列。
进一步筛选潜在的Gw靶标以鉴定与蜜蜂(意蜂(Apis mellifera,Am))序列共享有限同源性的序列。使用公众可获得的NCBI Bl2Seq分析程序(可从http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&PROG_DEF＝blastn&BLAST_PROG_DEF＝megaBlast&SHOW_DEFAULTS＝on&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq获得)来进行比对，以从与对应的Am基因共享有限(即小于80％)同一性的各个Gw靶标中鉴定100bp序列(或，当不可能鉴定出具有小于80％同一性的100bp序列时，鉴定此类序列的较短片段)。
鉴定的具有与Am序列有限同源性的各Om靶基因和序列在SEQ ID NO:1-24、47、48、51和52列出。表1列出各Om靶基因的SEQ ID NO以及其中所鉴定的具有有限同源性的序列。
表1具有与蜜蜂(意蜂)序列有限同一性的Om靶序列和片段
鉴定的具有与Am序列有限同源性的各Li靶基因和序列在SEQ ID NO:25-46、49、50、53和54中列出。表2列出各Li靶基因的SEQ ID NO以及其中所鉴定的具有有限同源性的序列。
表2具有与蜜蜂(意蜂)序列有限同一性的Li靶序列和片段
实施例3
dsRNA三基因沉默构建体的制备
包含来自三个Gw基因的节段(segments)的dsRNA三基因沉默构建体的结构的示意图示于图1。沉默构建体含有两个转基因。第一转基因包含来自三个Gw基因各自的片段(fragments)，片段融合并合成为反向重复，由环序列分隔。见图1A。此转基因的转录(在启动子P1起始并在T1终止)产生发夹RNA(hpRNA)，包含由三个Gw基因的反向重复序列的退火所形成的dsRNA区段(section)和环区域。见图1B。第二转基因包含三个融合的Gw基因，导向转录以产生具有三个基因片段的正义链。见图1A和1C。
下列序列用于构建三个沉默构建体。
Om沉默构建体#1
Om沉默构建体#1在图2中示意性示出。将Om Snf/shrub基因(SEQ ID NO:23)、Om MOR基因(SEQ ID NO:47)和Om TIF基因(SEQ ID NO:51)各自相应的100bp片段融合并合成为反向重复，由106bp的环序列(环1；SEQ ID NO:61)分隔。转录起始由35S CaMV启动子(SEQ ID NO:57)驱动。转录终止由AtActin7终止子(SEQ ID NO:59)提供。选择的100bp SEQ ID NO:23、47和51(相应地，SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:52)在sgFIMV启动子(SEQ ID NO:58)至NOS终止子(SEQ ID NO:60)之间正向合成。
构建体1的转录将产生两种mRNA：(1)具有由三个Om 100bp序列的反向互补序列形成的茎的发夹RNA(hpRNA)，以沉默对应的Om基因(见图2B)；和(2)三个融合的Om基因的正义mRNA(见图2C)。
构建体#1的形成hpRNA的转基因转录时形成的hpRNA具有SEQ ID NO:55所列出的序列。
各hpRNA序列对应于以下元件：
核苷酸1-100和607-706：SEQ ID NO:24相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:23的核苷酸1-100；
核苷酸101-200和507-606：SEQ ID NO:48相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:47的核苷酸213-312；
核苷酸201-300和407-506：SEQ ID NO:53相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:51的核苷酸840-939；以及
核苷酸301-406：基于部分桉树枝瘿姬小蜂几丁质合成酶内含子的106bp环片段(SEQ ID NO:61)。
由构建体1转录的正义mRNA包含SEQ ID NO:62所列出的序列。
Li沉默构建体#2
Li沉默构建体#2在图3中示意性示出。将Li Snf/shrub基因(SEQ ID NO:45)、Li MOR基因(SEQ ID NO:49)和Li TIF基因(SEQ ID NO:53)各自相应的100bp片段融合并合成为反向重复，由106bp的环序列(环1；SEQ ID NO:61)分隔。转录起始由35S CaMV启动子(SEQ ID NO:57)驱动。转录终止由AtActin7终止子(SEQ ID NO:59)提供。选择的100bp SEQ ID NO:45、49和53(相应地，SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:54)在sgFIMV启动子(SEQ ID NO:58)至NOS终止子(SEQ ID NO:60)之间正向合成。
构建体2的转录将产生两种mRNA：(1)具有由三个Li 100bp序列的反向互补序列形成的茎的发夹RNA(hpRNA)，以沉默对应的Li基因(见图3B)；和(2)三个融合的Li基因的正义mRNA(见图3C)。
构建体#2的形成hpRNA的转基因转录时形成的hpRNA具有SEQ ID NO:56所列出的序列。
各hpRNA序列对应于以下元件：
核苷酸1-100和607-706：SEQ ID NO:46相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:45的核苷酸39-138；
核苷酸101-200和507-606：SEQ ID NO:50相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:49的核苷酸492-591；
核苷酸201-300和407-506：SEQ ID NO:54相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:53的核苷酸840-939；以及
核苷酸301-406：基于部分桉树枝瘿姬小蜂几丁质合成酶内含子的106bp环片段(SEQ ID NO:61)。
由构建体2转录的正义mRNA包含SEQ ID NO:63所列出的序列。
单基因和双基因调控序列
使用包括100bp正义-100bp(大约)环-100bp反义的第一序列(其中“100bp正义”和“100bp反义”是指来自靶基因的互补序列)和第二100-bp正义扩增序列的序列的组合来产生单基因调控序列。
实施例4
包含来自一个或两个Gw基因的节段的沉默构建体的示意描述分别示于图4和图5。沉默构建体含有两个转基因。第一转基因包含来自一个(见图4)或两个(见图5)Gw基因的各自的片段，片段融合(在构建体含有两个Gw基因的情形)并合成为反向重复，由环序列分隔。见图4A和5A。此转基因的转录(在启动子P1起始并在T1终止)产生发夹RNA(hpRNA)，包含由相应Gw基因的反向重复序列的退火所形成的dsRNA区段和环区域。见图4B和5B。第二转基因包含Gw基因，导向转录以产生正义链。见图4C和5C。
Om沉默构建体#3(Om单基因构建体)
使用包括100bp正义-100bp(大约)环-100bp反义的第一序列(其中“100bp正义”和“100bp反义”是指来自靶基因的互补序列)和第二100-bp正义扩增序列的序列的组合来产生单基因调控序列。
为构建沉默Om构建体#3，将Om Snf 7/shrub基因(SEQ ID NO:23)的100bp片段融合并合成为反向重复，由106bp的环序列(环1；SEQ ID NO:61)分隔。转录起始由35S CaMV启动子(SEQ ID NO:57)驱动。转录终止由AtActin7终止子(SEQ ID NO:59)提供。选择的100bp Om SEQ ID NO:23(即SEQ ID NO:24)在sgFIMV启动子(SEQ ID NO:58)至NOS终止子(SEQ ID NO:60)之间正向合成。
构建体3的转录将产生两种mRNA：(1)具有由Om 100bp序列的反向互补序列形成的茎的发夹RNA(hpRNA)，以沉默对应的Om基因(见图4B)；和(2)Om基因的正义mRNA(见图4C)。
构建体#3的形成hpRNA的转基因转录时形成的hpRNA具有SEQ ID NO:64所列出的序列。
各hpRNA序列对应于以下元件：
核苷酸1-100和207-306：SEQ ID NO:24相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:23的核苷酸1-100；
核苷酸101-206：基于部分桉树枝瘿姬小蜂几丁质合成酶内含子的106bp环片段(SEQ ID NO:61)。
由构建体3转录的正义mRNA包含SEQ ID NO:24所列出的Om Snf7/shrub序列。
Om沉默构建体#4(Om双基因构建体)
为构建沉默Om构建体#4，将Om Snf 7/shrub基因(SEQ ID NO:23)和OmVps 28基因(SEQ ID NO:5)的100bp片段融合并合成为反向重复，由106bp的环序列(环1；SEQ ID NO:61)分隔。转录起始由35S CaMV启动子(SEQ ID NO:57)驱动。转录终止由AtActin7终止子(SEQ ID NO:59)提供。选择的100bp SEQID NO:23和5(相应地SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:6)在sgFIMV启动子(SEQID NO:58)至NOS终止子(SEQ ID NO:60)之间正向合成。
构建体4的转录将产生两种mRNA：(1)具有由Om 100bp序列的反向互补序列形成的茎的发夹RNA(hpRNA)，以沉默对应的Om基因(见图5B)；和(2)Om基因的正义mRNA(见图5C)。
构建体#4的形成hpRNA的转基因转录时形成的hpRNA在SEQ ID NO:65中列出。
各hpRNA序列对应于以下元件：
核苷酸1-100和407-506：SEQ ID NO:24相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:23的核苷酸1-100；
核苷酸101-200和307-406：SEQ ID NO:6相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:5的核苷酸350-449；
核苷酸201-306：基于部分桉树枝瘿姬小蜂几丁质合成酶内含子的106bp环片段(SEQ ID NO:61)。
由构建体5转录的正义mRNA包含SEQ ID NO:66所列出的序列。
Li沉默构建体#5(Li单基因构建体)
为构建沉默构建体5，将Li Snf 7/shrub基因(SEQ ID NO:45)的100bp片段融合并合成为反向重复，由106bp的环序列(环1；SEQ ID NO:61)分隔。转录起始由35S CaMV启动子(SEQ ID NO:57)驱动。转录终止由AtActin7终止子(SEQ ID NO:59)提供。选择的100bp Li SEQ ID NO:45(即SEQ ID NO:46)在sgFIMV启动子(SEQ ID NO:58)至NOS终止子(SEQ ID NO:60)之间正向合成。
构建体3的转录将产生两种mRNA：(1)具有由Li 100bp序列的反向互补序列形成的茎的发夹RNA(hpRNA)，以沉默对应的Li基因(见图4B)；和(2)Li基因的正义mRNA(见图4C)。
构建体#5的形成hpRNA的转基因转录时形成的hpRNA具有SEQ ID NO:67所列出的序列。
各hpRNA序列对应于以下元件：
核苷酸1-100和207-306：SEQ ID NO:46相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:45的核苷酸39-138；
核苷酸101-206：基于部分桉树枝瘿姬小蜂几丁质合成酶内含子的106bp环片段(SEQ ID NO:61)。
由构建体3转录的正义mRNA包含SEQ ID NO:45所列出的L9 Snf7/shrub序列。
Li沉默构建体#6(Li双基因构建体)
为构建沉默Li构建体#6，将Li Snf 7/shrub基因(SEQ ID NO:45)和Li Vps28基因(SEQ ID NO:29)的100bp片段融合并合成为反向重复，由106bp的环序列(环1；SEQ ID NO:61)分隔。转录起始由35S CaMV启动子(SEQ ID NO:57)驱动。转录终止由AtActin7终止子(SEQ ID NO:59)提供。选择的100bp SEQ IDNO:45和29(相应地SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:30)在sgFIMV启动子(SEQID NO:58)至NOS终止子(SEQ ID NO:60)之间正向合成。
Li构建体6的转录将产生两种mRNA：(1)具有由Li 100bp序列的反向互补序列形成的茎的发夹RNA(hpRNA)，以沉默对应的Li基因(见图5B)；和(2)Li基因的正义mRNA(见图5C)。
构建体#6的形成hpRNA的转基因转录时形成的hpRNA在SEQ ID NO:68中列出。
各hpRNA序列对应于以下元件：
核苷酸1-100和407-506：SEQ ID NO:46相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:45的核苷酸39-138；
核苷酸101-200和307-406：SEQ ID NO:30相应的正义和反向互补序列，对应于SEQ ID NO:29的核苷酸412-511；
核苷酸201-306：基于部分桉树枝瘿姬小蜂几丁质合成酶内含子的106bp环片段(SEQ ID NO:61)。
由构建体6转录的正义mRNA包含列出于SEQ ID NO:66的序列。
实施例5
RNAi构建体在桉树中的表达
使用大体上在Prakash等人，In Vitro Cell Dev Biol.-Plant,2009,45:429-434中描述的操作手册将dsRNA构建体#1和#2转化入桉树。简单地说，将桉树的嫩枝在由3％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)琼脂组成的穆拉希吉克(Murashige)和斯科克(Skoog)(MS)基本盐培养基上体外繁殖。所有体外植物材料在25±2℃下在利用强度为30μEm-2s-1的冷白色荧光灯的16-h光周期下培养。将载有包含nptII基因的二元载体pBI121的根癌农杆菌菌株LBA 4404用于转化。在晚对数生长期收集的细菌培养物压成丸并重悬于MS基本盐培养基。收集来自体外材料的叶并用作转化实验用外植体。
外植体在补充有0.5mg/l BAP和0.1mg/l NAA的MS再生培养基中预培养2d。在细菌悬浮液中温和振荡预培养的叶外植体10min并在无菌滤纸上吸干。然后在预培养条件下在培养基中共培养外植体2d。共培养后，将外植体在MS液体培养基中洗涤，在无菌滤纸上吸干，并转移至补充有40mg/l卡那霉素和300mg/l头孢噻肟的包含0.5mg/l BAP和0.1mg/l NAA的MS再生培养基。4-5周培养后，观察再生并将外植体转移至在纸桥上的液体伸长培养基(liquidelongation medium)(补充有0.5mg/l BAP、40mg/l卡那霉素和300mg/l头孢噻肟的MS培养基)。将细长的嫩枝(1.5-2cm)在含0.1mg/l BAP的MS培养基上繁殖。通过PCR和蛋白质印迹分析来自再生和伸长的嫩叶的叶段。将阳性嫩枝在包含0.04mg/L BAP的MS培养基上增殖至10个拷贝。从嫩枝切离一些叶并通过RT-PCR分析。
使用RT-PCR测定dsRNA的表达。使用EPICENTRE MasterPureTM植物RNA纯化试剂盒(Cat.#MPR09010)纯化来自50mg新鲜转基因植物组织的总RNA，接着用Ambion TURBO DNA-freeTMDnase(Cat.#AM1907)进行DNAse处理。通过RT PCR分析1μl来自各样品的总RNA。利用Platinum Taq DNA聚合酶试剂盒(Cat.#12574-018)使用Invitrogen SuperScript III一步RT-PCR体系进行RT PCR。作为对照，将Platinum Taq DNA聚合酶试剂盒(Cat.#12574-018和#10966-018)用于识别痕量DNA污染。该对照不期望有片段扩增。
实施例6
Li和Om dsRNA构建体的生物分析
为制备瘿瘤组织匀浆，打开瘿瘤并移除所有幼虫。然后将无幼虫的瘿瘤及周围的叶面用研钵和研杵在液氮中均质化直至获得细粉匀浆。通过将琼脂(50mg)在100℃下溶解在缓冲液中，冷却至45℃并添加5g瘿瘤组织匀浆并使总体积达到10ml来制备以琼脂为基本成分的瘿蜂幼虫人工饲料。将等分的人工饲料(10μl)置于可密封的管中并使其冷却至室温。通过从植物组织表面切割含有还未出现成年瘿蜂的活的幼虫的瘿瘤的盖(gall lid)以暴露瘿瘤内部，并使用尖头倾斜的杆轻轻接触幼虫来收集幼虫，从而将瘿蜂幼虫从瘿瘤中分离。将单个幼虫置于各人工饲料管中。通过在各管中放入一滴水来润湿管，将管密封并在25℃下培养。
由从转化有沉默构建体的桉树植物或对照植物(即，野生型未转化植物或单独转化有载体而不插入Li或Om核酸或没有可形成siRNA的核酸的植物)制备的瘿瘤组织制备人工饲料。将依靠由转化的桉树组织制备的人工饲料生长的瘿蜂幼虫与依靠由野生型和对照转化的桉树组织制备的人工饲料生长的幼虫相比较，检查对瘿蜂幼虫发育的影响，来确定Li和Om dsRNA的效果。
实施例7
Li和Om dsRNA构建体的保护效应的试验
用此处描述的Li和Om沉默构建体转化桉树植物并建立转基因株系。通过用载体单独转化植物而不插入Li或Om核酸或没有可形成siRNA的核酸来构建对照株系。
转基因、野生型和对照桉树植物在温室中的防虫笼(insect proof cage)中与成年瘿蜂一起生长。防虫笼保持接种体在内同时防止外部害虫进入笼。接种蜂后，评价在叶脉中和叶片中瘿瘤的外观。检查植物以确定瘿瘤数量、瘿瘤大小(最大长度)、瘿瘤中活力幼虫的数量和出现成熟瘿蜂的数量。测试转录dsRNA的转基因桉树植物的五个独立转化事件。在3次独立的重复中将各转化事件中的10株株系用成年瘿蜂接种。接种后的1、2、3和4个月记录瘿瘤数量、瘿瘤大小、每10个瘿瘤中活力幼虫和(通过出口孔)出现的成虫。
示例性预测结果：转录靶向瘿蜂基因的dsRNA的转基因植物与对照相比显示较小尺寸的瘿瘤的较少的瘿瘤，并且瘿瘤不进一步发展。在小瘿瘤中没有检测出活力幼虫，并且无成蜂出现。转基因植物株系与感染有充分发展的瘿瘤的对照和野生型植物相比抗瘿蜂感染。
已描述许多本发明的实施方案。然而，将理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可进行各种修改。因此，其他实施方案在下述权利要求的范围内。
在此将说明书中参考的所有专利、专利申请和非专利文献的全部内容引入于此以作参考。
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序列
SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:70
生物体：Om
Dmel
ESCRT通路(P)
意蜂(A.mellifera)NM_001112672.2
SEQ ID NO:1
ATGTCTAAGAAGGATAGCAACAAAATGCTGGTTCACCAGTTATCATCCGTATTACCAGACGATCGACCAATCACAGCAATAAATATTATCGAGGATTTGGATAAGTGTCCACCTAATTTCACTGTTGTATCAAGGACCTATGACTTAGATTCAGATGCAGACTTATGGCGAGAAAGTGGACTATTTATCAAAAAGAAATCCAGATACATATGTTTC[缺口(gap)]SEQ ID NO:70
ATCGATGAGAGAGAACCTCCTCCAGAAGGATTTAGTATGATCTCTCACACTGTAGATACAATGCAAAAAGCGTGGCGTAAAAGACAACTGTGTTATAAAATTAGAACTAGAGACTTATGCCCATGCGCAGTATCGGATATAATTATTTGCAATAGGATTGGTAAAGGCTCAAAAATGGCACCAAATGAATTTACTTATGCTGGTGTCATCAATGGAGTTTATATTTGTTACAAAACTGTACCCCTCTCTGCAAGCCCGTTATACTCTGCACAGTCATATGCTAATATAGAATTATTCCAAACGTTGTCTCCAACTCTGTCAAACGGTACACCGCACAGAGTGGCACCAGAGAGGCCACCAAAGCCAAAATTCACGCCGAAACCTACAAATGGACTGTATCCGCAAATAAGTCCAGTAAACGCAGGAAAGACTGCAGCGGATGAGAATGACCAAGACTATGAAGTACTAAGTCCAAGTGCCAGAATAAGGCCAACGCGACCAGCGCCAAGGCCACCGTCTAATAAATCGCCATTGGTTCATTCTGTGCCAGCTTATGGAACATTGACAGGTTCATCAGATCTCGACGGAGTTCCTTTTGTTCTCAATCCTCTTTTGAGCATGAGTACATCAATTATGTTAAATAAACAGTTTCCTGTGATTAAAATCCGAACTCAGAACGAGCTGGATAAAGAGTATTTCTACGACTTTCGAACTGAGAGAGAAACTTGA
SEQ ID NO:2
生物体：Om
SEQ ID NO:1核苷酸682-781(57)
GTACTAAGTCCAAGTGCCAGAATAAGGCCAACGCGACCAGCGCCAAGGCCACCGTCTAATAAATCGCCATTGGTTCATTCTGTGCCAGCTTATGGAACAT
SEQ ID NO:3
生物体：Om
Vps23
NADH-泛醌氧化还原酶,20Kd亚单位(F)
意蜂XM_392437.4
ATGTTGCGTTCCCTTTTAGCAAACCATACCTTTCAACAAGGTCTCAATTTGGTGGCACGTAACAATGCTGCTATCTTGCGATGTCAGAATCCACTCTTGGAGCATGCTAAAACAATGGCAACACAATCGGTAAATCAAAGTTCTGGAAGTTCAGCTCCAGCACCAGCAAAAAAAGAACCTTACAGTCCATTCCAAAACACAAGTAACATGGTTGAATATGCCTTAGCTAGACTAGACGATCTGTTAAATTGGGGAAGAAAAGGTTCAATGTGGCCACTGACGTTCGGGCTGGCATGTTGTGCTGTGGAAATGATGCACATTGCTGCTCCACGATACGATATGGACAGATTTGGTGTAGTTTTCCGTGCTTCTCCTAGGCATGCTGATGTTATCATAGTAGCTGGTACAGTGACAAATAAAATGGCACCGGCGTTGAGAAAAGTATACGATCAGATGCCTGATCCCAAATGGGTCATCTCAATGGGTAGTTGTGCAAATGGTGGAGGCTATTATCACTACAGTTACTCAGTTGTAAGGGGTTGCGATAGAATTATACCTGTGGACATTTATGTACCTGGCTGTCCTCCAACAGCTGAAGCATTACTTTATGGAGTTTTACAGCTGCAGAAAAAGGTGAAACGTATGGAGACTGCCCAAGTGTGGTACAGAAAATAG
SEQ ID NO:4
生物体：Om
SEQ ID NO:3核苷酸010-109(46)
TCCCTTTTAGCAAACCATACCTTTCAACAAGGTCTCAATTTGGTGGCACGTAACAATGCTGCTATCTTGCGATGTCAGAATCCACTCTTGGAGCATGCTA
SEQ ID NO:5
生物体：Om
Vps28液泡蛋白分选28(F)
意蜂XM_392314.4
ATGTCTATTGCACAAGATCGTCCTGAACTTTTTGAAGAAGTAAAGCTGTACAAAAATGCTAGGGAACGTGAAAAATATGATAACCAGGCCGATTTATATGCTGTTGTTAATACTTTACAGCATTTAGAGAAAGCTTATATCAGAGACTGTGTTACGCCCAAAGAATATACAGCTGCATGCAGCAAATTATTAGTTCAATATAGAGCTGCTTTTAAACAGGTCCAGAGCGATCAATTTCCAACAATTGATGCTTTTGCCAGAGCATTTAGACTTGATTGTCCAGCAGCACTTGAACGAATTAAAGAAGATAGACCTATCACCATTAAAGATGACAAAGGCAATACTTCTAAATGTATTGCTGACATTGTTTCACTCTTCATAACATTAATGGATAAGTTACGACTTGAAATTAAAGCTATGGATCAACTTCATCCAGATCTTAGAGATTTGATGGACACTATGAACAGGCTTAGTATATTGCCAAGCGATTTTGATGGAAAGCAAAAAGTTGCAGAATGGCTTCAGACCCTAAATAATATGTCAGCATCTGATGAACTATCGGATACTCAAGTTAGACAACTGATATTCGATTTAGAAACATCTTACAATGCTTTTAATAGAGTTTTACATAACTCGTAA
SEQ ID NO:6
生物体：Om
SEQ ID NO:5核苷酸350:449(78)
AATGTATTGCTGACATTGTTTCACTCTTCATAACATTAATGGATAAGTTACGACTTGAAATTAAAGCTATGGATCAACTTCATCCAGATCTTAGAGATTT
SEQ ID NO:7
生物体：Om
Vps37/mod(r)
ESCRT通路(P)
意蜂XM_001122159.2
ATGTTATCGCGAATATTCCTTGGGGAAAATGAAAATGCCGCAGTCAAGAGAAAACGTCAGATCGACACGCTGAAAATTTTCAACGACAATGTTCTGGAGCTGCAAGAAGATGTCGATTATCAAGTGCACTTTGATGCAGGAGGCAAAAGAATGGCTATTCAGGTCTCGCTATCTCCAGACTTTCCACTGGAAAAGCCAGTACTTAGAGTATCACCTCCGATAAAACATAAATGGTGCAATGAACACAGTGAAATCACTAGTGCTCCAGGATTATTAAATTTTACAGTACACAGTGATCTGGGTCGTGTTGTTCAAGCCATTATACGAGAATTTAGTAAAAATCCACCACAGTTGTTAGAAGAAAGTTCTCCAGTATCAAATCTAGCGCTTGGAGATTTAGCTGGAAGAACGTCACCATCTTCTTACATGTGGAAACCATGTGATCTTGCCTCAGGATCTTATAACTCATACTACAATCCTTCATTCCAGCAGTTTTCTTCGTCAAATGCTACACCTAGCATTTATAACTATAATTACACAAATGCTAGCAATACATATTTGGGCAATTCGCTAAGCTCCGTTCAGTTTAATACAACAAATGCTCAATCACAGTACTCATCGAGTCCTAGCGCAAATGCTTACACAAATTTACATTATGCTAATGCCAACATGGGACCATCGATGCAGAATCAAGTGCAATATAAAAGTAATAAAGTAACC
SEQ ID NO:8
生物体：Om
SEQ ID NO:7核苷酸361-460(54)
GAAAGTTCTCCAGTATCAAATCTAGCGCTTGGAGATTTAGCTGGAAGAACGTCACCATCTTCTTACATGTGGAAACCATGTGATCTTGCCTCAGGATCTT
SEQ ID NO:9
生物体：Om
Vps37b
ESCRT通路(P)
意蜂XM_001120612.2
ATGTTTAAACCACCACAAGAACCAAATATAGCTGCTGCTATTGCACCAATTTCAGATTTAAGTACGGATGCATTGAAAGAGTTGTTGAATGATGATGAAAAGTTTGAAGAGATTATCAAAGATAATCAACAGTTACTAGAGTTAGAATCAGAAAAAGAAGAGATTATGGTACGGAATCGATCGCTGGCAGAATTTAATTTATCAAAAGAACCAGAATTGGAGGAATGTAAAAGGAAAATACAATCACTTAGCGAAGAAGGCAATAATCTTTGCGCTAGTGTGCAAGCCAAACTTGAACAAATAACAAATAAAGCTGGAACTATGACAGTTGATACT
SEQ ID NO:10
生物体：Om
SEQ ID NO:9核苷酸95-194(66)
ATGAAAAGTTTGAAGAGATTATCAAAGATAATCAACAGTTACTAGAGTTAGAATCAGAAAAAGAAGAGATTATGGTACGGAATCGATCGCTGGCAGAATT
SEQ ID NO:11+SEQ ID NO:71
生物体：Om
Vps22/lsn
Notch信号传导通路调控(P)
意蜂XM_003251158.1
SEQ ID NO:11
ATGAGGAGAAAACCTGGAGTTGGAGCAATTCATAAACAAAAGTATGAACAAGAAAAATATAAAGATAAAGGAACGGAGCTTCAAGAAAATCAATTCGAGCAGATGACGAAGCAACTGGAAACTTTTCGAATAAATTTAGAAGACTTTGCTTCAAAACACAAGAATGAAATAAAGAAAAATGCGCACTTCAGGAAGCAATTTACAGATATGTGTGCCTCAATTGGTGTAGATCCATTAGCATCAGGAAAAGGATTTTGGTCTGTTCTTGGTATAGGAGACTTTTATTATGAAATTGCAGTACAAATTGTAGAAGTTTGCTTGGCGACAAACTATAAAAATGGAGGTTTGATATCTTTAGACGAATTA[gap]SEQIDNO:71
CAAAAAGCTTTAGATCATATGGTTAAAGAAGGATTAGCTTGGATAGATGAACAAAATGAAGAACCCTTGTACTGGTTTCCAAGTCTTTTTACAGCTTGCATTGCTTCAAAAACATAG
SEQ ID NO:12
生物体：Om
SEQ ID NO:11核苷酸110-209(73)
AGCAACTGGAAACTTTTCGAATAAATTTAGAAGACTTTGCTTCAAAACACAAGAATGAAATAAAGAAAAATGCGCACTTCAGGAAGCAATTTACAGATAT
SEQ ID NO:13
生物体：Om
Vps25
小泡介导的转运液泡蛋白分选25(P)
意蜂XM_395839.4
ATGACTGAAATTGACTGGCCCTGGCAATATAGTTTCCACCTTTTTTTCACACTTCAACCCCATACAGAAACAAGAGTAAAGCAGATAGAGGCATGGAAAACTTTAGTTTTGAATTACTTCAGGATAGCTAAACAAGCGATTCTTGATGTTCGAGAAATCCATAGCACTCCATTGTTTAACAACACTTCTATTGACAGAAAGCTACCACTAGAAGTCGTATCTATAATAGTAGAAGAATTAGCAAAATCAGGTAATGCAATACCTTTGGATAAATTGAAACAACGATGGATTATATCGTGGCACACATTAGAAGAATGGGCTGATACTATATACTCGTGGGCACAAGCAAATGGATTTATTGGGTCTGTTTGTACACTTTATGAACTAACACAAGGAGAGAATACAGTGGATGAAGAGTTTTATGGTTTGGACAACGAATTACTTATAAGATCTCTAAGGACACTGGAAGCTTCTAAAAAGGCAGAACTAATTATGTTTGAC
SEQ ID NO:14
生物体：Om
SEQ ID NO:13核苷酸140-239(69)
TTCTTGATGTTCGAGAAATCCATAGCACTCCATTGTTTAACAACACTTCTATTGACAGAAAGCTACCACTAGAAGTCGTATCTATAATAGTAGAAGAATT
SEQ ID NO:15
生物体：Om
Vps36
液泡蛋白分选(P)
意蜂XM_395542.3
TTTAAATCTTATCTCATGAGTCTTGGTATTGATGATCCAGTTACTAGAGAGGCCTATAAAAGTAGTAACGAATATTTCAAACAACTTGCCAGGCAGTTAGCTGAAATTTTGGATGAACCAATTAGGGAGGTAGGTGGAATGATGGCTTTAACTGATGTATACTGTCGCGTCAATAGAGCAAGAGGTTTGGAGCTTCTCTCACCTGAAGATTTACTTCATGCGTGTAGACAATTAGCTCCATTAAATCTGCCAATAGTATTAAGGATCTTTGACAGCGGTGTTATGGTTCTACAATCTAGAGCACATAACGATTATGAAATTGCTGAAGCTGTAGCTCAATTGATCAAGAGCAGAGGCTCGATAACAGCAACGGAACTGGCACAATCTGAAGGTATATCAATGGTTTTAGCTTGCGAAAGGCTTCTAATGACTGAAAAATAC
SEQ ID NO:16
生物体：Om
SEQ ID NO:15核苷酸293-392(66)
AATCTAGAGCACATAACGATTATGAAATTGCTGAAGCTGTAGCTCAATTGATCAAGAGCAGAGGCTCGATAACAGCAACGGAACTGGCACAATCTGAAGG
SEQ ID NO:17
生物体：Om
Vps2
蛋白转运(P)
意蜂XM_625161.3
ATGGCTAAAGATGGACAAATGGATGCGGTTAAAATTATGGCAAAAGATCTTGTGAGGACTAGGCGCTATGTTAAGAAATTCATGTTAATGAAAGCGAATATTCAAGCTGTGTCCCTCAAAATACAAACTCTTAAATCTCAAAACACAATGGCTCAAGCAATGAAAGGTGTCACAAAAGCTATGCAAAATATGAACAAGCAACTCAACTTACCTCAAATCCAAAAGATTTTGCAAGAGTTTGAGAAACAATCCGAAGTCATGGACATGAAAGAAGAAATAATGAACGATGCGATTGATGATGCAATGGAAGATGAGGGTGATGAAGAGGAAAGTGACGCAATTGTATCCCAAGTTCTGGACGAACTAGGCCTCCAACTCACCGACCAATTGTCCGGTCTACCTCAAGCCTCAGGGTCTCTGAGTATAGCAGGCTCCAAGCAACCAGTA
SEQ ID NO:18
生物体：Om
SEQ ID NO:17核苷酸332-431(76)
GTGACGCAATTGTATCCCAAGTTCTGGACGAACTAGGCCTCCAACTCACCGACCAATTGTCCGGTCTACCTCAAGCCTCAGGGTCTCTGAGTATAGCAGG
SEQ ID NO:19
生物体：Om
Vps20液泡蛋白分选20(P)
意蜂XM_394359.3
TTAGAGAATTTAGAGCGAATGGTACATGACTTGGAGTTTGCACAAGTTGAAGCTAAAGTTATCGATGGCCTTAAAGTCGGCAATGATGCCCTCAAAAAGTTACATGCAATATTATCAATTGATGAAATTGAAAAAGTCATGGATGAAACCAGAGAAGGTGTAGAGAAACAACAAGAAATTGATGCACTTTTGTCTGGAGCACTGAGTGATGAAGATGAAAATGATGTTGAAACTGAACTTAATGCTCTTATCTCGCAAGAAGCCGATGTAATAACCACGCCTGAAGTACCAGAAGATGTTCCAATGCCTGAC
SEQ ID NO:20
生物体：Om
SEQ ID NO:19核苷酸213-312(60)
AGATGAAAATGATGTTGAAACTGAACTTAATGCTCTTATCTCGCAAGAAGCCGATGTAATAACCACGCCTGAAGTACCAGAAGATGTTCCAATGCCTGAC
SEQ ID NO:21
生物体：Om
Vps24
带电多泡体蛋白3(P)
意蜂XM_394085.4
ATCCAGAGAGAAGAAGAAAAAGTGAAAAGATCATTAAAAGATGCAGCCAAAAAAGGTGATAAAGATGTATGTAAAGTATTGGCAAAAGAAGTTATTCGAGCCAGAACTGCATGTAATAAACTGCATACATCGAAAGCACATCTTAATTCAGTTACCTTACAAATGAAAAATCAGCTGGCAACAATAAGAGTAGCTGGATCTCTTTCAAAATCAACAGAAGTTATGCAAGCAATGCAAGCTCTCGTAAAAGTTCCAGAAGTTGCAGCAACCATGAGAGAACTTTCAAAAGAAATGATGAAAGCTGGGATAATTGAAGAAATGATGGATGAAACCTTGGATTCTATTGAAGATTCTGAAGAATTGGAAGATGCAGCAGATGAAGAAGTTGATAAAATTTTATGGGAAGTCACTGCTGGACAGATGGGAAGAGCGCCTGATGTTGTCACTGATACACCTGGAGCATCTACGTCTAAAGAAGAAGAAGTTGAAGAAGTCACGGATGACAAAGAATTAGAAGAAATGAAAAATAGGTTACAAAGCCTTCGCAGCTAG
SEQ ID NO:22
生物体：Om
SEQ ID NO:21核苷酸015-114(49)
AGAAAAAGTGAAAAGATCATTAAAAGATGCAGCCAAAAAAGGTGATAAAGATGTATGTAAAGTATTGGCAAAAGAAGTTATTCGAGCCAGAACTGCATGT
SEQ ID NO:23
生物体：Om
Snf7/shrub
ESCRT-III通路(F)
意蜂XM_395324.4
ATGAGCTTCTTCACGAAGGTCTTCGGCGGGAAGAAGGAGGCGGCTGCTCCGACGACCTCGGAGGCCATACAGAAACTACGCGAGACGGAGGAGATGCTCATCAAGAAGCAAGACTTCCTCGAGGGCAAGATCGAGCAGGAAATTCAGCAGGCTAGGAAATACGGAACTAAAAACAAACGAGCTGCTATCCAAGCATTAAAAAAGAAGAAACGCTATGAGAAACAACTGCAACAAATCGATGGCACATTATCCACAATTGAGATGCAGAGAGAGGCACTCGAAAGCGCCAACACGAATACTGCTGTTCTGACTACGATGAAGAATGCAGCAGATGCTTTGAAAGCTGCTCATCAACACATGGATGTTGATCAAGTCCATGATATGATGGATGACATTGCTGAACAACAAGATGTGGCAAAGGAAATTTCAGATGCTATCTCTAATCCAGTAGCATTCGGCCAAGACATAGATGAAGATGAACTTGAGAAGGAACTAGAGGAATTAGAACAAGAAGAATTAGATAAAGAATTGTTGGGTATAAAGACTACAGACGAATTACCGTCAGTTCCTGCTACATCATTGCCAGCTGTACCAGAAAAGAAAACAAGAGCAAAAGCAGAAGATGATGATGATTTGAGAGAACTGGAACAATGGGCATCGTAA
SEQ ID NO:24
生物体：Om
SEQ ID NO:23核苷酸001-100(71)
ATGAGCTTCTTCACGAAGGTCTTCGGCGGGAAGAAGGAGGCGGCTGCTCCGACGACCTCGGAGGCCATACAGAAACTACGCGAGACGGAGGAGATGCTCA
Li序列
序列表
SEQ ID NO:25
生物体：Li
Dmel
ESCRT通路(F)
意蜂NM_001112672.2
ATGTCGAAGAAGGATGGTAACAAAATGCTGGTTCACCAGTTATCGTCTGTTCTACCGGATGATAGGCCTATCACAGCAATAAATATCATAGAAGACTTGGACAAGTGTCCACCAAACTTCACTGTGGTATCAAGAACATATGATTTGGATTCAGATGCAGACTTGTGGCGAGAGAGTGGGCTGTTTATTAAGAAAAAGTCAAGATACATATGTTTTTCAAAGACTGAAGGATTGCCACATTCTGTTATAGAAAAAATTTCAATTCTTGATGAGAGAGAACCACCTCCAGAGGGATTCAGTATGATTTCTCATACTGTAGACTCAATGCAAAAAGCATGGCGTAAAAGGCAACTGTGTTACAAAATTAGAAATAAGGACTTGTGCACATGTGCAGTATCGGACATAATTATCTGTAGTAGGCTTGGTAAAGGTTCCAAACTGGCTCCAGATGAATTTACCTACGCTGGTGTCATAAACGGTGTTTACCTTTGCTATAAAACAGTTCCACTACTAGCGGGTTCCCACACAGTACAGCCATATGCGAACATAGAATTATTCAAAGCGGCCTCGCCAACGCTGTCGAACGGCGGCAGCACGCCACACAGGCCAGCACCGGAACGCCCGCCAAAGCCAAAGTTCGGGGCCAAGCCGACGAATGGACTGTATCCGCAAATAAGCCCGTCTAACGCGGGAAAGTCGGAGGAAAGCCAAGACCAAGACTACGAGATATTGAGCCCAAGCGCGAGAATAAGGCCAACGCGACCAGCGCCAAGGCCGCCATCCAACAAATCACCTCTCGTTAATTCGGTGCCATCGTACGGAACACTGCCTGGCTCGTCGGATCTCGATGGAGTTCCTTTTATTCTTAATCCGCTTCTCACTAGTGGCACGTCGCTTTCGTTAAATAAGCAATTCCCTGTCATTAAAATCCGAACTCAGAAAGAACTGGATAAAGAGTATTCCTACGATTTTCGAACGGAGCGAGAAACTTGA
SEQ ID NO:26
生物体：Li
SEQ ID NO:25核苷酸556-655(53)
TTCAAAGCGGCCTCGCCAACGCTGTCGAACGGCGGCAGCACGCCACACAGGCCAGCACCGGAACGCCCGCCAAAGCCAAAGTTCGGGGCCAAGCCGACGA
SEQ ID NO:27
生物体：Li
Vps23
NADH-泛醌氧化还原酶,20Kd亚单位(F)
意蜂XM_392437.4
ATGTTGCGTTCCCTTTTGACTAATCATACTTTCCAGCAAGGCTTGAATTTAGTGGCGAGAAATAATGTCACTATTTTGGGAACTCAGAGTCCGCTGCTGGAGCAGACAAAAAATTTAGCAACACAACCAGTTGAAAGCTCAGCACCAGCAGCAACTCCAGCAAAAGAACCTTACAGCCCCTTTCAGAATAAGAGTAGCATGGTTGAATATGCACTGGCTAGACTTGACGATTTGTTGAATTGGGGCAGAAAAGGTTCTATTTGGCCATTGACATTTGGTTTGGCTTGCTGTGCTGTGGAAATGATGCACATTGCTGCGCCACGTTATGATATGGACAGGTTTGGTGTTGTGTTTCGTGCCTCGCCTAGGCATGCTGATGTAATTATTGTAGCTGGTACAGTGACAAATAAGATGGCTCCTGCATTGAGGAAAGTTTACGATCAAATGCCAGACCCCAAATGGGTGATTTCTATGGGCAGCTGTGCCAATGGTGGAGGCTACTATCATTATAGTTACTCTGTTGTAAGGGGCTGCGACAGGATCATACCTGTGGACATTTATGTACCTGGCTGTCCTCCCACCGCAGAGGCACTCCTTTATGGGATTTTGCAGTTGCAGAAAAAAGTTAAGCGAATGGAGACTGCACAAGTGTGGTATAGAAAATAA
SEQ ID NO:28
生物体：Li
SEQ ID NO:27核苷酸010-109(46)
TCCCTTTTGACTAATCATACTTTCCAGCAAGGCTTGAATTTAGTGGCGAGAAATAATGTCACTATTTTGGGAACTCAGAGTCCGCTGCTGGAGCAGACAA
SEQ ID NO:29
生物体：Li
Vps28液泡蛋白分选28(P)
意蜂XM_392314.4
ACTCAAGATCGTCCGGAACTTTATGAAGAAGTAAAATTATACAAGAATGCCAGAGAACGAGAAAAGTATGAAAATCAAGCTGATTTGTATGCTGTTGTCAACACTTTGCAACATTTAGAGAAAGCTTACATCAGAGATTGTGTCACACCCAAAGAGTACACTGCGGCGTGCAGCAAGTTGTTAGTTCAATACAGAGCAGCTTTCAAACAGGTTCAAAGTGATCAGTTTCCAACAATTGATGCATTTGCCAGAGCCTTCAAACTTGACTGTCCAGCAGCTCTTGAGAGAATCAAAGAGGACAGGCCAATTACAATTAAAGATGACAAGGGCAATACATCGAAGTGCATTGCTGACATAGTTTCACTCTTCATTACCATCATGGATAAATTACGCTTGGAAATCAAAGCTATGGATCAACTTCACCCAGATCTCAGAGATTTAATGGATACCATGAACAGACTCAGTATACTGCCAAGTGACTTTGATGGAAAACAGAAGGTTGCGGAGTGGCTTCAGACTTTGAATAATATGTCTGCTTCGGACGAACTGTCAGATACGCAAGTTAGACAATTAATTTTTGATTTAGAAACGTCTTACAATGCATTTAACAAGGTTCTTCACAATTCTTAA
SEQ ID NO:30
生物体：Li
SEQ ID NO:29核苷酸412-511(78)
GATCAACTTCACCCAGATCTCAGAGATTTAATGGATACCATGAACAGACTCAGTATACTGCCAAGTGACTTTGATGGAAAACAGAAGGTTGCGGAGTGGC
SEQ ID NO:31+SEQ ID NO:72
生物体：Li
Vps37/mod(r)
ESCRT通路(P)
意蜂XM_001122159.2
SEQ ID NO:31
GAAAATGAAAATGTCGCCGTCAAGAGAAAACGACAGATTGACACGCTGAAAATCTTTAATGATAATGTCTTGGAACTGCAAGAAGATGTTGAATATCAAGTGCTGTTCAATGCTGGAGAAAGATGTATGGCAATTATGGTCTCATTGTCTCCAGACTTTCCACTGGAAAAACCAGTGCTCCGAGTTTCACCATCAATAAAGCATAAATGGTGTAATGAACACAGTGAAATTACTAGTGCACCAGGATTATTAAATTTTACGGTTCATAGTGACCTTGGGCGTGTTGTGCAAGCTATTATTAGGGAGTTCAGTAAAAATCCACCACAACTGTTGGAGGAAAATTCTGCACTCACAGATGTAGCTGGTAGAGTATCACCGTCGTACACATGGAAACCACACGAGCTTGCT[gap]SEQ ID NO:72
AGTCAAGAGCAAAGCGAAGTGATAGCCCAGGACTTTCTTGATCGCAAAATTGACGTGGAGCGTTTTCTTAGTACGTACGTCGAGTGTCGGAAGCTCGGCCAGGCCAGGCGGACCAAGGAGGAGAAACTCACACATCAACTCAACGAGCTAAAG
SEQ ID NO:32
生物体：Li
SEQ ID NO:31核苷酸465-564(67)
CGTGGAGCGTTTTCTTAGTACGTACGTCGAGTGTCGGAAGCTCGGCCAGGCCAGGCGGACCAAGGAGGAGAAACTCACACATCAACTCAACGAGCTAAAG
SEQ ID NO:33
生物体：Li
Vps37b
ESCRT通路(P)
意蜂XM_001120612.2
ATGTACAAGACATTTCAAGAGCCTGATATTCCAGCTGCTATAGGTCCAGTTTCAAACCTTAGCACGAACGAATTAAAAGATCTACTGAATGACGAGGATAAGTTTGAAGAAATCATCAAAACTAATCAACAGTTACTGGAGTTTGAGTCGGAGAAAGAAGAAATAATGGTGAGGAATCGATCTTTAGCAGAATTCAATTTATCAAAAGAACCTGAACTAGAAGAAGCTAAAAATTTCATAAGGTCCCTCAGCGAAGAAGGCAATCAATTGTGTTCCAGTGTTCAAGCCAAACTTGAACAAATAAAAAATAATGCTGGTGCAATGTCAACTGAAACT
SEQ ID NO:34
生物体：Li
SEQ ID NO:33核苷酸90-189(60)
TGACGAGGATAAGTTTGAAGAAATCATCAAAACTAATCAACAGTTACTGGAGTTTGAGTCGGAGAAAGAAGAAATAATGGTGAGGAATCGATCTTTAGCA
SEQ ID NO:35
生物体：Li
Vps22/lsn
Notch信号传导通路调控(F)
意蜂XM_003251158.1
ATGAGGAGAAAACCAGGAGTTGGAGCAATCCAAAAACAAAAATATGAACAAGAACGGTATAGAGACAAAGGAACGGAGCTTCAAGAGAATCAATTCGAGCAGATGACTAAGCAAATGGAAACTTTTAGAATAAATTTGGAAGAGTTTGCCTCGAAGCATAAGAATGAAATAAAGAAAAATGCACAATTCAGGCGTCAGTTTACAGAAATGTGTGCTTCTATAGGTGTAGATCCATTAGCATCTGGCAAAGGTTTTTGGTCTGTATTAGGTATTGGAGATTTCTACTATGAACTTGGAATTCAAATAGTTGAAGTATGTCTTGCAACTAATTACAAAAATGGAGGCTTGATATCGCTGGATGAACTAAGAGAACGATTAATCCAAGCAAGAGGACGTCGCAAAGAACATCAAGAGATAACAAACGAGGATTTACTTGCTTCAGCTAAAAAACTTAAAATATTAGGCAATGGATTCTCTGTGGTACCCATCAGTAAAGGCAAATACTTAGTTCAGTCTATACCTGGAGAGTTGAGCATGGATCACACTGCAGTCTTGCAGCAAACAAATAACAACGGCAATGCCTTTATTTCAAAATCATTGCTACAATCAGAATTAAAATGGGAGAGTGAAAGGGCTCAAAAAGCTCTTGATCATATGGTCAAAGAGGGATTAGCTTGGATTGATAATCAAAATGAAGGAGAACCATTGTACTGGTTTCCAAGTTTGTTCACTGCTTGCATTGCTTCAAAAACGTAA
SEQ ID NO:36
生物体：Li
SEQ ID NO:35核苷酸520-619(66)
CCTGGAGAGTTGAGCATGGATCACACTGCAGTCTTGCAGCAAACAAATAACAACGGCAATGCCTTTATTTCAAAATCATTGCTACAATCAGAATTAAAAT
SEQ ID NO:37+SEQ ID NO:73
生物体：Li
Vps25
小泡介导的转运液泡蛋白分选25(P)
意蜂XM_395839.4
SEQ ID NO:37
ATGACTGAAATTGATTGGCCCTGGCAATACAGTTTTCCTCCTTTTTTCACACTTCAGCCGCATGCTGAAACAAGGGCAAAACAAATTGACGCATGGAAGAGTTTAATTCTGGATTATTTTCGCACAACAAAGCAAGCAATTCTTGATGTTCGTGAAGTTCACAGCAGCCCATTATTCAACAATAGTTCCATTGATCGAAAACTACCAGTAGAAGTTGTATCACTGATTCTTGAGGAGCTGTCAAAGTCAGGTAATGCTACCCCACTAGACAAATCAAAGCAACGATGGGTTGTTTCATGGCATACACTTGACGAATGGGCTGACATATTGTACTGTTGGGCACAA[gap]SEQ ID NO:73
TTTTATGAACTAACCCAAGGAGAGGATACTGCTGATCAAGAATTTCATGGCTTAGATAACGAAGTACTTGTGAGAGCTTTAAGAACATTAGAAGCATCTAAAAAGGCTGAATTAATAATGTTTGATGATAATGAAGGTGTAAAGTTTTTCTAA
SEQ ID NO:38
生物体：Li
SEQ ID NO:37核苷酸213-312(68)
AGTTGTATCACTGATTCTTGAGGAGCTGTCAAAGTCAGGTAATGCTACCCCACTAGACAAATCAAAGCAACGATGGGTTGTTTCATGGCATACACTTGAC
SEQ ID NO:39+SEQ ID NO:74
生物体：Li
Vps36
液泡蛋白分选(P)
意蜂XM_395542.3
SEQ ID NO:39
ATGAACAGGTTCGAATACGCGGAGCCTCAGTTGTTGCCAAATGAAATTCACGTCAGACGCGATCGAGGCATCAGACTCTACGATGGAGACGTCAAGAGTCCTTTCGAGGGTGGAGAGGTGACACTGACAAGCCACAGAATAATTTATAAAACGCAAGATGGTCTCACATTTGCCTTAAGACTTAGCTTAGTTGTATTTTTTGAGGAGGAAAATCCAGGAGCTTTGTTTTTTACTCGCAGCAAGAAAGTAGTGTTGCATTTAGCTGAGCCACCCAGTGATAAACTTACTGGACCAATTGATCATAGCCACTATAATTATGTTAAGTTGTCATTTAAAGAGGGACTGGATCCTAATTTTGTTGCACACCTAAGTGATACAGTTATCAAAAAACTTTGGTAGATAGCGCCTATAAATGTTTCGTCAATACTCACAAGCTCTCCAAATGTGCAGGGGAGTTCAAGTGCAAAACCACTACCTCAAATTAAACCCAGAACTGGTATTATAGGAATAGAAAGAAGTATACAAGAGCAACAGAAAGCCACAGACGAAAGCATTACCGTTGCCTTTCAGGACTTGAAAAAGCTTATGGTCATGGCTAAGGATATGGTTACAATATCCAAGACCATATCTGCAAAAATAAGGGAACGACAAGGAGACATCACAGAGGATGAAACTGTTCGGTTCAAGTCATATTTGATGAGTTTGGGTATCGATGATCCTGTGACCAGAGATGCCTACAGAACTGAGAATGAATATTTTAAACAGCTTGCTCGACAGGTAGCTGAAGTACTAGAAGAGCCTGTAAAGGAAGTGGGTGGAATGATG[gap]SEQ ID NO:74
CAGGCAAGAGTTCACAGTGATTATGAAGTTGCCGAAGCTGTGTCACAATTGATAAAAGACAGAGGATCAATTACAGCTACGGAATTAGCACAATCAGCAGGAATTTCTGTGGTTTTGGCCTGTGAAAGGCTACTGATGACAGAGAAATACGGAAAAGCCTGCAGAGATGATTCGATCGAAGCATTGAGATTTTACCCTAATTTATTCCTGGAACAGGAGTCGTGA
SEQ ID NO:40
生物体：Li
SEQ ID NO:39核苷酸410-509(57)
TAAATGTTTCGTCAATACTCACAAGCTCTCCAAATGTGCAGGGGAGTTCAAGTGCAAAACCACTACCTCAAATTAAACCCAGAACTGGTATTATAGGAAT
SEQ ID NO:41
生物体：Li
Vps2
蛋白转运(F)
意蜂XM_625161.3
ATGGAGTGGCTTTTTGGAAAACGCGTAACTCCTGAGGAGATGCTCAGGAAGAATCAAAGAGCTTTGAACAAGGCAATGAGAGATCTAGACAGAGAAAGGATGAGAATGGAACAACAGGAAAAGAAAATCATAGCTGATATAAAGAAAATGGCAAAAGATGGACAAATGGATGCTGTTAAAATCATGGCTAAAGATCTTGTCAGGACAAGACGCTACGTTAAAAAGTTTATGTTAATGAAAGCAAATATTCAAGCAGTATCTCTGAAAATTCAGACTTTACGCTCTCAAAACACAATGGCTCAGGCCATGAAAGGAGTCACAAAGGCTATGCAAAATATGAACAAACAATTAAATTTGCCACAAATTCAAAAGATATTGCAAGAGTTTGAAAAACAATCTGAGATTATGGATATGAAAGAAGAAATAATGAATGATGCAATAGATGATGCCATGGAAGATGAGGGTGATGAAGAAGAAAGCGATGCGATTGTATCACAAGTTCTGGATGAACTTGGCCTTCAATTAAACGACCAGTTGTCAGGACTACCTCAAGCCTCAGGATCGTTGAGCATAGCAGGTTCGAAGCAACCAGTGGCCGCGGCAGCTGGAGCCGGTAACGACGACGGCAATCTGGCGGATGCCGATGCGGATCTTCATGCGCGACTTGAAAATCTGCGTCGCGAGTAG
SEQ ID NO:42
生物体：Li
SEQ ID NO:41核苷酸548-649(67)
CTCAAGCCTCAGGATCGTTGAGCATAGCAGGTTCGAAGCAACCAGTGGCCGCGGCAGCTGGAGCCGGTAACGACGACGGCAATCTGGCGGATGCCGATGC
SEQ ID NO:43
生物体：Li
Vps24
带电多泡体蛋白3(P)
意蜂XM_394085.4
GGTTATCAGATTGACAGGCAGGTTAGAGCAATCCAAAGAGAAGAAGAAAAAGTGAAAAAAACACTGAAAGAGGCAGCTAAAAAAGGTGACAAAGATGTCTGTAAGATTTTGGCCAAAGAAGTGATTAGAGCGCAGAAAGCTTGTAAGAAGTTGCATACCTCGAAAGCCCACCTGAATTCTGTCACCTTGCAAATGAAAAATCAATTAGCAACAATTAGAGTTGCTGGCTCTGTCTCAAAATCAACAGAAGTCATGCAAGCTATGCAAGCGCTTATCAAAGTTCCAGAGGTCGCTGCAACAATGCGAGATTTGTCCAAAGAAATGATGAAGGCTGGTATTATTGAGGAAATGATGGATGAAACTATGGATTCTATGGAGGATTCTGAAGAAGTAGAGGAAGCTGCTGATGAAGAAGTTGACAAGATTCTGTGGGAAGTTACTGCTGGACAAATGGGAAGAGCACCAGACGTTGTCACAGAAACACCTGGAGCTTCAACTTCAAAAGAAGAAGAAGAACCAGCTGAAGAACTGAGTGATGACAAGGAATTAGAAGAAATGAAAAATAGATTACAAAGTCTTCGGAGTTAG
SEQ ID NO:44
生物体：Li
SEQ ID NO:43核苷酸87-186(48)
TGACAAAGATGTCTGTAAGATTTTGGCCAAAGAAGTGATTAGAGCGCAGAAAGCTTGTAAGAAGTTGCATACCTCGAAAGCCCACCTGAATTCTGTCACC
SEQ ID NO:45
生物体：Li
Snf7/shrub
ESCRT-III通路(F)
意蜂XM_395324.4
ATGAGTTTCTTTAGCAAGGTCTTCGGCGGGAAAAAGGAGCCGACCGCCCTAACGACCGCCGAGGCGATACAAAAACTCCGAGAGACCGAGGAGATGCTCATCAAGAAACAGGACTTCCTTGAGACCAAGATCACACAGGAAATACAAACGGCCAGGAAGAACGGTACCAAGAACAAACGAGCTGCCATTCAAGCGACTGAAAAAAAGAAACGATATGAAAAGCAGCTACAACAAATCGATGGGACGTTGTCCACAATTGAGATGCAAAGAGAAGCTCTCGAAAGTGCAAACACAAATACTGCTGTTCTTACCACAATGAAGAATGCAGCTGATGCTCTCAAAGCTGCACATCAACACATGAATGTCGATGAAGTTCATGACATGATGGATGATATTGCTGAGCAACAAGATGTTGCAAAGGAAATTTCAGATGCAATTTCAAACCCTGTTGCATTTGGACAAGATATTGATGAAGATGAACTAGAGAAGGAGCTAGAAGAATTAGAACAAGAAGAGTTAGACAAAGAATTGCTCGGTATACAAACCACAGATGAACTACCTGCTGTTCCTGCTACAGCCTTACCAGCTGCACCCGAAAAGAAATCAAAACCAAAACAAGAAGAAGATGATGATTTAAGAGAACTAGAGCAATGGGCATCGTAA
SEQ ID NO:46
生物体：Li
SEQ ID NO:45核苷酸39-138(66)
GCCGACCGCCCTAACGACCGCCGAGGCGATACAAAAACTCCGAGAGACCGAGGAGATGCTCATCAAGAAACAGGACTTCCTTGAGACCAAGATCACACAG
SEQ ID NO:47[PCT SEQ ID NO:103]
生物体：Om
Mor转录共激活因子活性染色质重建
意蜂XM_393008
ATAGCAGAATGTGAAGATGATGCTACTCACATAATCTATCCATCTGCTGATCCTCTAGAAGAAGAATACGCAAGGCCGTGTTTTCGAAGAGATCGATCTGTTTTACTTCACTGGTATTATTTTCCAGATAGTTATGATTCGTGGGTCAACATTGAACTTCCATGGGATTTTCCTGAAACTGCTCTTGGAAACCCTCCTCCAAAGTCACCATATAAAGTTTCTGCTACTTGGGCACTAGATTTAGAACAATACAATGAATGGATGAATGAGGAAGATTATGAAGTAGATGAAAGTGGTCAGAAAAAAGTACATAAGTACAGGTTAAGCGTTGAAGACATGATGACACAATCAGCACCACCTTCTGTTAAAAAGCAGAAAAGGAAGAGGTCTCCGACTCCACCACCAAAACTAGGCAAACGAAAAAGTGGGCGAGCTCCTGCTGGTCCTCAAGGTATAAATTCTTCTACGGGTCCAAAGAAATCACGTGGAACTGGAGATGAAGAAGAAGACTTAACTCAAGGCATGGATGATCCACCTGCAGAACCCAGGATAATGGAAGTCGTCTCTACAAATGCTAACACACCAAACTCAGCTCAAAACAGTACTGGTCCTATCATTTCCAGTAGCAAAAAACAGGATAATGAATTGCAGCCATTAAAATCTGGAAATATGGCCGATCTTGATGAACCAGTGGATGGTGAAAAAAGTAACTCACAAACGTCTCAAGACCGAGAAGAAAGGGATACGAGTAAAGAAAGGAATGATGGTAGCAAAAGCGATGAACCAGAAGATAATGTTACAGAACAAACTCATCACATTGTTGTACCCAGTTACTCTGCGTGGTTTGATTACAATTCCATTCACACAATCGAGAAACGAGCTCTGTCTGAATTTTTCAATGGCAAAAACAAATCGAAAACACCAGAAATTTATTTGGCGTATAGAAATTTCATGATCGACACTTATCGTTTGAACCCAACAGAGTACATCACGTCAACAGCGTGCAGGCGAAATTTGGCTGGTGATGTTTGTGCGATAATGCGCGTACATGCTTTCCTCGAACAATGGGGTCTAATTAATTATCAGGTGGATGCCGATTCAAGGCCGACGCCTATGGGTCCACCGCCAACCTCACACTTCCACGTGCTTTCAGACACACCGTCAGGTTTAGCACCAGTTAATCCTAATCCTCCTAAAACGCCACAGCCATCCGCAGCGAAAACTCTTTTGGATCTCGAAAAGAAGCCTGTTATTACGGATGAAAAAGTTCCTCCGGTCGGACCCATGGCAAACTTTGGTCTCAAGATCGATCAGTATTCGAAAAAACCAGCCGTACTGAAAAATAAACAAGCTGCTGGTGCAACTCGTGATTGGACGGAACAAGAAACGTTATTATTACTAGAGGCTTTAGAACTTCATAAGGACGATTGGAATAAGGTGTGCGAGCACGTTGGCTCGAGGACACAAGATGAGTGCATTCTGCATTTCTTAAGGCTACCCATTGAGGATCCATACCTTGAGGAGCCGGAGGGTCTAGGCCCGTTGGCATATCAGCCTATTCCTTTCTCTAAGGCTGGAAATCCTGTTATGAGTACAGTAGCTTTCCTGGCATCAGTGGTTGATCCAAGAGTAGCGGCAAGTGCGGCCAAAGCTGCAATGGAAGAATTCGCTGCGATAAAGGATCAGGTGCCAGCAGCACTTCTGGATCAACATTTAAGGAATGTGCAGGCTAGCGCGAATTCGGATGGTAAATTCGATCCGGCAGCTGGTCTTGCACAGTCGGGTATCGCCGGAACCGGT
SEQ ID NO:48[PCT SEQ ID NO:130]
生物体：Om
SEQ ID NO:47核苷酸213-312(75)
ATCGACACTTATCGTTTGAACCCAACAGAGTACATCACGTCAACAGCGTGCAGGCGAAATTTGGCTGGTGATGTTTGTGCGATAATGCGCGTACATGCTT
SEQ ID NO:49[PCT SEQ ID NO:104]
生物体：Li
Mor转录共激活因子活性染色质重建
意蜂XM_393008
CAGTACAATGAGTGGATGAATGAAGAAGATTATGAAGTAGATGATAGTGGACAGAAAAAGGTACATAAATATAGACTATCAGTTGAGGACTTGATGGCTCCAACACCTGCATCAGGTAAAAAACAAAAGAGAAAAAGTCGCCCAGTCCTCCTCCAAAACTTGGAAAAAGAAAAGTGGCAGAGCTCCTGGAGGAACTCAAGGTGGGTTGTCCGGCCCAAAAAATCACGAGGTGGAGACGAAGAAGAAGACTTGACACAAGGAATGGAGGATCCTCCGTCTGAGCCGAGAATAACGGAAGTTGTAAATTCGAATACGAATGCATCTATCTCTGGACAGAATAGCAGCTCAGGCATGGTGTCCAGCAAAAAACAGGACAATGACATGCAGCCACTCAAGTCTGGAAACATGGCCGATTTGGATGAACCAGTTGATGGTGATAAAAGCAATTCGCAAAATTCACAAGACAGAGAAGAACGTGACACGAGCAAGGAAAGAGGCGACGGCAGCAAGAGCGATGAGCCCGAGGATAACGTGACCGAGCAGACTCATCACATTGTGATTCCGAGCTACTCGGCGTGGTTTGACTACAACTCTATTCACATGATTGAGAAGCGAGCACTATCAGAGTTTTTCAACGGCAAGAACAAGTCTAAGACACCAGAAATCTACCTCGCTTACAGGAATTTCATGATCGACACCTATCGCCTCAATCCGACCGAGTACATTACTTCCACAGCCTGTAGGCGAAACTTAGCTGGTGATGTATGCGCTATCATGCGCGTGCACGCTTTTCTCGAACAGTGGGGTCTGATCAATTATCAAGTGGATGCCGATTCAAGACCGACACCTATGGGACCTCCACCTACTTCGCACTTCCATGTTTTGTCAGATACACCGTCTGGGTTAGCTCCAGTTAATCCAAACCCTCCCAAAACACCGCAGCCGTCAGCGGCAAAGACGTTACTTGATCTCGAAAAGAAACCGATTATTGACGAGAAGATTCCAGCTGCTGGAGCGATGGCCAACTTCGGCCTGAAGCTCGATCAATACGCGAGGAAGCCTGCGGTTTTGAAAAACAAGCAAGCTGCTGGTGCTACTCGCGAGTGGACGGAACAAGAAACGCTGTTATTGCTTGAAGCTTTGGAGTTACACAAGGATGACTGGAATAAGGTTTGTGAGCATGTTGGTTCAAGAACTCAGGATGAATGTATCCTACACTTTTTGCGATTACCCATTGAAGACCCGTACCTTGAAGAACCAGAAGGTCTTGGTCCACTGGCATATCAGCCCATACCTTTTTCTAAGGCTGGTAACCCTGTCATGAGCACCGTTGCATTTTTGGCTTCGGTAGTGGATCCTAGAGTAGCAGCTAGTGCGGCAAAGGCTGCTATGGAAGAGTTTGCTGCCATCAAAGACCAGGTGCCTGCTGCTTTACTGGATCAACATTTGAGAAATGTTCAGGCTACTGCTGCTGATGGAAAATTCGACCCAGCCGCCGGTCTTGCACAGTCAGGTATCGCAGGCACAGGA
SEQ ID NO:50[PCT SEQ ID NO:127]
生物体：Li
SEQ ID NO:49核苷酸492-591(72)
AGAGGCGACGGCAGCAAGAGCGATGAGCCCGAGGATAACGTGACCGAGCAGACTCATCACATTGTGATTCCGAGCTACTCGGCGTGGTTTGACTACAACT
SEQ ID NO:51[PCT SEQ ID NO:120]
生物体：Om
TIF
真核翻译起始因子3亚单位I样(TIF)
翻译起始
意蜂XM_392780
ATGAAACCACTGATGTTACATGGGCACGAGCGTGCCATCACAAAAATCAAATACAACAGAGAAGGAGACTTACTTTTTTCTGCTAGTAAAGATAAACAACCGAATGTTTGGTATTCGTTAAACGGAGAAAGACTTGGAACATTCAATGGACACAATGGTTCAGTTTGGTGTATTGATGTCAATTGGGATACAACACGCTTTTTATCCGGTAGTGGTGACAACACTTTAAGATTATGGGATTGTGCAACAGGAAAAGAGATTAGTCAATTGTCCACAAACAGTTCAGTAAGAGCTTGTGCATTTAGCTATTCAGGCAATCTTGCTGTATATGCCACTGACAAAGCTCTTGGACACCAATGTGAAATGTTTATTATTGACATTAGGTCTCCTGAAAGTGTTCTTTCTCAAGATGATAACGTTTGTAGAACTTCAGTCAGTGGTTCAAGGATTTCATCTCTCTTGTGGGGAGCTCTCGATGAATCTATTATTACTGGTCATGAAAATGGTGATTTAAACATCTGGGACAGTAGGACTGGAAAGAAATTGAGTGATGCTCAGGGTCACAAGGGTCAAATTAATGACATGCAGTTCAACAAGGATGGAACTATGTTCGTTACAGCCTCAAAGGACCACACTGCAAAGTTGTTTGACAGTGAATCTCTTGTTCCATTGAAAACGTATAAAACAGAAAGGCCAGTTAACTCTGCCACGATATCTCCAATCTTTGATCACGTCGTAGTTGGAGGTGGTCAAGACGCTATGGACGTCACCACGACATCGACGAAACAAGGAAAATTCGATGCTCGTTTTTTCCATCTTGTCTTTGAAGAAGAATTTGCACGTTTAAAAGGTCACTTTGGTCCAATTAACTCGCTGGCCTTTCATCCAAATGGACGCAGTCTGTCTACTGGAGGAGAGGATGGTTATATTCGTATAAATACATTTGATCAGTCCTATTTCGATTTTCATTTTGAGTACTAA
SEQ ID NO:52[PCT SEQ ID NO:131]
生物体：Om
SEQ ID NO:51核苷酸375-474
含有C472G替换以在靶序列消除SacI位点(61)
TGACATTAGGTCTCCTGAAAGTGTTCTTTCTCAAGATGATAACGTTTGTAGAACTTCAGTCAGTGGTTCAAGGATTTCATCTCTCTTGTGGGGAGCTGTC
SEQ ID NO:53[PCT SEQ ID NO:121]
生物体：Li
TIF
真核翻译起始因子3亚单位I样(TIF)
翻译起始
意蜂XM_392780
ATGAAACCTTTAATGTTGCACGGGCACGAGCGTGCCATTACAAAAATTAAGTATAACAGAGAAGGAGATTTACTGTTTTCAGCCAGTAAAGACAAACAGCCTAATGTATGGTACTCTCTCAATGGTGAAAGATTGGGTACATTCAATGGCCACAACGGTTCAGTTTGGTGCATTGACGTCAATTGGGATACTACACGCTTCCTTTCTGGCAGTGGTGACAACACACTGAGAATATGGGATTGTCAAACAGGCAAAGAAATAAGCCAGTTGTCAACCAACAGTTCTGTAAGAGCTTGCGCTTTCAGTTACTCTGGTAACCTTGCTGTTTATGCAACTGACAAAGCTCTTGGTCATCAGTGTGAAATGTTCATTATTGATATTAGGACTCCTGAAAGTGTACTTTCTCAGGAAGATAATGTCTGCAGAACTATGATCGGTGGTTCCAGGATCTCATCTCTCCTTTGGGGAGCTCTTGATGAAACCATCATAACTGGTCATGAGAATGGTGACTTGACCATTTGGGATAGTAGGACTGGAAAGAAATTGAGCGACGCTCAGGGACACAAAGGTCAAATAAATGATATGCAGTTCAACAAAGATGCCACTATGTTTTGCACTGCCTCCAAAGATCACACTGCTAAATTATTTGACAGCGAATCTCTAGTTTCACTAAAAACTTACAAAACTGAGCGGCCCGTTAACTCGGCTACGATTTCTCCAATCTTTGATCATGTCGTTGTTGGAGGTGGTCAAGATGCCATGGATGTAACAACGACGTCGACGAAACAAGGAAAATTCGACGCTCGTTTTTATCATCTCGTCTTTGAAGAAGAATTTGCACGTTTAAAGGGCCATTTCGGCCCCATCAACTCATTATCCTTCCACCCGAACGGCAGAAGCTTAGCCACTGGAGGAGAGGACGGTTACATTCGTATCAAC
SEQ ID NO:54[PCT SEQ ID NO:128]
生物体：Li
SEQ ID NO:53核苷酸840-939(70)
ACGTTTAAAGGGCCATTTCGGCCCCATCAACTCATTATCCTTCCACCCGAACGGCAGAAGCTTAGCCACTGGAGGAGAGGACGGTTACATTCGTATCAAC
SEQ ID NO:55
沉默构建体#1,Om三基因构建体
ATGAGCTTCTTCACGAAGGTCTTCGGCGGGAAGAAGGAGGCGGCTGCTCCGACGACCTCGGAGGCCATACAGAAACTACGCGAGACGGAGGAGATGCTCAATCGACACTTATCGTTTGAACCCAACAGAGTACATCACGTCAACAGCGTGCAGGCGAAATTTGGCTGGTGATGTTTGTGCGATAATGCGCGTACATGCTTTGACATTAGGTCTCCTGAAAGTGTTCTTTCTCAAGATGATAACGTTTGTAGAACTTCAGTCAGTGGTTCAAGGATTTCATCTCTCTTGTGGGGAGCTGTCGGCTCGAACGAGCCGACTAATTGTCTTTAAACGCGCGATATAAGCGCACAATGCTCGAGAAACGATAAACTCTATCGCTCTGTCGCGTGCGTGGCATCTTCGCGCGGACAGCTCCCCACAAGAGAGATGAAATCCTTGAACCACTGACTGAAGTTCTACAAACGTTATCATCTTGAGAAAGAACACTTTCAGGAGACCTAATGTCAAAGCATGTACGCGCATTATCGCACAAACATCACCAGCCAAATTTCGCCTGCACGCTGTTGACGTGATGTACTCTGTTGGGTTCAAACGATAAGTGTCGATTGAGCATCTCCTCCGTCTCGCGTAGTTTCTGTATGGCCTCCGAGGTCGTCGGAGCAGCCGCCTCCTTCTTCCCGCCGAAGACCTTCGTGAAGAAGCTCAT
SEQ ID NO:56
沉默构建体#2,Li三基因构建体
GCCGACCGCCCTAACGACCGCCGAGGCGATACAAAAACTCCGAGAGACCGAGGAGATGCTCATCAAGAAACAGGACTTCCTTGAGACCAAGATCACACAGAGAGGCGACGGCAGCAAGAGCGATGAGCCCGAGGATAACGTGACCGAGCAGACTCATCACATTGTGATTCCGAGCTACTCGGCGTGGTTTGACTACAACTACGTTTAAAGGGCCATTTCGGCCCCATCAACTCATTATCCTTCCACCCGAACGGCAGAAGCTTAGCCACTGGAGGAGAGGACGGTTACATTCGTATCAACGGCTCGAACGAGCCGACTAATTGTCTTTAAACGCGCGATATAAGCGCACAATGCTCGAGAAACGATAAACTCTATCGCTCTGTCGCGTGCGTGGCATCTTCGCGCGGTTGATACGAATGTAACCGTCCTCTCCTCCAGTGGCTAAGCTTCTGCCGTTCGGGTGGAAGGATAATGAGTTGATGGGGCCGAAATGGCCCTTTAAACGTAGTTGTAGTCAAACCACGCCGAGTAGCTCGGAATCACAATGTGATGAGTCTGCTCGGTCACGTTATCCTCGGGCTCATCGCTCTTGCTGCCGTCGCCTCTCTGTGTGATCTTGGTCTCAAGGAAGTCCTGTTTCTTGATGAGCATCTCCTCGGTCTCTCGGAGTTTTTGTATCGCCTCGGCGGTCGTTAGGGCGGTCGGC
SEQ ID NO:57
P1-CaMV 35S启动子及ΩUTR
AGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGCAATAATCTCCAGGAAATCAAATACCTTCCCAAGAAGGTTAAAGATGCAGTCAAAAGATTCAGGACTAACTGCATCAAGAACACAGAGAAAGATATATTTCTCAAGATCAGAAGTACTATTCCAGTATGGACGATTCAAGGCTTGCTTCACAAACCAAGGCAAGTAATAGAGATTGGAGTCTCTAAAAAGGTAGTTCCCACTGAATCAAAGGCCATGGAGTCAAAGATTCAAATAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGTAAAGACTGGCGAACAGTTCATACAGAGTCTCTTACGACTCAATGACAAGAAGAAAATCTTCGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACGGGGGACTCTAGATATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACA
SEQ ID NO:58
sgFIMV启动子
TTTACAGTAAGAACTGATAACAAAAATTTTACTTATTTCCTTAGAATTAATCTTAAAGGTGATAGTAAACAAGGACGATTAGTCCGTTGGCAAAATTGGTTCAGCAAGTATCAATTTGATGTCGAACATCTTGAAGGTGTAAAAAACGTTTTAGCAGATTGCCTCACGAGAGATTTTAATGCTTAAAAACGTAAGCGCTGACGTATGATTTCAAAAAACGCAGCTATAAAAGAAGCCCTCCAGCTTCAAAGTTTTCATCAACACAAATTCTAAAAACAAAATTTTTTAGAGAGGGGGAGTG
SEQ ID NO:59
AtActin7终止子，含3’UTR
GTGTGTCTTGTCTTATCTGGTTCGTGGTGGTGAGTTTGTTACAAAAAAATCTATTTTCCCTAGTTGAGATGGGAATTGAACTATCTGTTGTTATGTGGATTTTATTTTCTTTTTTCTCTTTAGAACCTTATGGTTGTGTCAAGAAGTCTTGTGTACTTTAGTTTTATATCTCTGTTTTATCTCTTCTATTTTCTTTAGGATGCTTGTGATGATGCTGTTTTTTTTTGTCCCTAAGCAAAAAAATATCATATTATATTTGGTCCTTGGTTCATTTTTTTGGTTTTTTTTTGTCTTCACATATAAATATTGTTTGAATGTCTTCAATCTTTTATTTGTATGAGACAATTATTTAAGTATCGGGTGACAATGCAGCTATTATGTATTGTCGATTGTTATATTGGCGCCCAAAATATATACTTAGCCTAAGAATTTGGTAAGTGAGTGGCTTATGTTTTACTCCAGCAAAAATTGTGTGTGTATTACCATTCTGATGCGAAACAAGAAAAGAATTTGATCTAAGAAACCAAGTTTATTCACTAGTTAAAAAACAAATGACCTAATGTAATCGACTCCACATATCAAAATACGTAAAACAAACATTGTATGTTGACAAAAGGGAAAAGAAATGATTTATTTGGTTAAAAAGAAAGCTGGATTCAATTGCAACAGTTTAGTCGAAATCATTTTGAAAGGCTTACAATGGATTGAATGTGAATATTCCATTAAGCCGCTTCTGTCTACACAGAATGTTACGCTTGGAGAGCAGCAATCATTTTCACGTTTTTATCTTTTTAGGTGGACATGTATATTATTGGTTACGCCTTTGGAGTTTTTCGAAATTTATTTCTTTCAAATCACAAGATGACTAAACATCACAATCTGTTTATCTTCCTAACTAGTTAAATTTTTGTCCCCACCATT
SEQ ID NO:60
NOS终止子
GATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATC
SEQ ID NO:61
环序列
GGCTCGAACGAGCCGACTAATTGTCTTTAAACGCGCGATATAAGCGCACAATGCTCGAGAAACGATAAACTCTATCGCTCTGTCGCGTGCGTGGCATCTTCGCGCG
SEQ ID NO:62
正义转录本构建体#1
ATGAGCTTCTTCACGAAGGTCTTCGGCGGGAAGAAGGAGGCGGCTGCTCCGACGACCTCGGAGGCCATACAGAAACTACGCGAGACGGAGGAGATGCTCAATCGACACTTATCGTTTGAACCCAACAGAGTACATCACGTCAACAGCGTGCAGGCGAAATTTGGCTGGTGATGTTTGTGCGATAATGCGCGTACATGCTTTGACATTAGGTCTCCTGAAAGTGTTCTTTCTCAAGATGATAACGTTTGTAGAACTTCAGTCAGTGGTTCAAGGATTTCATCTCTCTTGTGGGGAGCTGTC
SEQ ID NO:63
正义转录本构建体#2
GCCGACCGCCCTAACGACCGCCGAGGCGATACAAAAACTCCGAGAGACCGAGGAGATGCTCATCAAGAAACAGGACTTCCTTGAGACCAAGATCACACAGAGAGGCGACGGCAGCAAGAGCGATGAGCCCGAGGATAACGTGACCGAGCAGACTCATCACATTGTGATTCCGAGCTACTCGGCGTGGTTTGACTACAACTACGTTTAAAGGGCCATTTCGGCCCCATCAACTCATTATCCTTCCACCCGAACGGCAGAAGCTTAGCCACTGGAGGAGAGGACGGTTACATTCGTATCAAC
SEQ ID NO:64
hpRNA构建体#3,Om单基因构建体
ATGAGCTTCTTCACGAAGGTCTTCGGCGGGAAGAAGGAGGCGGCTGCTCCGACGACCTCGGAGGCCATACAGAAACTACGCGAGACGGAGGAGATGCTCAGGCTCGAACGAGCCGACTAATTGTCTTTAAACGCGCGATATAAGCGCACAATGCTCGAGAAACGATAAACTCTATCGCTCTGTCGCGTGCGTGGCATCTTCGCGCGTGAGCATCTCCTCCGTCTCGCGTAGTTTCTGTATGGCCTCCGAGGTCGTCGGAGCAGCCGCCTCCTTCTTCCCGCCGAAGACCTTCGTGAAGAAGCTCAT
SEQ ID NO:65
hpRNA构建体#4,Om双基因构建体
ATGAGCTTCTTCACGAAGGTCTTCGGCGGGAAGAAGGAGGCGGCTGCTCCGACGACCTCGGAGGCCATACAGAAACTACGCGAGACGGAGGAGATGCTCAAATGTATTGCTGACATTGTTTCACTCTTCATAACATTAATGGATAAGTTACGACTTGAAATTAAAGCTATGGATCAACTTCATCCAGATCTTAGAGATTTGGCTCGAACGAGCCGACTAATTGTCTTTAAACGCGCGATATAAGCGCACAATGCTCGAGAAACGATAAACTCTATCGCTCTGTCGCGTGCGTGGCATCTTCGCGCGAAATCTCTAAGATCTGGATGAAGTTGATCCATAGCTTTAATTTCAAGTCGTAACTTATCCATTAATGTTATGAAGAGTGAAACAATGTCAGCAATACATTTGAGCATCTCCTCCGTCTCGCGTAGTTTCTGTATGGCCTCCGAGGTCGTCGGAGCAGCCGCCTCCTTCTTCCCGCCGAAGACCTTCGTGAAGAAGCTCAT
SEQ ID NO:66
正义转录本构建体#4,Om双基因构建体
ATGAGCTTCTTCACGAAGGTCTTCGGCGGGAAGAAGGAGGCGGCTGCTCCGACGACCTCGGAGGCCATACAGAAACTACGCGAGACGGAGGAGATGCTCAAATGTATTGCTGACATTGTTTCACTCTTCATAACATTAATGGATAAGTTACGACTTGAAATTAAAGCTATGGATCAACTTCATCCAGATCTTAGAGATTT
SEQ ID NO:67
hpRNA构建体#5,Li单基因构建体
GCCGACCGCCCTAACGACCGCCGAGGCGATACAAAAACTCCGAGAGACCGAGGAGATGCTCATCAAGAAACAGGACTTCCTTGAGACCAAGATCACACAGGGCTCGAACGAGCCGACTAATTGTCTTTAAACGCGCGATATAAGCGCACAATGCTCGAGAAACGATAAACTCTATCGCTCTGTCGCGTGCGTGGCATCTTCGCGCGCTGTGTGATCTTGGTCTCAAGGAAGTCCTGTTTCTTGATGAGCATCTCCTCGGTCTCTCGGAGTTTTTGTATCGCCTCGGCGGTCGTTAGGGCGGTCGGC
SEQ ID NO:68
hpRNA构建体#6,Li双基因构建体
GCCGACCGCCCTAACGACCGCCGAGGCGATACAAAAACTCCGAGAGACCGAGGAGATGCTCATCAAGAAACAGGACTTCCTTGAGACCAAGATCACACAGGATCAACTTCACCCAGATCTCAGAGATTTAATGGATACCATGAACAGACTCAGTATACTGCCAAGTGACTTTGATGGAAAACAGAAGGTTGCGGAGTGGCGGCTCGAACGAGCCGACTAATTGTCTTTAAACGCGCGATATAAGCGCACAATGCTCGAGAAACGATAAACTCTATCGCTCTGTCGCGTGCGTGGCATCTTCGCGCGGCCACTCCGCAACCTTCTGTTTTCCATCAAAGTCACTTGGCAGTATACTGAGTCTGTTCATGGTATCCATTAAATCTCTGAGATCTGGGTGAAGTTGATCCTGTGTGATCTTGGTCTCAAGGAAGTCCTGTTTCTTGATGAGCATCTCCTCGGTCTCTCGGAGTTTTTGTATCGCCTCGGCGGTCGTTAGGGCGGTCGGC
SEQ ID NO:69
正义转录本构建体#6,Li双基因构建体
GCCGACCGCCCTAACGACCGCCGAGGCGATACAAAAACTCCGAGAGACCGAGGAGATGCTCATCAAGAAACAGGACTTCCTTGAGACCAAGATCACACAGGATCAACTTCACCCAGATCTCAGAGATTTAATGGATACCATGAACAGACTCAGTATACTGCCAAGTGACTTTGATGGAAAACAGAAGGTTGCGGAGTGGC

Claims (35)

1.一种分离的双链核糖核酸分子(dsRNA)，其包含与SEQ ID NO:1-46和70-74所列出的至少17个邻接核苷酸实质上同一的第一链核苷酸和与所述第一链核苷酸实质上互补的第二链核苷酸的单元。
2.根据权利要求1所述的分离的dsRNA，其中所述第一链核苷酸与SEQID NO:1-46和70-74所列出的至少17个邻接核苷酸实质上同一。
3.根据权利要求1或2所述的dsRNA，其中所述第一链和第二链核苷酸的长度为至少约25、35、50、70或100个核苷酸。
4.根据权利要求1-3任一项所述的dsRNA，其中所述第一链和第二链核苷酸在遍及其各自的长度上与SEQ ID NO:1-46和70-74的同一性为70-100％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的dsRNA，其中所述第一链和第二链核苷酸与所述第一链和第二链核苷酸的蜜蜂直向同源物的序列的同一性小于约80％。
6.根据权利要求1-5任一项所述的dsRNA，其包含至少两个所述单元。
7.根据权利要求6所述的dsRNA，其中所述至少两个单元源自选自由SEQ ID NO:1-46和70-74组成的组的不同序列。
8.根据权利要求1-7任一项所述的dsRNA，其进一步包含分隔所述第一链和所述第二链核苷酸的环区域。
9.一种载体，其包含可操作地连接至作为权利要求1-8任一项所述的一条链或两条链的模板的核苷酸序列的表达调控序列。
10.一种宿主细胞，其包含根据权利要求9所述的表达载体。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中所述宿主为细菌细胞或酵母细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述宿主为农杆菌属菌。
13.一种植物组织，其由根据权利要求12所述的宿主细胞转化。
14.一种植物组织，其包含根据权利要求1-8任一项所述的dsRNA或根据权利要求9所述的载体。
15.一种分离的核酸，其包含在高严格杂交条件下与选自由SEQ ID NO:1-46和70-74组成的组的序列及其互补序列选择性杂交的序列。
16.根据权利要求15所述的分离的核酸，其中所述核酸与所述选自由SEQ ID NO:1-46和70-74组成的组的序列及其互补序列的同一性为90-99.99％。
17.根据权利要求15或16所述的分离的核酸，其中所述核酸包含选自由SEQ ID NO:1-46和70-74组成的组的序列及其互补序列的至少17个邻接核苷酸。
18.根据权利要求17所述的分离的核酸，其中所述核酸包含选自由SEQID NO:1-46和70-74组成的组的序列及其互补序列的至少25个邻接核苷酸。
19.根据权利要求15-18任一项所述的分离的核酸，其中所述核酸与所述核酸的蜜蜂直向同源物的同一性小于约80％。
20.一种载体，其包含可操作地连接至表达调控序列的根据权利要求15-19任一项所述的分离的核酸。
21.一种宿主细胞，其包含根据权利要求20所述的载体。
22.一种植物组织，其包含根据权利要求20所述的载体。
23.根据权利要求22所述的植物组织，其中所述组织选自由叶组织、叶脉、韧皮部、木质部、叶柄、分枝、主枝、花、干、果实和种子组成的组。
24.一种分离的小的抑制性核糖核酸分子(siRNA)，其抑制编码多泡体亚单位12B样(Dmel)、NADH脱氢酶[泛醌]铁硫蛋白7(Vps23)、液泡蛋白分选相关蛋白28同系物(Vps28)、液泡蛋白分选相关蛋白37A样(Vps37/mod-r)、液泡蛋白分选相关蛋白37B样(Vps37b)、液泡分选蛋白SNF8样(Vps22/Isn)、液泡蛋白分选相关蛋白25样(Vps25)、液泡蛋白分选相关蛋白36(Vps36)、带电多泡体蛋白2a样(Vps2)、带电多泡体蛋白6样(Vps20)、带电多泡体蛋白3样(Vps24)或带电多泡体蛋白4b样(Snf7/shrub)的桉树枝瘿姬小蜂或桉干瘿姬小蜂核酸分子的表达。
25.一种生产抗害虫植物的方法，其包含在所述植物中表达根据权利要求1-8任一项所述的dsRNA或增殖所述植物的生殖材料。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述植物为桉树。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述害虫为瘿蜂。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述害虫为桉树枝瘿姬小蜂或桉干瘿姬小蜂。
29.一种抑制害虫侵扰的方法，其包含培养含有根据权利要求1-8任一项所述的dsRNA的植物，以抑制所述侵扰。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述植物为桉树。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述害虫为桉树枝瘿姬小蜂或桉干瘿姬小蜂。
32.一种生产抗植物病原害虫的植物的方法，其包含：
(a)用表达根据权利要求1-8任一项所述的dsRNA的重组DNA构建体或构建体的组合来转化植物细胞；
(b)由所述转化的植物细胞来再生植物；和
(c)在适于所述重组DNA构建体转录的条件下使所述转化的植物细胞生长，
由此，所述生长的转化植物与未转化植物相比抗所述害虫。
33.根据权利要求32所述的方法，其进一步包含用重组DNA构建体转化所述植物细胞，所述重组DNA构建体表达与所述dsRNA的一条链或其片段互补的单链RNA。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述植物为桉树。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述害虫为桉树枝瘿姬小蜂或桉干瘿姬小蜂。
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