CN104894261B - 一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的试剂盒,属于生物技术领域。一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的VEGF‑A基因第6内含子rs142961510GA/‑位点的基因型，预测受试者对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的疗效。本发明可以通过测定与AMD相关基因VEGF‑A的多态性预测受试者对于雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的易感性，该方法可用于指导年龄相关性黄斑变性雷珠单抗的个体化治疗。

Description

一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的试剂盒，更具体的说是通过测定与AMD相关基因VEGF-A的多态性预测受试者对于雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的易感性，该方法可用于指导年龄相关性黄斑变性雷珠单抗的个体化治疗，属于生物技术领域。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD)是西方50岁以上人群致盲的首要原因，研究发现AMD可能与紫外线照射、微量元素缺乏等有关，但具体病因仍不清楚。国内的调查显示，年龄相关性黄斑变性发病率为15.5％，其发病率随着年龄的增加而增加。随着人口老龄化的到来，年龄相关性黄斑变性已经成为我国老年人致盲的首要原因。主要表现是患者视物变形、视力下降、眼前黑影遮挡，眼底表现是出血、渗出，严重者视力完全丧失，进而严重危害老年人的生活质量。

AMD属多基因疾病，具有明显的遗传倾向，虽然通常认为遗传与环境因素在AMD发病中起主导作用，但确切的病因与发病机制仍不清楚。

研究发现，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是导致年龄相关性黄斑变性(AMD)脉络膜新生血管(CNV)形成的关键因子，抗VEGF药物雷珠单抗能够结合血管内皮生长因子A(VEGF-A)所有亚型，有效抑制CNV的生长及渗漏，但仍有25.8％患者治疗后最终视力低于基线视力。

目前进行AMD遗传病因研究，多采用SNP作为基因组标志的关联分析方法，是有效的。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1％，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1％为同型碱基之间的转换：如G/A或T/C，29.1％为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶)，SNP包含了已知多态性的80-90％，是最常见的遗传变异。

由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNP以其密度高(平均每1kb就有1个)、代表性强(位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNP在人群中多为双等位基因标记，可简单以“+/－或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。

目前国外多选取wAMD易感基因研究其与雷珠单抗疗效的相关性。有报道研究药物治疗的靶基因及其通路VEGF及VEGFR变异与雷珠单抗疗效的相关性，但结论不一致。目前尚无任何关于VEGF-A基因rs142961510GA/-位点与雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效相关的研究结果。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的方法。

本发明的第二个目的是提供一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的VEGF-A基因第6内含子rs142961510GA/-位点的基因型，预测受试者对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的疗效；VEGF-A基因第6内含子区rs142961510GA/-位点的基因型为GA/-时，受试者对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的疗效较差；携带GA等位基因时，受试者对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的疗效较好。

本发明提供了一种分离核酸，具有Seq ID NO.1所示的碱基序列，其+401位即是变异位点，以字母“GA/-”标示出。该核酸序列为VEGF-A基因全长序列。图1为VEGF-A基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有7个外显子，rs142961510GA/-位点标在VEGF-A基因图中第6内含子区的相应位置。

本发明提供了一组检测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的特异性引物，具有SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的碱基序列，长度均为20bp，而且可以特异性地扩增出包含有Seq ID NO.1所示序列中+401位置的产物。

本发明提供了一种检测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增VEGF-A基因+401位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分、含量、来源和使用方法如下：

一种检测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的诊断试剂盒，含有SEQ IDNo.2和SEQ ID No.3所示的特异性引物。

一种检测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的诊断试剂盒，由以下试剂组成：

30μL 10×PCR缓冲液；

5μL浓度为10mM的dNTP混合液；

5μL浓度为2U/μL的TaqDNA聚合酶；

2.5μL浓度为10pM/μL的F1引物；

2.5μL浓度为10pM/μL的R1引物；

235μL纯水。

所述F1引物具有SEQ ID No.2所示的碱基序列；R1引物具有SEQ ID No.3所示的碱基序列。

使用方法：

1)PCR扩增：通过PCR扩增VEGF-A基因的第6内含子区部分片段，制备混合液：10×PCR反应缓冲液3μL，10mM/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，10pM/L上游引物0.5μL，10pM/L下游引物0.5μL，基因组DNA 2μL，加纯水至30μL。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸25s，总共35个循环，72℃总延伸2min。PCR前于每一体系中加入20μL的石蜡油，以防止液体挥发。

2)基因型判定：将PCR产物直接测序，根据荧光信号的差异判定基因型。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品来源无限制，如：体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含VEGF-A基因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含VEGF-A基因变异点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。

在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据VEGF-A基因的突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定VEGF-A基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。

本发明的优点是：本发明首次阐明了VEGF-A基因多态性位点与雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效相关性，提供了一种预测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的方法和试剂盒，该方法可用于指导年龄相关性黄斑变性雷珠单抗的个体化治疗。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以便公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为VEGF-A基因结构及其多态性变异位点rs142961510GA/-的示意图

图2为VEGF-A基因变异位点的测序图

具体实施方式

用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下：

10×PCR缓冲液：10mM Tris-HCL(pH＝8.3)，0.5M氯化钾(KCL)，10mM氯化镁(MgCL)，0.01％(W/V)白明胶

dNTP：脱氧核苷三磷酸

EDTA：乙二胺四乙酸

TE：10mM Tris-HCI(pH＝7.5)，1mM EDTA(pH＝8.0)

实施例1：血液样本收集和基因组DNA的提取

1、按纽约1984年的修订诊断标准入选病例，共选取来自北京地区无血缘关系的AMD患者，其中将雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效较好的患者55例作为病例组(年龄：55-80岁，平均71岁)，雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效较差的患者60例作为对照组(年龄：56-82岁，平均72岁)。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到北京医院，北京老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》：人体医学研究的伦理原则。

2、根据下列方法，制备人基因组DNA。①首先在已标号的1.5mLEP管中加1000μL红细胞裂解液，后加入400μLEDTA抗凝血(抗凝血加入前颠倒混匀3-5次)，颠倒混匀，室温静置10分钟；②13000rpm离心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480μL核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20μL蛋白酶K(用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K)，颠倒混匀，65℃孵箱10分钟，(期间不时上下混匀，确保无凝块)；④拿出后降至室温，加300μL蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；⑤将上清液移至新EP管中，加入670μL预冷的异丙醇，充分颠倒混匀(10次以上)，可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；⑥弃上清液并确保沉淀留在EP管中，加入670μL70％乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；⑦弃上清，使管内乙醇挥发干净；⑧加入TE溶液(400μL)，充分溶解，对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/μL，置于4℃备用，剩余基因组DNA置-20℃冰箱保存。

实施例2：变异位点的识别鉴定

本发明采用PCR-测序分析法对VEGF-A基因的第6内含子区的+401位点(其等位位点为G/A)的基因型进行检测。图2为VEGF-A基因变异位点的测序图。

1、PCR-测序引物的确定

从Genebank中查取rs142961510GA/-附近的DNA碱基序列(Seq ID№1)，引物设计在Oligo7.0软件下完成。目的片段定位在VEGF-A基因第6内含子区，全长806bp，确定了正义链F1(+291bp-+310bp)与反义链R1(+473bp-+492bp)，特异性引物序列如下：

F1：5’-AAAACACAGACTCGCGTTGC-3’(Seq ID NO.2)

R1：5’-AGTTTCTAGCTGCCTGCCTG-3’(Seq ID NO.3)

2、PCR-测序反应体系及条件

通过PCR扩增VEGF-A基因第6内含子区部分片段，PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液3μL，10mM/LdNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，10pM/L上游引物0.5μL，10pM/L下游引物0.5μL，基因组DNA 1μL，加去离子水至30μL。PCR时于每一体系中加入20μL石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸25s，总共35个循环，72℃总延伸2min。

3、测序判定基因型

PCR产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后送华大基因测序部进行测序验证。结果如图2所示。

实施例3：基因SNP与AMD的相关性

统计方法：运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。利用SPSS17.0软件中Pearson卡方检验计算VEGF-A基因rs142961510GA/-位点的等位基因、基因型在雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效病例组与正常对照组间的分布频率，雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的风险OR值及其95％CI可信区间，以P<0.05为差异显著性标准。

结果：位于6p12区域的VEGF-A基因上rs142961510GA/-位点的基因型和等位基因频率在病例与对照组间的分布详见表1。

表1 VEGF-A(rs142961510GA/-)位点的基因型和等位基因频率在病例对照组间的分布

注：OR：比值比；CI：可信区间。*GA等位基因为雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的风险等位基因。受试者分为雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的风险等位基因(GA/-)携带者，和非风险等位基因(GA/GA)携带者。

由表2可见，VEGF-A(rs142961510GA/-位点)的GA/-等位基因，即等位基因GA杂合缺失，在雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效较好的患者群体中的分布频率显著高于其在健康正常人群中的等位基因分布频率(0.182vs.0.033)，具有显著性差异(P＝0.000)，而且GA/-位点的OR值为5.900，95％CI：1.263-27.559；在雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的风险等位基因(GA/-)携带者和非风险等位基因(GA/GA)携带者中，风险基因型在病例组中的分布频率显著高于对照组中的(P＜0.05)，均表明VEGF-A基因rs142961510GA/-位点位点与雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效呈负相关。

实施例4检测试剂盒

制备检测AMD相关风险的试剂盒，包含有可扩增出VEGF-A基因SNP+401位点的引物对，及其他PCR-HRM相应试剂。本发明试剂盒供10人份检测应用，于-20℃避光保存，其组分、含量和来源包括：

30μL 10×PCR缓冲液(Pharmacia),

5μL 10mMdNTP混合液(Pharmacia),

5μL TaqDNA聚合酶(2U/μL)(Takara)

2.5μL F1(SEQ ID NO.2)(10pM/μL)

2.5μL R1(SEQ ID NO.3)(10pM/μL)引物，

235μL纯水。

经PCR-测序检测后，可轻易检测出VEGF-A基因第6内含子区rs142961510GA/-多态性。VEGF-A基因第6内含子区rs142961510GA/-位点的基因型为GA/-时，受试者对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的疗效较差；携带GA等位基因时，受试者对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性的疗效较好。

本发明具有实用性的例证：

本发明的VEGF-A基因多态性的检测方法可用于分析人常染色体6p12区的VEGF-A基因上的罕见变异位点的GA/-等位基因缺失，应用于对雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的辅助性诊断，以利于开展AMD的雷珠单抗的个体化治疗。

本发明建立的检测VEGF-A基因多态性的核酸序列和雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效相关位点，可高灵敏度，特异性的应用于雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效基因辅助诊断的试剂盒。

如上所述，得出结论，VEGF-A基因rs142961510GA/-位点的多态性与雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效具显著相关性。因此，根据本发明测定此多态性，可用于雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的基因辅助诊断。

本发明叙述了VEGF-A基因雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效相关的新突变位点，并提供了一种测定VEGF-A基因多态性的方法，而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效相关基因多态性的基因辅助诊断方法。

Claims (2)

1.序列为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的碱基序列的引物对在制备检测雷珠单抗治疗年龄相关性黄斑变性疗效的试剂盒的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述试剂盒由以下试剂组成：

30μL 10×PCR缓冲液；

5μL浓度为10mM的dNTP混合液；

5μL浓度为2U/μL的TaqDNA聚合酶；

2.5μL浓度为10pM/μL的F1引物；

2.5μL浓度为10pM/μL的R1引物；

235μL纯水；

所述F1引物序列为SEQ ID No.2所示的碱基序列；R1引物序列为SEQ ID No.3所示的碱基序列。

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