CN104894077A - 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素p450还原酶及其应用 - Google Patents
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素p450还原酶及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶及其应用。本发明首次揭示了人参来源的NADPH-细胞色素P450还原酶，其具有良好的辅酶特性，可协助细胞色素P450发挥催化活性，促进底物达玛烯二醇生成原人参二醇。本发明还揭示了编码所述NADPH-细胞色素P450还原酶的多核苷酸，表达所述NADPH细胞色素P450还原酶的表达载体及宿主细胞，以及生产原人参二醇的方法。应用人参来源的NADPH-细胞色素P450还原酶，可显著提高原人参二醇的生产效率，进而提高人参皂苷生物合成产量。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和植物生物学领域；更具体地，本发明涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶及其应用。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶(EC1.6.2.4Cytochrome P450 Reductase，CPR)是细胞色素P450(CYP)催化体系中重要的组成部分。细胞色素P450催化的氧化还原反应中需要电子(还原力)的供应，NADPH-细胞色素P450还原酶可以通过从电子供体获得电子后传递给CYP，为CYP所催化的反应提供还原力。如果没有CPR的存在时，CYP对底物就没有催化活性。NADPH-细胞色素P450还原酶属于核黄素蛋白家族，是一种膜蛋白并具有与辅酶FMN，FAD和NADPH结合的保守结构域。
由于CPR的结构域进化上非常稳定，因此在研究细胞色素P450的催化活性时，如果没有对应物种的CPR，通常会使用来源于其他物种的CPR代替。但是，两个酶来源的物种亲缘关系较远，则催化效率会明显降低。例如在丹参酮合成的例子中，使用来源于拟南芥的CPR(ATR1)促进丹参合成中的P450酶CYP76AH1作用，丹参酮的前体铁锈醇(ferruginol)的产量为2.1mg/L，而使用丹参自身来源的CPR(smCPR1)与丹参合成中的P450酶CYP76AH1协同作用能显著提高铁锈醇的产量至10.5mg/L。相比于已经报道的数量庞大的CYP(1万多个)而言，目前仅有不到100个CPR被鉴定，多数CYP并未有与其相对应的CPR协同作用。因此从同一物种或者亲缘关系较近的物种中克隆CPR会给CYP提供更合适的CPR，使这些CYP能更有效的发挥作用。
人参(Panax ginseng C.A.Mey.)中的主要活性物质人参皂苷的合成途径中需要两个CYP(CYP716A47和CYP716A53v2)的作用，CYP716A47可对达玛烯二醇(dammarenediol-II Dm)进行羟基化修饰合成原人参二醇(protopanaxadiolPPD)，而CYP716A53v2可对PPD进行羟基化修饰合成原人参三醇(protopanaxatriol PPT)，原人参二醇和原人参三醇是各种人参皂苷合成的前体，通过多种糖基转移酶(UDP-glycosyltransferase)进行糖基化修饰后合成多种具有不同生物活性的人参皂苷。虽然目前这个两个CYP基因已经被克隆和鉴定，但是尚无人参中的NADPH-细胞色素P450还原酶被克隆。以往的研究中这两个CYP所需的CPR都是用来源于拟南芥的CPR(ATR1、ATR2-1)等来代替。虽然与拟南芥来源的CPR配合，这些人参来源的CYP也具有催化活性，但由于拟南芥与人参的亲缘关系较远，其催化活性还有待提高。因此，本领域有必要开发更为适用的NADPH-细胞色素P450还原酶。
发明内容
本发明的目的在于提供烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶及其应用。
在本发明的第一方面，提供分离的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶，所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24任一所示的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％)序列相同性，且具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶活性的由(a)衍生的多肽。
在一个优选例中，所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶活性是指传递电子给细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)酶并协助CYP进行对底物的氧化修饰；例如，对植物的小分子代谢产物进行氧化修饰。
在另一优选例中，所述的植物小分子代谢产物为人参的次生代谢产物(如达玛烯二醇或者原人参二醇)。
在另一优选例中，所述的序列(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。
在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，该多核苷酸是编码所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的多核苷酸。
在一个优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO.:25所示。
在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，它含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；所述的真菌细胞包括酵母细胞。
在本发明的另一方面，提供所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶。
在本发明的另一方面，提供所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的用途，用于传递电子给细胞色素P450酶并协助细胞色素P450酶进行对底物的氧化修饰。
在另一优选例中，所述的细胞色素P450酶是CYP716A47或CYP716A53v2；或所述的底物是达玛烯二醇。
在本发明的另一方面，提供一种表达构建物，所述表达构建物包括以下酶的基因表达盒：
所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶；和
细胞色素P450还原酶。
在另一优选例中，所述的表达构建物还包括：达玛烯二醇合成酶(Dammarenediol II Synthase；DDS)的表达盒。
在另一优选例中，当转化酵母细胞时，所述的表达构建物中，在所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的基因表达盒中，以酵母启动子、较佳地为酿酒酵母启动子TEF2作为启动子，以酵母终止子、较佳地为酿酒酵母终止子TPI1作为终止子。
在另一优选例中，所述的表达构建物是表达载体。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞中包括所述的表达构建物。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；较佳地，所述的宿主细胞是包含有细胞色素P450酶的底物的细胞；较佳地，所述的宿主细胞是内源存在达玛烯二醇或其前体的细胞；更佳地，所述的宿主细胞是酵母细胞。
在本发明的另一方面，提供所述的表达构建物的用途，用于生产原人参二醇。
在本发明的另一方面，提供一种生产原人参二醇的方法，所述方法包括：利用所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶作为辅酶，促进细胞色素P450酶催化达玛烯二醇生成原人参二醇。
在一个优选例中，所述方法包括：以所述的表达构建物转化宿主细胞，利用转化的宿主细胞催化达玛烯二醇生成原人参二醇；所述的宿主细胞是原核细胞和或真核细胞；常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；较佳地，该宿主细胞是真菌细胞；所述的真菌细胞包括酵母细胞。
在另一优选例中，所述方法包括：以所述的表达构建物转化宿主细胞，培养转化的酵母细胞，生成原人参二醇；该宿主细胞是包含有细胞色素P450酶的底物的细胞；较佳地，该宿主细胞是内源存在达玛烯二醇或其前体的细胞；更佳地，该宿主细胞是酵母细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1、两对引物SEQ ID NO:3/4和SEQ ID NO:5/6的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
图2、重组酿酒酵母BY-CYP-CPR1(图中“1”)、BY-CYP-CPR2(图中“2”)、对照BY-CYP(图中“空白对照”)体外催化反应的产物的HPLC图。
图3、重组酿酒酵母BYCPR1和BYCPR2发酵产物的HPLC图。
图4、重组酿酒酵母BYCPR1，BYCPR2和BYCPR1C发酵生产原人参二醇的产量的柱形图。
具体实施方式
本发明首次揭示了人参来源的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶，其具有良好的辅酶特性，可协助细胞色素P450(CYP)发挥催化活性，促进底物达玛烯二醇生成原人参二醇。本发明还揭示了编码所述NADPH-细胞色素P450还原酶的多核苷酸，表达所述NADPH细胞色素P450还原酶的表达载体及宿主细胞，以及还揭示了生产原人参二醇的方法。本发明应用人参来源的NADPH-细胞色素P450还原酶，可显著提高原人参二醇的生产效率，进而提高人参皂苷生物合成产量。本发明还可以为与人参亲缘关系比较近的植物(例如五加科的植物)中的细胞色素P450提供更合适的还原酶。
如本文所用，所述的“基因表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等；这些元件是操作性相连的。
如本文所用，所述的“可操作地连接(相连)”或“操作性连接(相连)”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“表达构建物”是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，其可以包含一个或多个基因表达盒。所述的“构建物”通常被包含在表达载体中。
酶
本发明中揭示的NADPH-细胞色素P450还原酶可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动植物或微生物。此外，所述的酶也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组酶。优选的，本发明可应用重组的酶。
所述的NADPH-细胞色素P450还原酶包括全长的酶或其生物活性片段(或称为活性片段)。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的酶的氨基酸序列也包括在本发明中。酶的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的酶的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长酶的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长酶的55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、或100％的活性。酶或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。
本发明也可采用经修饰或改良的NADPH-细胞色素P450还原酶，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢和/的效力而加以修饰或改良的酶。所述经过修饰或改良的酶可以是与天然存在的酶具有较小的共同点，但也能发挥与野生型相同或基本相同的功能，且不会带来其它不良影响。也就是说，任何不影响酶的生物活性的变化形式都可应用于本发明中。
本发明还包括了编码所述NADPH-细胞色素P450还原酶的生物活性片段的分离的核酸，也可以是其互补链。作为本发明的优选方式，可对酶的编码序列进行密码子优化，以提高表达效率。编码酶的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法获得。在获得了编码所述的酶的生物活性片段的DNA序列之后，将其连入合适的表达构建物(如表达载体)中，再转入合适的宿主细胞。最后通过培养转化后的宿主细胞，得到所要的蛋白。
本发明还包括了包含编码所述NADPH-细胞色素P450还原酶的生物活性片段的核酸分子的表达构建物。所述的表达构建物可包括编码所述酶的基因表达盒，还可包含与所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的表达调控序列的设计是本领域公知的。表达调控序列中，根据不同的需要，可以应用诱导型或组成型的启动子，诱导型的启动子可实现更可控的蛋白表达以及化合物生产，有利于工业化应用。
表达构建物及宿主细胞
作为本发明的优选方式，提供了一种表达构建物，其包括以下酶的基因表达盒：所述的NADPH-细胞色素P450还原酶和细胞色素P450还原酶。更优选的，所述的表达构建物还包括以下酶的基因表达盒：达玛烯二醇合成酶。
表达构建物的建立目前已经是本领域技术人员熟悉的技术。因此，在得知了所需选择的酶之后，本领域技术人员易于进行表达构建物的建立。编码酶的基因序列可以被插入到不同的表达构建物(如表达载体)中，也可以被插入到同一表达构建物中，只要在转入到细胞后酶能够被有效地表达即可。
本发明中，制备表达盒所需的启动子或终止子可以是任何适用的启动子或终止子，并不限于本发明具体所记载的那些。适用的启动子或终止子的选择是本领域技术人员可以进行的，可以根据宿主细胞的种类而定。例如，当应用于酵母重组表达时，现有技术已经揭示了一些酵母启动子或终止子，从而易于作出选择。
作为本发明的优选实施方式，提供一种NADPH-细胞色素P450还原酶的基因表达盒，以酵母作为宿主，以酵母启动子如酿酒酵母启动子TEF2作为启动子，以酵母终止子如酿酒酵母终止子TPI1作为终止子。
含有编码所述酶的生物活性片段核酸序列的宿主细胞也包括在本发明中。当用于表达所述的NADPH-细胞色素P450还原酶时，所述的“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。较佳地，所述的宿主细胞是真菌细胞、原核细胞或植物细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
当用于生产原人参二醇时，所述的“宿主细胞”还可以是包含有细胞色素P450酶的底物的细胞；较佳地，所述的宿主细胞是内源存在达玛烯二醇或其前体的细胞；更佳地，所述的宿主细胞是真菌细胞、细菌细胞或植物细胞；所述的真菌细胞包括酵母细胞。更佳地，所述的宿主细胞是酵母细胞；所述的酵母细胞包括但不限于：酿酒酵母细胞、毕赤酵母细胞，克鲁维酵母细胞，解脂耶氏酵母等。
针对原核细胞和真核细胞，本领域已知适合的表达载体是哪些，因此人们易于选择到合适的表达载体作为克隆编码基因的骨架载体，例如，当所述的细胞为细菌细胞时，采用pET系列表达载体(如pET28a)来重组表达各酶；当所述的细胞为酵母细胞，采用pESC系列表达载体。
生产原人参二醇的方法
本发明公开一种利用微生物异源生产原人参二醇的方法。利用生物工程技术，表达相关的酶，体外催化底物达玛烯二醇生成原人参二醇；或在酵母细胞内生成原人参二醇。
一种生产原人参二醇的方法是：重组表达本发明的NADPH-细胞色素P450还原酶以及细胞色素P450还原酶；较佳地，利用宿主细胞(原核细胞或真核细胞，如常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等)重组表达上述两种酶。表达获得的酶或能够表达上述两种酶的宿主细胞与底物达玛烯二醇进行反应，生产原人参二醇。
另一种生产原人参二醇的方法是：在宿主细胞(内源存在达玛烯二醇或其前体的细胞)内重组表达本发明的NADPH-细胞色素P450还原酶、细胞色素P450还原酶以及达玛烯二醇合成酶；鉴于宿主细胞自身能够合成达玛烯二醇的前体(如2，3-氧化角鲨烯)，所述的达玛烯二醇合成酶能够催化前体(如2，3-氧化角鲨烯)生成达玛烯二醇，之后由NADPH-细胞色素P450还原酶与细胞色素P450还原酶协同作用催化达玛烯二醇生成原人参二醇。该方法可以获得高产量的原人参二醇。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶的克隆
合成四条引物分别具有序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的核苷酸序列。
以从人参中提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上两对引物SEQ ID NO:3/4和SEQ ID NO:5/6分别进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KOD DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃ 2min；94℃15s，58℃ 30s，68℃ 2min，共35个循环；68℃ 10min，降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。
在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen Gel ExtractionKit(AXYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的糖基转移酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的pMD18-T克隆试剂盒，将回收的两个PCR产物克隆到pMD18-T载体，所构建的载体分别命名为pMDT-PgCPR1和pMDT-PgCPR2。经测序获得PgCPR1和PgCPR2的基因序列。
PgCPR1基因具有序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸序列。自SEQ ID NO:1的5’端第1-2037位核苷酸为PgCPR1的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，自SEQ ID NO:1的5’端的第1-3位核苷酸为PgCPR1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:1的5’端的第2035-2037位核苷酸为PgCPR1基因的终止密码子TAA。NADPH-细胞色素P450还原酶基因PgCPR1编码一个含有678个氨基酸的蛋白质PgCPR1，具有SEQ ID NO:23的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为75.5kDa，等电点pI为5.09。自SEQ ID NO:23的氨基端的第135-142位氨基酸以及第203-213位氨基酸为NADPH-细胞色素P450还原酶保守功能域。
PgCPR2基因具有序列表中SEQ ID NO:2的核苷酸序列。自SEQ ID NO:2的5’端第1-2070核苷酸为PgCPR2的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，自SEQ ID NO:2的5’端的第1-3位核苷酸为PgCPR2基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:2的5’端的第2068-2070位核苷酸为PgCPR2基因的终止密码子TAA。NADPH-细胞色素P450还原酶基因PgCPR1编码一个含有689个氨基酸的蛋白质PgCPR2，具有SEQ ID NO:24的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为76.5kDa，等电点pI为4.95。自SEQ ID NO:24的氨基端的第145-152位氨基酸以及第213-223位氨基酸为NADPH-细胞色素P450还原酶保守功能域。
实施例2、表达PgDDS、CYP716A47、PgCPR1和PgCPR2基因的重组载体的构建
(1)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8核苷酸序列的两条引物。
在合成的引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8(扩增CYP716A47)两端分别设置BamH I和Xho I两个酶切位点，以人参的cDNA为模板进行PCR。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后经BamH I和Xho I双酶切，利用NEB公司的T4DNA连接酶连入同样经BamH I和Xho I双酶切的pESC-HIS载体(安捷伦公司Agilent Technologies)中。所获得的重组质粒命名为pESC-HIS-CYP。
(2)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:11-16核苷酸序列的六条引物。以酿酒酵母BY4742(购于Euroscarf)基因组为模板，利用引物对SEQ ID NO:11/12扩增启动子片段TEF2p-1(即TEF2，其5’端含有与PESC-HIS载体同源序列，3’端含有与PgCPR1同源的序列)。以pMDT-PgCPR1为模板，利用引物对SEQID NO:13/14扩增PgCPR1开放阅读框序列。以酿酒酵母基因组为模板，利用引物对SEQ ID NO:15/16扩增终止子TPI1t-1(即TPI1其5’端含有与PgCPR1同源序列，3’端含有与ESC-HIS载体同源的序列)片段。PCR扩增程序同实施例1。
以前述启动子片段TEF2p-1、PgCPR1开放阅读框序列和终止子TPI1t-1片段共三个片段为模板，利用引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16进行overlapextension-PCR，DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的primeSTARDNA聚合酶。PCR程序为：98℃ 2min；98℃ 10s，55℃ 15s，68℃ 3min，共35个循环；68℃ 10min降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，回收后获得PgCPR1基因的表达盒TEF2-PgCPR1-TPI1t，该表达盒两端分别带有39bp与pESC-HIS-CYP载体Mfe I酶切位点两端同源的序列。
用GBclonart公司无缝克隆试剂盒将PgCPR1基因的表达盒TEF2-PgCPR1-TPI1t导入到pESC-HIS-CYP载体构建重组质粒pESC-HIS-CYP-PgCPR1。所用反应体系为：在10uL的反应体系中加入TEF2-PgCPR1-TPI1t片段1.25uL，经Mfe I酶切线性化的载体pESC-HIS-CYP1.25uL，GBclonart反应液7.5uL在45℃水浴中反应30min。反应产物转化E.coliEPI300(购自Epicenter)感受态细胞，并涂布于添加100μg/mL氨苄霉素的LB平板上。通过菌落PCR验证阳性转化子，并测序进一步验证重组质粒pESC-HIS-CYP-PgCPR1构建成功，命名为pHCR1。
(3)合成六条引物分别具有序列表中SEQ ID NO:17-20的序列。以酿酒酵母BY4742(购自Euroscarf)基因组为模板，利用引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:17扩增启动子片段TEF2p-2(即TEF2其5’端含有与PESC-HIS载体同源序列，3’端含有与PgCPR2同源的序列)。以pMDT-PgCPR2为模板，利用引物SEQ IDNO:18和SEQ ID NO:19扩增PgCPR2开放阅读框序列。以酿酒酵母基因组为模板，利用引物SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:16扩增终止子TPI1t-2(即TPI1其5’端含有与PgCPR2同源序列，3’端含有与PESC-HIS载体同源的序列)片段。PCR扩增程序同实施例1。
以前述启动子片段TEF2p-2、PgCPR2开放阅读框序列和终止子TPI1t-2片段共三个片段为模板，利用引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16进行overlapextension-PCR，PCR扩增程序同实施例2。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，回收后获得PgCPR2基因的表达盒TEF2-PgCPR2-TPI1t，该表达盒两端分别带有39bp与pESC-HIS-CYP载体Mfe I酶切位点两端同源的序列。
用GBclonart公司无缝克隆试剂盒将PgCPR2基因的表达盒TEF2-PgCPR2-TPI1t导入到pESC-HIS-CYP载体构建重组质粒pHCR2。构建方法同pHCR1。
所述酿酒酵母启动子TEF2具有如序列表中SEQ ID NO:21的核苷酸序列。
所述酿酒酵母终止子TPI1具有如序列表中SEQ ID NO:22的核苷酸序列。
(4)合成分别具有序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10核苷酸序列的两条引物。
在合成的引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10(扩增DDS)两端分别设置Not I和Sac I两个酶切位点，以从人参中提取的RNA反转录的cDNA为模板进行PCR。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后经Not I和Sac I双酶切，利用NEB公司的T4DNA连接酶连入同样经Not I和Sac I双酶切的pESC-HIS-CYP载体中。所获得的重组质粒pESC-HIS-CYP-DDS，简称为pHCD。
实施例3、体外NADPH-细胞色素P450还原酶和细胞色素P450(CYP716A47)协同催化达玛烯二醇转化为原人参二醇
(1)将重组质粒pHCR1利用ZYMO Research公司的Frozen-EZ YeastTransformation II转化试剂盒导入酿酒酵母BY4742(购自Euroscarf)中构建重组酿酒酵母BY-CYP-CPR1。配制液体诱导培养基：0.67％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，2％(w/v)半乳糖，0.01％(w/v)亮氨酸，0.01％(w/v)赖氨酸，0.01％(w/v)尿嘧啶。接种BY-CYP-CPR1于50ml诱导培养基诱导培养四天。离心收集菌体后，低温裂解细胞，超速离心机离心制备微粒体。重组质粒pESC-HIS-CYP同样方法导入BY4742构建重组酿酒酵母BY-CYP(空白对照)，并制备微粒体。
体外催化反应体系：Tris盐酸缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 7.5)，50mM达玛烯二醇，50微升BY-CYP-CPR1微粒体(约2mg)。水浴30℃反应过夜。加入等体积正丁醇抽提反应产物。结果如图2。
空白对照体外催化反应体系：Tris盐酸缓冲液(50mM Tris-HCl、1mMEDTA，pH 7.5)，50mM达玛烯二醇，50微升BY-CYP微粒体(约2mg)。水浴30℃反应过夜。加入等体积正丁醇抽提反应产物。结果如图2。
(2)将重组质粒pHCR2利用ZYMO Research公司的Frozen-EZ YeastTransformation II转化试剂盒导入酿酒酵母BY4742中构建重组酿酒酵母BY-CYP-CPR2。按如上方法制备微粒体。
体外催化反应体系：Tris盐酸缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH 7.5)，50mM达玛烯二醇，50微升BY-CYP-CPR2微粒体(约2mg)。水浴30℃反应过夜。加入等体积正丁醇抽提反应产物。结果如图2。
图2结果显示，体外反应中两个NADPH-细胞色素P450还原酶PgCPR1和PgCPR2都能够与细胞色素P450(CYP716A47)协同催化达玛烯二醇转化为原人参二醇，而单独的细胞色素P450(CYP716A47)不能够将达玛烯二醇转化为原人参二醇。因此，本发明的两个NADPH-细胞色素P450还原酶PgCPR1和PgCPR2可用于传递电子给细胞色素P450酶并协助细胞色素P450酶进行对底物的氧化修饰。
实施例4、重组酿酒酵母BYCPR1和BYCPR2构建
(1)重组酿酒酵母BYCPR1构建
合成分别具有序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10核苷酸序列的两条引物。
在合成的引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两端分别加Not I和Sac I两个酶切位点，以从人参中提取的RNA反转录的cDNA为模板进行PCR。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后经Not I和SacI双酶切，利用NEB公司的T4DNA连接酶连入同样经Not I和Sac I双酶切的pHCR1载体中。所获得的重组质粒pESC-HIS-CYP-DDS-PgCPR1，简称为pHCDR1。
将重组质粒pHCDR1利用ZYMO Research公司的Frozen-EZ YeastTransformation II转化试剂盒导入酿酒酵母BY4742中构建重组酿酒酵母BYCPR1。
(2)重组酿酒酵母BYCPR2构建
合成分别具有序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10核苷酸序列的两条引物。
在合成的引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两端分别加Not I和Sac I两个酶切位点，以从人参中提取的RNA反转录的cDNA为模板进行PCR。PCR扩增程序同实施例1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收后经Not I和SacI双酶切，利用NEB公司的T4 DNA连接酶连入同样经Not I和Sac I双酶切的pHCR2载体中。所获得的重组质粒pESC-HIS-CYP-DDS-PgCPR2，简称为pHCDR2。
将重组质粒pHCDR2利用ZYMO Research公司的Frozen-EZ YeastTransformation II转化试剂盒导入酿酒酵母BY4742中构建重组酿酒酵母BYCPR2。
实施例5、重组酿酒酵母BYCPR1和BYCPR2诱导生产原人参二醇
配制固体培养基：0.67％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，2％(w/v)葡萄糖，2％(w/v)琼脂糖，0.01％(w/v)亮氨酸，0.01％(w/v)赖氨酸，0.01％(w/v)尿嘧啶。
配制液体种子培养基：0.67％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，2％(w/v)葡糖糖，0.01％(w/v)亮氨酸，0.01％(w/v)赖氨酸，0.01％(w/v)尿嘧啶。
配制液体诱导培养基：0.67％(w/v)酵母氮源(无氨基酸)，2％(w/v)半乳糖，0.01％(w/v)亮氨酸，0.01％(w/v)赖氨酸，0.01％(w/v)尿嘧啶。
诱导培养方法：分别挑取在固体培养基平板上划线的酵母：BYCPR1和BYCPR2于含有5mL液体种子培养基的试管震荡培养过夜(30℃，250rpm，16h)；离心收集菌体，转移至50mL发酵液的250mL三角瓶中，调OD600至0.05，30℃，250rpm震荡培养4天得到发酵产物。本方法对两株重组酵母同时设置一个平行实验。
原人参二醇产物提取及检测：分别将BYCPR1和BYCPR250mL的发酵液离心收集菌体，加入3mL酵母裂解缓冲液(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、1mMPMSF、5％甘油，pH 7.5)重悬后，用Fastprep震荡裂解酵母，加入等体积(3mL)的正丁醇抽提，而后在真空条件下使正丁醇蒸干。用100μL甲醇溶解后通过HPLC检测目的产物原人参二醇的产量。
HPLC结果见图3。
结果，所构建的两株酿酒酵母菌株均能合成人参皂苷前体化合物原人参二醇，利用液体诱导培养基，在250mL摇瓶条件下诱导4d，重组酿酒酵母BYCPR1和BYCPR2可生产原人参二醇量分别为：800.76μg/L和476.52μg/L，如图4。
实施例6、利用密码子优化的PgCPR1构建重组酿酒酵母BYCPR1C诱导生产原人参二醇
NADPH-细胞色素P450还原酶PgCPR1具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，其翻译的蛋白质具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。利用Genscript(南京金斯瑞生物有限公司)提供的密码子优化方案对PgCPR1核苷酸序列按照酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化，在4组经密码子优化后的基因中挑选出效果最佳的新基因。新的基因命名为PgCPR1C，该基因具有序列表中SEQ ID NO:25的核苷酸序列。自SEQ ID NO:25的5’端第1-2037位核苷酸为PgCPR1的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，自SEQ ID NO:25的5’端的第1-3位核苷酸为PgCPR1基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:25的5’端的第2035-2037位核苷酸为PgCPR1基因的终止密码子TAA。NADPH-细胞色素P450还原酶基因PgCPR1C编码一个含有678个氨基酸的蛋白质，具有SEQ ID NO:23的氨基酸残基序列。
合成六条引物分别具有序列表中SEQ ID NO:26-29的序列。以重组质粒PHCDR1为模板，利用引物SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27扩增PHCDR1载体片段(其5’端与3’端均含有与PgCPR1C同源的序列)。以基因PgCPR1C为模板，利用引物SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29扩增PgCPR1C开放阅读框序列。
用GBclonart公司无缝克隆试剂盒将PgCPR1C基因开放阅读框序列导入到PHCDR1载体片段构建重组质粒pESC-HIS-CYP-DDS-PgCPR1C，简称pHCDR1C。
将重组质粒pHCDR1C利用ZYMO Research公司的Frozen-EZ YeastTransformation II转化试剂盒导入酿酒酵母BY4742中构建重组酿酒酵母BYCPR1C。按实施例5诱导方案对酿酒酵母BYCPR1C进行诱导并检测其原人参二醇产量。
结果，所构建的酿酒酵母菌株BYCPR1C能合成人参皂苷前体化合物原人参二醇，929.70μg/L如图4。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (17)
1.分离的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶，其特征在于，所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24任一所示的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶活性的由(a)衍生的多肽。
2.分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸是编码权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:25所示。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体或基因组中整合有权利要求2或3所述的多核苷酸。
6.权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶。
7.权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的用途，其特征在于，用于传递电子给细胞色素P450酶并协助细胞色素P450酶进行对底物的氧化修饰。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的细胞色素P450酶是CYP716A47或CYP716A53v2；
所述的底物是达玛烯二醇。
9.一种表达构建物，其特征在于，所述表达构建物包括以下酶的基因表达盒：
权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶；和
细胞色素P450还原酶。
10.如权利要求9所述的表达构建物，其特征在于，还包括：达玛烯二醇合成酶的表达盒。
11.如权利要求9或10所述的表达构建物，其特征在于，权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶的基因表达盒中，以酵母启动子、较佳地为酿酒酵母启动子TEF2作为启动子，以酵母终止子、较佳地为酿酒酵母终止子TPI1作为终止子。
12.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中包括权利要求9-11任一所述的表达构建物。
13.如权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是包含有细胞色素P450酶的底物的细胞；较佳地，所述的宿主细胞是内源存在达玛烯二醇或其前体的细胞；更佳地，所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；所述的真菌细胞包括酵母细胞。
14.权利要求9-11任一所述的表达构建物或权利要求12或13的宿主细胞的用途，其特征在于，用于生产原人参二醇。
15.一种生产原人参二醇的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-细胞色素P450还原酶作为辅酶，促进细胞色素P450酶催化达玛烯二醇生成原人参二醇。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求9所述的表达构建物转化宿主细胞，利用转化的宿主细胞催化达玛烯二醇生成原人参二醇。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求10所述的表达构建物转化宿主细胞，培养转化的宿主细胞，生成原人参二醇；该宿主细胞是包含有细胞色素P450酶的底物的细胞；所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞；常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；较佳地，该宿主细胞是内源存在达玛烯二醇或其前体的细胞；更佳地，所述的真菌细胞包括酵母细胞。
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