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CN104878104B - 胆管癌诊治分子标志物及其应用 - Google Patents

胆管癌诊治分子标志物及其应用 Download PDF

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CN104878104B CN201510291981.4A CN201510291981A CN104878104B CN 104878104 B CN104878104 B CN 104878104B CN 201510291981 A CN201510291981 A CN 201510291981A CN 104878104 B CN104878104 B CN 104878104B
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Abstract

本发明公开了一种用于胆管癌早期诊断的分子标志物‑MARCO基因。实验证明，在胆管癌组织中MARCO基因的mRNA水平显著低于正常胆管组织，因此通过测定受试者胆管组织中MARCO的表达水平可以判断受试者是否存在患有胆管癌的风险，或者可以判断受试者是否已经患有胆管癌。MARCO基因及其表达产物可以制备成药物施用于胆管癌的患者或者施用于患胆管癌风险高的患者，以用于治疗胆管癌或预防胆管癌的发生。本发明为临床上诊断胆管癌提供了新的诊断方法并且为治疗胆管癌提供了新的候选药物。

Description

胆管癌诊治分子标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人MARCO基因在胆管癌诊断、治疗中的用途。
背景技术
胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)是起源于胆管上皮细胞的一种恶性肿瘤，居肝胆恶性肿瘤的第2位，仅次于肝细胞癌，约占消化系统肿瘤的3％。胆管癌可发生在肝外胆管的各个部位，其中以近段胆管(肝门部胆管)最多见，约占58％，中远段胆管分别占13％和18％，发生在胆囊管者占4％，另有7％为弥漫发生。
目前临床上用于胆管癌确诊的方法包括：1)实验室检查：以血总胆红素、直接胆红素、碱性磷酸酶和γ-谷胺酰转移酶为检测指标；2)影像学检查，又分为超声显像检查、经皮肝穿刺胆道造影(PTC)、内镜逆行胆胰管造影(ERCP)、CT检查、磁共振胆胰管成像(MRCP)、核素显影扫描、选择性肝动脉造影和门静脉造影。但是上述方法不能应用于胆管癌早期的诊断，因为临床上CCA的早期症状并不明显，而目前作为治疗CCA最有效的方案-手术治疗的关键恰恰在于疾病的早期发现，因此为了更有效的提高CCA的治愈率，如何早期诊断越来越引起学者们的重视。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于胆管癌早期诊断的分子标志物。相比传统的胆管癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断胆管癌的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在癌症早期就能知晓癌症风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种人MARCO基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应用。
进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MARCO基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增MARCO基因的引物；所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增MARCO基因的引物；所述用免疫检测诊断胆管癌的产品包括：与MARCO蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断胆管癌的产品包括：与MARCO基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断胆管癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与MARCO蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MARCO基因的核酸序列杂交的探针。
优选地，所述产品包括芯片、试剂盒。
本发明还提供了人MARCO基因在高通量测序平台中的应用。随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知人MARCO基因的异常与胆管癌相关也属于人MARCO基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了人MARCO基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
进一步，所述药物包括：含有人MARCO基因的药物、携带人MARCO基因的载体或宿主细胞所形成的药物、人MARCO蛋白质药物、或其他能够促进MARCO基因表达的药物。本发明的药物可以用于补充内源性的人MARCO蛋白的缺失或不足，通过提高人MARCO蛋白的表达，从而治疗因人MARCO蛋白缺乏导致的胆管癌。
本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有人MARCO基因的药物或者含有人MARCO蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有人MARCO基因的药物或者含有人MARCO蛋白质的药物注入体内组织中。
本发明的药物还可与其他治疗胆管癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
本发明还提供了一种诊断胆管癌的芯片，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MARCO基因转录水平的针对MARCO基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的MARCO蛋白的特异性抗体。
进一步，所述基因芯片可用于检测包括人MARCO基因在内的多个基因(例如，与胆管癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括人MARCO蛋白在内的多个蛋白质(例如与胆管癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与胆管癌的标志物同时检测，可大大提高胆管癌诊断的准确率。
本发明提供了一种诊断胆管癌的试剂盒，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测MARCO基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括MARCO蛋白的特异性抗体。
进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测MARCO基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对MARCO基因的引物和/或探针。根据SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测MARCO基因表达水平的引物和探针。
与MARCO基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述MARCO蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述MARCO蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与MARCO蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的上下文中，“MARCO基因”包括人MARCO基因以及人MARCO基因的任何功能等同物的多核苷酸。MARCO基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中MARCO基因(NC_000002.12)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，MARCO基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述MARCO基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，MARCO基因表达产物包括人MARCO蛋白以及人MARCO蛋白的部分肽。所述MARCO蛋白的部分肽含有与胆管癌相关的功能域。
“MARCO蛋白”包括人MARCO蛋白以及人MARCO蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括人MARCO蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人MARCO的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，MARCO蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述MARCO蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是MARCO蛋白的融合蛋白。对于与MARCO蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留MARCO蛋白的生物学活性即可。
本发明的MARCO蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留MARCO蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断胆管癌”既包括判断受试者是否已经患有胆管癌、也包括判断受试者是否存在患有胆管癌的风险。
在本发明的上下文中，“治疗胆管癌”包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了MARCO基因表达与胆管癌相关，通过检测受试者胆管黏膜中MARCO的表达，可以判断受试者是否患有胆管癌、或者判断受试者是否存在患有胆管癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-MARCO基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现胆管癌的早期诊断，从而降低胆管癌的死亡率。
附图说明
图1显示利用RT-PCR检测MARCO基因在胆管癌组织中的表达情况；
图2显示利用RT-PCR检测MARCO基因在胆管癌细胞中的过表达情况；
图3显示利用MTT检测MARCO基因表达对胆管癌细胞增殖能力的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 筛选与胆管癌相关的基因标志物
1.1 样品收集
各收集8例正常胆管组织和胆管癌组织样本。上述样本为胆管癌患者的手术切除标本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
1.2 RNA样品的制备及质量分析
1.2.1 RNA样品的制备
正常胆管组织和胆管癌组织经过RNA抽提后经琼脂糖凝胶电泳判断RNA样品质量，合格者可以用于进一步的转录组分析。
1.2.2 RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
1.2.3 RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer)
Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
1.3 高通量转录组测序
1.3.1 RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
1.3.2 转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
1.3.3 差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
1.4 结果
RNA-seq结果显示，MARCO基因在胆管癌组织中的表达量显著低于正常的胆管组织。
实施例2 RT-PCR测序验证MARCO基因的差异表达
1、根据高通量测序的检测结果选择MARCO基因进行大样本RT-PCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择胆管癌组织和正常胆管组织各80例。
2、RNA提取过程同实施例1。
3、逆转录：采用TAKARA的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录，具体操作步骤见说明书。
4、PCR扩增
MARCO基因RT-PCR引物序列如下：
MARCO：正向引物为5’-AGCAAGGAGTAAAGGGAGAA-3’(SEQ ID NO.3)；
MARCO：反向引物为5’-GGTTACTACTGCCGACAATC-3’(SEQ ID NO.4)。
β-actin基因的RT-PCR引物序列如下：
β-actin：正向引物为5’-CATCCTGCGTCTGGACCT-3’(SEQ ID NO.5)；
β-actin：反向引物为5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’(SEQ ID NO.6)。
按照表1配制PCR反应体系：
表1PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 0.2μl
反向引物 0.2μl
10×PCR缓冲液 0.4μl
dNTP混合物 1μl
Taq DNA聚合酶 1μl
模板 2μl
去离子水 补足10μl
反应条件：94℃，5min预变性；94℃，30s变性；55℃，30s退火；72℃，30s延伸；共40个循环。
以DNA条带的亮度来衡量DNA量，条带越亮，代表DNA量越多。以β-actin作内参对照，将MARCO基因扩增产物的条带的亮度进行均一化处理，比较胆管癌组织和正常胆管组织中MARCO基因扩增产物的亮度的比值。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与正常胆管组织相比，MARCO基因在胆管癌组织中的表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3 MARCO基因过表达
1、人胆管癌细胞株QBC939，以含10％小牛血清的DMEM(高糖)培养基在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。
2、MARCO基因的过表达
2.1 MARCO基因表达载体的构建
根据MARCO基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：正向引物为5’-ATGCGGCTGCCAGAGCAA-3’(SEQ ID NO.7)，反向引物为5’-CGGAGTATCTGGTTGGCTG-3’(SEQ ID NO.8)。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的MARCO基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-MARCO用于后续实验。
2.2 转染
将胆管癌细胞株QBC939分为两组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和MARCO过表达组(转染pcDNA3.1-MARCO)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-MARCO的工作浓度均为0.5μg/ml。
2.3 RT-PCR检测
具体步骤同实施例2。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
如图2所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-MARCO的细胞中MARCO的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 MARCO基因对胆管癌细胞增殖的影响
采用MTT实验检测MARCO基因对胆管癌细胞增殖能力影响。
1、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测：每孔加入5g/L的MTT液20μl，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO 150μl，细心吹打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(A值)。然后每12h检测1次，连续测72h，共7次。本实验重复3次。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
图3所示的结果显示：转染pcDNA3.1-MARCO组的细胞生长速度明显低于转染pcDNA3.1空载体组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明MARCO表达能够抑制胆管癌细胞的生长。
实施例5 MARCO基因对胆管癌细胞的细胞周期的影响
使用流式细胞仪检测细胞周期，在此过程中使用的PI单染试剂购自美国BD公司。
1、步骤：各组细胞转染48h后胰酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗涤2次，70％的乙醇固定过夜。按操作说明加相应试剂，避光放置30min，流式细胞仪检测各组细胞周期。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
如表2中显示的结果，与转染pcDNA3.1空载体组细胞相比，转染pcDNA3.1-MARCO组细胞处于G1期的细胞明显增多，处于S期的细胞明显减少。上述结果表明，MARCO基因表达能够抑制细胞周期。
表2细胞转染后细胞周期变化
组别 G1期 G2期 S期
转染pcDNA3.1空载体组 39.04±1.02 15.24±0.74 45.72±0.41
转染pcDNA3.1-MARCO 70.14±1.43* 12.37±1.02 17.49±1.54*
注：与转染pcDNA3.1空载体组相比，*P<0.05。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (2)

1.人MARCO基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括：含有人MARCO基因的药物、携带人MARCO基因的载体或宿主细胞所形成的药物、人MARCO蛋白质药物、或其他能够促进MARCO基因表达的药物。
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