CN104878022A - 编码hpv58l1、hpv52l1蛋白的核苷酸序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开编码HPV58L1、HPV52L1蛋白的核苷酸序列及其应用，针对HPV疫苗中使用的蛋白种类和活性的问题，通过密码子优化使其能够在酵母细胞中实现高水平表达；同时通过表达在酵母细胞中产生HPV52和HPV58病毒样颗粒(VLPs)，以用于疫苗的研发。

Description

编码HPV58L1、HPV52L1蛋白的核苷酸序列及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更加具体地说，涉及人乳头瘤病毒编码及其应用。

背景技术

人乳头状瘤病毒(human papilkgna virus,HPV)是一种致瘤DNA病毒，可引起人生殖道和肛门皮肤、黏膜发生良性和恶性肿瘤，其中与宫颈癌发病密切相关的有HPV 16,18等。每年全世界宫颈癌的新增病例约为50万人，死亡人数近30万，是威胁女性健康的第二大癌症。

有80种以上的人乳头瘤病毒，即HPV。其中很多与各式各样的生物学表型相关，所述生物学表型为从良性增生性疣到恶性癌。HPV6和HPV11是与生殖器或呼吸粘膜的良性疣、非恶性尖锐湿疣和轻度发育不良相关的最普通类型。HPV16和HPV18是与子宫颈、阴道、女阴和肛管的原位和侵袭性癌最常相关的高风险类型。90％以上的子宫颈癌与HPV16、HPV18或较少流行的致癌类型HPV31、-33、-45、-52和-58的感染相关。在对90％以上子宫颈癌中检测到HPV DNA的观察结果提供了HPVs引起子宫颈癌的强大流行病学证据。人乳头瘤病毒是小(50-60nm)、无包膜、二十面体的DNA病毒，其编码最多8个早期和2个晚期基因。该病毒基因组的可读框命名为E1至E7，和L1和L2，其中E表示早期L表示晚期。L1和L2编码病毒衣壳蛋白，而E基因与病毒复制和细胞转化的功能相关。L1蛋白是主要的衣壳蛋白，并具有55-60kDa的分子量。L2蛋白是次要的衣壳蛋白。免疫学数据提示在病毒衣壳中，大多数L2蛋白位于L1蛋白内部。在不同人乳头瘤病毒中，L1和L2蛋白是高度保守的。L1蛋白或L1和L2蛋白组合在酵母、昆虫细胞、脯乳动物细胞或细菌中的表达导致病毒样颗粒(VLPs)的自动装配。VLPs形态上类似于真的病毒体且在施用于动物或人后能够诱导高效价的中和抗体。因为VLPs不会有潜在地致癌病毒基因组，所以它们为活病毒在HPV疫苗开发中的用途提供了安全的备选方案。由于这个原因，L1和L2基因已经被确定为HPV感染和疾病的预防和治疗性疫苗开发的免疫学靶。

在亚洲地区的流行病学调查显示，52、58型就与30％以上的宫颈癌相关。在正常人群中HPV52的流行程度仅次于HPV16，约为2.42％，在宫颈糜烂患者中也占有一定的比例(略低于HPV58)，但在浸润性子宫颈癌中，HPV52的流行度却大大降低，这可能与HPV52E7癌蛋白的转化能力有限有关。宫颈癌的发生是一个由宫颈糜烂引发的渐进过程，而HPV52又是宫颈糜烂发生和发展的一个重要因素，因此针对HPV52亚型的免疫保护反应对于宫颈癌的预防性疫苗有着重要的意义。

与在成功转化的宿主生物中获得高表达水平的衣壳蛋白、限制纯化蛋白的生产相关的困难已阻碍了HPV疫苗开发和商业化。因此，尽管鉴定了编码HPV58L1蛋白的野生型核苷酸序列，但是非常期望开发出HPV58L1蛋白的可容易更新来源，该蛋白利用在制定宿主细胞中表达被最优化的编码HPV58L1的核苷酸序列。另外，产生具有天然蛋白的赋予免疫性质的用于疫苗开发的大量HPV58L1VLPs将很有用处。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，针对HPV疫苗中使用的蛋白种类和活性的问题，提供编码HPV58L1或HPV52L1蛋白的核苷酸序列，通过密码子优化使其能够在酵母细胞中实现高水平表达；同时通过表达在酵母细胞中产生HPV52L1或HPV58L1病毒样颗粒(VLPs)，以用于疫苗的研发。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

编码HPV52L1蛋白的核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

编码HPV58L1蛋白的核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。

一种载体，含有编码上述HPV52L1蛋白的核苷酸序列，或者编码HPV58L1蛋白的核苷酸序列。

一种真核汉逊酵母工程菌，以含有编码上述HPV52L1蛋白的核苷酸序列，或者编码HPV58L1蛋白的核苷酸序列的载体转染真核汉逊酵母菌株RB-11，经筛选得到表达水平和质粒拷贝数最高的菌株来获得。

RB-11细胞株为LR9细胞株的改良衍生株(Roggenkamp.R etal.,1986Transformation ofthe methylotrophic yeast Hanseunla polymorpha by autonomous replication and integrationvectors,Mol.Gen Genet 202:302)。RB-11细胞株为5′-乳清酸苷磷酸脱羧酶基因缺陷性突变株，已被广泛应用于工业重组菌的构建。

利用甲醇对转染后的真核汉逊酵母菌株RB-11进行诱导表达，在整个过程中温度为28—32℃，时间为72h，开始时甲醇用量为细胞悬浮液质量的0.5％，每间隔24h，向细胞悬浮液中添加甲醇，添加甲醇的量为细胞悬浮液质量的0.5％。

利用真核汉逊酵母工程菌进行发酵的方法，在发酵过程中，所述真核汉逊酵母工程菌经过生长时相、去阻遏时相和诱导表达时相，其中一个质量份为1g：

(1)生长时相：发酵罐pH值控制在5.4-5.5，发酵温度控制在28—32℃，使用的发酵培养基经灭菌处理，由NH₄H₂PO₄170—180质量份、MgSO₄·7H₂O 40—50质量份、KCl 40—45质量份、NaCl 4—5质量份、甘油500—550质量份，发酵消泡剂4—5质量份和去离子水10000—15000质量份组成；在生长时相中，发酵罐内溶氧会缓慢下降，当下降至60％时，向发酵罐中匀速打入补料培养基，使用的补料培养基经灭菌处理，由NH₄H₂PO₄80—90质量份、甘油250—300质量份和去离子水500—550质量份组成；当发酵罐溶氧水平降至40％以下时，将空气流量由起初的25—30L/min调至12—15L/min，搅拌转速由起初的1200—1500rpm调至700rpm；整个生长时相时间在20—25小时，细胞生长状态良好，发酵罐溶氧水平可下降至20％以下，细胞OD₆₀₀达到80以上；

(2)去阻遏时相：当发酵罐溶氧由最低点回升到60％以上时，进入去阻遏时相，维持空气流量和搅拌条件不变，加入去阻遏培养基；所述去阻遏培养基经灭菌处理，由NH₄H₂PO₄25—30质量份、MgSO₄·7H₂O 5—10质量份、KCl 5—8质量份、NaCl 0.5—1质量份、甘油1700—1900质量份和去离子水1200—1350质量份组成，去阻遏时相持续20—25h；

(3)诱导时相：去阻遏时相之后进入诱导时相，向发酵罐中补加诱导培养基，所述诱导培养基经灭菌处理，由甘油和甲醇组成，甘油和甲醇的体积比为(38—40)：(60—65)，调控甲醇的用量，以使甲醇在整个发酵罐的液相体积中，体积百分比为0.3％—0.5％，诱导时相持续48—55h。

在生长时相中，发酵培养基优选由NH₄H₂PO₄170—175质量份、MgSO₄·7H₂O 40—45质量份、KCl 42—44质量份、NaCl 4.2—4.4质量份、甘油520—540质量份，发酵消泡剂4—5质量份和去离子水10000—12000质量份组成，所述发酵消泡剂为THIF—298型生物发酵消泡剂。

在生长时相中，补料培养基优选由NH₄H₂PO₄85—87质量份、甘油260—280质量份和去离子水520—540质量份组成。

在生长时相中，补料培养基和发酵培养基的体积比为(0.8—1)：(10—12)。

在去阻遏时相中，去阻遏培养基优选由NH₄H₂PO₄26—28质量份、MgSO₄·7H₂O 6—8质量份、KCl 7—8质量份、NaCl 0.6—0.8质量份、甘油1750—1850质量份和去离子水1300—1350质量份组成。在去阻遏时相中，发酵培养基和去阻遏培养基的体积比为4：(1—1.2)。

在诱导时相中，诱导培养基的使用体积为去阻遏培养基体积的30—40％。

本发明利用野生型基因，在充分考虑真核汉逊酵母菌株RB-11的表达特点的基础上，提供了两种新的核苷酸序列，编码HPV52L1蛋白或HPV58L1蛋白，在构建载体和转染RB—11之后，诱导发酵得到的产物中形成各自的VLPs，并且表达量明显高于野生型基因的表达水平，且能够作为疫苗进行使用。

附图说明

图1是表达载体pMPT—HPV52L1的构建示意图。

图2是表达载体pMPT—HPV58L1的构建示意图。

图3是表达载体pMPT—HPV58L1转染细胞后PCR扩增的电泳照片。

图4是HPV58L1的转化子west—blot方法筛选结果图。

图5是悬浮缓冲液中HPV58L1 VLPs图像。

图6是悬浮缓冲液中HPV52L1 VLPs图像。

图7是野生基因与优化基因的酵母表达VLPs量的对比示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1 编码HPV52L1或HPV58L1蛋白的核苷酸序列的合成

在NCBI数据库中分别检索得到HPV52L1和HPV58L1的野生型DNA序列和蛋白质序列，其中对HPV52L1来说，野生型DNA序列HPV52L1-WT全长1512个碱基，蛋白质序列Genbank登记号为HQ537731.1，蛋白质序列全长504个氨基酸。

将HPV52L1氨基酸序列转换为真核汉逊酵母偏爱密码子模式的核苷酸序列。重建HPV52L1序列被工程改造，以删除任何可能的转录提前终止位点以确保稳固的转录。首选兼并密码子中真核汉逊酵母偏爱性处于第一位的密码子，主要使用兼并密码子中真核汉逊酵母偏爱性处于第一第二位的密码子，少数情况使用第三位的密码子完成局部调整，利用DNAMAN软件避免过长互补序列、重复序列，通过RNA结构预测，避免过长复杂的发卡结构，排除强二级结构，增加特异性的分子内部稳定性。基因的核苷酸序列中还避免出现可能对基因转录、转译效率带来不利影响的序列，如内含子剪接序列、转录终止序列、内部启动子序列(TATA)和核糖体结合位点(GGAGG)等。转录终止序列主要有：ATTATTTTAT、TTTTTATA、TAG(富含T)TA(G)GT、(富含AT)TTT等。最终确定整个序列，如序列表中SEQ ID NO.1所示。利用全人工合成方法合成序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

对HPV58L1来说，氨基酸序列全长498氨基酸，转换为真核汉逊酵母偏爱密码子模式的核苷酸序列。采用如上述HPV52L1一样的转换思路和方法，重建HPV58L1序列被工程改造，以删除任何可能的转录提前终止位点以确保稳固的转录。最终整个序列，如序列表中SEQ No.2所示。利用全人工合成方法合成序列表中SEQ No.2所示的DNA序列。

实施例2表达载体的构建

(1)HPV52L1表达载体的构建

利用全人工合成方法合成序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列，序列两端加上限制性内切酶EcoR I和BamH I的识别位点。用EcoR I和BamH I酶切合成的DNA序列，电泳回收酶切后的片段，﹣20℃保存备用。

以汉逊酵母CGMCC 22497基因组DNA为模板，克隆1.5kb的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子、350bp的甲醇氧化酶基因(MOX)终止子、1.0kb的自主复制序列HARS；并从YIp5(Genbank Acession NO.L09157)质粒中克隆出1.1kb的酿酒酵母尿脲嘧啶基因ScURA3；将上述4部分连接后，插入pBluescrip II质粒的多克隆位点，构建成穿梭载体pMPT-02。

用EcoR I和BamH I酶切载体pMPT-02，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的大片段，在T4-DNA连接酶的作用下，与同样双酶切的SEQ ID NO.1所示合成的DNA序列连接，连接反应在16℃下隔夜，反应液转化天根生化科技(北京)有限公司TOP10感受态细胞，用带氨苄青霉素抗性的平皿筛选转化子，对平皿上长出的大肠杆菌转化子使用引物primer fd15‘-ATGTCTGTTTGGAGACCGTC-‘3和primer fd25‘-GGGATCCGTGTAATTATCTCTTGAC-‘3通过PCR扩增筛选含载体pMPT-HPV52L1的转化子，筛选得到的转化子扩大培养，用宝生物工程大连有限公司的质粒回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0)提纯得到表达载体pMPT-HPV52L1，载体构建示意图见附图1。

(2)以相同方法和步骤构建HPV58L1表达载体，见附图2。

利用全人工合成方法合成序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA序列，序列两端加上限制性内切酶EcoR I和BamH I的识别位点。用EcoR I和BamH I酶切合成的DNA序列，电泳回收酶切后的片段，﹣20℃保存备用。

以汉逊酵母CGMCC 22497基因组DNA为模板，克隆1.5kb的甲醇氧化酶基因(MOX)启动子、350bp的甲醇氧化酶基因(MOX)终止子、1.0kb的自主复制序列HARS；并从YIp5(Genbank Acession NO.L09157)质粒中克隆出1.1kb的酿酒酵母尿脲嘧啶基因ScURA3；将上述4部分连接后，插入pBluescrip II质粒的多克隆位点，构建成穿梭载体pMPT-02。

用EcoR I和BamH I酶切载体pMPT-02，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的大片段，在T4-DNA连接酶的作用下，与同样双酶切的合成的DNA序列连接，连接反应在16℃下隔夜，反应液转化天根生化科技(北京)有限公司TOP10感受态细胞，用带氨苄青霉素抗性的平皿筛选转化子，对平皿上长出的大肠杆菌转化子使用引物primer fd35‘-ATGTCCGTGTGGCGTCCTTCGG-‘3和primer fd4 5‘-TTACTTCTTGACCTTC-‘3通过PCR扩增筛选含载体pMPT-HPV58L1的转化子，筛选得到的转化子扩大培养，用宝生物工程大连有限公司的质粒回收试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0)提纯得到表达载体pMPT-HPV58L1，载体构建示意图见附图2。

实施例3表达载体电转化真核汉逊酵母感受态宿主细胞

(1)pMPT-HPV52L1感受宿主细胞

用Sac I分别酶切载体pMPT-HPV52L1，使载体线性化。线性化的载体通过电转化法(天津理工大学生产的LN-101型基因脉冲导入仪，1.5kV，50μF，200Ω，3-5mSec)转化真核汉逊酵母RB-11(直接购自德国莱茵生物公司，RB-11细胞株为LR9细胞株的改良衍生株Roggenkamp.R etal.,1986Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunlapolymorpha by autonomous replication and integration vectors,Mol.Gen Genet 202:302，RB-11细胞株为5′-乳清酸苷磷酸脱羧酶基因缺陷性突变株，已被广泛应用于工业重组菌的构建)。在含有1.34％YNB(酵母氮源基础培养基)和2％葡萄糖的培养基平板上筛选转化子。通过PCR筛选产生的菌落中正确方向的HPV 52L1插入片段。将酵母转化混合物铺平板在MD固体培养基中，并在30℃倒置培养3-5天。挑取菌落并在平板上划线进行克隆分离。分离的菌落随后在旋转管培养中于37℃生长以诱导L1转录和蛋白表达。48小时后，沉淀相当于0D₆₀₀＝10量的细胞，除去上清液和冷冻沉淀并保存在-70℃。

(2)pMPT-HPV58L1感受宿主细胞：采用与(1)中基本相同的方案，使用载体pMPT-HPV58L1转化真核汉逊酵母RB-11。

实施例4目的基因的筛选、测序和检测

(1)细胞破碎：取约1mLOD₆₀₀为10的酵母菌体至1.5mL离心管，6000rpm离心5min后去上清，加入与沉淀菌体体积相同的酸洗玻璃液，100μL细胞破碎液，至于振荡器上震荡5-10min。

(2)DNA抽提：细胞破碎完成后，在离心管中加入100μL无菌水，再加100μL酚、氯仿抽提液，混匀后4℃放置十分钟，10000rpm离心5min，取上清1μL用于扩增反应。

(3)PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

使用引物primer fd3 5‘—ATGTCCGTGTGGCGTCCTTCGG—’3和primer fd45‘—TTACTTCTTGACCTTC—’3对以上制备的DNA模板PCR扩增，以上引物可同时扩增真核汉逊酵母单拷贝的MOX基因和整合的HPV58L1基因。所扩增HPV58L1片段长度为1500bp，MOX片段长度为2060bp，在1.0％琼脂糖凝胶加样孔中上样5μL，电泳完毕取出凝胶摄像，电泳照片见附图3，其中1500bp左右条带为HPV58L1基因，2000bp左右条带为MOX基因。其中1、9道是高拷贝转化子，5、7、8道是较高拷贝转化子，2、3、4、6道是低拷贝转化子，10道是阴性对照的宿主菌，11道是DL2000Marker，从上到下依次为2000bp、1000bp、750bp和500bp。以上扩增的PCR产物琼脂糖凝胶电泳后用DNA纯化试剂盒抽提1500bp的DNA片段进行基因测序，与设计基因比对结果一致。

(4)多拷贝转化子实时定量PCR检测拷贝数

已知MOX基因为真核汉逊酵母的单拷贝基因，以NOX基因为内标，设计引物对同一样品同时扩增MOX基因片段和HPV58L1基因片段，并用荧光定量PCR仪检测，由于MOX基因在真核汉逊酵母基因组中是单拷贝，故HPV58L1片段的量/MOX片段的量即为每个细胞的HPV58L1基因的拷贝数。基因通过质粒载体转化到受体菌并稳定整合后才能高效表达，其拷贝数一定程度上反映高效表达的工程菌株表达目的蛋白的特性。

两对引物均使用软件Primer5设计，由大连宝生物工程有限公司代理合成。扩增HPV58L1基因片段的引物序列如5’-TCTGAGCCCTATGGCGATT-‘3和5’-AGCGGAAGACTGGATGACA-‘3所示，片段长度为156bp。扩增MOX基因片段的引物序列分别为MOX primer forward(Sp2)：5‘-GCCACCTTCTACTCGTCCAG-‘3和MOXprimer forward(As2)：5’-ACTCCCAGTCGTCGTAGTCG-‘3，片段长度为145bp。

模板DNA制备同上述DNA抽提方法，其稀释如下：标准品稀释，取某一样品抽提得到的DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10倍，稀释4次，此稀释要求精确。样品稀释，取其他样品用抽提得到的DNA溶液先稀释20倍，然后进行系列稀释，每次稀释10倍，稀释2次，此稀释不要求精确。

实时定量PCR反应体系：总体积20μL，其中正反向引物(10mM)各0.5μL，EX PremierTaq(含4mM Mg2⁺、0.4mM dNTP、0.5M ExTaq)10μL，SYBR 0.5μL，模板5μL。实时定量PCR检测使用澳大利亚Corbett Research公司的荧光定量PCR仪(型号：Rotor-Gene3000)。实时定量PCR反应热循环参数：预变性94℃5min，变性94℃15secs，退火及延伸60℃50secs，35个循环。熔解检验反应特异性：从60℃缓慢升温到94℃，每5秒升温一次，每次升温0.5℃，每升高一次进行信号采集。利用Rotor-Gene5.0.28(Corbett Research)软件分析样品拷贝数。

(5)采用如上述步骤和方法进行HPV52L1基因的筛选、测序和检测，试剂盒抽提的DNA片段经基因测序，与设计基因比对结果一致。

实施例5细胞培养诱导表达

将冻存菌种从-70℃冰箱中取出迅速溶解，用0.2mL吸管将菌悬液吹打/搅拌均匀后，接40μL菌悬液到装有10mL MD培养基的三角瓶中，每个样品接2只以上的三角瓶。接种后摇床培养24小时左右，培养温度31±2℃，摇床转速160rpm。

用吸管接培养得到的菌悬液0.1mL，到装有10mL MD培养基的三角瓶中培养24小时左右，培养温度31±2℃，摇床转速160rpm。将得到的菌悬液转入灭过菌的10mL离心管，在台式离心机上3000rpm离心10分钟，弃去上清液。加无菌水10mL，充分混匀后以3000rpm离心10分钟，弃去上清液。用10mL无碳源培养基将洗涤后的菌体震荡混匀，转入三角瓶中。

在以上培养得到的细胞悬液中加入0.5％(50μL)甲醇，将三角瓶置于培养摇床中，温度为31±2℃，摇床转速160rpm振荡培养。次日起每天上午、下午各加甲醇一次。诱导培养24小时后，补加1mL无碳源培养基，加0.5％(55μL)甲醇，将三角瓶置于培养摇床中，温度为31±2℃，摇床转速160rpm振荡培养。诱导培养72小时后取样检测，菌悬液稀释30倍，用分光光度计测OD₆₀₀值，计算诱导培养后菌悬液的OD₆₀₀值，取相当1mL 200D细胞进行表达水平的检测。

实施例6真核汉逊酵母重组疫苗工程菌三时相中试发酵工艺

(1)菌种制备及种子放大

将菌株构建中筛选的高拷贝高表达菌株制备为原代种子、主代种子、工作种子三级种子库，放在﹣70℃冰柜中冻存，工作种子用于发酵工艺开发及疫苗发酵生产。培养基的配制：2g/100ml葡萄糖、1.34g/100ml YNB；一级种子培养基200mL，二级种子培养基1600mL，高压灭菌。从﹣70℃冰柜中取一支(1mL、OD₆₀₀≈100)接入200mL一级种子培养基，31℃培养24小时转接1600mL二级种子培养基扩大培养，31℃培养22小时细胞OD₆₀₀达到10以上，作为发酵种子。

(2)发酵过程，使用THIF—298型生物发酵消泡剂作为发酵消泡剂

补料培养基：NH₄H₂PO₄87g溶于540mL水中，高压灭菌；另取260g甘油高压灭菌。

去阻遏培养基：共计3L，NH₄H₂PO₄27g、MgSO₄·7H₂O 6g、KCl 6.8g、NaCl 0.7g，以上原料溶于660mL水中，高压灭菌；另取1.8L甘油高压灭菌。

诱导培养基：甘油400mL，高压灭菌后加0.6L甲醇。

发酵培养基：发酵起始体积12L，包含NH₄H₂PO₄175g、MgSO₄·7H₂O 40g、KCl 44g、NaCl 4.4g、甘油520g，另加4mL消泡剂，罐内110-115℃高压灭菌30分钟。

发酵工艺：用日本丸菱理化装置研究所生产的30L发酵罐(型号：MSJ-J2)进行发酵工艺。对发酵罐中发酵培养基进行在线灭菌华东华东理工大学生物工程学院的FC-280型溶解氧监控仪进行溶氧的监测和控制。

将1800mL二级种子接入装有经灭菌的12L发酵培养基的发酵罐中开始发酵，发酵工艺主要包含三个时相，即生长时相、去阻遏时相和诱导表达时相。

生长时相：发酵罐pH值控制在5.4-5.5，发酵温度控制在30℃±2℃，管压0.5Kg/cm²。发酵罐内溶氧会缓慢下降，当下降至60％(体积比)左右时，连接好补料管路，用蠕动泵匀速打入约800mL补料培养基。当发酵罐溶氧水平降至40％以下时，将空气流量调至15L/min，搅拌转速调至700rpm。生长时相后期(发酵约22小时)，若细胞生长状态良好，发酵罐溶氧水平可下降至20％以下，细胞OD₆₀₀达到80以上。

去阻遏时相：溶氧回升前将蠕动泵电源插头与溶解氧监控仪信号输出电源连接；监控仪溶氧控制在40，死区为2，高端打开；蠕动泵电源开关关闭。当观察到发酵罐溶氧由最低点回升到60％以上时，进入去阻遏时相。此时打开蠕动泵电源开关，设定泵速22rpm，开始流加去阻遏培养基。去阻遏后期，若细胞生长良好，OD₆₀₀可达到300以上。

诱导时相：去阻遏时相持续24小时，进入诱导时相，开始补加诱导培养基，通过甲醇电极控制甲醇浓度0.3％(V/V)，整个发酵时间大约为96小时。

在进行发酵过程中，可根据发明内容记载的发酵工艺参数进行调整，均可实现发酵效果。

实施例7蛋白质的纯化

样品预处理：﹣72℃冻存细胞4℃融解，加200mM PMSF至终浓度4mM，悬液混匀后，用高压均质机在1300BAR条件下将细胞破碎两遍。用Sigma 6K-15离心机8000rpm离心25min，取上清液，用赛多利斯Sartocon 2Plus切向流系统10KDa膜超滤，浓缩3倍，用8倍缓冲液A(25mM pH7.2磷酸盐缓冲液，0.1M NaCl，4mM EDTA，0.03％Tween80)充分置换，去除小分子杂质。

强阳离子交换层析：应用QXL强阴离子交换层析树脂填充层析柱(26mmID×100mm)，该柱在使用前用0.5M NaOH清洁消毒。在室温下用缓冲液A平平衡层析柱。室温下超滤样品以15mL/min的速度上柱，用8个柱体积的缓冲液A以15mL/min的速度流洗，100％缓冲液A到100％缓冲液B(25mM pH7.2磷酸盐缓冲液，2M NaCl，4mMEDTA，0.03％Tween80)线性梯度洗脱层析柱，总的线性梯度为10个柱体积，收集所有吸收峰的流分。梯度洗脱后用5个柱体积的缓冲液B以15mL/min的速度冲柱，接着用10个柱体积的1M NaOH冲柱，最后用缓冲液A以15mL/min的速度冲柱平衡。

羟基磷灰石柱层析：以平衡液(50mM MOPS，0.7M pH7.2NaCl)用10KDa膜超滤充分置换QXL强阴离子交换层析洗脱下的有效成分，用于羟基磷灰石柱层析上样样品。

40g羟基磷灰石用200mM pH7.0磷酸盐缓冲液充分溶胀后装填(16mmID×360mm)层析柱。流速3mL/min，6个柱体积的平衡液。样品为平衡液超滤浓缩、恒滤，取50mL用平衡液3倍稀释，流速3mL/min上样。分别经过4个柱体积的平衡液，2个柱体积的洗脱液Ⅰ(50mM MOPS，0.7M pH7.2NaCl，5mM Na₃PO₄)，流速3mL/min流洗。用8个柱体积100％洗脱液Ⅰ到100％洗脱液Ⅱ(50mM MOPS，0.7M pH7.2NaCl，200mMNa₃PO₄)梯度洗脱，收集洗脱峰的流分。用1.5个柱体积的洗脱液Ⅲ(50mM MOPS，0.7MpH7.2NaCl，500mM Na₃PO₄)洗脱，收集洗脱峰的流分。用Bradford法、SDS-PAGE电泳、west-blot检测分析各洗脱峰的含量纯度。

采用上述方案可依照细胞发酵并纯化得到相应的蛋白质，即HPV58L1蛋白或HPV52L1蛋白。

1.目标蛋白west-blot检测

(1)使用Novagen的酵母专用蛋白抽提试剂YeastBuster提取发酵表达细胞总蛋白，离心去掉细胞碎片，上清液用2×loading Buffer[100mM Tris-Cl，pH6.8，20％(w/v)甘油，2％(w/v)SDS，0.2M DTT，少许溴酚蓝]1∶1混合后沸水浴10分钟；

(2)经SDS-PAGE电泳，应用《分子克隆》第二版蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，将电泳条带转到PVDF膜上，通过预染蛋白Marker指示转膜效果；

(3)使用BSA包被，HPV58L1(CAMVIR-1)：sc-47699单克隆抗体作为一抗，Goatanti Mouse IgG-AP作为二抗，检测目标蛋白特异性，用BCIP/NBT显色试剂盒显色。转化子west-blot方法筛选结果见附图4。其中，1、4为蛋白Marker，从上至下依次为170、130、100、70、55、40、35、25KDa。2道为HPV58全长L1表达转化子，3道为HPV58截短L1表达转化子。

2.电镜检查：为证明58L1蛋白和52L1蛋白确实自动装配形成五邻体L1壳粒，后者接着自动装配入病毒样颗粒，使部分纯化的HPV58L1和HPV52L1蛋白提取物进行透射电子显微镜术(EM)。

细胞在小规模发酵下生长并沉淀，产生的沉淀进行纯化处理。通过免疫印迹分析沉淀和澄清酵母提取物以证明L1蛋白表达和通过纯化步骤的保留。然后使澄清酵母提取物在45％蔗糖垫层上进行离心，并将产生的沉淀悬浮于缓冲液中以通过透射EM进行分析。产生的代表性HPV58L1 VLPs图像在图5中显示，HPV52L1 VLPs图像在图6中显示。这种粗样品中的球状颗粒的直径范围从30至60nm，一些颗粒显示规则排列的壳粒。

3.分别使用HPV52L1和HPV52L1的野生型DNA序列，利用上述相同的载体构建、细胞转染和诱导发酵的工艺方法，以得到野生型基因的总酵母蛋白提取物，分别与相应的设计的基因的总酵母蛋白提取物进行对比

为证明HPV52L1 VLP表达，通过ELISA分析一部分HPV52L1WT(含HPV52L1野生基因)和HPV52L1总酵母蛋白提取物。各自用相同方法使表达HPV52L1WT和HPV52L1的酵母细胞生长，包括旋转管培养、摇瓶和发酵罐。裂解酵母细胞并制备蛋白提取物以确定每微克总蛋白产生的HPV52L1病毒样颗粒(VLPs)的量。夹心ELISA被设计用于证明HPV52L1 VLP表达。将G蛋白纯化的H582C3.F7(F7)单克隆抗体(mAb)用来结合酵母蛋白提取物中的完整HPV52L1 VLPS。F7特异性识别HPV52L1 VLP构象表位。未结合的蛋白被洗掉，并将另一个HPV52L1 VLP构象特异性mAb H586E11.F4(F4)用作检测抗体。真正的构象正确的HPV52L1 VLPs发生结合，且通过使用抗小鼠IgG2bHRP缀合的抗体和TMB(PierceBiotechnology，Inc.,Rockford,IL)底物来促进检测。在450nm波长读平板并通过与参照标准物相比以ng VLP/μg总蛋白测定HPV 52L1 VLPs的浓度。

具体而言，将F7用来于4℃包被Immulon 4HBX 96孔平板的底部过夜。用PBS和0.05％Tween 20洗涤平板三次，随后用封闭液(PBS+0.05％Tween 20+1％BSA)封闭。将平板洗涤三次并将抗原(在封闭液中稀释至12.5μg/ml的总酵母细胞裂解物)一式两份，用于A行。纯化的HPV52L1 VLPS的参照标准物以12.5μg/ml总酵母蛋白中为206ng/ml应用于A行3和4列。然后将参照和试验样品沿着每列连续稀释两倍。室温下三小时后，通过吸出除去过量抗原并洗涤平板3次。在封闭液中稀释F4构象特异性mAb并将其应用于每个孔，室温下进行一小时。洗涤平板三次并在封闭液中稀释抗小鼠IgG2bHRP-缀合的抗体，并在室温下应用1小时。洗涤平板并将TMB(PierceBiotechnology，Inc.,Rockford,IL)应用5分钟以检测HRP缀合的抗体复合物。通过添加2M H₂SO₄终止检测反应。在450nm波长读平板并通过与参照标准物相比以ng VLP/μg总蛋白测定HPV 52L1 VLPs的浓度。

从图7显示数据可知看出，两组使用野生基因的酵母中检测到的VLPs的量(52L1WT)都明显小于本发明中酵母密码子优化后的基因的酵母中检测到的VLPs的量(52L1)，纵坐标为ng VLP/μg Total yeast protein。酵母密码子最优化使HPV52L1VLPs表达水平增加了2-3倍。针对HPV58L1的野生型基因和优化型基因，采用相同方法进行VLPs的对比检测，HPV58L1的野生型和优化型表现出与HPV52L1的野生型和优化型基本相同的性质，即酵母密码子最优化使HPV58L1 VLPs表达水平增加了2-3倍。

4.使用VLPs单价疫苗进行动物免疫实验

(1)小鼠半数有效量(ED₅₀)：使用60只6～8周龄的SPF级NIH或Balb/c小鼠，分为6组，每组10只小鼠。HPV的VLPs单价疫苗制备成浓度160μg/mL，每只小鼠各免疫1mL VLPs疫苗稀释液,浓度分别为：原倍、1:5倍稀释液、1:20倍稀释液、1:80倍稀释液、1:160倍稀释液、1:320倍稀释液。采用腹腔注射1mL，免疫后六周处死采血，血清分离不少于0.5mL，存放于-20℃备用

(2)大耳白兔的免疫和抗血清的采取：用含完全弗式佐剂的HPV58 VLP颗粒抗原，免疫2只大耳白兔。免疫剂量为160μg，免疫后4周和10周各加强一次。免疫后每二周采血一次，将采集的血液置37℃中2h，再移入4℃过夜，4000g离心10min，吸取上清，获得的多抗血清存放于-20℃备用。第10周处死采血，血清分离不少于50mL，存放于-20℃备用。

(3)上述鼠兔实验验证了VLPs单价疫苗的功效和作用，能够有效激发鼠兔产生相应的免疫抗体。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.编码HPV52L1蛋白的核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。

2.编码HPV58L1蛋白的核苷酸序列，如序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。

3.一种载体，含有编码HPV52L1蛋白的核苷酸序列SEQ ID No.1，或者编码HPV58L1蛋白的核苷酸序列SEQ ID No.2。

4.一种真核汉逊酵母工程菌，以含有编码HPV52L1蛋白的核苷酸序列SEQ ID No.1，或者编码HPV58L1蛋白的核苷酸序列SEQ ID No.2的载体转染真核汉逊酵母菌株RB-11，得到转染的真核汉逊酵母菌株RB-11。

5.利用甲醇对转染的真核汉逊酵母菌株RB-11进行诱导表达，其特征在于，在整个过程中温度为28—32℃，时间为72h，开始时甲醇用量为细胞悬浮液质量的0.5％，每间隔24h，向细胞悬浮液中添加甲醇，添加甲醇的量为细胞悬浮液质量的0.5％。

6.利用转染的真核汉逊酵母菌株RB-11进行发酵的方法，其特征在于，在发酵过程中，所述真核汉逊酵母工程菌经过生长时相、去阻遏时相和诱导表达时相：

(1)生长时相：发酵罐pH值控制在5.4-5.5，发酵温度控制在28—32℃，使用的发酵培养基经灭菌处理，由NH₄H₂PO₄170—180质量份、MgSO₄·7H₂O 40—50质量份、KCl 40—45质量份、NaCl 4—5质量份、甘油500—550质量份，发酵消泡剂4—5质量份和去离子水10000—15000质量份组成；在生长时相中，发酵罐内溶氧会缓慢下降，当下降至60％时，向发酵罐中匀速打入补料培养基，使用的补料培养基经灭菌处理，由NH₄H₂PO₄80—90质量份、甘油250—300质量份和去离子水500—550质量份组成；当发酵罐溶氧水平降至40％以下时，将空气流量由起初的25—30L/min调至12—15L/min，搅拌转速由起初的1200—1500rpm调至700rpm；整个生长时相时间在20—25小时，细胞生长状态良好，发酵罐溶氧水平可下降至20％以下，细胞OD₆₀₀达到80以上；

(2)去阻遏时相：当发酵罐溶氧由最低点回升到60％以上时，进入去阻遏时相，维持空气流量和搅拌条件不变，加入去阻遏培养基；所述去阻遏培养基经灭菌处理，由NH₄H₂PO₄25—30质量份、MgSO₄·7H₂O 5—10质量份、KCl 5—8质量份、NaCl 0.5—1质量份、甘油1700—1900质量份和去离子水1200—1350质量份组成，去阻遏时相持续20—25h；

(3)诱导时相：去阻遏时相之后进入诱导时相，向发酵罐中补加诱导培养基，所述诱导培养基经灭菌处理，由甘油和甲醇组成，甘油和甲醇的体积比为(38—40)：(60—65)，调控甲醇的用量，以使甲醇在整个发酵罐的液相体积中，体积百分比为0.3％—0.5％，诱导时相持续48—55h。

7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，在生长时相中，发酵培养基优选由NH₄H₂PO₄170—175质量份、MgSO₄·7H₂O 40—45质量份、KCl 42—44质量份、NaCl 4.2—4.4质量份、甘油520—540质量份，发酵消泡剂4—5质量份和去离子水10000—12000质量份组成，所述发酵消泡剂为THIF—298型生物发酵消泡剂；补料培养基优选由NH₄H₂PO₄85—87质量份、甘油260—280质量份和去离子水520—540质量份组成；补料培养基和发酵培养基的体积比为(0.8—1)：(10—12)。

8.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，去阻遏培养基优选由NH₄H₂PO₄26—28质量份、MgSO₄·7H₂O 6—8质量份、KCl 7—8质量份、NaCl 0.6—0.8质量份、甘油1750—1850质量份和去离子水1300—1350质量份组成。在去阻遏时相中，发酵培养基和去阻遏培养基的体积比为4：(1—1.2)。

9.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，诱导培养基的使用体积为去阻遏培养基体积的30—40％。

10.如权利要求1所述的编码HPV52L1蛋白的核苷酸序列、如权利要求2所述的编码HPV58L1蛋白的核苷酸序列、如权利要求3所述的载体、如权利要求4所述的真核汉逊酵母工程菌在制备病毒样颗粒中的应用。