CN104877963A - 一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基，属于干细胞技术领域，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分：重组人胰岛素、重组转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子、纤维连接蛋白、胎球蛋白和β细胞素。本发明提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基无需进行培养瓶包被，细胞贴壁性和形态良好，细胞增殖速率高。
Description
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，涉及一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基及其制备方法。
背景技术
人脐带间充质干细胞源自脐带华尔氏通胶，是具有明显可塑性和多向分化潜能的一种成体干细胞，在不同生长因子的调节下，可分化成来源于3个胚层的不同组织细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、肝样细胞、心肌样细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰岛样细胞等。除此，人脐带间充质干细胞不表达主要组织相容性II类抗原，微量表达主要组织相容性I类抗原，免疫原性低，移植排斥作用小，而且具有免疫调节功效，移植后的人脐带间充质干细胞分泌的营养因子，具有促血管生成、促细胞生长、抗炎症和抗纤维化等作用。
传统的含动物血清的干细胞培养基给干细胞的生产与科研带来多种不利因素。血清能为干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，使用不方便，成分不明确，有抑制细胞生长的成分，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满足干细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培养基是干细胞走向临床应用的重要条件。
目前已有一些市售间充质干细胞无血清培养基，比如Life Technology的间充质干细胞无血清培养基 StemPro SFM。但是，现有市售无血清培养基存在细胞贴壁差、操作不便等缺陷。比如Gibco无血清培养基、Stem CELL无血清培养基的应用需要进行培养瓶包被。此外，这些培养基培养的细胞增殖速率不够理想。
中国专利CN 102433302公开了一种无血清培养基，该培养基以DMEM/F12为基础培养基，但该发明培养基仅有一种贴壁因子，细胞贴壁性能不够理想。中国专利申请CN 104164404公开了一种人脐带间质干细胞培养基，该培养基以a-MEM为基础培养基，添加的细胞因子及其他组分多达29种，组分非常复杂。
因此，现有技术存在细胞贴壁性差，组分过于复杂，细胞增殖速率不够理想等问题。
发明内容
为解决现有技术中存在的细胞贴壁性差，组分过于复杂，细胞增殖速率不够理想等问题，发明人通过大量试验筛选，得到一种新的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，该培养基无需进行培养瓶包被，操作简便，细胞贴壁性和形态良好，细胞增殖速率高。
本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。
本发明提供一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素 0.5~5mg/mL、重组转铁蛋白 1~5μg/mL、维生素C 5~50μg/mL、人血清白蛋白 0.5~5mg/mL、成纤维细胞生长因子 5~50ng/mL、血小板衍生生长因子 5~50ng/mL、表皮生长因子 5~50ng/mL、胰岛素样生长因子 5~50ng/mL、转化生长因子 5~50ng/mL、纤维连接蛋白 5~50ng/mL、胎球蛋白 0.5~5mg/mL和β细胞素5~50μg /mL。
采用上述技术方案的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，无需添加动物血清，可以实现人脐带间充质干细胞的快速增殖，维持良好的干细胞幼稚状态，具有良好的细胞诱导分化潜能。
本发明提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基中，通过纤维连结蛋白（fibronectin）和胎球蛋白（Fetuin）的协同作用，大大增强了人脐带间充质干细胞的贴壁性能；β细胞素（betacellulin）有助于维持人脐带间充质干细胞的干细胞特性，并防止细胞老化。
优选地，本发明提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素 0.5~2mg/mL、重组转铁蛋白 1~4 μg/mL、维生素C 5~30μg/mL、人血清白蛋白 0.5~2mg/mL、成纤维细胞生长因子 5~20ng/mL、血小板衍生生长因子 5~20ng/mL、表皮生长因子 5~20ng/mL、胰岛素样生长因子 5~20ng/mL、转化生长因子 5~20ng/mL、纤维连接蛋白 5~20ng/mL、胎球蛋白 0.5~3mg/mL和β细胞素5~20μg /mL。
更优选地，本发明提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素 1mg/mL、重组转铁蛋白 2.5μg/mL、维生素C 16.1μg/mL、人血清白蛋白 1mg/mL、成纤维细胞生长因子 10ng/mL、血小板衍生生长因子 10ng/mL、表皮生长因子 10ng/mL、胰岛素样生长因子 10ng/mL、转化生长因子 10ng/mL、纤维连接蛋白 10ng/mL、胎球蛋白 1mg/mL和β细胞素10μg /mL。
优选地，所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子，所述血小板衍生生长因子为PDGF-bb，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1，所述转化生长因子为转化生长因子-β。
优选地，本发明提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，还包括1%体积百分比的非必需氨基酸，例如购自广州赛业生物科技有限公司的非必须氨基酸，货号NEAA-10201-100。
相应地，本发明还提供无血清的人脐带间充质干细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：向IMDM基础培养基中，按所述浓度加入重组人胰岛素母液、重组转铁蛋白母液、维生素C母液、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子母液、血小板衍生生长因子母液、表皮生长因子母液、胰岛素样生长因子母液、转化生长因子母液、纤维连接蛋白母液、胎球蛋白母液和β细胞素母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。
优选地，所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子，所述血小板衍生生长因子为PDGF-bb，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1，所述转化生长因子为转化生长因子-β。
相应地，本发明还提供无血清的人脐带间充质干细胞培养基在人脐带间充质干细胞培养中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，与传统的含血清培养基和其他无血清培养基相比，本发明提供的培养基培养的人脐带间充质干细胞能够保持较好的干细胞幼稚形态，具有更好的细胞增殖速率、细胞干性和细胞诱导分化潜能。本发明提供的制备方法简单，制得的无血清的人脐带间充质干细胞培养基用于人脐带间充质干细胞的培养，表现出优异的细胞性能。
附图说明
图1 含不同浓度β细胞素的培养基对细胞增殖的影响。
图2 P5代人脐带间充质干细胞在3种培养基中培养的形态。
图3 人脐带间充质干细胞在3种培养基中的增殖曲线。
图4 P3代人脐带间充质干细胞在3种培养基中的细胞克隆数量。
图5 培养基1培养的P5代人脐带间充质干细胞的表面抗原表达水平。
图6 培养基2培养的P5代人脐带间充质干细胞的表面抗原表达水平。
图7 培养基3培养的P5代人脐带间充质干细胞的表面抗原表达水平。
图8 3种培养基培养的P5代人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化染色结果图。
图9 3种培养基培养的P5代人脐带间充质干细胞在诱导培养基中的成脂诱导分化相关基因FABP4的表达结果图。
图10 3种培养基培养的P5代人脐带间充质干细胞的成骨诱导分化染色结果图。
图11 3种培养基培养的P5代人脐带间充质干细胞在诱导培养基中的成骨诱导分化相关基因OPN的表达结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明中的各组分均为常规市售产品，例如β细胞素购自Sigma，货号B3670。本发明中，培养基1：本发明实施例二提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基；培养基2：Life Tecnology公司的的StemPro MSC SFM 无血清培养基，货号A10332-01；培养基3：IMDM基础培养基+10%体积百分比的FBS。
实施例一 含不同浓度β细胞素的培养基对细胞增殖的影响
发明人进行大量试验筛选得到本发明提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基配方，并进一步对β细胞素的浓度影响进行了考察。将P1代HUMSC以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，分别用含不同浓度β细胞素的无血清的人脐带间充质干细胞培养基（与培养基1相比，区别仅在于β细胞素的浓度不同）培养，每3天将细胞用0.25%胰酶消化，收集细胞并计算数量，并以5000个/cm2的密度再次接种培养，直至P5代，根据每个代次的细胞收获数量，绘制细胞增殖曲线，结果如图1所示。
从图1可知，β细胞素的浓度为10ng/mL时，细胞增殖速率最高，浓度为5ng/mL和20ng/mL时也具有较高的细胞增殖速率，但浓度达到30ng/mL时，不仅未提高细胞增殖速率，反而降低了细胞增殖速率。因此，β细胞素的浓度对本发明提供的无血清的人脐带间充质干细胞培养基具有至关重要的影响。
实施例二 无血清的人脐带间充质干细胞培养基
无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素 1mg/mL、重组转铁蛋白 2.5μg/mL、维生素C 16.1μg/mL、人血清白蛋白 1mg/mL、bFGF 10ng/mL、PDGF-bb 10ng/mL、EGF 10ng/mL、IGF-1 10ng/mL、TGF-β10ng/mL、纤维连接蛋白 10ng/mL、胎球蛋白 1mg/mL和β细胞素10μg /mL。
制备方法：向IMDM基础培养基中，按所述浓度加入重组人胰岛素母液、重组转铁蛋白母液、维生素C母液、人血清白蛋白、bFGF母液、PDGF-bb母液、EGF母液、IGF-1母液、TGF-β母液、纤维连接蛋白母液、胎球蛋白母液和β细胞素母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。
重组人胰岛素母液的制备：取1g，用0.01mol/L盐酸溶解，配成100mg/mL的母液，-20度保存。重组转铁蛋白母液的制备：取10mg，用IMDM基础培养基溶解，配成2.5mg/mL的母液，-20度保存。维生素C母液的制备：取10g，用IMDM基础培养基溶解，配成16.1mg/mL的母液，-20度保存。bFGF母液的制备：取10mg，用IMDM基础培养基溶解，配成1mg/mL的母液，-20度保存。PDGF-bb母液的制备：取10mg，用IMDM基础培养基溶解，配成1mg/mL的母液，-20度保存。EGF母液的制备：取10mg，用IMDM基础培养基溶解，配成1mg/mL的母液，-20度保存。IGF-1母液的制备：取10mg，用IMDM基础培养基溶解，配成1mg/mL的母液，-20度保存。TGF-β母液的制备：取10mg，用IMDM基础培养基溶解，配成1mg/mL的母液，-20度保存。纤维连接蛋白母液的制备：取10mg，用IMDM基础培养基溶解，配成1mg/mL的母液，-20度保存。Fetuin母液的制备：取1g，用IMDM基础培养基溶解，配成100mg/mL的母液，-20度保存。β细胞素母液的制备：取100 μg，用IMDM基础培养基溶解，配成10mg/mL的母液，-20度保存。
实施例三 无血清的人脐带间充质干细胞培养基
无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素 1mg/mL、重组转铁蛋白 2μg/mL、维生素C 15μg/mL、人血清白蛋白 1.5mg/mL、bFGF 15ng/mL、PDGF-bb 10ng/mL、EGF 10ng/mL、IGF-1 15ng/mL、TGF-β10ng/mL、纤维连接蛋白 15ng/mL、胎球蛋白 3mg/mL和β细胞素 15ng/mL。
制备方法：与实施例二中的制备方法类似。
实施例四 无血清的人脐带间充质干细胞培养基
无血清的人脐带间充质干细胞培养基，包括IMDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素 2mg/mL、重组转铁蛋白 1 μg/mL、维生素C 10μg/mL、人血清白蛋白 2mg/mL、bFGF 15ng/mL、PDGF-bb 15ng/mL、EGF 15ng/mL、IGF-1 10ng/mL、TGF-β10ng/mL、纤维连接蛋白 10ng/mL、胎球蛋白 2mg/mL和β细胞素 5ng/mL。
制备方法：与实施例二中的制备方法类似。
实施例五 人脐带间充质干细胞在培养基中培养的形态
将P1代HUMSC以5000个/cm2的密度接种于培养瓶中，分别用培养基1、培养基2和培养基3培养，待细胞汇合度达85%时进行传代培养，直至P5代，显微镜下观察细胞形态，结果如图2所示。从图2可知，本发明提供的培养基所培养的细胞形态更为均一，呈梭形，维持良好的干细胞幼稚状态，而其他培养基培养的细胞形态不一，并呈现出老化状态。
实施例六 人脐带间充质干细胞在培养基中培养的增殖
将P1代HUMSC以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，分别用培养基1、培养基2和培养基3培养，每3天将细胞用0.25%胰酶消化下来，收集细胞并计算数量，并以5000个/cm2的密度再次接种培养，直至P5代，根据每个代次的细胞收获数量，绘制细胞增殖曲线，结果如图3所示。从图3可知，本发明提供的培养基1所培养的细胞增殖速率更高。
实施例七 人脐带间充质干细胞在培养基中培养的克隆增殖
取P3代HUMSC100个接种于10cm培养皿中，分别加入10mL培养基1、培养基2和培养基3进行培养，每3天半量换液一次，待最大的细胞克隆所含细胞数目为200个以上时，用结晶紫进行染色，肉眼计算培养皿中的细胞克隆数量，结果如图4所示。从图4可知，本发明提供的培养基1所培养的细胞克隆数量更多。
实施例八 人脐带间充质干细胞在培养基中培养的表面抗原表达
取实施例五中分别用培养基1、培养基2和培养基3培养的P5代细胞，应用流式细胞仪鉴定细胞表面抗原CD59、CD45、CD90、HLA-DR的表达水平，结果如图5至图7所示。从图5至图7可知，培养基1、培养基2和培养基3培养的细胞表面抗原均符合人脐带间充质干细胞的表面抗原要求。
实施例九 人脐带间充质干细胞在培养基中培养的成脂诱导分化潜能
取实施例五中分别用培养基1、培养基2和培养基3培养的P5代细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并添加相应的培养基1、培养基2和培养基3进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，并加入成脂诱导分化培养基（购自Life Tecnology公司，货号A10070-01），每3天换液一次，培养3周后，用油红O进行成脂鉴定，结果如图8所示。同时，用qPCR鉴定成脂细胞相关基因FABP4的表达水平，结果如图9所示。从图8和图9可知，本发明提供的培养基1所培养的细胞成脂诱导分化潜能更佳。
实施例十 人脐带间充质干细胞在培养基中培养的成骨诱导分化潜能
取实施例五中分别用培养基1、培养基2和培养基3培养的P5代细胞，以5000个/cm2的密度接种于六孔板中，并添加相应的培养基1、培养基2和培养基3进行培养，待细胞汇合度达80%时，弃去培养基，并加入成骨分化培养基（购自Life Tecnology公司，货号A10072-01），每3天换液一次，培养4周后，用茜素红进行成骨鉴定，结果如图10所示。同时，用qPCR鉴定成骨细胞相关基因OPN的表达水平，结果如图11所示。从图10和图11可知，本发明提供的培养基1所培养的细胞成骨诱导分化潜能更佳。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于：包括IMDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素 0.5~5mg/mL、重组转铁蛋白 1~5μg/mL、维生素C 5~50μg/mL、人血清白蛋白 0.5~5mg/mL、成纤维细胞生长因子 5~50ng/mL、血小板衍生生长因子 5~50ng/mL、表皮生长因子 5~50ng/mL、胰岛素样生长因子 5~50ng/mL、转化生长因子 5~50ng/mL、纤维连接蛋白 5~50ng/mL、胎球蛋白 0.5~5mg/mL和β细胞素5~50μg /mL。
2.根据权利要求1所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于：包括IMDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素 0.5~2mg/mL、重组转铁蛋白 1~4 μg/mL、维生素C 5~30μg/mL、人血清白蛋白 0.5~2mg/mL、成纤维细胞生长因子 5~20ng/mL、血小板衍生生长因子 5~20ng/mL、表皮生长因子 5~20ng/mL、胰岛素样生长因子 5~20ng/mL、转化生长因子 5~20ng/mL、纤维连接蛋白 5~20ng/mL、胎球蛋白 0.5~3mg/mL和β细胞素5~20μg /mL。
3.根据权利要求2所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于：包括IMDM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素 1mg/mL、重组转铁蛋白 2.5μg/mL、维生素C 16.1μg/mL、人血清白蛋白 1mg/mL、成纤维细胞生长因子 10ng/mL、血小板衍生生长因子 10ng/mL、表皮生长因子 10ng/mL、胰岛素样生长因子 10ng/mL、转化生长因子 10ng/mL、纤维连接蛋白 10ng/mL、胎球蛋白 1mg/mL和β细胞素10μg /mL。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于：所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子，所述血小板衍生生长因子为PDGF-bb，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1，所述转化生长因子为转化生长因子-β。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基，其特征在于：还包括1%体积百分比的非必需氨基酸。
6.根据权利要求1所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：向IMDM基础培养基中，按所述浓度加入重组人胰岛素母液、重组转铁蛋白母液、维生素C母液、人血清白蛋白、成纤维细胞生长因子母液、血小板衍生生长因子母液、表皮生长因子母液、胰岛素样生长因子母液、转化生长因子母液、纤维连接蛋白母液、胎球蛋白母液和β细胞素母液，搅拌均匀，过膜除菌即得。
7.根据权利要求6所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于：所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子，所述血小板衍生生长因子为PDGF-bb，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1，所述转化生长因子为转化生长因子-β。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的无血清的人脐带间充质干细胞培养基在人脐带间充质干细胞培养中的用途。
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