CN104871974B - 一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法及专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的专用培养基，本培养基的特点是在胚珠培养和诱导体胚发生过程中可采用同一种基本配方，在不同培养阶段加入不同附加成分即可达到预期效果。本发明还公开一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，葡萄开花后6周田间采集幼果，消毒，依次进行胚珠内胚培养，胚性愈伤组织诱导培养，体细胞胚分化培养，得到体细胞胚离体再生植株，之后进行炼苗、移栽，得到健壮的葡萄植株，诱导分化的体细胞胚数量多，发育整齐，萌发成苗后生长健壮，移栽易于成活。
Description
技术领域
本发明属于植物培养技术领域，具体涉及一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的专用培养基，本发明还提供一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法。
背景技术
葡萄是世界上最古老的果树树种之一，迄今已有5000多年的栽培历史，因其具有适应性强、产量高、营养丰富及多种保健功能深受人们喜爱在我国，葡萄生产一直是农业生产的重要组成部分，近年来，我国葡萄产业得到迅猛发展，对鲜食葡萄品种的要求也越来越高，尤其是无核葡萄，无论用于鲜食、加工或制干都受到国内外消费者的青睐。与其它植物相比，葡萄转基因技术的研究和应用进展相对缓慢。这是由于，转基因技术的发展严格受到再生体系的限制。一般认为，葡萄的再生体系主要有器官发生和胚状体发生两种途径，由于后者具有单细胞起源、不易产生嵌合体等优点，在转基因中具有更大的利用价值。已有的研究表明，葡萄的许多部位如花药、子房、柱头等，卷须等都具有发生体细胞胚的能力，但再生效率普遍较低。
截止目前，以未成熟花药作为外植体诱导产生胚状体的研究和在转基因技术中的应用最为常见。通常包括以下几个步骤：(ⅰ)采集花前未成熟的葡萄花序，经自来水冲洗、70％酒精消毒和0.1％升汞消毒后，无菌水冲洗干净；(ⅱ)剥取花药接种在愈伤组织诱导培养基上，暗培养直至形成愈伤组织；(ⅲ)3-4个月内将胚性愈伤组织转接至体细胞胚分化培养基上，暗培养3-4周；(ⅳ)将诱导获得的体细胞胚依次接种在胚萌发、生根培养基上，光照培养2-3个月；(ⅴ)将生根良好的再生植株进行炼苗和移栽。但是，以花药做外植体诱导体胚发生的缺点是(1)耗时长，从花药接种到形成胚性愈伤组织，一般需要3-4个月时间；(2)诱导效率低，胚性愈伤组织诱导率通常在60％以下；(3)具有严格的基因型依赖性，目前只在很少数品种上可以成功诱导体细胞胚发生，而大多数品种的花药经诱导后发生体细胞胚十分困难，这是目前限制葡萄转基因技术发展的瓶颈。
合子胚由葡萄精子与卵细胞结合后发育而成，在系统发育上与体细胞胚有着相似的发育过程。前人的研究认为，用葡萄的合子胚做外植体，也可以诱导发生体细胞胚，这方面的研究在有核葡萄上已有报道，但在绝大多数无核葡萄上，由于受精后的合子胚发育过程中中途败育，胚珠不能形成正常的种子而仅留下大小不同的种子痕迹。无核葡萄幼胚发育的这一特点使得其合子胚做外植体取材困难，因此在以无核葡萄合子胚为外植体诱导胚性愈伤组织继而诱导分化体细胞胚方面，至今仍缺乏较为系统地研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的专用培养基，解决了现有技术中存在的无核葡萄诱导发生体细胞胚困难和再生植株效率低的问题。
本发明的另一目的是提供诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法。
本发明所采用的第一技术方案是，一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的专用培养基，其组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水。
本发明所采用的第二技术方案是，一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1、葡萄开花后6周田间采集幼果，自来水冲洗10min；在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟后，再用0.1％的HgCl2浸泡8分钟，无菌水漂洗3次；
步骤2、消毒后的果粒置于灭过菌的培养皿中，无菌条件下取出胚珠，接种在合子胚发育培养基上进行胚珠内胚培养；合子胚发育培养基为固液双相的TL培养基，其中附加蔗糖6.0g/L，活性炭1.5g/L；
步骤3、胚珠在合子胚发育培养基上培养6周后，无菌条件下取出发育的幼胚，接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上，胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；
步骤4、幼胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养4周后，将获得的黄色、颗粒状、发育紧实的胚性愈伤组织接种在固体的体细胞胚分化培养基上，体细胞胚分化培养基的成分为TL+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA，其中，附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；
步骤5、胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养3-4周后，将获得的体细胞胚接种在TL+0.2mg/L IBA培养基上，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，令其萌发成苗；每4周继代一次，2月内获得具有正常的根、茎和真叶的体细胞胚离体再生植株；
步骤6、将离体条件下根系发育良好的植株经温室炼苗后用清水洗净其上附着的琼脂，移栽入装有营养土的营养钵内，成活后的幼苗进行常规管理，发育成健壮的葡萄植株。
在上述技术方案中，TL培养基的组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水。
步骤3中胚珠在合子胚发育培养基上培养条件为：25℃弱光条件下，光照强度800Lux，光照时间16h/d。
步骤4中幼胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养条件为：25℃黑暗条件。
步骤5中胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养条件为：25℃黑暗条件。
体细胞胚在TL+0.2mg/L IBA培养基上培养条件为：25℃光照条件下培养，光照强度2000Lux，光照时间16h/d。
本发明的有益效果是：本发明使用的培养基原料中含有多种促进胚性细胞发育的活性因子，营养搭配合理，能有效促进无核葡萄合子胚在离体条件下迅速形成胚性愈伤组织继而分化体细胞胚，从接种合子胚至诱导产生胚性愈伤组织只需20-30天时间，胚性愈伤组织形成比率可以达到80％以上，明显高于以通常使用的以花药为外植体的诱导方法；应用本发明，我们已经在多个无核葡萄品种上通过试验获得了成功。而且诱导分化的体细胞胚数量多，发育整齐，萌发成苗后生长健壮，移栽易于成活。本发明主要用于以无核葡萄合子胚为外植体的胚性愈伤组织和体细胞胚诱导发生，也可用于有核葡萄幼胚和成熟胚的体细胞胚诱导发生，亦可用于葡萄树植物体细胞胚的长期保存和萌发成苗培养，诱导获得的胚性愈伤组织、原胚细胞团和体细胞胚可用于遗传转化、细胞工程和人工种子构建等方面的研究。本培养基的特点是在胚珠培养和诱导体胚发生过程中可采用同一种基本配方，在不同培养阶段加入不同附加成分即可达到预期效果。
附图说明
图1是诱导无核葡萄的幼胚发生发生体细胞胚及植株再生培养的过程；其中，A，胚珠培养；B，胚珠内发育的幼胚；C，从胚珠内取出的幼胚；D，幼胚经诱导后获得的胚性愈伤组织；E，胚性愈伤组织表面发生的大量体细胞胚；F，萌发前的体细胞胚；G，萌发后的体细胞胚；H，体细胞胚再生获得的植株；I，移栽后成活的体细胞胚再生植株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的专用培养基，命名为TL培养基，其组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水。
本发明提出的TL培养基配方组分合理，可以有效促进无核葡萄体细胞胚的发生、分化和生长，其培养效率明显优于葡萄组织培养领域通常使用的MS和NN培养基，比对结果见表1。
表1不同培养基诱导“无核白”幼胚发生胚性愈伤组织及体细胞胚的效果对比
诱导幼胚发生胚性愈伤组织阶段不同培养基添加激素均为0.5mg/L6-BA+1.0mg/L2，4-D；诱导体细胞胚发生阶段不同培养基添加激素均为0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA。
从表1可以看出，本发明培养基的胚性愈伤组织诱导率和体细胞胚发生率均高于MS培养基和NN培养基。
本发明还提供一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，培养过程如图1所示，具体按照以下步骤实施：
步骤1、葡萄开花后6周田间采集幼果，自来水冲洗10min；在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟后，再用0.1％的HgCl2浸泡8分钟，无菌水漂洗3次；
步骤2、消毒后的果粒置于灭过菌的培养皿中，无菌条件下取出胚珠，接种在合子胚发育培养基上进行胚珠内胚培养；合子胚发育培养基为固液双相的TL培养基，其中附加蔗糖6.0g/L，活性炭1.5g/L，TL培养基为上述诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的专用培养基；
步骤3、胚珠在合子胚发育培养基上培养6周后(25℃弱光条件下，光照强度800Lux，光照时间16h/d)，无菌条件下取出发育的幼胚，接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上，胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；
步骤4、幼胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养4周后(25℃黑暗条件下)，将获得的黄色、颗粒状、发育紧实的胚性愈伤组织接种在固体的体细胞胚分化培养基上，体细胞胚分化培养基的成分为TL+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA，其中，附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；
步骤5、胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养3-4周后(25℃黑暗条件下)，将获得的体细胞胚接种在TL+0.2mg/L IBA培养基上，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，令其萌发成苗(25℃光照条件下培养，光照强度2000Lux，光照时间16h/d)；每4周继代一次，2月内可获得具有正常的根、茎和真叶的体细胞胚离体再生植株；
步骤6、将离体条件下根系发育良好的植株经温室炼苗后用清水洗净其上附着的琼脂，移栽入装有营养土的营养钵内，成活后的幼苗进行常规管理，可发育成健壮的葡萄植株。
本发明中胚珠在合子胚发育培养基上的培养时间为6周，大于或小于这个范围胚性愈伤组织诱导率明显降低(见表2)。采用不同培养基配方诱导无核葡萄发生胚性愈伤组织和体细胞胚发生的效果明显不同，本发明提出的TL培养基配方，其培养效率明显优于葡萄组织培养领域通常使用的MS和NN培养基。
表2不同胚珠培养时间对“无核白”幼胚胚性愈伤组织诱导率和体细胞胚诱导率的影响
Claims (6)
1.一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的专用培养基，其特征在于，其组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水。
2.一种诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1、葡萄开花后6周田间采集幼果，自来水冲洗10min；在超净工作台上用70％的酒精浸泡1分钟后，再用0.1％的HgCl2浸泡8分钟，无菌水漂洗3次；
步骤2、消毒后的果粒置于灭过菌的培养皿中，无菌条件下取出胚珠，接种在合子胚发育培养基上进行胚珠内胚培养；合子胚发育培养基为固液双相的TL培养基，其中附加蔗糖6.0g/L，活性炭1.5g/L；
步骤3、胚珠在合子胚发育培养基上培养6周后，无菌条件下取出发育的幼胚，接种在固体的胚性愈伤组织诱导培养基上，胚性愈伤组织诱导培养基的成分为TL+0.5mg/L6-BA+1.0mg/L 2，4-D，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；
步骤4、幼胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养4周后，将获得的黄色、颗粒状、发育紧实的胚性愈伤组织接种在固体的体细胞胚分化培养基上，体细胞胚分化培养基的成分为TL+0.5mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA，其中，附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L；
步骤5、胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养3-4周后，将获得的体细胞胚接种在TL+0.2mg/L IBA培养基上，其中附加蔗糖30g/L，琼脂6.0g/L，令其萌发成苗；每4周继代一次，2月内获得具有正常的根、茎和真叶的体细胞胚离体再生植株；
步骤6、将离体条件下根系发育良好的植株经温室炼苗后用清水洗净其上附着的琼脂，移栽入装有营养土的营养钵内，成活后的幼苗进行常规管理，发育成健壮的葡萄植株；
所述TL培养基的组分和含量如下：硝酸钙250.0mg/L，硝酸钾600.0mg/L，氯化钾75.0mg/L，硝酸铵300.0mg/L，硫酸镁1200.0mg/L，磷酸二氢钾300.0mg/L，硫酸锰3.0mg/L，碘化钾0.8mg/L，硼酸0.5mg/L，硫酸锌0.5mg/L，亚硒酸钠0.25mg/L，氯化钴0.025mg/L，硫酸铜0.025mg/L，钼酸钠0.025mg/L，柠檬酸铁10.0mg/L，盐酸硫胺素0.25mg/L，盐酸吡哆辛0.25mg/L，D-泛酸钙0.25mg/L，烟酸0.25mg/L，天冬酰胺300mg/L，甘氨酸5.0mg/L，精氨酸2.0mg/L，肌醇50.0mg/L，水解酪蛋白500.0mg/L，L-半胱氨酸121.16mg/L，蔗糖30000mg/L，琼脂6000mg/L，其余为蒸馏水。
3.根据权利要求2所述的诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，所述步骤3中胚珠在合子胚发育培养基上培养条件为：25℃弱光条件下，光照强度800Lux，光照时间16h/d。
4.根据权利要求2所述的诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，所述步骤4中幼胚在胚性愈伤组织诱导培养基上培养条件为：25℃黑暗条件。
5.根据权利要求2所述的诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，所述步骤5中胚性愈伤组织在体细胞胚分化培养基上培养条件为：25℃黑暗条件。
6.根据权利要求2所述的诱导无核葡萄幼胚发生体细胞胚的方法，其特征在于，所述体细胞胚在TL+0.2mg/L IBA培养基上培养条件为：25℃光照条件下培养，光照强度2000Lux，光照时间16h/d。
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