CN104830901A

CN104830901A - 一种鼠肿瘤模型的构建方法及其应用

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Publication number: CN104830901A
Application number: CN201510029926.8A
Authority: CN
Inventors: 王涛; 范克索; 周鹏飞; 罗振; 刘杨; 刘勇; 熊辉
Original assignee: YZY BIOPHARMA CO Ltd
Current assignee: YZY BIOPHARMA CO Ltd
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明提供了一种鼠肿瘤模型的构建方法，该方法包括：制备表达人源肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞系；和将所述鼠肿瘤细胞系接种至免疫系统正常的小鼠以形成肿瘤。本发明还提供了一种评价双特异性抗体治疗肿瘤的效力的系统，包括：表达人源肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞系，用于接种至免疫系统正常的小鼠以形成肿瘤；和对照试剂。

Description

一种鼠肿瘤模型的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及鼠肿瘤模型的构建方法及其应用。更具体地，本发明涉及用于评价双特异性抗体治疗其靶向抗原相关疾病效力的鼠肿瘤模型的构建方法，以及评价双特异性抗体治疗其靶向抗原相关疾病效力的系统。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，BiAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能。BiAb在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。通过BiAb介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特点是BiAb能同时结合肿瘤相关抗原和免疫效应细胞上的靶分子，从而促进免疫效应细胞识别肿瘤细胞，并形成免疫复合体，直接触发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。以下是针对所研究的免疫细胞抗原和肿瘤细胞抗原，以及相关技术发展的一些背景技术介绍。

1.CD3

CD3分子由4个亚基组成：δ、ε、γ、ζ，其分子质量分别为18.9k Da、23.1k Da、20.5k Da、18.7k Da，其长度分别有171、207、182、164个氨基酸残基。它们一起组成6条肽链，常与TCR紧密结合形成含有8条肽链的TCR-CD3复合体，结构示意图见图1。此复合体具有T细胞活化信号转导，稳定T细胞受体(TCR)结构的功能。CD3胞质段含免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)，TCR识别并结合由MHC(major histo-compatibility complex)分子提呈的抗原肽，导致CD3的ITAM的保守序列的酪氨酸残基被T细胞内的酪氨酸蛋白激酶p56lck磷酸化，然后可募集其他含有SH2(Scr homology 2)结构域的酪氨酸蛋白激酶(如ZAP-70)。ITAM的磷酸化和与ZAP-70的结合是T细胞活化信号传导过程早期阶段的重要生化反应之一。因此，CD3分子的功能是转导TCR识别抗原所产生的活化信号。

2.HER2

1981年Shih等(Shih C,Padhy LC,Murray M,et al.Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts[J].Nature,1981,290(5803):261-264.)首次从大鼠神经母细胞瘤基因组中克隆出癌基因neu，Slamon等(1987,Science 2；35；177-182)从人cDNA文库中分离出HER2基因。随后的序列分析和染色体谱分析发现neu和HER2为同一个基因，习惯上称为HER2/neu基因或c-erbB-2基因。HER2是人类表皮生长因子受体家族的第2个成员，该家族属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶,又称ErbB受体家族,其在许多正常和异常表皮细胞的生长、分化和转移过程中起着重要的调控作用，许多肿瘤的发生、发展和病情轻重与其活性大小密切相关。家族内共有四个受体：HER1，HER2，HER3和HER4。这些受体可以相互作用产生异源或同源二聚体，激活细胞内多条信号转导通路，其中HER2在细胞信号转导过程中起着重要作用。HER2的结构包括胞外生长因子的结合区，亲脂的跨膜区和带有调节羧基末端片段的胞内区。HER2受体胞内区有酪氨酸蛋白激酶PTK活性，自身也具有若干酪氨酸残基Tyr磷酸化位点。特异性生长因子与HER2受体结合后可诱导二聚体化并激发受体的交叉磷酸化，磷酸化的受体可以把细胞外的生长信号迅速转导至核内，刺激控制与细胞分裂有关的基因表达。

HER2定位于人染色体17q21，编码分子量为185kD的跨膜蛋白，具有酪氨酸激酶RTK活性，正常情况下处于非激活状态，参与细胞正常分化的调节，通常只在胎儿期表达，成年后，仅在极少数正常组织内微量表达。正常细胞中HER2基因为2个拷贝,基因突变可将其激活，其扩增将导致转录上调，蛋白合成增加，从而抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖，上调血管内皮生长因子VEGF/血管通透性因子VPF，促进肿瘤新生血管生成，增加肿瘤细胞侵袭力，破坏机体组织抗侵袭屏障等[Artufel MV,Valero AC,Llado RR,etal.Molecular Protocol for Her-2/neu analysis in breast carcinoma[J].Clin Transl Oncol,2005,7.(11):504-511.]。HER2蛋白的过度表达也在细胞的分裂、增殖、转化、促进肿瘤的转移、侵袭、粘附中发挥重要作用[Hynes NE,Stem DF.The biology of erbB-2/neu/HER-2and its role in cancer[J].Biochem Biophys Acta,1994,1198(2-3):165-184.]。

除可发生基因突变或扩增外,上调HER2的表达也可激HER2下游的两个主要信号转导途径：MAPK通路，PI3K/Akt通路，从而引发瀑布式连锁反应，调节凋亡相关基因，促进细胞无限增殖分化，抑制凋亡，从而发生癌变。前者主要参与细胞的有丝分裂，后者主要影响细胞的存活和凋亡。HER2可通过MAPK途径活化Ets转录因子家族成员ER81而上调人端粒末端转移酶逆转录酶hTERT,进而导致细胞端粒末端转移酶异常活化,使细胞转化并进入永久增殖状态[Gouel iBS,JanknechtR.Upregulation of the catalytic telomerase subunit by the transcription factor ER81and oncogenic HER2/Neu,Ras,or Raf.Mol Cel l Biol,2004,24:25-35.]。PI3K活化后，可催化磷脂酰肌醇PI生成PIP2和PIP3，它们是细胞内重要的第二信使，能激活下游的蛋白激酶Akt/PKB，进一步导致下游BAD蛋白的磷酸化,从而阻止BAD与凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL组成复合物,同时还诱导叉头转录因子1磷酸化,从而抑制原凋亡基因的表达。

另外，HER2癌基因也是肿瘤转移驱动因子,HER2过表达能通过启动多种转移相关机制而增加肿瘤细胞转移能力，如细胞迁移率、体外侵袭力、W型胶原酶活性等，还可以影响某些黏附分子如上皮细胞钙黏蛋白等的合成，从而促进转移。Carter等(CarterW,Hoying J,Boswel l C,et al.HER-2/neu over-expression induces endothel ial cel l retraction[J].Int Cancer,2001,91(3):295-299.)研究认为，HER2过表达可使内皮细胞收缩，细胞间隙增宽，肿瘤细胞易于从内皮细胞间穿越，肿瘤细胞发生移位或转移。多数研究认为，HER2基因扩增和(或)蛋白过表达往往提示肿瘤恶性程度高，转移能力强。

HER2的过表达常与肿瘤的发生有关，例如：

(1)胃癌：胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,预后差,进展期胃癌5年生存率仅为5％～20％,中位生存时间不超过1年。不同的研究小组检测HER2蛋白在胃癌中过表达的比率变异为7％～43％。HER2蛋白在胃癌中的阳性表达与肿瘤分化程度、Lauren分型及WHO分型有关,与年龄、性别、肿瘤发生部位及临床分期不相关。

(2)乳腺癌：研究表明,HER2在20％～30％的原发性乳腺浸润性导管癌中有基因的扩增和蛋白的过度表达。HER2的高表达常导致细胞的恶性转移,因此HER2阳性的乳腺癌浸润性强,无病生存期短,预后差。体外实验显示,抑制HER2的表达可导致肿瘤细胞的凋亡。

(3)卵巢癌：卵巢癌是妇科肿瘤致死的主要原因。卵巢癌中HER2的过表达与乳腺癌中相似,占15％～30％。Verri等(Verri E,Gugl ielmini P,Puntoni M,et al.HER2/neu oncoprotein overexpression in epithel ial ovarian cancer:evaluation of its prevalence and prognostic significance[J].Oncology,2005,68:154-161.)的研究显示,HER2阳性(2+/3+)患者比阴性患者(0/1+)总生存期显著降低(29个月vs48个月,P<0.05)。观察Ⅲ、Ⅳ期的卵巢癌20个卵巢细胞株发现,均存在HER2蛋白过表达。

(4)前列腺癌：前列腺癌发生时属于雄激素依赖性,在接受药物或手术去势治疗后肿瘤退缩,但最终会转变为雄激素非依赖性而继续生长,这是目前前列腺癌治疗中最主要的问题。研究表明,HER2是前列腺癌从激素依赖型转变为激素非依赖型过程中的主要介导者。Signoretti等(Signoretti S,Montironi R,Manola J,et al.Her-2-neu expression and progression toward androgen independence in human prostate cancer[J].J Natl Cancer Inst,2000,92:1918-1925.)研究分析不同临床阶段肿瘤样本HER2的DNA、RNA以及蛋白质的表达水平,结果显示,25％的仅手术切除前列腺癌的患者(UNTtumor),59％的手术前接受抗雄激素治疗的患者(TAAtumor)和78％的雄激素治疗失败后并且发生骨转移(雄激素非依赖型AI)的患者存在过表达的HER2。

(5)肺癌：肺癌中HER2的过表达主要与基因转录和转录后修饰有关。国内研究显示,HER2过表达主要发生在非小细胞肺癌,且主要是腺癌,而不是鳞癌。但是,国外88 例匈牙利非小细胞肺癌患者的检测结果显示,仅有5例存在HER2过表达,且均为鳞状细胞癌,研究结果存在差别。此外,对HER2在肺癌中过表达与细胞分化程度的关系也有不同的结论。

针对HER2靶点的抗体药物：曲妥珠商品名为赫赛汀Herceptin，是以HER2为靶点的人源化单克隆抗体。Herceptin是通过基因工程方法将非特异性的人IgG的稳定区与鼠的抗HER2蛋白IgG的抗原决定簇嵌合在一起获得的,其不仅对HER2受体有高度亲和力,同时还解决了鼠源性抗体应用于人体的免疫源性问题,能减少人抗鼠抗体的产生,从而避免被网状内皮系统清除。体内外实验研究表明，应用Herceptin下调的表达，能使细胞生长减慢，并能显著提高其对放化疗的敏感性。1998年美国FDA批准该药用于HER2过表达的转移性乳腺癌二线和三线治疗，是第一个被批准用于治疗HER2/neu蛋白表达阳性转移性乳腺癌和早期乳腺癌的人源化单克隆抗体药物。

3.EpCAM

EpCAM(CD326)是I型跨膜糖蛋白，作为上皮细胞的特异性细胞粘附分子。它还涉及到其他一些过程，包括细胞迁移，增殖，分化等。EpCAM是最早应用单克隆抗体技术鉴定出的肿瘤相关抗原之一，它以多聚体的形式广泛表达于上皮组织表面，介导钙非依赖性细胞间同型黏附功能,据此可归入粘附分子家族。EpCAM还具备粘附分子家族的其他特性，参与包括细胞与基质的相互作用、迁移、细胞分化、形态、细胞周期调节、信号传导、代谢等多种过程。同时,EpCAM在多种上皮来源的肿瘤中呈过表达,提示其与肿瘤密切相关。病理情况下，EpCAM不同程度的表达于腺癌中，包括结直肠癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝细胞癌和视网膜母细胞瘤。多项研究已证实EpCAM的表达与乳腺癌和结肠癌细胞的增殖、周期分布、转移有关(见表1)。单特异性抗EpCAM单克隆抗体(MAB)，例如单抗17-1A(glaxowellcome，Centocor)，是第一个在德国批准的EpCAM导向治疗结直肠癌的药物，然而，大量的临床用药数据显示，这种单特异性抗体与化疗相比没有更加有益的效果。目前，一些其他的EpCAM定向治疗，包括双特异性抗体，正在发展为癌症治疗的方向，双特异性抗体MT110和Catumaxomab都是针对肿瘤抗原EpCAM的治疗性双抗体药物，其中 Catumaxomab已于2009年由欧盟批准用于恶性癌性腹水，MT110已在临床研究中。显然，EpCAM已成为目前肿瘤治疗研究的热点靶标之一。

表1 EpCAM广泛的肿瘤分布

肿瘤	EpCAM阳性率
		卵巢癌	88-100％
胃癌	98％
		结肠癌	99％
胰腺癌	96％
		乳腺癌	90％
子宫内膜癌	91-96％
		肺癌	87％
前列腺癌	98％

4.双特异性抗体技术发展

双特异性抗体，一个抗体分子中的两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位的抗体。

抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的生物大分子药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点。单克隆抗体在临床上主要应用于以下三个方面：肿瘤治疗、免疫性疾病治疗以及抗感染治疗。其中肿瘤的治疗是目前单抗应用最为广泛的领域，目前已经进入临床试验和上市的单抗产品中，用于肿瘤治疗的产品数量占比大概为50％。单克隆抗体治疗肿瘤是一种针对病变细胞特异靶点刺激免疫系统来杀伤靶细胞的免疫疗法，为了增强抗体的效应功能，特别是杀伤肿瘤细胞的效果，人们尝试多种方法改造抗体分子，双特异性抗体是改善抗体治疗效果的发展方向之一，现已成为抗体工程研究领域的热点。

用于免疫治疗的双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。

5.肿瘤的过继免疫治疗

肿瘤的过继免疫治疗是将自体或异体的免疫活性细胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能，主要包括LAK细胞、TIL细胞和CIK细胞的免疫治疗。而免疫疗法只能清除少量的、零散的肿瘤细胞，对于晚期的实体肿瘤疗效有限。故常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规方法联合应用。先用常规方法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿瘤综合治疗的效果。然而，一种更理想的方式应该是，对于培养好的免疫细胞，双特异性抗体结合其表面CD3，随同免疫细胞一起输入体内，而双特异性抗体的另一端能很好地结合肿瘤细胞的表面抗原；这样，双特异性抗体在体内就能在肿瘤细胞和免疫细胞之间架起一座桥梁，使免疫细胞集中在肿瘤细胞周围，进而对肿瘤细胞进行杀伤。有效解决其转移和扩散，克服了手术、放化疗三大传统治疗方式后的“不彻底、易转移、副作用大”等弊端。

然而，在双特异性抗体药物研发过程中，特别是体内药效研究，很难建立一种由完整免疫系统介导的免疫杀伤模型，现有的肿瘤药效模型集中于针对单克隆抗体的肿瘤药效模型，都是将人源肿瘤细胞系接种到免疫缺陷小鼠，形成肿瘤并通过药物直接抑制肿瘤生长，未能高效利用免疫系统。因此建立完整的免疫杀伤模型显得尤为重要。

发明内容

术语和缩略语

BiAb:bispecific antibody

TA:肿瘤抗原(tumor antigen)

VH:重链可变区(heavy chain variable region)。

VL:轻链可变区(light chain variable region)。

CDR：是英文Complementarity determining regions(CDRs)的缩写，是指抗体的抗原互补决定区。

ScFv：单链可变区抗体片段(single-chain variable fragment)，又称为单链抗体。

MSBODY：双特异性抗体(monomer and ScFv bispecific antibody)。

CLD:细胞系开发(cell line development)

FACS：荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated cell sorting)，也称为流式细胞分选术。

本发明的目的是在免疫系统正常的小鼠中形成表达人源肿瘤抗原(即抗体靶标)的肿瘤，同时利用小鼠的免疫细胞有效杀伤和/或抑制肿瘤。与现有技术相比，根据本发明构建的鼠肿瘤模型高效利用了免疫系统，提高了抑制肿瘤的效果并降低了给药剂量。

本发明一方面提供了一种鼠肿瘤模型的构建方法，该方法包括：制备表达人源肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞系；和将所述鼠肿瘤细胞系接种至免疫系统正常的小鼠以形成肿瘤。在本发明的一个实施方案中，所述人源肿瘤抗原是人源HER2或EpCAM。

在本发明的另一个实施方案中，制备表达人源肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞系的步骤包括：准备鼠肿瘤细胞；获得抗原基因并构建表达载体；用所述表达载体转染细胞系；和筛选稳定细胞系。

在本发明的另一个实施方案中，鼠肿瘤细胞系是B16小鼠黑色素瘤细胞或CT26.WT小鼠结肠癌细胞。在本发明的另一个实施方案中，将表达人源肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞系以2×10⁶细胞/只小鼠的量皮下接种至小鼠。

本发明提供的鼠肿瘤模型的构建方法可用于评价双特异性抗体治疗其靶向抗原相关肿瘤的效力。在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤是表达HER2或EpCAM特异抗原的肿瘤细胞所引起的肿瘤。

本发明另一方面提供了一种评价双特异性抗体治疗肿瘤的效力的系统，包括：表达人源肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞系，用于接种至免疫系统正常的小鼠以形成肿瘤；和对照试剂。在本发明的一个实施方案中，所述人源肿瘤抗原是人源HER2或EpCAM。在本发明的另一个实施方案中，所述起始鼠肿瘤细胞系是B16小鼠黑色素瘤细胞或CT26.WT小鼠结肠癌细胞。

根据本发明的鼠肿瘤模型构建方法，表达人源HER2或EpCAM蛋白的鼠肿瘤细胞系是通过构建全长人源HER2或EpCAM蛋白基因质粒，转染鼠肿瘤细胞系后，加压筛选得到稳定表达人源HER2或EpCAM的鼠肿瘤细胞系，该细胞系能在具有正常免疫系统的小鼠中形成肿瘤，并表达相应双抗体靶向的人源HER2或EpCAM。

而根据本发明构建的鼠肿瘤模型正是利用构建的表达人源HER2或EpCAM的稳定鼠细胞系在具有正常免疫系统的老鼠体内高效地形成肿瘤，并利用构建的双特异性抗体介导，其能同时结合肿瘤细胞、表达CD3的T细胞以及能Fc结合的免疫佐细胞，在老鼠免疫细胞和肿瘤细胞间搭起一座桥梁，形成一个免疫复合体，免疫细胞发生强烈的免疫反应，分泌多种细胞因子，对肿瘤细胞进行杀伤，从而抑制肿瘤的生长。

根据本发明构建的鼠肿瘤模型是一个在完整的免疫系统中开展的，利用免疫系统细胞对肿瘤进行杀伤，并能有效的反映双特异性抗体介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞的药效，为靶向免疫细胞和肿瘤细胞的双特异性抗体药物开发提供一个很好药效评估系统。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1.CD3分子结构示意图。

图2.MSBODY结构示意图。1：盐桥；2：隆突-入-穴；3：人lgG1的Fc；4：抗体A的VH和CH1；5：抗体B的ScFv；6：抗体A的轻链。

图3a.M806双特异性抗体分子示意图。

图3b.M706双特异性抗体分子示意图。

图4a.PCR产物电泳检测图；4a-A，M:DL10000核酸分子量标记；1:赫赛汀HC；2:赫赛汀LC；4a-B，M:DL10000核酸分子量标记；1:2C11-ScFv；2:hIgG1-Fc。

图4b.PCR产物电泳检测图；4b-A，M:DL2000核酸分子量标记；1:抗-EpCAM HC；2:抗-Ep-CAM LC；4b-B，M:DL10000核酸分子量标记；1:2C11-ScFv；2: hIgG1-Fc；

图5a.M806纯化后6％非变性SDS-PAGE电泳和SEC检测纯度；5a-A，M:蛋白分子量标记；1:M806双特异性抗体；5a-B，M806双特异性抗体SEC分析图。

图5b.M706纯化后6％非变性SDS-PAGE电泳和SEC检测纯度结果图；5b-A，M:蛋白分子量标记,1:M706双特异性抗体非还原SDS-PAGE,2:还原SDS-PAGE；5b-B，M706双特异性抗体SEC分析图。

图6a.基于流式方法的亲和力分析情况图；6a-A，M806双特异性抗体结合NCI-N87细胞表面的HER2的亲和力测定；6a-B，M806双特异性抗体结合鼠PBMC细胞表面的CD3的亲和力测定。

图6b.检测M706与细胞表面EpCAM和细胞表面CD3亲和力情况图；6b-A,(■)M706与HCT116细胞表面的EpCAM的亲和力，(●)Anti-EpCAM与HCT116细胞表面的EpCAM的亲和力；6b-B,(●)M706与Jurkat细胞表面的CD3的亲和力。

图7a.转染48小时后流式检测转染效率和表达情况图；7a-A，B16转染HER2基因后的检测；7a-B，CT26转染HER2基因后的检测。

图7b.转染48小时后流式检测转染效率和表达情况图；7b-A，B16转染EpCAM基因后的检测；7b-B，CT26转染EpCAM基因后的检测；

图8a.筛选HER2阳性克隆分别传5，10，15，20代后的稳定性检测；8a-A,B16-HER2；8a-B，CT26-HER2。

图8b.筛选EpCAM阳性克隆分别传5，10，15，20代后的稳定性检测结果图；8b-A，B16-EpCAM；8b-B，CT26-EpCAM。

图9a.取自小鼠脾脏的PBMC细胞对B16-HER2和CT26-HER2的细胞杀伤情况图；9a-A,B16-HER2；9a-B，CT26-HER2。

图9b.取自小鼠脾脏的PBMC细胞对B16-EpCAM和B16-EpCAM的细胞杀伤结果图；9b-A，B16-EpCAM；9b-B，CT26-EpCAM。

图10a.B16-EpCAM/C57BL/6J肿瘤模型抑瘤检测结果，小鼠品系:C57BL/6；接种细胞:B16-Her2(2×10⁶)；治疗方法:Herceptin:2mg/kg，第0,7,14天给药；MCO106:0.125mg/kg，1-7天，每天一次给药；M806:0.125mg/kg，Day1-7天，每天一次给药。(●)PBS(NC)；(■)赫赛汀单克隆抗体；(▲)MCO106；(◆)M806双抗体。

图10b.B16-EpCAM/C57BL/6J肿瘤模型抑瘤检测结果图，品系:C57BL/6；接种细胞量:1×10⁴(i.p)；治疗方法：0.125mg/kg(i.p)，0-6天,每天给药一次。(●)PBS(NC)；(■)MCO106；(▲)Anti-EpCAM单克隆抗体；(◆)M706双抗体。

图11a.CT26-HER2/Balb/C肿瘤模型抑瘤检测结果，小鼠品系:Balb/C；接种细胞:B16-Her2(2×10⁶)；治疗方法:Herceptin:1mg/kg，第0,7,14天给药；MCO106:0.5mg/kg，0,3,6天，各给药一次；M806:0.5mg/kg，Day0,3,6天，各给药一次。(●)PBS(NC)；(■)赫赛汀单克隆抗体；(▲)MCO106；(◆)M806双抗体。

图11b.CT26-Her2/BALB/c肿瘤模型抑瘤检测结果，图品系:Balb/C；接种细胞量:1×10⁴(i.p)；治疗方法：0.125mg/kg(i.p)，0-6天,每天给药一次。(●)PBS(NC)；(■)MCO106；(▲)Anti-EpCAM单克隆抗体；(◆)M706双抗体。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照附图进一步详细地描述本发明。应理解，本发明书中的实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1a：双特异性抗体的制备(HER2×mCD3,M806)

1.双特异性抗体序列设计

以HER2和mCD3为靶点的双特异性抗体被命名为M806，如图3a所示，抗-HER2这边为IgG形式，包括抗-HER2重链与轻链，抗-mCD3(克隆号2C11)这边为Scfv-Fc形式，包括抗-mCD3VH、VL、Fc结构域。

抗-HER2重链(氨基酸序列序列号1)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗-HER2轻链(氨基酸序列序列号2)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

抗-mCD3(2C11)Scfv-Fc(氨基酸序列序列号3)

EVQLVESGGGLVQPGKSLKLSCEASGFTFSGYGMHWVRQAPGRGLESVAYITSSSINIKYADAVKGRFTVSRDNAKNLLFLQMNILKSEDTAMYYCARFDWDKNYWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLPASLGDRVTINCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTNKLADGVPSRFSGSGSGRDSSFTISSLESEDIGSYYCQQYYNYPWTFGPGTKLEIKRGAAAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCRVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHHH

2.双特异性抗体基因克隆

表1a中的根据克隆方案设计好后，发送到苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。以表1a中的引物进行PCR扩增，模板为早期实验中基因合成或亚克隆到pCDNA3.1或pUC57上的基因质粒，PCT/CN2012/084982专利有详细描述，然后分别将抗-HER2重、轻链构建到pCHO1.0的表达载体上，将抗-mCD3Scfv-Fc构建到pCDNA3.4的表达载体上。

初始PCR扩增模板DNA：35ng的模板DNA，如，目标抗体的轻链和重链；1μl的10μM正向引物和反向引物；2.5μl的10×PCR Buffer缓冲液；1μl的10mM dNTP；1μl的2.5单位/μl Pyrobest DNA聚合酶(Takara，R005A)；和蒸馏水到25μl总体积在microfuge管中轻柔混合，并在微量离心机中快速旋转以收集反应混合物到管底。使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)和以下设置进行PCR反应：95℃，5分钟；以下的25个循环：95℃，每次30秒；56℃，30秒；和72℃，1分钟。

通过正向引物M802-VL F1与反向引物hIgK(PacI)R扩增抗-HER2轻链，再通过正向引物Kozak(EcoR V)F与反向引物hIgK(PacI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链(图4a-A)；通过正向引物M802-VH F1与反向引物hIgG1(sbfI)R扩增抗-HER2重链，再通过正向引物Kozak(Avr II)F与反向引物hIgG1(sbfI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链(见图4a-A)。先将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，分别获得装入抗-HER2轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-HER2的pCHO1.0表达载体，质粒分别命名为pCHO1.0-抗-HER2-HL-KKW。

通过正向引物hIgG1-Fc-F与反向引物hIgG1-CH(7His.NheI)-R pCDNA3.4(7His.NheI)-R两轮PCR扩增Fc结构域，通过正向Kozak(AflII)F与反向引物AMC3-1-VL-R1扩增抗-mCD3ScFv结构域，再通过正向引物hIgG1-FC F与反向引物pCDNA3.4(7His.NheI)-R/pCDNA3.4(7His.NheI)-R Overlap PCR扩增将Kozak序列、前导序列及酶切位点AflII与NheI引入ScFv或Fc，将扩增好的2个基因片段(图4a-B)与酶切过的pCDNA3.4表达载体进行同源重组，获得装入抗-mCD3Scfv-Fc的pCDNA3.4表达载体，质粒命名为pCDNA3.4-抗-mCD3ScFv-Fc-LDY。

表1a 双特异性抗体基因克隆中使用的引物

引物名称	序列号	序列
			Kozak(EcoR V)F	4	gaggaaggatctcgagctcaagcttgatatcgccgccaccatg
M802-VLF1	5	tgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgagctcgtgatgacacag
			hIgK(PacI)R	6	cttatcatgtctggatcgaagcttaattaactaacactctcccctgttgaag
Kozak(AvrII)F	7	cccgaggaggaacggttccgggccgcctagggccgccaccatg
			M802-VHF1	8	tgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgaagtgcagctggtggaaa
hIgG1(sbfI)R	9	catagagtataatatagagtatacacctgcaggtcatttacccggagacagggag
			hIgG1-Fc-F	10	ggtgcggccgcagagcccaaatctt
hIgG1-CH(7His.NheI)-R	11	CCTTGCTAGCTCAATGGTGATGGTGATGATGATGTTTACCCGGAGACAGGGAGAG
			pCDNA3.4(7His.NheI)-R	12	ACTAACCGGTAGGGATCGAACCCTTGCTAGCTCAATGGTGATGGTG
Kozak(AflII)F	13	CAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCGAACCCTTAAGGCCGCCACCATGGA
			AMC3-1-VL-R1	14	AAGATTTGGGCTCTGCGGCCGCACCACGCTTAATCTCCAGTTTTGTG

3.双特异性抗体表达

利用无内毒素大提试剂盒(Qiagen，12391)进行质粒大提，具体操作按照厂商提供的说明书进行。CHO-S细胞培养根据厂商提供的说明书在CD CHO培养基(Invitrogen，10743-029)中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养，准备好细胞后，根据制造商的说明书(Maxcyte)，使用Maxcyte STX电转仪将质粒pCHO1.0-Anti-HER2-HL-KKW与pCDNA3.4-Anti-mCD3Scfv-Fc-LDY一起共转染到CHO-S细胞中，设计共转染这两种质粒以表达针对HER2和mCD3的双特异性抗体M806。

分别在转染后第2天，培养温度下调到32℃，并每天补加3.5％FeedA(Invitrogen，A10234-01)，培养14天后，2000*g离心收获表达上清。

4.双特异性抗体纯化

表达上清用0.22uM滤膜过滤，利用Mabselect SuRe亲和层析柱(购自GE公司，18-1153-45,17-5438-01)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，用平衡缓冲液(9.5mM NaH2PO4+40.5mM Na2HPO4，pH7.0)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸+100mM精氨酸，pH3.2)洗脱。通过SP阳离子交换层析，实现目标双特异性抗体与副产物的分离，阳离子交换柱购自GE公司(18-1153-44,17-1087-01)，用平衡缓冲液A(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄，pH 6.0)平衡层析柱后，样品用双纯水稀释电导至3.0-3.5ms之间，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液B(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄+1M NaCl，pH 6.0)20个柱体积线性洗脱；最后浓缩置换Buffer PBS。纯化后的双特异性抗体进行SDS-PAGE、SEC检测，纯度在95％以上(见图5a)。

5.双特异性抗体亲和力测定(FACS)

利用流式分析法分析双特异性抗体与HER2阳性细胞NCI-N87(购自ATCC，CRL-5822)、mCD3阳性细胞(mPBMC，从Balb/C老鼠脾脏中分离得到)阳性细胞的结合情况。双特异性抗体的浓度从160nmol开始，4倍倍比稀释，得到6个浓度梯度，备用。

收集细胞，PBS洗两遍，再加PBS重悬，分至96孔板中，每孔2×10⁵个细胞，300g离心4分钟，弃上清，加入50ul双特异性抗体稀释液重悬，室温孵育1小时，PBS洗两遍，再用PE-抗human IgG FC(Biolegend，409304)重悬细胞，室温避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再用软件GraphPad Prism5.0进行分析(见图6a)。

实施例1b：双特异性抗体的制备(EpCAM×mCD3,M706)

1.双特异性抗体序列设计

以EpCAM和mCD3为靶点的双特异性抗体被命名为M706，如图3b，抗-EpCAM这边为IgG形式，包括抗-EpCAM重链与轻链，抗-mCD3这边为Scfv-Fc形式，包括抗-mCD3VH、VL、Fc结构域。

抗-EpCAM重链(氨基酸序列序列号15)

EVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗-EpCAM轻链(氨基酸序列序列号16)

ELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

抗-mCD3Scfv-Fc(氨基酸序列序列号17)

2.双特异性抗体基因克隆

表1b中的根据克隆方案设计好后，发送到苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。以表1b中的引物进行PCR扩增，模板为早期实验中基因合成或亚克隆到pCDNA3.1或 pUC57上的基因质粒，PCT/CN2012/084982专利有详细描述，然后抗-EpCAM重、轻链分别构建到pCHO1.0的表达载体上，将抗-mCD3ScFv-Fc构建到pCDNA3.4的表达载体上。

通过正向引物M701-VL F1与反向引物hIgK(PacI)R扩增抗-EpCAM轻链，再通过正向引物Kozak(EcoR V)F与反向引物hIgK(PacI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点EcoR V与PacI引入轻链(图4b-A、B)；通过正向引物M701-VH F1与反向引物hIgG1(sbfI)R扩增抗-EpCAM重链，再通过正向引物Kozak(Avr II)F与反向引物hIgG1(sbfI)R PCR扩增，将Kozak序列、前导序列及酶切位点AvrII与BstZl7I引入重链(见图4b-A、B)。先将扩增好的LC基因片段与用EcoR V与PacI酶切过的pCHO1.0表达载体进行同源重组，分别获得装入抗-EpCAM轻链的表达载体；然后用AvrII与BstZl7I酶切后再和HC进行同源重组，获得抗-EpCAM的pCHO1.0表达载体，质粒分别命名为pCHO1.0-抗-EpCAM-HL-KKW。

通过正向引物hIgG1-Fc-F与反向引物hIgG1-CH(7His.NheI)-R pCDNA3.4(7His.NheI)-R两轮PCR扩增Fc结构域，通过正向Kozak(AflII)F与反向引物AMC3-1-VL-R1扩增抗-mCD3ScFv结构域，再通过正向引物hIgG1-FC F与反向引物pCDNA3.4(7His.NheI)-R/pCDNA3.4(7His.NheI)-R Overlap PCR扩增将Kozak序列、前导序列及酶切位点AflII与NheI引入ScFv或Fc，将扩增好的2个基因片段(图4b-B)与酶切过的pCDNA3.4表达载体进行同源重组，获得装入抗-mCD3Scfv-Fc的 pCDNA3.4表达载体，质粒命名为pCDNA3.4-抗-mCD3ScFv-Fc-LDY。

表1b 双特异性抗体基因克隆中使用的引物

3.双特异性抗体表达

利用无内毒素大提试剂盒(Qiagen，12391)进行质粒大提，具体操作按照厂商提供的说明书进行。CHO-S细胞培养根据厂商提供的说明书在CD CHO培养基(Invitrogen，10743-029)中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中进行培养，准备好细胞后，根据制造商的说明书(Maxcyte)，使用Maxcyte STX电转仪将将质粒pCHO1.0-抗-EpCAM-HL-KKW与pCDNA3.4-抗-mCD3Scfv-Fc-LDY一起共转染到CHO-S细胞中，设计共转染这两种质粒以表达对EpCAM和mCD3的双特异性抗体M706。

4.双特异性抗体纯化

表达上清用0.22uM滤膜过滤，利用Mabselect SuRe亲和层析柱(购自GE公司， 18-1153-45,17-5438-01)从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，用平衡缓冲液(9.5mM NaH₂PO₄+40.5mM Na₂HPO₄，pH7.0)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(50mM柠檬酸+100mM精氨酸，pH3.2)洗脱。通过SP阳离子交换层析，实现目标双特异性抗体与副产物的分离，阳离子交换柱购自GE公司(18-1153-44,17-1087-01)，用平衡缓冲液A(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄，pH 6.0)平衡层析柱后，样品用双纯水稀释电导至3.0-3.5ms之间，过SP柱子结合后，用洗脱缓冲液B(43.8mM NaH₂PO₄+6.2mM Na₂HPO₄+1M NaCl，pH 6.0)20个柱体积线性洗脱；最后浓缩置换缓冲液PBS。纯化后的双特异性抗体进行SDS-PAGE、SEC检测，纯度在95％以上(见图5b)。

5.双特异性抗体亲和力测定(FACS)

利用流式分析法分析双特异性抗体与EpCAM阳性细胞HCT116(购自ATCC，CRL-5822)、mCD3阳性细胞(mPBMC，从Balb/C老鼠脾脏中分离得到)阳性细胞的结合情况。双特异性抗体的浓度从160nmol开始，4倍倍比稀释，得到6个浓度梯度，备用。

收集细胞，PBS洗两遍，再加PBS重悬，分至96孔板中，每孔2×10⁵个细胞，300g离心4分钟，弃上清，加入50ul双特异性抗体稀释液重悬，室温孵育1小时，PBS洗两遍，再用PE-抗human IgG FC(Biolegend，409304)重悬细胞，室温避光孵育30分钟，PBS洗两遍，再用100ul PBS重悬，上机检测，再用软件GraphPad Prism5.0进行分析(见图6b),结果显示，M706具有良好的与细胞表面EpCAM和CD3的结合活性，其亲和力分别为32.56nM和27.51nM。

实施例2a：表达人源肿瘤抗原HER2的鼠肿瘤细胞系的制备

1.鼠肿瘤细胞准备

B16小鼠黑色素瘤细胞和CT26.WT小鼠结肠癌细胞从中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心细胞库购买。

2.抗原基因的获得及表达载体的构建

分别取培养好的表达人源HER2的SK-BR-3细胞(ATCC，HTB-30)，400g离心5min，弃上清。加入离心前培养基同等体积的PBS，重悬沉淀，400g离心2-3分钟，弃上清。采用Invitrogen公司的reagent试剂盒(15596-026)按照说明书操作进行细胞的总RNA提取。

先用Takara公司的5’RACE FULL试剂盒(购自TAKARA，货号为D315)中的随机引物，以总RNA为模板，反转录为第一链cDNA。然后以表2a中的引物分别扩增HER2全长基因，PCR扩增的条件为95℃5min，按下列参数循环25次：95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸3min。扩增完成后电泳检测。并通过Afl II/NheI酶切位点克隆到pCDNA3.4载体上，测序验证完全正确后(见SEQ ID NO.4)，HER2基因序列详见用无内毒素大提试剂盒(Qiagen，12391)进行质粒大提，具体操作按照厂商提供的说明书进行。

表2a 从SK-BR-3细胞中克隆人源HER2基因的引物列表

引物名称	序列号	序列
			hHER2-full(Afl II)F	29	cagcctccggactctagaggatcgaacccttaaggccgccaccatggagctgg
hHER2-full(Nhe I)R	30	TTACTAACCGGTAGGGATCGAACCCTTGCTAGCTCACACTGGCACGTCCAGACC

人源HER基因(氨基酸序列序列号31)

MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLA CHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV

3.转染表达，检测

B16/CT26表达HER2细胞系转染表达及检测

使用10％FBS(BI，04-001-1A)+1640培养基(购自Gibco，C11875)在37℃，5％CO₂培养箱中培养B16/CT26细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，TCM 2，TCM37)，转染前0.25％胰酶消化细胞，37℃消化20秒，Vi-Cell细胞计数仪检测细胞数量及活力，活力达90％以上。电转缓冲液(272mM蔗糖,7mM K₂HPO₄,1mM MgCl₂,pH 7.4)调整细胞浓度到2×10⁷即可进行转染实验。取400ul细胞悬液至Ep管中，加入16ug HER2-Ag质粒DNA到细胞悬液之中，混合混匀，冰浴静置5min，加入到400ulBTX电极杯(BTX,640)中以电压175V、脉冲12ms参数在BTX电转仪(BTX,ECM830)上电转染，转染完毕细胞转移至10％FBS 1640培养基置于37℃,5％CO₂培养箱中培养，48小时后，加入赫赛汀(Roche)单克隆抗体后，加入PE标记的抗人IgG1 Fc二抗，流式FACS检测转染效率(见图7a-A、B)，结果显示B16细胞的转染效率为49.1％；CT26细胞的转染效率为27.2％；有了一定的表达HER2的阳性细胞，可以进行下一步的加压筛选。

4.稳定细胞系筛选

转染表达为阳性的细胞，显微镜下观察，待细胞铺满瓶底约50％时加入500mM浓度G418抗生素(AMEROSCO,E859-5G)维持培养30天，流式检测加压细胞抗原表达状况，检测方法同3.1或3.2，收集细胞在MoFlo流式分选仪上对细胞进行单克隆分选，分选后的单克隆于96孔培养板中，置于37℃,5％CO₂培养箱中培养7天，流式检测，根据流式结果挑选出阳性率高，峰形单一的单克隆扩大培养并进入下一步稳定性检测。

5.稳定性检测

经过流式挑选出来的单克隆阳性细胞株，扩大到T75培养瓶中撤掉G418抗生素，连续代传代20代培养，流式检测不同代数细胞对抗原的表达是否稳定，检测方法同3，检测结果见图8a，结果显示挑选的B16-HER2单克隆细胞系C2B6在20代内能稳定的表达HER2，CT26-HER2的单克隆细胞B3F7在20代内能稳定的表达HER2，于是选择这两株稳定细胞系进行下一步的体外/体内药效研究。

实施例2b：表达人源肿瘤抗原EpCAM的鼠肿瘤细胞系的制备

1.鼠肿瘤细胞准备

2.抗原基因的获得及表达载体的构建

分别取培养好的表达人源EpCAM的HCT116细胞，400g离心5min，弃上清。加入离心前培养基同等体积的PBS，重悬沉淀，400g离心2-3分钟，弃上清。采用Invitrogen公司的reagent试剂盒(15596-026)按照说明书操作进行细胞的总RNA提取。

先用Takara公司的5’RACE FULL试剂盒(购自TAKARA，货号为D315)中的随机引物，以总RNA为模板，反转录为第一链cDNA。然后以表2b中的引物扩增EpCAM全长基因，PCR扩增的条件为95℃5min，按下列参数循环25次：95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，最后一个循环72℃延伸3min。扩增完成后电泳检测。并通过Afl II/NheI酶切位点克隆到pCDNA3.4载体上，测序验证完全正确后(见SEQ ID NO.4)，EpCAM基因序列详见用无内毒素大提试剂盒(Qiagen，12391)进行质粒大提，具体操作按照厂商提供的说明书进行。

表2b 从HCT116细胞中克隆人源EpCAM基因的引物列表

人源EpCAM基因(氨基酸序列序列号34)

MAPPQVLAFGLLLAAATATFAAAQEECVCENYKLAVNCFVNNNRQCQCTSVGAQNTVICSKLAAKCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLYDPDCDESGLFKAKQCNGTSMCWCVNTAGVRRTDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREKPYDSKSLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDLVQNSSQKTQNDVDIADVAYYFEKDVKGESLFHSKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVISRKKRMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA

3.转染表达，检测

B16/CT26表达EpCAM细胞系转染表达及检测

10％FBS 1640培养基培养B16/CT26细胞，转染前0.25％胰酶消化细胞，Vi-Cell细胞计数仪检测细胞数量及活力，活力达90％以上，电转缓冲液调整细胞浓度到2×10⁷即可进行转染实验。取400ul细胞悬液至Ep管中，加入16ug EpCAM-Ag质粒DNA 到细胞悬液之中，温和混匀，冰浴静置5-10min，加入到400ulBTX电极杯中以电压175V、脉冲12ms参数在BTX电转仪上电转染，转染完毕细胞转移至10％FBS 1640培养基置于37℃,5％CO₂培养箱中培养，48小时后，加入抗EpCAM单克隆抗体(Biolegend，324201)后，加入PE标记的抗人IgG1Fc二抗，流式检测转染效率(见图7b-A、B)，结果显示B16细胞的转染效率为68.4％；CT26细胞的转染效率为21.6％；有了一定的表达HER2的阳性细胞，可以进行下一步的加压筛选。

4.稳定细胞系筛选

5.稳定性检测

经过流式挑选出来的单克隆阳性细胞株，扩大到T75培养瓶中撤掉G418抗生素，连续代传代20代培养，流式检测不同代数细胞对抗原的表达是否稳定，检测方法同3，检测结果见图8b，结果显示挑选的B16-EpCAM单克隆细胞系C2B6在20代内能稳定的表达EpCAM，CT26-EpCAM的单克隆细胞B3F7在20代内能稳定的表达EpCAM，于是选择这两株稳定细胞系进行下一步的体外/体内药效研究。

实施例3a：体外细胞杀伤检测(HER2×mCD3，M806)

1.鼠脾细胞准备：

钝性分离小鼠脾脏，用注射器向脾脏内反复注入PBS，收集流出的脾细胞悬液，400g离心10min，PBS重悬沉淀，5倍体积的红细胞裂解液(beyotime，C3702)作用5min后400g离心5min，PBS洗涤一次后用10％FBS-1640培养基重悬细胞至1×10⁶ 个细胞/ml，备用。

2.表达人肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞准备

B16-HER2/CT26-HER2细胞在RPMI-1640(GIBCO，C11875)+10％FBS(BI，04-001-1A)培养，培养好后，0.25％胰酶消化细胞，Vi-Cell细胞计数仪检测细胞数量及活力，收集细胞离心去上清，重悬至1％FBS-PBS中，制成单细胞悬液，终浓度5uM的CFSE染色，5％CO₂，37℃条件下孵育15min。1％FBS-PBS洗涤染色后的细胞两次，重悬细胞，备用，流式细胞仪检测细胞染色结果。

3.体外细胞杀伤

将CFSE染色后的B16-HER2或CT26-HER2细胞用RPMI-1640+10％FBS重悬至2×10⁵/ml，按照100ul/孔加入96孔板置于37℃,5％CO₂培养箱中培养16h，按照实验设计做抗体浓度梯度稀释配制，抗体浓度从160nM开始，3倍梯度稀释，在靶细胞板中按照50ul/孔分别加入M806、赫赛汀单抗，以及MCO106(共转染一种抗荧光素酶的抗体基因4420和mCD3的双特异性抗体MCO106)，按50：1效靶比每孔中加入鼠脾细胞50ul/孔，48h后用胰酶消化20秒，使各孔细胞为单细胞悬液，收集所有细胞，500g离心5min，1％FBS-PBS重悬混匀细胞，加入终浓度为1ug/ml的PI，室温作用10-15min后流式上机检测CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例即为靶细胞CT26-HER2的死亡率(见图9a-A,9a-B)，图9a-A的结果显示M806介导鼠的脾细胞对表达HER2的肿瘤细胞B16-HER2有很好杀伤作用，其EC50值为4955pg/ml，最高杀伤率为76.03％；图9a-B的结果显示M806介导鼠的脾细胞对表达HER2的肿瘤细胞CT26-HER2有良好的杀伤作用，其EC50值为3448pg/ml，最高杀伤率为46.66％。

实施例3b：体外细胞杀伤检测(EpCAM×mCD3，M706)

1.鼠脾细胞准备：

钝性分离小鼠脾脏，用注射器向脾脏内反复注入PBS，收集流出的脾细胞悬液，400g离心10min，PBS重悬沉淀，5倍体积的红细胞裂解液(beyotime，C3702)作用 5min后400g离心5min，PBS洗涤一次后用10％FBS-1640培养基重悬细胞至1×10⁶个细胞/ml，备用。

2.表达人肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞准备

B16-EpCAM/CT26-EpCAM细胞在RPMI-1640(GIBCO，C11875)+10％FBS(BI，04-001-1A)培养，培养好后，0.25％胰酶消化细胞20秒，Vi-Cell细胞计数仪检测细胞数量及活力，收集细胞离心去上清，重悬至1％FBS-PBS制成单细胞悬液，终浓度5uM的CFSE染色，5％CO₂，37℃条件下孵育15min，1％FBS-PBS洗涤染色后的细胞两次，重悬细胞，备用，流式细胞仪检测细胞染色结果。

3.体外细胞杀伤

将CFSE染色后的B16-EpCAM/CT26-EpCAM细胞重悬至2×10⁵/ml，按照100ul/孔加入96孔板置于37℃,5％CO₂培养箱中培养16h，按照实验设计做抗体浓度梯度稀释配制，抗体浓度从160nM开始，3倍梯度稀释，在靶细胞板中加入50ul/孔的相应抗体，按50：1效靶比按照50ul/孔加入鼠脾细胞，48h后用胰酶消化20秒，使各孔细胞为单细胞悬液，收集所有细胞，500g离心5min，1％FBS-PBS重悬混匀细胞，加入终浓度为1ug/mlPI，室温作用10-15min后流式上机检测CFSE、PI双阳性细胞占CFSE阳性细胞比例即为靶细胞CT26-EpCAM的死亡率(见图9b-A,B)，图9b-A的结果显示M706介导鼠的脾细胞对表达EpCAM的肿瘤细胞B16-EpCAM有很好杀伤作用，其EC50值为4955pg/ml，最高杀伤率为76.03％；图9b-B的结果显示M706介导鼠的脾细胞对表达EpCAM的肿瘤细胞CT26-EpCAM有良好的杀伤作用，其EC50值为3448pg/ml，最高杀伤率为46.66％。

实施例4a：肿瘤模型建立(HER2)

1.B16-HER2肿瘤模型建立：

7-8周龄C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，侧背腹部皮下分别以2×10⁶、1×10⁶、5×10⁵、2.5×10⁵、1.25×10⁵个/只接种按照实施例2所述方法制备的 B16-HER2细胞株，每组5只老鼠，接种完毕小鼠饲养于屏障环境，每天观察小鼠接种部位肿瘤形成情况，待实体瘤成瘤，游标卡尺测量并记录肿瘤的长宽，根据长*宽*宽/2公式计算肿瘤体积，之后每三天监测一次(游标卡尺测量并记录肿瘤的长宽，根据长*宽*宽/2公式计算肿瘤体积，之后每三天监测一次)。

2.CT26-HER2肿瘤模型建立

7-8周龄Balb/c小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，侧背腹部皮下分别以2×10⁶、1×10⁶、5×10⁵、2.5×10⁵、1.25×10⁵个/只接种按照实施例2所述方法制备的CT26-HER2细胞株，每组5只老鼠，接种完毕小鼠饲养于屏障环境，每天观察小鼠接种部位肿瘤形成情况，待实体瘤成瘤，游标卡尺测量并记录肿瘤的长宽，根据长*宽*宽/2公式计算肿瘤体积，之后每三天监测一次。

实施例4b：腹水肿瘤模型建立(EpCAM)

1.B16-EpCAM腹水瘤模型建立

7-8周龄C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，腹腔分别以1×10³、5×10³、1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶个/只接种按照实施例2所述方法制备的B16-EpCAM细胞株，每组5只老鼠，接种后小鼠饲养于屏障环境，每天观察小鼠腹水生成和体征状况，记录小鼠死亡情况，并统计生存率。

2.CT26-EpCAM腹水瘤模型建立

7-8周龄Balb/c小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，腹腔分别以1×10³、5×10³、1×10⁴、5×10⁴、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶个/只接种按照实施例2所述方法制备的CT26-EpCAM细胞株，每组5只老鼠，接种后小鼠饲养于屏障环境，每天观察小鼠腹水生成和体征状况，记录小鼠死亡情况，并统计生存率。

实施例5a：双特异性抗体介导的免疫系统杀伤肿瘤的药效检测(HER2×mCD3杀伤抑制肿瘤试验)

1.B16-HER2肿瘤模型及药效学实验

2×10⁶个/只B16-HER2细胞皮下接种7-8周龄C57BL/6J小鼠，每组8只老鼠，接种完毕，按照20ug/只老鼠的剂量对小鼠尾静脉给药按照实施例1的方法制备的MSBODY(M806，HER2-mCD3)，同时设置对照组PBS、HIgG、4420×mCD3(对照组剂量都是20ug/只老鼠)，接种后6、12天同样剂量对小鼠给药一次；接种后第6天监测小鼠肿瘤生长状况(见图10a)。结果统计如表3，双特异性抗体M806显示了良好的抑制肿瘤的效果，肿瘤抑制率达到63.6％。

表3.双特异性抗体M806，赫赛汀对移植瘤的疗效

分组	给药	途径	平均肿瘤体积(mm3，D24)	％抑瘤率(D24)
					PBS	D1,4,7	IV	2786.62
赫赛汀1mg/kg	D1,4,7	IV	2166.94	22.24
					MCO101 1mg/kg	D1,4,7	IV	3079.63	-10.52
M806 1mg/kg	D1,4,7	IV	1013.81	63.62

2.CT26-HER2肿瘤模型及药效学实验

2×10⁶个/只CT26-HER2细胞皮下接种7-8周龄Balb/c小鼠，每组8只老鼠，接种完毕，按照1.0mg/kg的剂量对小鼠尾静脉给予按照实施例1的方法制备的MSBODY(M806，HER2-mCD3)，同时设置对照组PBS、HIgG、4420×mCD3(1.0mg/kg)，接种后6、12天后重复给药；接种后第6天开始监测小鼠肿瘤生长状况(见图11a)，统计结果见表4，双特异性抗体M806显示了良好的抑制肿瘤的效果，肿瘤抑制率达到78.61％。

表4.双特异性抗体M806，赫赛汀对移植瘤的疗效

分组	给药	途径	平均肿瘤体积(mm³，D24)	％抑瘤率(D24)
					PBS	D1,4,7	IV	2395.47	-
赫赛汀2mg/kg	D1,7,14	IV	1834.47	23.42
					MCO101 1mg/kg	D1,4,7	IV	2157.52	9.93
M806 1mg/kg	D1,4,7	IV	512.32	78.61

[0184] 实施例5b：双特异性抗体介导的免疫系统杀伤肿瘤的药效检测(EpCAM×mCD3杀伤抑制肿瘤试验)

1.B16-EpCAM腹水瘤模型及药效学实验

将1×104个按照实施例2的方法制备的B16-EpCAM细胞腹腔接种C57BL/6J小鼠，每组8只老鼠，接种约1h后，按照0.5mg/kg的剂量对小鼠尾静脉给予按照实施例1的方法制备的MSBODY(M806，HER2-mCD3)，同时设置对照组PBS、HIgG、4420×mCD3(1.0mg/kg)，3天后再次给药，并每天观察小鼠腹水生成和体征状况，记录小鼠死亡情况，并统计生存率(见图10b)，结果显示，M706双抗体显示了良好抑制腹水肿瘤细胞生长的效果，并延长实验小鼠的生命，观察至第50天尚未见小鼠的死亡，其他对照组实验小鼠均发现腹水肿瘤，生存期不超过40天。

2.CT26-EpCAM腹水瘤模型及药效学实验

将1×10⁴个按照实施例2的方法CT26-EpCAM细胞腹腔接种Balb/c小鼠，每组8只老鼠，接种约1h后，按照0.5mg/kg的剂量对小鼠腹腔给予按照实施例1的方法制备的MSBODY(M706，EpCAM-mCD3)，同时设置对照组PBS、HIgG、4420×mCD3(1.0mg/kg)，3天后再次给药，并每天观察小鼠腹水生成和体征状况，记录小鼠死亡情况，并统计生存率(见图11b)，结果显示，M706双抗体显示了良好抑制腹水肿瘤细胞生长的效果，并延长实验小鼠的生命，观察至第50天尚未见小鼠的死亡，其他对照组实验小鼠均发现腹水肿瘤，生存期不超过40天。

Claims

1.一种鼠肿瘤模型的构建方法，包括以下步骤：

制备表达人源肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞系；和

将所述鼠肿瘤细胞系接种至免疫系统正常的小鼠以形成肿瘤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人源肿瘤抗原是人源HER2或EpCAM。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述鼠肿瘤细胞系是B16小鼠黑色素瘤细胞或CT26.WT小鼠结肠癌细胞。

4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述接种以2×10⁶细胞/只小鼠的量皮下接种。

5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述制备表达人源肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞系的步骤包括：准备鼠肿瘤细胞；获得抗原基因并构建表达载体；用所述表达载体转染细胞系；和筛选稳定细胞系。

6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述鼠肿瘤模型用于评价双特异性抗体治疗受试者肿瘤的效力。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肿瘤是HER2或EpCAM特异抗原表达所引起的肿瘤。

8.一种评价双特异性抗体治疗肿瘤的效力的系统，包括：

表达人源肿瘤抗原的鼠肿瘤细胞系，用于接种至免疫系统正常的小鼠以形成肿瘤；和

对照试剂。

9.权利要求8所述的系统，其中所述人源肿瘤抗原是人源HER2或EpCAM。

10.权利要求8或9所述的系统，其中所述鼠肿瘤细胞系是B16小鼠黑色素瘤细胞或CT26.WT小鼠结肠癌细胞。