CN104804134A - 基于纳米二氧化钛的异鼠李素表面分子印迹微球制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种采用种子沉淀聚合法制备以TiO₂为核心的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的方法，该方法解决了沉淀聚合法制备聚合物微球包埋现象严重、分离处理效率低等问题及表面印迹方法需要表面嫁接技术制备印迹微球时引发剂在聚合溶液中容易凝胶化的问题。采用本方法制备出的印迹聚合物微球的颗粒形状规则，大小均一，没有团聚现象，增加了异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的比表面积，且使聚合物的结合位点分布于印迹微球的表面，从而提高了异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的吸附性能。本发明制备的印迹微球可达到有效分离提取银杏黄酮苷元——异鼠李素的目的，具有广阔的应用前景。

Description

基于纳米二氧化钛的异鼠李素表面分子印迹微球制备方法

技术领域

本发明具体是采用种子沉淀聚合法制备以TiO₂为核心的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球，即是一种对异鼠李素具有较高选择识别性能的分离材料的制备，并在药物成分分离纯化中的应用。 

背景技术

异鼠李素为一种黄酮类化合物，是中草药中重要的活性成分，具有止咳祛痰，消食化滞，活血散瘀的作用，多用于咳嗽痰多、消化不良、食积腹痛、跌扑瘀肿、瘀血经闭。目前，用于提取异鼠李素的传统方法主要有溶剂法、微波提取法、大孔树脂提取法、超临界萃取法、毛细管电泳法以及酶法等，但采用常规方法不仅加工工艺繁琐、能耗高、选择性不理想，而且这些工艺对温度和压力有特殊要求，容易在操作过程中发生危险，易造成资源的浪费和环境的污染。 

分子印迹技术是模拟抗体与抗原、酶与底物等存在于自然界的分子识别作用，是近年来发展较快的一种技术。分子印迹聚合物（Molecular Imprinted Polymer,MIP）是一种具有固定孔穴大小和形状且对特定分子具有特异选择性的新型分子识别材料。由于分子印迹聚合物具有高度交联的结构，稳定性好，能够在恶劣环境中使用，且造价低廉，操作简单，模板和聚合物可回收利用，具备强特异性和高选择性等优点，可将一些低含量的药物有效成分直接从粗提物中筛选出来，具有良好的应用前景。 

分子印迹聚合物多采用本体聚合法制备，但聚合物需要经过研磨、过筛等过程，费时费力收率不高，且颗粒形状不规则从而导致印迹分子难以进入吸附位点，吸附容量较低。与块状分子印迹聚合物相比，分子印迹聚合物微球的制备方法和应用更方便、便于功能设计。目前制备分子印迹微球的方法主要有分散聚合法、多步溶胀法、沉淀聚合法及表面印迹技术等，但分散聚合法使用的全氟代高聚合物分散剂价格昂贵；多步溶胀法操作过程繁琐；沉淀聚合法制备聚合物的识别位点大多位于聚合物微球内部，印迹分子与识别位点结合速率低；表面印迹需要表面嫁接技术制备印迹微球时引发剂在聚合溶液中容易凝胶化。因此，本发明将沉淀聚合法与表面印迹技术相结合，制得的聚合物微球性能更好，该印迹微 球一方面具有颗粒形状规则，大小均一，没有团聚现象；另一方面结合位点分布于微球的表面，该印迹微球更有利于异鼠李素的提取分离。 

发明内容

本发明提供了一种采用种子沉淀聚合法制备以TiO₂为核心的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的方法，该方法解决了沉淀聚合法制备聚合物微球包埋现象严重、分离处理效率低等问题，制备出的表面印迹聚合物（Surface Molecular Imprinted Polymer,SMIP）可用于从银杏黄酮粗提物中选择性提取、分离、富集黄酮苷元物质。 

本发明通过以下技术方案实现，其步骤为： 

（1）将模板分子和功能单体按摩尔比1:（4-10）:（10-50）溶解到适量致孔剂中，超声分散10-20min后，加入适量纳米TiO₂，密封，并在室温下以200-300rpm的速度搅拌2h-3h； 

（2）将混合液置于反应装置上继续搅拌并通氮脱氧10-20min后，在混合液中加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯，继续搅拌并通氮脱氧10-20min后，再加入引发剂偶氮二异丁腈，真空状态下于50℃-70℃恒温油浴中反应24-48h，最终得到粉末状聚合物，过筛； 

（3）以甲醇：乙酸（V/V，9:1-5：5）为提取液，索氏提取72h以上，洗脱除去模板分子，后用甲醇平衡除去乙酸； 

（4）将所得聚合物置于真空干燥箱中60℃干燥24h，即得到以TiO₂为核心的表面分子印迹聚合物。 

在步骤（1）中，模板分子为异鼠李素，优选功能单体为丙烯酰胺（AM）、2-乙烯基吡啶（2-VP）、4-乙烯基吡啶（4-VP）、甲基丙烯酸（MAA）中的一种，致孔剂选用氯仿、丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈中的一种。 

在步骤（2）中，交联剂物质的量为功能单体的4-10倍。 

采用本发明方法得到的以TiO₂为核心的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的颗粒形状规则，大小均一，没有团聚现象，增加了异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的比表面积，且使聚合物的结合位点分布于基质的表面，从而提高了异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的吸附性能。通过吸附平衡实验及特异吸附性实验表明：该聚合物含有与模板分子空间结构相匹配、官能团相互作用的三维孔穴，具有显著的分子“记忆”功能。本发明制备的聚合物可达到有效分离提取银杏黄酮 苷元的目的，具有广阔的应用前景。 

附图说明

图1是实施例1制得异鼠李素表面分子印迹聚合物的吸附动力学曲线。 

图2是实施例1制得未添加TiO₂的异鼠李素分子印迹聚合物的吸附动力学曲线。 

图3是实施例1制得异鼠李素表面分子印迹聚合物的吸附等温线图。 

图4是实施例2制得异鼠李素表面分子印迹聚合物的吸附等温线图。 

具体实施方式

实施例1 

将1mmol模板分子异鼠李素和4mmol功能单体4-VP溶解到40ml致孔剂乙腈中，超声分散10min后，加入20mg TiO₂，机械搅拌2h，通氮脱氧20min后，加入交联剂EDMA20mmol，通氮脱氧20min，加入引发剂AIBN50mg，真空状态下密封，于63℃油浴中反应24h得固体聚合物。将合成的印迹聚合物过200目分样筛，用甲醇：乙酸（V/V，9:1）为提取液，对聚合物颗粒索氏提取72h，后再用纯甲醇索氏提取24h，平衡除去乙酸。将所得聚合物置于真空干燥箱中60℃干燥24h，即得到异鼠李素表面分子印迹聚合物SMIP1。制备不添加TiO₂的异鼠李素分子印迹聚合物（MIP）作为空白对比试验，其他制备条件一致。 

（1）吸附动力学实验 

称取50mg洗脱后的SMIP1（MIP）置于150mL的磨口锥形瓶中，再加入浓度为50mol·L^-1的异鼠李素乙醇溶液，在振荡开始时计时，分别在1、3、5、15、30、60、120、180、240、300min时，用针筒抽取溶液，过0.45μm有机系滤膜，再通过紫外分光光度测得吸光度，考察聚合物对异鼠李素分子的吸附随时间变化的规律。 

吸附量的计算方法如下： 

$Q=\frac{(C_r\×C_e)\×V}{m}$

式中：Q—吸附容量，mg·g^-1； 

Cr—质量起始浓度，mg·ml^-1； 

Ce—平衡质量浓度，mg·ml^-1； 

V—溶液体积，ml； 

m—吸附剂的质量，g。 

SMIP1与MIP的吸附动力学结果分别如图1、图2所示 

由图1可知，SMIP1对异鼠李素的吸附量在短时间内增加很快，然而随着振荡时间延长，吸附速率降低，最终吸附量接近饱和。这是因为模板分子通过印迹和洗脱过程在聚合物表面和内部形成了具有固定形态和大小的印迹“孔穴”，其具有与模板分子结构互补、空间上固定排列的官能基团。由于种子沉淀聚合法合成聚合物微球，在吸附开始阶段，模板分子被表面分子印迹聚合物“孔穴”捕获，较浅的“孔穴”有利于聚合物对异鼠李素的快速吸附，与官能基团发生作用，吸附速率较快，当表面“孔穴”达到吸附饱和后，底物向聚合物内部“孔穴”的传质受到一定的阻力，吸附速率变慢。由图2可知，MIP对异鼠李素的吸附动力学曲线与SMIP1的趋势相似。与图1相比，MIP的吸附量明显低于SMIP1，这表明两种聚合物在空间结构上存在明显差异：MIP的印迹位点包埋于内部的较多，而SMIP1的印迹结合位点都位于表面，故吸附能力较强，选择性较高。 

（2）吸附平衡性实验 

分别称取50mg洗脱后的SMIP1置于150ml磨口锥形瓶中，分别加入100ml浓度为1、3、5、7、9、11、14、16、18、20mol·L^-1的异鼠李素乙醇溶液，恒温摇床密闭振荡48h（分子印迹聚合物吸附达到平衡），然后用针筒抽取溶液，过0.45μm有机系滤膜，用紫外分光光度计测定溶液吸光度，吸附量计算方法如上。 

对SMIP1不同浓度的异鼠李素溶液的等温吸附结果如图3所示。 

由图3可知，随着异鼠李素浓度的升高，吸附量也随之增大并达到吸附平衡。这是由于表面分子印迹聚合物的吸附量由特异性吸附组成，它主要由印迹空穴和结合位点的共同作用决定，而功能单体与模板分子结合的强弱决定着结合位点作用的强弱，对特异性吸附的效率构成影响。 

实施例2 

将1mmol模板分子异鼠李素和5mmol功能单体AM溶解到20ml致孔剂氯仿：DMF（V/V,10:3）中，超声分散20min后，加入40mg TiO₂，机械搅拌2h，通氮脱氧40min后，加入交联剂EDMA20mmol，通氮脱氧20min，加入引发剂AIBN20mg，真空状态下密封，于63℃油浴中反应24h得固体聚合物。用甲醇：乙酸（V/V，9:1）为提取液，对聚合物颗粒索氏提取72h，后再用纯甲醇索氏提 取24h，平衡除去乙酸。将所得聚合物置于真空干燥箱中60℃干燥24h，即得到异鼠李素表面分子印迹聚合物SMIP2。 

分别称取50mg洗脱后的SMIP2置于150ml磨口锥形瓶中，分别加入100ml浓度为1、3、5、7、9、11、14、16、18、20mol·L^-1的异鼠李素乙醇溶液，恒温摇床密闭振荡48h（分子印迹聚合物吸附达到平衡），然后用针筒抽取溶液，过0.45μm有机系滤膜，用紫外分光光度计测定溶液吸光度。 

吸附量的计算方法如下： 

$Q=\frac{(C_r\×C_e)\×V}{m}$

式中：Q—吸附容量，mg·g^-1； 

Cr—质量起始浓度，mg·ml^-1； 

Ce—平衡质量浓度，mg·ml^-1； 

V—溶液体积，ml； 

m—吸附剂的质量，g。 

对SMIP2不同浓度的异鼠李素溶液的等温吸附结果如图4所示。 

由图4可知，随着异鼠李素浓度的升高，吸附量也随之增大并达到吸附平衡。与图3相比，在不同浓度范围内，SMIP1均比SMIP2对异鼠李素有较高的吸附量，这是由于表面分子印迹聚合物的吸附量由特异性吸附组成，它主要由印迹空穴和结合位点的共同作用决定，而功能单体与模板分子结合的强弱决定着结合位点作用的强弱，对特异性吸附的效率构成影响。4-VP可以与异鼠李素形成较强的相互作用，因此以4-VP为功能单体的表面分子印迹聚合物有高吸附量和较强特异性吸附。 

实施例3 

将1mmol模板分子异鼠李素和6mmol功能单体2-VP溶解到20mL乙腈中，超声分散10min后，加入30mg TiO₂，机械搅拌3h，通氮脱氧20min后，加入交联剂EDMA30mmol，通氮脱氧10min，加入引发剂AIBN10mg，真空状态下密封，于60℃油浴中反应24h得固体聚合物。用甲醇：乙酸（V/V，9:1）为提取液，对聚合物颗粒索氏提取72h，再用纯甲醇洗脱24h，平衡除去乙酸。将所得聚合物置于真空干燥箱中60℃干燥24h，即得到异鼠李素表面分子印迹聚合物SMIP3。 

分子印迹聚合物的吸附选择性实验。 

①分别配制10mg/L槲皮素、异鼠李素、芦丁乙醇溶液； 

②分别加入SMIP330mg于3种不同溶液中； 

③置于摇床30℃振荡24h，后离心沉降，取上清液，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，所得溶液用紫外可见分光光度计分别测定其吸光度。 

④采用结合位点平衡解离常数K_D及分离因子α评价特异吸附性能。 

K_D=C_p/C_e

K_D——结合位点平衡解离常数，ml/g； 

C_p——聚合物吸附底物的浓度，即聚合物对底物的吸附量Q，mg/g; 

C_e——吸附平衡时溶液中底物的浓度，mg/ml。 

α=K_Di/K_Dj

α——分离因子，一般α>1时，才表示聚合物对模板分子具有特异吸附性能； 

K_Di——模板分子的结合位点平衡解离常数，ml/g； 

K_Dj——干扰分子的结合位点平衡解离常数，ml/g。 

SMIP3对不同底物的K_D及α，见表1、表2 

表1聚合物对不同底物的结合位点平衡解离常数K_D（ml/g） 

表2聚合物对不同底物的分离因子α 

由表1、表2数据可看出，SMIP3对异鼠李素的K_D明显大于两种干扰底物，说明SMIP3对异鼠李素具有显著的特异吸附性能，且SMIP3的分离因子大于1，可在干扰存在条件下实现对异鼠李素的有效分离。 

Claims (9)

1.一种异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于其反应物的组成成分为：模板分子、功能单体、载体、交联剂、引发剂、致孔剂，其中模板分子、功能单体、交联剂的摩尔质量比为1：（4-10）:（10-50），模板分子与载体添加量比为1:（10-80）[n(mmol):m(mg)]，模板分子与致孔剂的量比为1:（20-60）[n(mmol):V(ml)]，交联剂物质的量为功能单体的4-10倍，引发剂用量为功能单体与交联剂质量之和的10-20%。

2.根据权利要求1所述的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于所述方法中模板分子为异鼠李素。

3.根据权利要求1所述的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于所述方法中功能单体选择丙烯酰胺、2-乙烯基吡啶、4-乙烯基吡啶、甲基丙烯酸中的一种。

4.根据权利要求1所述的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于所述方法中载体选用纳米TiO₂。

5.根据权利要求1所述的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于所述方法中致孔剂选用乙腈、氯仿、丙酮、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中的一种。

6.根据权利要求1所述的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于所述方法中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯中的一种，引发剂为偶氮二异丁腈。

7.根据权利要求1所述的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的制备方法，其具体步骤为：

将模板分子和功能单体按摩尔比溶解到适量致孔剂中，超声分散，加入适量纳米TiO₂，搅拌，置于反应装置上通氮脱氧，加入交联剂和致孔剂，控制温度在50-70℃反应，得到分子印迹聚合物微球；

将得到的聚合物用甲醇/乙酸混合液在索式提取装置中进行洗脱72h以上，再用甲醇溶液洗涤平衡除去乙酸，将洗涤后的聚合物真空干燥，即得到异鼠李素分子印迹聚合物。

8.根据权利要求7所述的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球的制备方法，其特征在于步骤（1）中的超声分散时间为10-20min，搅拌2-4小时，通氮脱氧时间为10-20min；步骤（2）中的混合液甲醇：乙酸的体积比为9:1-5：5。

9.根据权利要求1所述的制得的异鼠李素表面分子印迹聚合物微球用于药物成分的分离纯化中，其特征在于：吸附温度为15-45℃，吸附量为1.5-3.5mg/g。