CN104792979B - 一种检测人基质金属蛋白酶‑12活性的荧光多肽底物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测人基质金属蛋白酶‑12活性的荧光多肽底物及检测方法。该荧光多肽底物包括如PeptideⅠ所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列的第1位异亮氨酸结合荧光基团5‑羧基荧光素，第12位的赖氨酸结合荧光猝灭基团5‑羧基四甲基若丹明。本发明所述的荧光多肽底物与MMP‑12反应的酶促反应动力学常数Km为35μM，kcat/Km：35428M‑1.s‑1，其是MMP‑9酶切本发明荧光多肽底物kcat/Km的6.4倍，MMP‑1、3与本发明所述的荧光多肽底物几乎无反应。本发明所述检测人血清MMP‑12活性的方法，操作简便，快速，具有一定的特异性，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有特定序列或基序的检测基质金属蛋白酶-12（MMP-12）的荧光多肽底物及其活性检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases， MMPs)是一类依赖钙离子的含锌的内肽酶家族，能够降解细胞外基质及基底膜中的多种成分，具有以下特点：①能降解细胞外基质及基底膜的成分；②以酶原形式分泌，激活后具有生物学活性；③依赖钙离子维持其稳定性；④能被内源性组织型金属蛋白酶组织抑制剂抑制。MMPs来源于多种组织及细胞，如内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞及脑组织[1-3]。MMPs不仅在正常生理情况下参与组织器官形态的发生、细胞迁移和血管生成等，也在病理性的重塑过程中发挥重要的作用，如类风湿性关节炎[4]肿瘤的侵袭和转移[5]及慢性阻塞性肺疾病[6]、心血管疾病[7]等。
基质金属蛋白酶-12(Matrix Metalloproteinases-12，MMP-12)又被称为人巨噬细胞弹性蛋白酶，1975年由Werb等[8]首次在小鼠腹膜巨噬细胞中发现，1993年Shapiro等[9]在吸烟者的肺泡巨噬细胞中成功克隆出MMP-12的cDNA序列。MMP-12以54-kDa的酶原形式分泌，分泌后自剪切掉氨基末端的序列，生成45-kDa的活性形式，再剪切掉羧基末端的序列生成成熟的22-kDa活性形式[9,10]，MP-12的底物为弹性蛋白酶、Ⅳ型胶原、纤维结合蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、蛋白聚糖、硫酸软骨素、髓鞘碱性蛋白及α1-抗胰蛋白酶。在体内MMP-12、MMP-3、MMP-9、MMP-7以血纤维蛋白溶酶原为底物，血纤维蛋白溶酶原被水解后形成类血管抑制素的片段[11]；MMP-12还能够激活其它的MMPs，如MMP-2及和MMP-3，放大并加速蛋白的降解[12]。
研究发现MMP-12与多种疾病的发生与发展密切相关，如慢性阻塞性肺疾病[6]、冠心病斑块破裂[13]、主动脉夹层[14]、腹主动脉瘤[15]、创伤型深静脉血栓[16]等。但是由于MMPs间的复杂相互作用机制及研究方法的限制，其具体作用机制仍未阐明。因此建立一个准确高效的MMP-12活性检测方法在了解MMP-12的功能及相关作用机制的研究中显得十分重要。
目前检测蛋白酶活性的主要方法有分光光度法、荧光法、同位素测定法、电化学方法等。由于荧光发发的灵敏度往往比分光光度法要高若干个数量级，荧光强度也和激发光的光源有关；荧光多肽合成、纯化方法较简便以及在实验过程中可避免离子强度、pH、温度等多种因素对实验结果的影响，在酶学研究中越来越多地被采用。
检测MMPs活性的荧光底物原理是在合成的蛋白酶底物两端分别偶联荧光发光基团和淬灭基团，可通过检测底物被切割后产生荧光的强度来检测蛋白酶切割反应的情况[17, 18]。在无蛋白酶时，由于荧光核和猝灭剂相互彼此靠近,该完整肽链不具有内源性的荧光活性，当蛋白酶断裂该肽链，被分离的荧光核不能再被猝灭剂有效地猝灭而表现荧光活性，即可测定蛋白酶裂解底物在特定Ex/Em产生的荧光值。
目前报道了多种可被MMP-12水解的荧光多肽底物，但是特异性低，在被MMP-12水解的同时也可以与其它MMPs发生水解反应，例如美国Anaspec公司所合成的MMP-12荧光底物可同时被MMP-1、2、3、8和13酶切。临床血清样本中含有多种MMPs，MMP-12的功能是与多种家族成员及组织抑制剂共同调节完成的，由此以来使用这些荧光多肽底物检测血清中的MMP-12的活性便降低了检测的可靠性。不适合于临床检测MMP-12酶活性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种特异性高的能检测MMP-12活性的荧光多肽底物及检测方法。
为实现本发明的上述目的，本发明采用的技术方案如下：
使用化学合成的方法合成一种检测MMP-12酶活性的荧光多肽底物，该底物包括如PeptideⅠ所示的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第1位的异亮氨酸的氨基和第12位的赖氨酸的氨基分别结合有荧光基团和荧光猝灭基团。
荧光素染料的应用非常广泛，包括荧光显微镜，流式细胞技术和免疫荧光分析等。所述的结合在PeptideⅠ所示的氨基酸序列的荧光基团和荧光猝灭基团是：与第1位异亮氨酸的氨基结合的荧光基团5—羧基荧光素(5-FAM)，与第12位的赖氨酸的氨基结合的荧光猝灭基团5—羧基四甲基若丹明(5-TAMRA)。本发明所述荧光多肽底物其氨基酸序列N端第1位异亮氨酸和第12位赖氨酸结合有荧光基团和荧光猝灭基团，激光照射时荧光多肽底物中的荧光基团发射能量，用以荧光检测。能够使用的荧光基团和荧光猝灭基团在本行业是很多的，包括荧光素1—氨基萘—8—羧酸(EDANS),羧基荧光素（FAM）。但作为优选，本发明所述荧光基团为5一羧基荧光素（5-FAM），荧光猝灭基团为5一羧基四甲基若丹明(5-TAMRA)。
当一定波长激光照射该荧光多肽底物时，N端第1位异亮氨酸和第12位赖氨酸的荧光基团同时发射能量，但此发射能量又由于彼此位点的接近而被彼此所吸收，无法发射能量。而当该荧光多肽底物被MMP-12酶解后，由于异亮氨酸和赖氨酸相互分离，从而使能量发射并被检测出来。
本发明提供的荧光多肽底物可被MMP-12水解，MMP-12催化荧光多肽底物反应的酶促反应动力学常数km：35μM，kcat为1.24s-1，kcat/Km为35428M-1.s-1。其中MMP-9酶切本发明所述荧光多肽底物kcat/Km的6.4倍，MMP-1、3与本发明所述的荧光多肽底物几乎无反应。说明本发明所述的荧光多肽底物在与MMPs反应时有一定的特异性。
本发明还提供了一种检测血清中MMP-12酶活性的方法，取APMA激活后的待测血清与过量的上述荧光多肽底物在反应缓冲液中混合，并在黑色96孔板上建立100μl的反应体系，37℃下在所述荧光多肽底物所结合荧光集团相应的激发波长和发射波长下，检测荧光强度，从标准曲线中计算出蛋白酶活性，以单位质量蛋白酶裂解底物的速率μmol/L.s.mg表示，比较不同血清样本的MMP-12活性。
本发明所述检测方法是利用一定波长激光照射含有特定待测血浆样品和荧光多肽底物，如果血浆样品中MMP-12酶活性很低，无法酶解荧光肽链底物，连接在N端第1位异亮氨酸的荧光基团被连接在第12位的赖氨酸位点的猝灭基团猝灭，当蛋白酶断裂该肽链，被分离的荧光核不能再被猝灭剂有效地猝灭而表现荧光活性，即可测定蛋白酶裂解底物在特定Ex/Em产生的荧光值。MMP-12在正常血浆中的浓度未知，因此采用ELISA的方法先测定血清中MMP-12的浓度，所测样本中MMP-12浓度大约为4ng/ml。为了保证检测结果的准确性，本发明所述检测MMP-12活性的方法中加入过量的荧光多肽底物，使血浆样品中MMP-12充分反应。在以下的实例1中，所述荧光多肽底物的用量为18μmol，远远大于血清中MMP-12含量。
本发明所述检测MMP-12活性的方法操作简便，快速，有一定的特异性。
在以下的实例1中，本发明所述的荧光多肽底物所结合的荧光基团为荧光素-5-马来酰胺，所述的发光波长为485nm，发射波长为538nm。所述反应缓冲液包括：50mM Tris，PH7.4，20 mM CaCl2，200mM NaCl，0.005%Brij-35。
本发明还提供一种检测MMP-12酶的试剂盒，包括上述荧光多肽底物。所述的试剂盒中的反应缓冲液包括50mM Tris，PH7.4，20 mM CaCl2，200mM NaCl，0.005%Brij-35。
本发明所述的试剂盒稳定性好，保存时间长，检测MMP-12活性方便，可应用于检测血清中MMP-12活性。
附图说明
图1为本发明所述荧光多肽底物的HPLC分析图。
图2为本发明所述荧光多肽底物的质谱分析图。
图3为本发明所述荧光多肽底物与MMP-12反应的Lineweaver-Burk(A)
与Michaelis-Menton(B)散点图。
图4为本发明所述检测MMP-12活性的荧光多肽底物与MMP-1、3、9、12的反应折线图。荧光多肽底物为本发明所示的荧光多肽底物，底物浓度0.5μM，MMP-1、3、9、12浓度为15nM。横坐标为时间min，纵坐标为相对荧光单位RFU。
图5为本发明实例1所述荧光多肽底物与血清中MMP-12反应的散点图，其中1、2号样本取自冠状动脉造影正常患者的动脉血清，3、4号样本取自冠状动脉造影证实有狭窄的稳定型心绞痛患者的动脉血清，荧光多肽底物为本发明所示的荧光多肽底物，底物浓度为18μM，横坐标为时间min，纵坐标为相对荧光单位RFU。图表中每一个点的数值取两次重复实验的平均值（mean±SD）。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种检测MMP-12活性的荧光多肽底物及检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数，但是特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明。为了进一步理解本发明，下面结合实例对本发明进行详细说明，但是并不是要将本发明限定为实施例。
实施例：本发明所述的荧光多肽底物（北京赛百盛生物工程公司化学合成），MMP-1、12购自美国R＆D Systems公司，MMP-9、3购自美国RayBiotech公司，APMA购自美国Anaspec公司，5-FAM购自美国Sigma公司，检测血清中MMP-12的ELISA试剂盒购自EIAab(武汉伊艾博科技有限公司)。
1、荧光多肽的合成及储存。
化学合成荧光多肽底物，序列为PeptideⅠ所示，合成的荧光多肽底物行高压液相色谱和质谱分析以检测荧光多肽底物的纯度及质量（图1，图2）。荧光多肽底物以冻干粉形式储存于-20℃冰箱。
2. MMP-12催化荧光多肽底物的酶促反应动力学参数计算。
MMP-12酶原加入1mM APMA，37℃下温育2小时，活化后用反应缓冲液将酶溶液稀释为15nM。DMSO溶解荧光多肽底物冻干粉并配成1mM的溶液，反应缓冲液稀释1mM的DMSO底物溶液为10～320μM的底物工作液。
将酶溶液及底物工作液分别置于37℃温育15min，在黑色不透明的96孔板的孔内分别加入不同浓度的底物工作液50μl及等体积的反应缓冲液或酶溶液建立100μl反应体系，酶与底物混匀后立即放入荧光酶标仪，37℃下用Ex/Em=485nm/538nm的滤光片读取荧光强度，间隔1min，读取120次。
5-FAM标准曲线绘制：由于荧光多肽底物自身会吸收一定的荧光值，因此需要对实验中使用过的不同浓度的底物工作液分别做5-FAM标准曲线来校正因被荧光多肽底物吸收而猝灭的荧光值。在黑色不透明的96孔板中用反应缓冲液将5-FAM稀释为0.03~1.25μM的工作液，每孔50μl，再在孔中加入等体积的底物工作液，在荧光酶标仪上用Ex/Em=485nm/538nm的滤光片读取荧光强度，绘制标准曲线。使用相同的方法对5~160μM的底物工作液分别做标准曲线。根据标准曲线将RFU转换为酶催化荧光多肽底物产生的产物的摩尔浓度。
荧光多肽底物的酶促反应的动力学参数Km、kcat是根据酶与不同浓度底物（10～80μM）的反应曲线以及双倒数作图法计算出来的。（计算条件：在反应的前几分钟内，产物生成率或底物转化率应低于10%）。
图3结果所示，A：双倒数作图得出y轴截距为1/Vmax=0.01122 s/μM，x轴截距为-1/Km=-0.02835L/μM。B:当荧光多肽底物浓度约为120μM时，酶与底物出现最大反应速度，达到最大反应速度一半时的底物浓度即Km，Km大约为30μM。因此MMP-12水解本发明所述荧光多肽底物的Km为Km：35μM,kcat为1.24s-1，kcat/Km为35428M-1.s-1。
3、酶催化荧光多肽底物反应的特异性分析。
在37℃下，用1mM APMA分别活化MMP-1、3、9、12，具体活化时间见表1。
表1 MMPs活化时间表
。
用反应缓冲液将活化后的MMPs稀释为30nM，稀释1mM荧光多肽底物为1μM的底物工作液，分别置于37℃孵育15min后在黑色96孔板中加入50μl酶溶液和等体积的底物工作液，建立100μl的反应体系，酶与底物混匀后放入荧光酶标仪，用Ex/Em=485nm/538nm的滤光片读取荧光强度，每5min读取一次，一共读取12次。
由图4结果可见，经过60分钟的反应，相对于MMP-12酶切本发明中的荧光多肽底物的效率，MMP-12酶切本发明所述荧光多肽底物的kcat/Km是MMP-9酶切本发明所述底物kcat/Km的6.4倍，MMP-1、3与本发明所述的荧光多肽底物几乎无反应。说明本发明所述的荧光多肽底物在与MMPs反应时有一定的特异性。
4、实例1：人血清MMP-12活性的检测。
取4份不同患者的动脉血清样品，1、2号为冠状动脉造影正常患者，3、4号为冠状动脉造影证实有狭窄的稳定型心绞痛患者。先用ELISA方法检测血清中MMP-12浓度，在黑色不透明的96孔板中加入50μl MMP-12浓度最低的血清样本，再用反应缓冲液将余下3份血清样本稀释使得MMP-12浓度相同，取50μl加入96孔板。血清中加入一定量的APMA使得其终浓度为1mM，37℃温育血清2小时。用反应缓冲液配制浓度为36μM的荧光多肽底物溶液并置于37℃温育15min。在温育后的血清中加入等体积的荧光多肽底物溶液，建立100μl的反应体系。酶与底物混匀后立即放入荧光酶标仪，在37℃下用Ex/Em=485nm/538nm的滤光片读取荧光强度，间隔5min，读取12次。每份血清样本检测两次，两次计算结果取平均值（mean±SD）。制作荧光多肽底物浓度为18μM的5-FAM标准曲线（具体方法见前述）。根据蛋白酶-底物反应荧光变化速率及标准曲线计算出蛋白酶的活性，以单位质量MMP-12裂解底物的速率表示，结果见表2。
表2待测血清样本MMP-12活性检测
。
由图5结果可见4个血清样本与本发明所述的荧光多肽底物反应得到不同的反应曲线。表2结果可见本发明所述的荧光多肽底物可以检测血清中MMP-12的活性，并且在MMP-12浓度相同4组血清样本中具有不同活性，从而为临床试验研究MMP-12活性与冠心病的发生和发展的关系提供方法和思路。
以上说明只是用于帮助理解本发明的方法及荧光多肽底物的相关特性。应当指出的是对于本技术领域人员来说，在不脱离本发明底物序列及实验方法的前提下，还可以对本发明进行改进、修饰或者扩展获得更多的实例，这些改进、修饰及实例也属于本发明权利要求的保护范围内。
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SEQUENCE LISTING
<110> 昆明医科大学附属第一医院
<120> 一种检测人基质金属蛋白酶-12活性的荧光多肽底物
<140> 201410450501.X
<141> 2014-09-09
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ile Lys Ser Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Lys
1 5 10
Claims (13)
1.一种检测人基质金属蛋白酶-12活性的荧光多肽底物，其特征在于：包括如PeptideⅠ所示的完整的氨基酸序列，并且其氨基酸序列N端第1位的异亮氨酸的氨基和第12位的赖氨酸的氨基分别结合有荧光基团和荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的检测人基质金属蛋白酶-12活性的荧光多肽底物，其特征在于：所述结合的荧光基团和荧光猝灭基团是，与第1位异亮氨酸的氨基结合的荧光基团5—羧基荧光素，与第12位的赖氨酸的氨基结合的荧光猝灭基团5—羧基四甲基若丹明。
3.根据权利要求2所述的检测人基质金属蛋白酶-12活性的荧光多肽底物，其特征在于：在PH为7.4的50mM Tris， 20 mM CaCl2，200mM NaCl，0.005%Brij-35，温度为37℃的反应体系下，MMP-12催化荧光多肽底物反应的酶促反应动力学常数Km为35μM，kcat为1.24s-1，kcat/Km为35428M-1.s-1。
4.根据权利要求3所述的检测人基质金属蛋白酶-12活性的荧光多肽底物，其特征在于： MMP-9酶切所述荧光多肽底物kcat/Km的6.4倍，MMP-1、3与所述的荧光多肽底物反应趋近为零。
5.一种如权利要求1所述的荧光多肽底物在制备检测人血清中MMP-12活性制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的荧光多肽底物在制备检测人血清中MMP-12活性制剂中的应用，其特征在于检测方法为：取待测血浆样品与过量的所述荧光多肽底物在反应缓冲液中混合，并在黑色96孔板上建立100μl的反应体系，然后在所述荧光多肽底物所结合荧光基团相应的激发光波长和发射光波长下，检测反应体系的荧光强度，根据荧光强度的变化速率，从标准曲线中计算出蛋白酶活性，以单位质量蛋白酶裂解底物的速率μmol/L.s.mg表示。
7.根据权利要求6所述的荧光多肽底物在制备检测人血清中MMP-12活性制剂中的应用，其特征在于：所用的荧光多肽底物浓度为18μM。
8.根据权利要求6所述的荧光多肽底物在制备检测人血清中MMP-12活性制剂中的应用，其特征在于：对应荧光发光基团5—羧基荧光素的激发光波长为485nm，发射光波长为538nm。
9.根据权利要求6所述的荧光多肽底物在制备检测人血清中MMP-12活性制剂中的应用，其特征在于：所述反应缓冲液包括PH为7.5的50mM Tris，20 mM CaCl2，200mM NaCl，0.005%Brij-35。
10.根据权利要求6所述的荧光多肽底物在制备检测人血清中MMP-12活性制剂中的应用，其特征在于：待测血浆样品与过量的所述荧光多肽底物在反应缓冲液中混合反应是在37℃进行。
11.一种检测人基质金属蛋白酶-12活性的荧光多肽底物试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的荧光多肽底物。
12.根据权利要求11所述的检测人基质金属蛋白酶-12活性的荧光多肽底物试剂盒，其特征在于：试剂盒所对应的反应缓冲液包括PH为7.5的50mM Tris，20 mM CaCl2，200mMNaCl，0.005%Brij-35。
13.根据权利要求11所述的检测人基质金属蛋白酶-12活性的荧光多肽底物试剂盒，其特征在于：试剂盒所对应的反应在37℃进行。
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