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CN104781414B - 用于获得1-蔗果三糖的方法 - Google Patents

用于获得1-蔗果三糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了通过使用在非解糖酵母宿主中组成性地表达的分离自苇状羊茅(Festuca arundinacea)的重组果糖基转移酶(FTF)来以工业规模获得1‑蔗果三糖的方法。在本发明中，组成性地、稳定地和以高水平产生蔗糖:蔗糖1‑果糖基转移酶类型的重组FTF(1‑SSTrec)，在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株的培养物的上清液以及细胞沉淀物中。因此，本发明还提供了用于以工业规模获得1‑SST的方法。所得的重组酶用于从蔗糖开始大量地酶促产生果寡糖(FOS)，尤其是1‑蔗果三糖。本发明的方法允许高于55％的FOS转化率，其中1‑蔗果三糖占大于90％。

Description

用于获得1-蔗果三糖的方法
技术领域
本发明涉及食品领域和制糖工业，特别地涉及从蔗糖或其他包含蔗糖的原料(例如蜂蜜、糖膏、糖浆等)开始来获得果寡糖(FOS)。
现有技术
FOS由具有1-9个通过β2→1键与蔗糖分子相连接的果糖残基的线性链组成(Yun,1996,Enzyme Microb.Technol.,19:107-117)。这些化合物的重要性在于，其可以用作人以及动物的饮食的不可消化成分，从而通过经由选择性地刺激在结肠中的一种或多种类型的微生物的生长或活性而产生有益作用来提供益生效应。在所述微生物之中包括乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)(Gibson和Roberfroid,1995,J.Nutr.,125(6):1401-12)。在自然界中，FOS通过植物、真菌、细菌和某些酵母的果糖基转移酶(FTF，EC 2.4.1.9)和β-呋喃果糖苷酶(EC 3.2.1.26)类型的酶的作用而产生(Guío等人,2009,Recent Patents on Food,Nutrition&Agriculture.,1(3):221-30)。
目前，FOS的工业生产遵循两种策略来进行：菊粉的部分降解(Yun.,1996,EnzymeMicrob.Technol.,19:107-117；Franck.,2002,British Journal of Nutrition,87(2):S287-S291)，或者通过使用主要由真菌(黑曲霉(Aspergillus niger)、日本曲霉(A.japonicus)、米曲霉(A.oryzae)、棘孢曲霉(A.aculeatus)和出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans))产生的具有高的转果糖基酶活性的β-呋喃果糖苷酶或FTF而从蔗糖开始进行酶促合成(Yun.,1996,Enzyme Microb.Technol.,19:107-117；Vaňková等人,2008,Chemical Papers,62(4):375-381)。这两种技术均产生其聚合度(DP)从2至10变化的FOS的混合物，其主要组分为：1-蔗果三糖(GF2)、真菌四糖(GF3)、果糖基真菌四糖(GF4)、黑麦双叉寡糖(bifurcose)(GF3)、菊粉二糖(F2)、菊粉三糖(F3)和菊粉四糖(F4)。1-蔗果三糖是具有最大商业利益的FOS，这是由于其低热量甜味剂的和益生的双重作用，以及由于其作为用于糖尿病患者的糖的可能用途(Vega和Zúniga-Hansen.,2011,BioresourceTechnology,102(22),10180-10186)。
通过蔗糖的生物转化来生产FOS的技术和专利文献基于野生型微生物的细胞和酶(固定化的或游离的)的使用，所述野生型微生物例如为：出芽短梗霉(Smith和Luenser,1980,专利US4309505)、海枣曲霉(A.phoenicis)(Van Dooren等人,1988,专利US4849356)、黑曲霉(Hidaka,H.等人,1988,Agric.Biol.Chem.,1181)、棘孢曲霉(Fernandez-Arrojo等人,2009,专利申请WO 2010/103150 A1)，酵母红酵母属物种(Rhodotorula sp.)(Aguiarde Oliveira等人,2007,专利申请BRPI0705359-2 A2)，以及细菌产左聚糖微杆菌(Microbacterium laevaniformans)(Hatcher等人,1988,专利US4927757)、水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)(Ohtsuka,K.等人,Biosci.Biotech.Biochem.,56(9),1373-1377,1992)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)(Hatcher等人,1988,专利US4797360)等。这些生产方法在各种不同类型(主要是搅拌罐和固定床类型)的反应器中实施，所述反应器要么以不连续的方式要么以连续的方式运作。迄今所使用的不连续方法具有这样的限制：释放出的葡萄糖的积累抑制了合成反应。另一方面，使用固定化在各种不同支持物上的酶或细胞的连续方法通过生物催化剂的再使用而降低了生产过程的成本，并且还减小了葡萄糖的抑制效应。然而，所述连续方法具有这样的限制：不可以以高流量进行运作，这归因于向底物扩散和接近的限制。调节反应时间以避免水解活性，所述时间取决于初始的酶活性量/克底物，并且在8和24小时之间变化，在此期间合成1-蔗果三糖、真菌四糖和果糖基真菌四糖的混合物。
从其碳水化合物组成为大约20-25％的葡萄糖、10-15％的蔗糖、5％的果糖和55-60％的总FOS的反应产物的混合物开始和从1-蔗果三糖浓度可以在40和60％之间变化的FOS开始来获得纯度大于90％的或者以晶体形式的1-蔗果三糖(Tetsuhiro等人,1995,专利US5463038；Koichiro等人,2010,专利申请JP2010273580-A)，是一个极其复杂的过程，其从技术-经济的观点来看对于其在食品中的使用来说是难以实现的。从技术-经济的观点来看，1-蔗果三糖的色谱法分开仅当在混合物中其浓度高于总FOS的80％时才是切实可行的(Nishizawa等人,1996,专利US6479657)。
其FOS内容物主要为1-蔗果三糖(大于所述混合物的糖类的80％)的反应混合物的获得是罕见的。已经通过源自于某些真菌例如棘孢曲霉(Hang和Woodams,1995,Biotechnology Letters,17:295-298)和日本曲霉ATCC 20236的酶，依靠使用低于227g/L的蔗糖浓度(Mussatto等人,2009,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,59:76-81)，以高水平合成了1-蔗果三糖。在这两个报告中，1-蔗果三糖占存在于混合物中的总FOS的大约71％，但是当检定高于500g/L的蔗糖浓度时，1-蔗果三糖的百分比降低至接近或低于60％的值(Ghazi等人,2005,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,35:19-27)。黑曲霉ATCC 20611、娄地青霉(Penicillium roqueforti)和短柄帚霉(Scopulariopsis brevicaulis)的β-呋喃果糖苷酶能够在500g/L的蔗糖的浓度下，分别以76.7％、86.7％和91.3％产生1-蔗果三糖(Nishizawa等人,2002,专利US6479657 B1)。虽然这些数字显示娄地青霉和短柄帚霉的酶在1-蔗果三糖的产量方面优于黑曲霉的酶，但在生产率和稳定性方面则不是这样。此外，这两种微生物均未被认为对于在食品中应用来说是安全的(GRAS(General Recognized as Save)或QPS(Qualified Presumption ofSafety))(EFSA Panel on Biological Hazards.,2009,EFSA Journal,7(12):1431；Cuenca-Estrella等人,2003,Antimicrob Agents Chemother,47(7):2339-2341)。
在工业发酵中丝状真菌的使用是另一个巨大的生产限制，因为菌丝缠绕到搅拌器的推进器中，从而损坏其翼板，并且所述菌丝经常倾向于阻塞发酵罐的空气扩散器(Ahmad等人,2010,Bioprocess Biosyst Eng.,33,599-606)。
在各种不同的β-呋喃果糖苷酶之间的氨基酸序列同一性的研究用作用于获得黑曲霉的该酶的突变型形式的工具。通过在缺乏β-呋喃果糖苷酶活性的同一真菌的菌株中表达编码该突变型酶的基因，达到了93.5％的总FOS相应于1-蔗果三糖，当该酶在550g/L的蔗糖浓度下反应时(Nakamura等人,2010,专利US7655449)。
然而，还未找到技术上可行的FTF生产系统(其允许所述酶的商业可得性)，以用于FOS的工业生产，更特别地说用于特异地生产1-蔗果三糖(Vega和Zúniga-Hansen.,2011,Bioresource Technology,102(22),10180-10186)。真菌的培养以及随后的内源性FTF的提取和/或纯化是主要的限制，因此需要调查研究其他宿主的使用。
作为旨在揭示和描述在植物中果聚糖的合成机制的基础性调查研究的结果，已经发表了与编码作用于作为底物的蔗糖的酶FTF的基因的分离有关的工作。所述基因来源于各种不同的植物物种，例如：菊苣(Cichorium intybus)(De Halleux和van Cutsem.,1997,Plant Physiol,113:1003-)、大麦(Hordeum vulgare)(Hochstrasser等人,1998,FEBSLetters,440:356-360)、菊芋(Helianthus tuberosus)(Van der Meer等人,1998,PlantJ.,8月15日,(4):489-500)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)(Luscher等人,2000,PlantPhysiology,124(3):1217-1227)、特基拉龙舌兰(Agave tequilana)(Avila-Fernandez等人,2007,Plant Science,173:478-486)、洋葱(Allium cepa)(Gadegaard等人,2008,J.Plant Physiol.,165:1214-1225)、多年黑麦草(Lolium perenne)(Lasseur等人,2009,Journal of Experimental Botany,57(11):2719-2734)和普通小麦(Triticum aestivum)(Schroeven等人,2008,New Phytol,180:822-831)。已经在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中表达了这些天然的、组合的(通过催化结构域的互换而形成杂合酶)或者具有点突变的基因中的一些，以用于与系统发生、酶功能性和分子表征有关的基础研究(不具有生产目的)(Altenbach等人,2004,FEBS Letters,567:214-218)。在所有这些在实验室水平上进行的研究中，使用了醇氧化酶I的转录调控启动子(pAOXI)。该可用甲醇诱导的启动子在许多大规模的工业方法中不被接受，这是由于要使用的甲醇的巨大的量，考虑到其挥发性和易燃特征。此外，该醇的使用在食品或其成分的加工中被禁止。在一些工作中，证明了蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)在1-蔗果三糖合成中的特异性，但仅在0.1-0.15M(34.2-51.3g/L)的相对低的蔗糖浓度下。此外，观察到这些1-SST类型的酶能够使用1-蔗果三糖作为底物(Luscher等人,2000,Plant Physiology,124(3):1217-1227；Avila-Fernández等人,2007,Plant Science,173:478-486)。在与将启动子pAOXI用于牵涉食品的大规模方法的实际限制相联系地而提及的工作中，没有发现极低的表达水平，也没有发现极低的热稳定性水平，这为在FOS的工业生产中使用植物来源的该类型的酶暗示了或奠定了基础。
因此，在1-蔗果三糖的工业生产中，从未使用过从植物来源分离的重组酶。在工业规模上，仅使用了植物菊苣和菊薯(Polymnia sonchifolia)的汁液，其由具有各种不同DP的FOS的混合物构成，其中1-蔗果三糖不是占多数的(Guío等人,2009,Recent Patents onFood,Nutrition&Agriculture,第1卷第3期)。诸如低产率、很少向细胞外介质中分泌以及在其通过重组脱氧核糖核酸(DNA)技术进行表达期间被蛋白酶降解此类的因素，连同所考虑的酶的自身不稳定性一起，已经在FOS的工业生产中使平衡倾向于偏向使用真菌或由其产生的酶FTF。
如果在文献中缺少或没有关于将植物来源的酶用于工业化生产1-蔗果三糖的报告，那么也就不会为此目的使用膜生物反应器(MBR)。迄今为止，该技术已成功地用于建筑物中水的重复利用、对于小社区的废水处理、工业残余物的处理、垃圾场沥滤液的处理等(Judd S.,2008,TRENDS in Biotechnology,25(2):109-116)。仅两个报道反映了将直接接触式MBR用于生产FOS。其中之一使用膜来将微生物与包含FOS的反应混合物分开，其中1-蔗果三糖不是占多数的产物(Sánchez等人,2008,Food and bioproducts processing,86,109-115)。使用了类似的生物反应器来通过纳米过滤膜去除在不连续反应中由黑曲霉ATCC20611的游离的β-呋喃果糖苷酶所释放出的葡萄糖(其抑制FOS的合成)，其中蔗糖的初始浓度仅为300g/L和1-蔗果三糖的最终浓度为总FOS的38.7％(Nishizawa等人,2001,FoodSci.Tech.Res.,7,39-44)。在这些条件下，1-蔗果三糖的工业生产是很少赢利的。不存在与使用MBR来获得1-蔗果三糖有关的报告和专利。
通过所有上面所陈述的，可以领会到获得以高生产率和低成本生产1-蔗果三糖的技术是令人感兴趣的。
发明描述
本发明通过提供用于从蔗糖开始以工业规模获得1-蔗果三糖的方法而解决了上面提出的问题，所述方法借助于简单、便宜、有效和工业上可规模化的技术。本发明的方法的特征在于：在生物反应器中通过使用在非解糖酵母宿主中组成性地表达的分离自苇状羊茅的重组FTF来进行蔗糖向1-蔗果三糖的转化。
在本发明中首次描述的该方法全面地对待处理关于在从蔗糖开始获得FOS的方法中存在的主要技术限制(特别是与1-蔗果三糖的获得有关的限制)的解决办法。所描述的工艺程序凸显了该方法的两个基本步骤：1)酶或生物催化剂的产生，和2)1-蔗果三糖的产生。
为了本发明，工业规模是这样的1-蔗果三糖的生产规模，即其全部或部分的产物体积以商业目的进行使用。为此可以使用就其设计而言普遍的和在市场上可得的设备。
在本发明的背景下，非解糖酵母被定义为缺乏对于蔗糖的水解活性的野生型或突变型酵母。在该类型的酵母之中包括例如，甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)，以及突变型酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YSH2.64-1A(Rehm等人,1998,Journal of Bacteriology,180(5):1305-1310)。
在本发明的一个实施方案中，所述FTF为蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)。在本发明中，对于通过重组DNA技术获得的该酶，将其命名为1-SSTrec。为了优化该酶的获得和产生步骤，在本发明中，从分别分离自羊茅(苇状羊茅)、洋葱(洋葱)和龙舌兰(特基拉龙舌兰)的1-SST类型的植物FTF的选择和鉴定方法出发。该观察分析在与FOS的工业生产有关的文献报道中还未碰到过。将编码这些中的每一个的基因克隆到表达盒中，以用于巴斯德毕赤酵母的遗传修饰。尽管有该酵母作为宿主用于工业生产的可能的生产限制，例如在其生长期间溶解氧的限制，但该微生物(缺乏内源性解糖活性)被认为具有高的异源蛋白质向培养基中的分泌水平，在发酵罐中在受控的生产条件下高的生物质产量，并且从关于食品加工的生物安全性规章的观点来看被认为是GRAS。因此，上面提及的1-蔗果三糖的生产方法是本发明的一部分，其中所述非解糖酵母宿主为巴斯德毕赤酵母菌株。
在该调查研究的第一个阶段中，在编码1-SSTrec的基因的表达中，成功地使用了醇氧化酶I的转录调控启动子(pAOXI)。然而，该可用甲醇诱导的启动子的使用对于大规模的工业方法来说不被接受，这是由于要操作处理的大的甲醇体积、其挥发性和其易燃特征。另一方面，该醇的使用在食品或其成分的加工中不被允许。令人惊讶地，通过使用源自甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的组成型启动子(pGAP)来进行的编码1-SSTrec的基因的表达经证明对于酵母宿主来说不是毒性的，并且使得能够获得高的生物质水平和分泌至细胞外介质的该酶的表达水平，高于在本发明中所研究的其他两种FTF。可以强调，这是首次成功地将该启动子用于表达编码植物来源的FTF的基因。
将对所研究的酶的每一种的三个转化体在工作体积为5升的发酵罐中进行培养，接着是增补式培养策略。在72小时的发酵之后，使培养液经历离心过程，从而获得两个级分：一个是细胞或生物质，和一个是培养物上清液。使这两个级分都经历30分钟的短期的酶活性测定法，在30℃下用在0.02M乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中用0.87M(300g/L)蔗糖溶液进行温育。在这些条件下，观察到携带一个拷贝的编码分离自苇状羊茅的1-SST的基因1-sstf的所检定的三个克隆在所述两个级分中都显示出最高水平的释放出的葡萄糖，这表明了比所检定的其余酶高得多的活性。令人惊讶地，分离自苇状羊茅的1-SSTrec经证明比其洋葱和龙舌兰的同源物更稳定，这允许大规模地生产1-蔗果三糖。
使用多个拷贝的基因1-sstf来通过双或单同源重组对巴斯德毕赤酵母进行遗传修饰，直至获得菌株CIGB 308。该菌株包含稳定地整合到其基因组中的所提及的基因的新拷贝。因此，本发明的目标为用于以工业规模生产1-蔗果三糖的方法，其中所述巴斯德毕赤酵母菌株包含多个拷贝的整合到其基因组中的编码1-SST的基因。
当在发酵罐中培养时，巴斯德毕赤酵母菌株CIGB 308产生酶1-SSTrec。这在当处于下述情况时均发生：发酵罐以不连续方式、以连续方式或者通过补料分批方式运作，此外还使用了补充有酵母提取物、痕量盐和维生素的含盐培养基，并且使用甘油或葡萄糖作为碳源，尽管使用蔗糖或包含其的原料是优选的，因为用该底物获得最高的生产产量。
因此，在本发明的一个方面，在以工业规模生产1-蔗果三糖中使用的FTF在巴斯德毕赤酵母培养物的上清液和/或细胞沉淀物中获得。在本发明的一个实施方案中，所述FTF通过在以不连续、连续或增补的方式进行操作的发酵罐中培养重组酵母来产生。在一个特别的实施方案中，在培养中所使用的碳源为选自任何纯度的甘油、葡萄糖和蔗糖的化合物。
在本发明中所获得的细胞外酶活性水平接近于对于真菌的酶所报告的平均值，其低于100.0U/mL(Driouch等人,2010,Appl Microbiol Biotechnol,87:2011-2024)，但比对于在酵母中表达的任何来源的重组FTF所描述的高得多(Trujillo等人,2002,Afinidad,59(500):365-370；Rehm等人,1998,Journal of Bacteriology,180(5):1305-1310)。关于在细胞内级分中的活性，高活性与高细胞密度的组合产生超过38000U/L培养物的生物质产量，这等价于在文献中对于真菌的酶所报道的最大值的6或7倍(Dorta等人,2006,Journalof Industrial Microbiology and Biotechnology,33(12):1003-1009)。
尽管巴斯德毕赤酵母也具有一些已经提及的生产限制，但是其作为宿主用于1-SSTrec的重组表达的用途(如在本发明中所描述的)消除了在工业中作为FTF的天然来源而使用的真菌的生产限制中的一些，其在上面已作了描述。从关于食品加工的生物安全性规章的观点来看，巴斯德毕赤酵母是一种GRAS微生物。
在本发明的一个实施方案中，为了以工业规模获得1-蔗果三糖而使用的蔗糖浓度高于400g/L。在本发明的一个实施方案中，通过以其游离或固定化形式的1-SST来进行蔗糖向1-蔗果三糖的转化。
在本发明的一个方面，在搅拌罐、固定床或膜类型的生物反应器中进行蔗糖向1-蔗果三糖的转化。在一个特别的实施方案中，所述MBR以连续或半连续的方式运作。
本发明的目标还为用于以工业规模将蔗糖转化为1-蔗果三糖的酶制备物，其特征在于，该酶制备物包含有在非解糖酵母中组成性地表达的分离自苇状羊茅的1-SST。
为了本发明，酶制备物为具有酶活性并且能够与特异的底物反应以将其转化为产物的液体或固体制剂。
在本发明的一个实施方案中，从中获得1-SSTrec的非解糖酵母为巴斯德毕赤酵母菌株。在一个特别的实施方案中，所述巴斯德毕赤酵母菌株包含多个拷贝的整合到其基因组中的编码1-SST的基因。从所述培养物开始，在其上清液和/或细胞沉淀物中获得所述1-SST。而在其这方面，为了本发明的目的，所述1-SST可以处于液体或固体状态，其是游离的或固定化的。在本发明的一个实施方案中，在通过包含1-SSTrec的酶制备物来工业获得1-蔗果三糖中所使用的蔗糖浓度高于400g/L。
如在实施例中所证明的，从巴斯德毕赤酵母菌株CIGB 308的培养物上清液或生物质开始通过常规的蛋白质纯化、干燥和固定化方法而获得的、液体或固体的、游离或固定化的1-SSTrec的酶制备物经证明对于进行贮存和销售来说是足够地热稳定的。由于该特征，所述制备物可以最终在FOS的工业生产中用作生物催化剂，如此让位于本发明的用于获得1-蔗果三糖的方法的第二个步骤。其的酶制备物(以其各种不同的变化形式)普遍地具有：在作为底物的蔗糖存在下能够以高于55％的转化率产生FOS，并且特别地在所述FOS中1-蔗果三糖大于90％。
在本发明的一个实施方案中，1-蔗果三糖的合成反应在下述条件下发生：200-800g/L，优选地600g/L的蔗糖浓度；4.0-7.0的pH，最佳pH为5.5；30-50℃，优选地40℃的温度；2-40的以U/g表示的“酶浓度/底物量”，对于1-24小时的反应时间，优选地15U/g，对于3小时的反应时间，这可应用于所拥有的酶制备物的任何变化形式，并且不依赖于为生产FOS而描述的生物反应器类型和操作方式。
本发明的方法消除了在从蔗糖开始工业获得FOS，特别是获得1-蔗果三糖的方法方面现有技术所收集的限制。代替使用真菌或源自这些微生物的酶FTF，而使用了重组的植物酶，其出人意料地且与所检定的其他植物FTF不同地，在巴斯德毕赤酵母中以高水平稳定地进行分泌，并且作为其对于蔗糖的作用的结果，有效地产生1-蔗果三糖。在本发明之前，还没有在FOS的工业生产中使用过重组的植物酶。另一方面，在通常用于工业酶促反应的搅拌罐型反应器的技术中，该酶仅被使用一次，这表现为低的生产率、产物量的变化(归因于批次与批次之间的差异)等。在本发明的一个实施方案中，通过MBR(以不连续的、连续的或顺次的方式(该最后一种是优选的))的游离的该酶的使用使得能够提高生产率，因为在更短的时间内达到了与在搅拌罐型反应器中所达到的类似的转化率，其中大于55％的蔗糖转化为FOS，并且在所述FOS中1-蔗果三糖占大于90％。
这些结果超过了所报道的，并且同时解决了现有的用于基于使用丝状真菌来工业生产1-蔗果三糖的技术的限制。另一方面，本发明的方法需要更少的投资成本、更低的能量消耗、更低的每单位数量的所产生的1-蔗果三糖所需的酶消耗，并且减少了在最终产物的精制中的操作的数目。
如已经提出的，通过应用本发明的方法，解决了在迄今所描述的FOS的生产方法中存在的限制，对于任何的微生物和反应器类型。
首次将苇状羊茅的1-SST用于工业获得1-蔗果三糖。尚未报告过通过使用植物来源的重组FTF来工业生产FOS。出人意料地且与所检定的其他植物FTF不同地，该酶以高水平稳定地产生，并且由酵母宿主巴斯德毕赤酵母分泌到培养基中。除了这些技术优点外，作为其对高于400g/L浓度的蔗糖的作用的结果，本发明的重组酶主要产生1-蔗果三糖。
真菌的酶也合成该三糖，但是几乎从反应开始起就极大程度地将其用作用于产生1-真菌四糖和果糖基真菌四糖的底物，这危害了1-蔗果三糖的最终产量。
另一方面，目前在国际市场上不存在用于大量生产FOS的FTF的供应商。用本发明的方法，创建了一种新的低成本的工艺程序，其用于工业生产高产1-蔗果三糖的重组的植物FTF，这有助于该类型的酶的商业可得性。令人惊讶地，重组的苇状羊茅FTF的使用具有额外的优点，即相对于其他FOS生产技术而言，降低了用于获得FOS和1-蔗果三糖的方法的价格。
因此，本发明提供了用于以工业规模获得1-SST的方法，其特征在于，在发酵罐中培养非解糖酵母，所述非解糖酵母包含多个拷贝的整合到其基因组中的分离自苇状羊茅的编码1-SST的基因。所述酵母组成性地表达所提及的酶。在本发明的一个实施方案中，所述组成性地表达1-SST的非解糖酵母为巴斯德毕赤酵母菌株。为了本发明的目的，所述1-SST从巴斯德毕赤酵母培养物的上清液和/或其细胞沉淀物中获得。
为了本发明，1-SST的生产的工业规模是这样的规模，所述规模牵涉在发酵罐中培养1-SST的生产性菌株，其全部或部分的1-SST体积超过10000U的酶。
与在专门的文献中找到的报道相反，在本发明的一个实施方案中，首次将所提及的植物FTF的使用与MBR的使用相组合，这优化了用于获得高产量的FOS和1-蔗果三糖的方法。用该组合所获得的结果经证明是令人惊讶的，高于从数学建模开始在理论上计算出的产量值。此外，该方法消除了批次之间的不一致性以及在当使用其他类型的反应器时遇到的产物的可变性，因为允许再利用可溶形式的FTF，并以此达到从技术和经济的观点来看可行的酶-底物比例，其是在搅拌罐中所使用的10倍。这两个优点表现为反应时间减少至3小时，从而相对于搅拌罐而言将日生产率提高到至少5倍，因而降低了生产成本。另一方面，减少了操作处理和用于生产的物理空间。
本发明的另一个方面为用于人或动物膳食的产品，其包含通过使用本发明的方法而获得的1-蔗果三糖，其特征在于，在生物反应器中通过使用在非解糖酵母宿主中组成性地表达的分离自苇状羊茅的重组FTF来进行蔗糖向1-蔗果三糖的转化。在一个特别的实施方案中，所述用于人或动物膳食的产品的特征在于，此外将该产品与益生菌制备物一起进行配制，从而形成共生体以便其用作营养品。
附图简述
图1.经由分别将编码羊茅(1-sstf)、洋葱(1-sstc)和龙舌兰(1-ssta)的1-SST的基因插入到表达载体pGAPZαA、B、C中而得到的表达盒的图示。所得的质粒分别被命名为p1-SSTF(羊茅的1-SST)、p1-SSTC(洋葱的1-SST)和p1-SSTA(龙舌兰的1-SST)。pGAP：GAP启动子；SP：酿酒酵母的α因子的信号肽；His6：多组氨酸尾标；TT：基因AOX1的转录终止子。
图2.质粒p1SSTF6x+6个额外拷贝的表达盒的构建策略，该质粒用于在巴斯德毕赤酵母菌株GS115中组成性地表达数个拷贝的基因1-sstf。A.具有单一拷贝的该基因的构建体。B.具有六个拷贝的该基因的构建体，通过基因histidine 4的补充来进行选择。C.具有九个拷贝的该基因和潮霉素抗性的构建体。pGAP：GAP启动子；5’AΟΧ1：醇氧化酶的启动子；SP：酿酒酵母的α因子的信号肽；His6：多组氨酸尾标；TT：基因AOX1的转录终止子；His4：基因his4的开放阅读框。
图3.在搅拌罐型反应器中由酶1-SSTrec催化的FOS的合成反应的时间进程。反应条件：9000U/L的1-SSTrec，600g/L的蔗糖，在0.1M的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中；温度为40℃，搅拌速度为250转/分钟(rpm)，反应时间为6小时。图例：蔗果三糖(GF2)；真菌四糖(GF3)；总FOS(FOS＝GF2+GF3)；蔗糖(GF)；葡萄糖(G)；果糖(F)。
图4.经由通过高分辨率液相色谱法(HPLC)对在各种不同的反应时间(tr)处获取的样品进行分析而得到的产物谱的色谱图。A.真菌四糖(GF3)、蔗果三糖(GF2)、蔗糖(GF)、葡萄糖(G)、果糖(F)的保留时间的标准。B.在时间tr＝0处，通过1-SSTrec的FOS的合成反应。C.tr＝180分钟。D.tr＝360分钟。
图5.在MBR中生产FOS的系统的示意图。
图6.在3个相继的循环期间在以半连续方式进行操作的MBR中由1-SSTrec催化的1-蔗果三糖的合成的时间过程。反应条件：9000U/L的1-SSTrec，600g/L的蔗糖，在0.1M的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中；温度为40℃，搅拌速度为250rpm。操作顺序：第1个循环：3小时的连续合成反应，和30分钟的排放；第2和3个循环：2小时30分钟的合成，和30分钟的排放。
图7.经由通过HPLC对在以半连续方式进行操作的MBR中FOS的合成循环中的每一个完成时获取的样品进行分析而得到的产物谱的色谱图。A.第1个循环；B.第2个循环；和C.第3个循环。图例：真菌四糖(GF3)、蔗果三糖(GF2)、蔗糖(GF)、葡萄糖(G)、果糖(F)。
实施方案的详细描述/实施例
实施例1.在巴斯德毕赤酵母中产生的3种来自植物的蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的果糖基转移酶(FTF)活性水平的比较研究
为了比较在巴斯德毕赤酵母中三种植物1-SST的FTF活性水平，通过使用反转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)和在文献中所描述的引物(Vijn等人,1998,The PlantJournal,11(3):387-398；Luscher等人,2000,Plant Physiology,124(3):1217-1227；Avila-Fernandez等人,2007,Plant Science,173:478-486)，从其天然宿主中分离出了编码羊茅(苇状羊茅)、洋葱(洋葱)和龙舌兰(特基拉龙舌兰)的所述酶的互补DNA。将相应于编码成熟酶的DNA的从这些PCR中得到的产物(大小：羊茅的1-SST：1668bp；洋葱的1-SST：1668bp；和龙舌兰的1-SST：2026bp)在其5’末端按照合适的阅读框与酿酒酵母的α因子的信号肽相融合，和在3’末端与存在于商业载体pGAPZαC(Invitrogen,Leek,Holanda)中的编码表位myc和随后的具有六个组氨酸残基的尾标的序列相融合。该商业载体允许借助于对于抗生素zeocin的抗性来选择转化体。在命名为p1-SSTF(羊茅的1-SST)、p1-SSTC(洋葱的1-SST)和p1-SSTA(龙舌兰的1-SST)的三个所获得的构建体中，编码所述三种1-SST的嵌合基因处于GAP启动子和醇氧化酶1的转录终止子(AOX1TT)的转录控制之下，如图1所显示的那样。用限制酶AvrII在GAP启动子的序列中的唯一位点处消化所述三个构建体，并且通过电穿孔将其引入到酵母宿主菌株X-33的基因组中。由此，对于每一种构建体获得大约20个转化体，在补充有2％甘油和100μg/mL zeocin的YP培养基上。为了该比较研究，使所述三个变体中的每一个变体的3个对zeocin具有抗性的克隆在有效体积为5升的发酵罐中生长，直至达到细胞生长的稳定期。每个发酵罐用200mL的在摇床中生长的每个克隆的预先接种物进行接种。
在发酵的第一个步骤中，为了将溶解氧的浓度保持在超过20％的值，自动地提高搅拌(500和900rpm之间)，并且将通气保持在1vvm(空气体积/培养基体积/分钟)。一旦溶解氧的值增加(表明用作碳源的甘油被耗尽)，就转入第二个进料步骤。为了开始第二个步骤，增加空气流量直至2vvm，并且以由溶解氧的变化进行控制的5至7mL/L/h的流量，用1.5L的增补料(相同的初始碳源)向培养物进料。相对于在类似条件下生长的非重组天然菌株而言，在重组菌株的72小时的培养期间未观察到毒性效应。接着，通过离心来分开最终培养物，从而产生两个级分，沉淀物(细胞或生物质)和培养物上清液。从这两个级分中都取0.2mL的样品，并且与300g/L(0.87M)的蔗糖溶液反应30分钟。将作为对于蔗糖的转果糖基反应的结果而释放出的葡萄糖的浓度用作重组克隆的FTF活性水平的指示。具有葡萄糖标准曲线这一事实使得能够将该糖的浓度与“Glucose-Trinder”试剂盒(Sigma,US)的酶复合物“葡萄糖氧化酶/过氧化物酶/色原”的比色反应产物的颜色强度相关联，并且将活性水平分成高的(深红色，高于5.5mM的葡萄糖浓度)、中等的(浅玫瑰色，0.5-5.5mM的浓度)和不可检测的(透明的外观颜色和低于0.5mM的浓度)。在所检定的反应条件下，在用编码龙舌兰的1-SST的基因转化的克隆和用编码洋葱的1-SST的基因转化的克隆中在沉淀物和培养物上清液中均未观察到可检测的活性。仅分别在3和5小时的反应之后，对于所述两种情况实现在培养物上清液中获得浅玫瑰色，这相应于低-中等的酶活性。相反地，在这些反应条件下，在所述3个用编码羊茅的1-SST的基因1-sstf转化的重组克隆中观察到深红色，这表明高的FTF活性水平。
实施例2.在携带一个拷贝的基因1-sstf的、以高FTF活性进行组成性表达的所述三个克隆的发酵期间所分析的参数的平均值
通过使用在实施例1中所描述的相同的实验条件，在发酵罐水平上比较了具有一个拷贝的整合到其基因组中的基因1-sstf的所述三个克隆。
一个单位(U)的1-SSTrec表示这样的酶的量，其在与在0.1M的乙酸钠缓冲液(pH5.5)中的50％(1.46M)蔗糖溶液在30℃下反应30分钟时，每分钟释放出1μmol的葡萄糖。表1中所显示的数据表示在每个所评价的克隆的三次发酵中获得的参数值的平均值±标准偏差。
表1.在三个具有1-SSTrec活性的所评价的克隆的发酵期间分析的参数的比较
参数 值
生物质的产量(g/L培养物) 366±4
细胞内的1-SSTrec活性(U/g湿生物质) 4.3±0.2
细胞外的1-SSTrec活性(U/L培养物上清液) 3.7±0.1
培养时间(小时) 69
总1-SSTrec活性(U/L培养物) 3955±211
在生物质中的总1-SSTrec活性(U/L培养物) 1573.8±25.6
在生物质中的活性的生产率(U/L/h) 22.8
这三个克隆的生产率在组成性表达系统中是在当使用通过甲醇可诱导的表达系统时的2倍，因为在更少的时间(69小时)内达到了更大的细胞浓度(366g/L)。
实施例3.通过在巴斯德毕赤酵母的AOX1基因座中整合多个拷贝的基因1-sstf的表达盒来增加1-SSTrec活性
赢利的以工业规模生产FOS的技术的开发需要具有高的1-SSTrec活性水平，所以必需增加在酵母宿主中的基因剂量。为了获得数个拷贝的相继地且以相同的转录方向进行布置的表达盒，用限制酶BamHI和BglII消化质粒p1-SSTF，其具有单一拷贝的包含基因1-sstf的表达盒。在琼脂糖凝胶中分离出包含表达盒的2.82kb的条带，并且借助于T4连接酶进行重新连接。BamHI(G↓GATCC)和BglII(A↓GATCT)末端的联合产生序列为GGATCT的杂合位点，其不被这两种酶中的任一种所识别。在连接反应时，添加酶BamHI和BglII以促进不同末端的联合。分离出包含两个拷贝的表达盒的5.64kb的条带，并且用酶BamHI和BglII再次处理以保证表达盒以相同的转录方向进行联合。将该序列插入到用BamHI进行消化并用碱性磷酸酶进行去磷酸化的相同的质粒p1-SSTF中。
新的构建体(p1-SSTF3x)携带三个拷贝的表达盒。用酶BamHI和BglII消化p1-SSTF3x，分离出所获得的8.46kb的条带并重新连接，如在前一个段落中所描述的那样。将16.92kb的序列插入到用酶BamHI进行消化并用碱性磷酸酶进行去磷酸化的载体pAO815中。该载体使得能够通过his4营养缺陷型的补充来选择巴斯德毕赤酵母菌株GS115的转化体。所得的质粒(p1SSTF6x)包含六个拷贝的相继地且以相同的转录方向进行布置的表达盒，其插入在AOX1启动子和AOX1基因座的终止子区的3’片段之间(图2)。用酶BglII消化该质粒以用于通过电穿孔来转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115。通过该消化，产生了两个片段，其中一个具有22.23kb，在中央携带所述六个表达盒和对his4营养缺陷型进行补充的基因；在5’末端存在AOX1启动子和在3’末端存在AOX1基因座的终止子区的3’片段。用该策略，促进了替代AOX1基因座的双同源重组。
在补充有2％葡萄糖的YNB基本培养基中选择用质粒p1-SSTF6x转化的菌株GS115的菌落。为了评价转化体利用蔗糖作为碳源的能力，在100-孔平板中在补充有5％蔗糖和0.025％溴百里酚蓝(pH指示剂)的YP固体培养基(pH 5.5)上独个地生长93个His4+菌落。使用具有一个拷贝的羊茅的基因1-sst(PF1x)的克隆GS115/p1-SSTF作为该实验的阳性对照。两个命名为PF6Xa和PF6Xb的克隆使培养基的颜色从最初的绿色(pH 5.5)转变为黄色(pH≤6.0)，这归因于1-SSTrec的转果糖基反应，由此通过消耗从蔗糖中释放出的葡萄糖而产生乳酸。培养基的该颜色变化在多拷贝菌株中比在携带单一拷贝的该基因的菌株中更快地出现。该事实表明了从多拷贝克隆方面来说具有更大的酶活性。
为了证实该结果，使多拷贝克隆PF6Xa和PF6Xb以及单拷贝克隆PF1x在28℃下在轨道式摇床上在10mL的补充有2％甘油的YP液体培养基中生长24小时。以与在实施例1中的相同的方式，通过“Glucose-Trinder”试剂盒(Sigma)的酶复合物“葡萄糖氧化酶/过氧化物酶/色原”的比色反应，在相应于两个多拷贝克隆以及携带单个拷贝的克隆的沉淀物(细胞或生物质)和培养物上清液的级分中测定由于重组酶的FTF活性而释放出的葡萄糖。
所述两个多拷贝克隆显示出比单拷贝克隆更高的酶活性(表2)，这证明通过增加整合到巴斯德毕赤酵母的基因组中的基因1-sstf的拷贝，在这两个重组菌株中增加了1-SSTrec活性。在培养物上清液中，克隆PF6Xb显示出比克隆PF6Xa高31.4％和比单拷贝克隆高64.2％的1-SSTrec活性。在生物质中观察到，克隆PF6Xb具有比克隆PF6Xa高18％和比单拷贝克隆高36％的酶活性。表2显示了在巴斯德毕赤酵母的多拷贝克隆中基因1-sstf的拷贝数对于酶活性的影响。作为对照，使用菌株GS115，和单拷贝克隆。在数据右边的不同的字母表明了通过使用统计学软件包StatGraph3的单分类方差分析而确定的显著差异。借助于Tukey HSD的平均值比较检验在内部比较了酶活性的平均值(n＝3)(p<0.01)。
表2.在单拷贝克隆和多拷贝克隆中1-SSTrec活性的比较
酶活性单位/在600nm的波长处测量的光密度(UEA/OD600)。不同的字母指明了在借助于Tukey HSD的平均值比较检验在内部比较的酶活性之间的显著差异(p<0.01)。
根据所获得的结果，选择多拷贝克隆PF6Xb(从现在起命名为PF6X)用于继续进行表达实验，因为其具有最高的1-SSTrec活性，无论在生物质中还是在培养物上清液中。
实施例4.通过再转化多拷贝克隆PF6X以将6个额外拷贝的表达盒插入到AOX1基因座中来增加1-SST酶活性
为了增加克隆PF6X的1-SST酶活性，构建了命名为pALS223的新质粒。为了获得该新的构建体，将用于构建质粒p1-SSTF6x的、包含六个拷贝的相继地且以相同的转录方向进行布置的表达盒的、16.92kb的序列插入到用BamHI进行消化并用碱性磷酸酶进行去磷酸化的载体pPICHαC AOX1-linker中。该载体允许通过巴斯德毕赤酵母的AOX1启动子来进行单同源重组和用抗生素潮霉素来选择转化体。在通过限制性分析和DNA测序检查该基因构建体后，开始用酶Hpa I消化该新质粒，以使其线性化并通过电穿孔来再转化克隆PF6X。该酶在该质粒的AOX1启动子的位点处进行切割，这促进其通过单同源重组在AOX1基因座处整合到酵母的基因组中。在补充有2％甘油和0.2g/L潮霉素的固体YP培养基上选择具有多于6个拷贝的插入在酵母宿主基因组中的表达盒的转化体。对于多于60个对抗生素潮霉素具有抗性的菌落(HigR)，连同菌株PF6x和PF1x一起，测定了在生物质和培养物上清液中的酶活性，如在前面的实施例中所描述的那样，其中采用“Glucose-Trinder”试剂盒的酶复合物“葡萄糖氧化酶/过氧化物酶/色原”的比色反应。所分析的对潮霉素具有抗性的克隆之一(命名为CIGB 308)是在细胞沉淀物中和在培养物上清液中均显示出最高的1-SSTrec酶活性的那一个。该新克隆在上清液中(1.87倍)和在生物质中(1.76倍)具有比克隆PF6X更高的酶活性。相对于单拷贝菌株而言，克隆CIGB 308的活性在上清液中为3.58倍，和在生物质中为2.41倍，这确认了通过增加稳定地整合到宿主中的基因1-sstf的拷贝数，增加了酵母宿主的1-SST酶活性。Southern印迹类型的分析揭示了，在克隆CIGB 308中稳定地整合了9个拷贝的表达盒。这些结果表明，在该再转化事件中，插入了另外仅3个拷贝的表达盒，而不是如所预期的那样另外6个拷贝。
实施例5.在发酵罐水平上，巴斯德毕赤酵母菌株CIGB 308具有比其前体PF1X和PF6X更高的1-SST酶活性并且经证明更具生产力
使克隆CIGB 308以及其前体即具有一个和六个拷贝的表达盒的菌株(PF1X和PF6X)均在28℃、pH 5.5、500-900rpm的搅拌、1-2vvm的通气和超过20％的受控溶解氧的条件下，在工作体积为5L的7.5L发酵罐中进行生长。不依赖于所插入的拷贝的数目，这三个菌株显示出了相似的生长模式。在培养的初始的19和20小时之间，消耗了培养基的所有甘油，而将溶解氧压力的下降调节至20％，通过将搅拌从500rpm逐渐提高至900rpm。在消耗完甘油时，观察到溶解氧的快速上升，并且开始用50％(v/v)甘油对培养基进行进料，直至该过程持续72小时。
在这些培养条件下，对于所比较的所述三个克隆而获得的生物质为358±8g/L湿重，因此可以推断，基因剂量以及重组酶的产生和积累不影响生长，并且经证明对于酵母宿主来说也不是毒性的。
在70-72小时的培养过后，克隆CIGB 308显示出最大的1-SST酶活性，无论是细胞外还是细胞内，分别达到29.7±0.2U/mL培养物和12.4±0.2U/mL培养物(34U/g湿重)的最大值。在所检测出的对于每mL的克隆CIGB 308的培养物而言总的42.1±0.2U/mL之中，70.6％的FTF活性位于培养物上清液中和29.4％位于细胞中。从该研究出发，选择克隆CIGB308用于从事1-SSTrec的大量生产。
直至本发明之时，在文献中还不存在有描述了在发酵罐水平上获得从巴斯德毕赤酵母的多拷贝克隆开始组成性地表达的植物1-SSTrec的报告。
实施例6.使用蔗糖作为碳源的巴斯德毕赤酵母菌株CIGB 308的增补式培养
如果使用比甘油更便宜的碳源例如蔗糖或葡萄糖，则巴斯德毕赤酵母菌株CIGB308的发酵成本将会降低。用作宿主的巴斯德毕赤酵母菌株GS115缺乏转化酶活性，因此不能利用蔗糖作为碳源。然而，由于酵母宿主所获得的新的FTF活性，因而作为从蔗糖开始的转果糖基反应的产物产生了葡萄糖，其被直接代谢以用于该微生物的生长。所述重组菌株的该优点使得能够降低生产过程的发酵成本。
蔗糖的发酵通过在容量为75L和工作体积为50L的发酵罐中的增补式不连续培养来进行。经调整的参数为下列：温度：28℃；pH：5.5；搅拌：600rpm；通气：1.0vvm；操作压力：0.2atm。所使用的碳源为50g/L的蔗糖，其包含在精制糖、粗糖或蜂蜜中。当开始耗尽碳源时(通过pH的升高或氧压力的增加而检测的)，大约在发酵起始了20小时之时，开始以8mL/L/h的“增补料流量/初始培养物体积”来添加增补料溶液(与最初使用的相同的碳源的溶液，但以500g/L)。在该时刻，重新调整相应于下列值的发酵参数：搅拌：800rpm；和通气：1.5vvm；氧压力：0.4atm。发酵进行72小时。用该培养条件，获得了与用在具有甘油的培养基中生长的该克隆所达到的那些类似的生物质生产产量，而总的酶活性(在72小时的培养中)对于包含蔗糖的培养基来说是非常出众的，不依赖于包含有蔗糖的原料。将使用各种不同碳源的巴斯德毕赤酵母菌株CIGB 308的生长的结果概括在表3中。
表3.使用甘油或蔗糖作为碳源，在发酵罐水平上在巴斯德毕赤酵母菌株CIGB 308生长后获得的结果的概要
括号之间的值表示在培养72小时之时巴斯德毕赤酵母菌株CIGB 308的细胞内和细胞外酶活性的百分比。一个酶单位(U)表示这样的1-SSTrec的量，其在30℃下在处于0.1M的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中的1.75M蔗糖溶液之中以初始反应速度每分钟释放出1μmol的葡萄糖。所述数据呈现了用每一种碳源进行的发酵的平均值±标准偏差。
根据这些结果，得出结论：蔗糖和蜂蜜均经证明是适合于从事该重组FTF的工业生产的底物。
实施例7.酶1-SSTrec的连续培养生产
在文献中不存在有描述了在巴斯德毕赤酵母中以高水平表达的重组FTF的连续生产的报道。该FTF的连续生产在总体积为7.5L和工作体积为5L的INFORS HT发酵罐中进行。确定下述参数，并且在整个培养期间通过软件Iris V 5.0进行记录。温度保持在28℃,而5.5的pH值通过自动添加NH3OH(28％(v/v))和H3PO4(40％(v/v))来控制。在整个培养期间，保持溶解氧高于20％,通过自动改变搅拌(500和900rpm之间)、空气流量(1-2vvm)和压力(0-0.7atm)。
发酵的初始体积为3L培养基，其包含22g/L NH4SO4；18.2g/L K2HPO4；7.5g/LMgSO4·7H2O；0.5g/L CaCl2·2H2O；5g/L酵母提取物，痕量盐，和维生素，以足够的量，加上50g/L蔗糖。对于不连续增补步骤，使用1.5L的500g/L蔗糖溶液。在连续培养步骤中，使用包含200g/L蔗糖；2.5g/L酵母提取物；11g/L NH4SO4；9.1g/L K2HPO4；3.75g/L MgSO4·7H2O；0.25g/L CaCl2·2H2O；痕量盐；和维生素的培养基。
用200mL的在摇床中生长的接种物对发酵罐进行接种。一旦碳源被耗尽，就转入不连续增补步骤，其中以在7-30mL/L/h之间变化的流量向培养物进料。当增补料被耗尽时，开始连续培养，其中以1个稀释(D)/天的速度对发酵罐进行进料。一旦达到稳定状态，就维持培养运行45天，其中具有70±5U/mL的平均活性产量和352±11g/L湿重的细胞浓度。
实施例8.用于合成1-蔗果三糖的酶1-SSTrec的最佳反应参数的确定
依照制造商的说明书，使用在具有Hydrosart膜(0.2μm)的Sartocon Slice 200(Sartorius)中的过滤器，使在发酵罐的上清液中获得的酶制备物经历过滤过程。然后，通过使用具有Hydrosart超滤膜(10kDa)的相同设备逆0.1M的乙酸钠缓冲液进行渗滤来将滤液浓缩10倍，从而获得1000U/mL的最终制备物。可选地，使其经历冻干过程，从而获得具有大于8500U/g的活性的固体酶制备物。
a)对于1-SST活性来说最佳的pH的确定：
在4至8的pH范围内检查了酶1-SSTrec的活性。在0.5mL的最终体积中，在浓度为0.87M的蔗糖和10U的酶的溶液中，在30℃下，反应进行1小时。对于pH 4.0-5.5的范围，使用0.1M的乙酸钠缓冲液，和对于6.0-8.0的pH，使用0.1M的磷酸盐缓冲液。1-SSTrec酶活性的最大值出现在5.5至6.0的pH。
b)对于FOS的合成来说最佳的温度和底物浓度：
为了确定这些参数，在10mL的最终反应体积中和在250rpm的搅拌下，分别在30、40和50℃下，使60U的1-SSTrec在0.1M的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中与200至600g/L的底物浓度反应。在1小时的反应之后，通过HPLC来测定存在于反应混合物中的糖的组成。对于该色谱法，在Aminex HPX 42-C柱(BioRad,Richmond)中施加20μL的样品，其中工作流量为0.6mL/分钟、压力为大约52巴和工作温度为81.7℃。所使用的流动相为水。使用折光率检测仪Knauer Differential-Refractometer。借助于信息学软件包BioCrom(3.0版,CIGB,1996-1997)来对糖进行定量。
表4显示了对于各种不同的条件而测定的糖的百分比组成和定量，1-蔗果三糖的合成速度，以及转果糖基活性与水解活性之间的比率。
在40℃的温度和600g/L的蔗糖浓度下达到了1-蔗果三糖的最大合成速度，同时不存在水解活性。当使用固定化在藻酸钙上的具有周质1-SST活性的完整细胞和共价地固定化至Eupergit(Sigma)的酶作为酶制备物时，获得了类似的结果。
表4.在FOS的合成中温度和底物浓度的影响
在反应一小时后反应混合物的组成：(G)葡萄糖，(F)果糖，(GF)蔗糖，(GF2)1-蔗果三糖，(GF3)真菌四糖。反应参数：(r(GF2))：以“g/分钟”给出的1-蔗果三糖的合成速度；(RT/H)：通过将1-蔗果三糖与果糖的组成相除而给出的转果糖基活性与水解活性之间的比率。
c)游离的、固定化的和冻干的酶1-SSTrec的半寿期
评价了游离的和固定化在Eupergit上的酶以及固定化在藻酸钙上的巴斯德毕赤酵母CIGB 308细胞的热稳定性，其中将该酶或固定化的那种在0.1M的乙酸盐缓冲液(pH5.5)中在30、35和40℃下进行温育。分别在30℃下以24小时的间隔、在35℃下以1小时的间隔和在40℃下以20分钟的间隔，获取每一个反应的样品，以便通过标准的活性方法来检定残留的活性。然后，作为在那时每一种酶制备物丧失了50％的初始活性的时间来测定半寿期。表5的结果显示，包含从细胞中分离的1-SSTrec的酶制备物比固定化在藻酸钙上的具有1-SST活性的细胞稳定得多。
另一方面，出人意料地，在非反应性条件下，在30℃下，以溶液形式的1-SSTrec粗提取物的半寿期为1432小时。该时间是迄今为止对于植物的酶1-SST所报道的半寿期的100多倍。
表5.在非反应性条件下，各种不同的1-SSTrec酶制备物的半寿期
对于冻干的酶制备物进行热稳定性测定法。作为结果获得了，该固体制备物在30℃下具有超过3年的半寿期。
实施例9.使用搅拌罐型反应器，在不连续反应中由1-SSTrec催化蔗糖向FOS的转化
在具有250rpm的搅拌的1L反应器中，在40℃下，在0.1M的乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中，在600g/L的蔗糖浓度下检定由1-SSTrec催化的FOS合成的动力学，进行6小时，其中添加15U/g的“酶/底物重量”比率。以与实施例8相似的方式，通过HPLC来测定在每20分钟获取的样品中存在的糖的组成和定量。1-蔗果三糖的最大生产量为320.8g/L；在混合物中53.4％为总碳水化合物和90.4％为总FOS。在图3中显示了，1-蔗果三糖的该最大生产量在反应的2.7和3小时之间达到，当多于70％的初始蔗糖被消耗时。在该点，1-蔗果三糖的最大浓度与真菌四糖这种四糖出现的起始同时发生。
该事实对于酶1-SSTrec在大规模生产1-蔗果三糖中的使用来说是有利的，因为在蔗糖的转化反应中不合成真菌四糖，直至仅50％的初始蔗糖被消耗，如在图4中可看出的。相反地，真菌的FTF从反应起始开始就积累真菌四糖，伴随着第一批1-蔗果三糖分子的出现，并且还合成果糖基真菌四糖这种五糖。
在相似的反应条件下，通过使用游离的或固定化在藻酸钙上的具有周质1-SSTrec酶活性的细胞以及共价地固定化至Eupergit(Sigma)的酶，获得了蔗糖向1-蔗果三糖的转化过程的类似的值和行为。在表6中显示了通过各种不同的酶制备物获得的FOS的浓度。
表6.使用各种不同的1-SSTrec酶制备物，在反应3小时之时合成的FOS的浓度
使在3小时的合成之后获得的转果糖基反应的混合物经历巴氏灭菌过程，以此使所述酶失活。然后，使糖浆经历光洁过程，其以过滤开始，随后为脱矿质-脱色，以便以通过模拟床的移动来进行的色谱法分开结束，所述色谱法分开在洗脱期间导致富含FOS的流，其中具有大于90％的1-蔗果三糖。这证明了该工艺程序用于生产富含1-蔗果三糖(其为具有最高的益生效应的FOS)的糖浆的技术可行性，这使其成为是最具商业利益的。
该工艺程序的以工业规模的技术可行性通过在容量分别为30和100L的反应器中按比例扩大蔗糖向1-蔗果三糖的转化反应而得到确认。从在1L的模型反应器中进行的试验之中获得的信息开始，通过基于“相似原理”的方法来进行该操作的按比例扩大。以所述两个新的规模获得的1-蔗果三糖的浓度平均为322±7g/L，该结果未显示出与在模型反应器中所获得的浓度值的显著差异。这从而证明了在搅拌罐型反应器中由1-SSTrec催化的蔗糖向1-蔗果三糖的转化反应在高规模下的可再现性。
实施例10.在以半连续方式进行操作的膜反应器中从蔗糖开始的1-蔗果三糖的合成
按照在图5中所显示的，应用在实施例9中所描述的工艺程序，以便在有用体积为1L的搅拌罐型生物反应器中通过使用游离的1-SSTrec从蔗糖开始来合成1-蔗果三糖，所述生物反应器在其出口处与使得能够分开酶反应的产物的卷筒型超滤膜(Prep/scale TFF-130kDa,Millipore，具有0.09m2的标称过滤面积)相连接。所使用的参数为：初始酶浓度为9000U/L，初始蔗糖浓度为600g/L，在0.1M的乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中；温度为40℃，搅拌速度为250rpm，在向所述膜进料的生物反应器出口处的流量为40mL/分钟。在合成步骤期间，在膜出口处的截留物流和渗透物流返回至所述酶生物反应器。对于在渗透物流中每30分钟获取的样品，通过HPLC来测定蔗糖转化为1-蔗果三糖的程度，如在实施例8和9中所描述的那样。在3小时的反应之后，关闭渗透物向生物反应器再循环的阀，打开先前保持关闭的FOS收集罐的阀，并且调节截留物流的阀以达到30mL/分钟的渗透物流量。在30分钟后，排放出反应体积的90％，在那一时刻关闭向收集罐的渗透物的出口阀，打开返回至生物反应器的阀，并且调节截留物的阀，以便返回至生物反应器的渗透物流量为5mL/分钟。紧接着，向生物反应器添加或加载以900mL的在0.1M的乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中的600g/L蔗糖。还添加180U的1-SSTrec，以保持相同的反应时间和相等的1-蔗果三糖转化率，如此开始第二个合成循环。在2小时30分钟的反应之后，如在第一个循环中所进行的那样，开始进行反应产物的排放。在完成了第二个循环的反应体积的90％的排放后，以在第二个循环中所做的相同的方式重新向生物反应器进行加载。这些“反应-排放”的步骤顺次地进行重复，直至完成10个操作循环，在此之后开始进行清洁MBR的步骤。在图6中反映了在最初3个循环期间的行为，和在图7中显示了在它们中的每一个完成时的产物谱。
以顺次方式进行操作的MBR的使用保持了与具有相等容量的搅拌罐型生物反应器类似的生产率，但每单位数量的所产生的1-蔗果三糖消耗少8倍的酶。
对于以半连续方式进行操作的MBR的其他操作条件，获得了类似的1-蔗果三糖的浓度。在这些可以变化而不影响产物谱的条件之中包括“酶/底物”比率(2-40U/g蔗糖)，蔗糖浓度(400-800g/L)，温度(30-50℃)，pH(5.0-6.5)，只要保持排放时间在1-蔗果三糖的最大生产量的时间的10和20％之间。超过该范围的排放时间促进真菌四糖的合成和果糖的产生，而损害1-蔗果三糖的浓度。在本发明之前，在文献中不存在有描述了在MBR中获得1-蔗果三糖的报告。

Claims (11)

1.用于以工业规模获得重组蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的方法，其特征在于，在发酵罐中培养非解糖酵母，所述非解糖酵母包含6-9个拷贝的整合到其基因组中的分离自苇状羊茅的编码1-SST的基因，并且组成性地表达所述酶。
2.权利要求1的方法，其中所述非解糖酵母为巴斯德毕赤酵母菌株。
3.权利要求2的方法，其中所述1-SST从巴斯德毕赤酵母培养物的上清液和/或细胞沉淀物中获得。
4.权利要求1的方法，其中所述酵母的培养在以不连续、连续或增补的方式进行操作的发酵罐中进行。
5.权利要求4的方法，其中在所述酵母的培养中所使用的碳源为选自任何纯度的甘油、葡萄糖和蔗糖的化合物。
6.用于以工业规模获得1-蔗果三糖的方法，其特征在于，所述方法包括：
经由权利要求1的方法来获得蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)；和
在生物反应器中通过使用经由权利要求1的方法而获得的蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)来进行蔗糖向1-蔗果三糖的转化。
7.权利要求6的方法，其中所述非解糖酵母为巴斯德毕赤酵母菌株。
8.权利要求6的方法，其中在生物反应器中的蔗糖浓度高于400g/L。
9.权利要求6的方法，其中通过以其游离或固定化形式的1-SST来进行蔗糖向1-蔗果三糖的转化。
10.权利要求6的方法，其中在搅拌罐、固定床或膜类型的生物反应器中进行蔗糖向1-蔗果三糖的转化。
11.权利要求10的方法，其中所述膜生物反应器以连续或半连续的方式运作。
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