CN104780941B

CN104780941B - 光敏剂与壳聚糖的缀合物及其用途

Info

Publication number: CN104780941B
Application number: CN201380037602.8A
Authority: CN
Inventors: K·贝格; A·霍格赛特; M·马森; V·S·加瓦尔
Original assignee: PCI Biotech AS
Current assignee: PCI Biotech AS
Priority date: 2012-05-15
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2019-01-15
Anticipated expiration: 2033-05-14
Also published as: ZA201408406B; CN104780941A; MX362237B; AU2013279748A1; PL2849791T3; KR102269861B1; RU2675830C2; CA2873259C; WO2013189663A1; NZ630582A; MX2014013516A; ES2682762T3; KR20200085380A; IN2014DN09418A; DK2849791T3; HK1203850A1; PT2849791T; US9901636B2; RU2014150569A; HRP20181276T1

Abstract

本发明涉及一种新型壳聚糖基缀合物，例如纳米载体，其包含缀合于光敏化剂的生物相容性高分子壳聚糖的衍生物，以及其在光化学内化(PCI)和光动力疗法(PDT)中的用途。本发明也涉及本发明的该新型缀合物在疾病、特别是癌症的治疗和预防中的用途和用于疫苗接种目的的用途。

Description

光敏剂与壳聚糖的缀合物及其用途

本发明涉及一种新型壳聚糖基缀合物，例如纳米载体，其包含缀合于光敏化剂的生物相容性高分子壳聚糖的衍生物，以及其在光化学内化(PCI)和光动力疗法(PDT)中的用途。本发明也涉及本发明的该新型缀合物在疾病、特别是癌症的治疗和预防中和用于疫苗接种目的的用途。

纳米材料具有特殊的物理化学性质，其包括与相同组成的大块材料相比下的小尺寸和大表面积-质量比，以及高活性。这些独特性质能够改善和克服见于传统药物中的一些限制。纳米材料的应用为改变如溶解度、扩散率、血液循环半衰期、药物释放特性和免疫原性等性质提供了机会。在最近二十年中，已经开发了许多治疗和诊断用纳米颗粒基试剂以用于疾病的治疗。

纳米材料的使用可以提供更有效且更方便的施用途径、更低的毒性、更小的副作用、更高的生物利用率，和产品在系统中更长的生命周期。作为药物递送系统，纳米颗粒或纳米载体能够提供靶向递送和控释。此外，它们可以用于诊断目的。例如，它们可以实现已确立的传统方法无法检测的癌前细胞、病毒片段和疾病标记物的检测。

当前，天然和合成高分子和脂质体是文献中遇到的主要纳米颗粒平台(Peer等，2007,Natl.,2(12),p751-760)。其他受欢迎的平台包括树枝状高分子(dendrimers)、油纳米乳剂、中孔二氧化硅纳米颗粒和氧化铁纳米颗粒。

可以是纳米载体的本发明的新型缀合物包含生物相容性高分子壳聚糖(其衍生自甲壳素)的衍生物。甲壳素(聚(β-(1→4)-N-乙酰基-D-葡糖胺))是天然多糖，并且是昆虫和甲壳类动物的支撑材料。甲壳素是继纤维素之后地球上第二天然丰富的多糖。其通常来自如蟹和虾的细胞等来源。结构上，甲壳素类似于纤维素，但在高分子骨架的C2位上具有乙酰氨基，而不是羟基。

壳聚糖是甲壳素最重要的衍生物，通常通过碱法除去乙酰基而生产。虽然大多数天然高分子是天然中性或酸性的，但壳聚糖是高度碱性的多糖。C2位的氮原子为通过合成策略使高分子改性以将分子向某些所期望的性质(例如，较高的溶解度和改进的生物性质)定制提供了机会。

壳聚糖高分子由具有不同脱乙酰度(DD)的β-(1→4)连接的D-葡糖胺单元构成，其中保留的乙酰基以嵌段或无规的方式分布在线性高分子链中。壳聚糖由于酸性条件下氨基的正电荷而溶于如乙酸等稀酸。虽然DD可以变化非常大，但其几乎从来不是100％。甲壳素相对于壳聚糖关于DD的独特命名尚未得到限定，但壳聚糖的DD可以在40％至100％之间变化。分子量可以高达2000kDa，但低于50kDa的那些有时被认为是壳寡糖(oligochitosan)。

在过去几十年中，对于甲壳素和壳聚糖就其在药物中的潜在应用方面已经进行了关注。已经设计并合成了各种壳聚糖衍生物，以增强其溶解性和进一步提高其物理、化学和生物性质。

除壳聚糖衍生物外，本发明的缀合物也包含光敏化剂，其缀合于壳聚糖。该缀合物由此在涉及光敏化(photosensitisation)的方法中具有特别用途。

光敏化是传递所吸收光的能量的过程。吸收之后，能量被传递至(选定的)反应物。光敏剂是能够将光能转化成II型化学反应的化合物。这些过程中的高反应性最终产物产生细胞和血管毒性。

光敏剂可以通过许多机制直接或间接地发挥其作用。因此，例如，某些光敏剂在通过光活化时直接变为有毒，而另一些光敏剂起到产生毒性物种的作用，所述毒性物种例如为氧化剂，如单线态氧或其他氧衍生的自由基，它们对于如脂质、蛋白和核酸等细胞物质和生物分子破坏性极强。

存在许多已知光敏化剂，包括卟啉、酞菁、红紫素、二氢卟吩、苯并卟啉、亲溶酶体(lysomotropic)弱碱、萘酞菁、阳离子染料和四环素或它们的衍生物(Berg等,(1997),J.Photochemistry and Photobiology,65,403-409)。其他光敏化剂包括特沙弗林、脱镁叶绿酸(pheophorbides)、类卟吩(porphycenes)、菌绿素(bacteriochlorins)、酮绿素类(ketochlorins)、血卟啉(hematoporphyrin)衍生物和5-氨基乙酰丙酸诱导的内源性光敏剂。如以下讨论的，在本发明的壳聚糖基分子中，采用的是卟啉和二氢卟吩，特别是四苯基卟啉(TPP)和四苯基二氢卟吩(TPC)。

卟啉是最广泛研究的光敏化剂。其分子结构包括通过次甲基桥连接在一起的四个吡咯环。它们是经常能够形成金属络合物的天然化合物。例如，在氧转运蛋白血红素中，铁原子被引入血红素B的卟啉核中。

二氢卟吩是杂环芳香环，其核心处由通过四个次甲基键偶联的三个吡咯和一个吡咯啉构成。因此，不像卟啉，二氢卟吩在很大程度上是芳香性的，但不是在整个环呈现出芳香性。

光敏化剂被用于光动力疗法(PDT)和光化学内化(PCI)方法。PDT是一种两步法，涉及光敏剂的全身或局部施用，及随后适当波长的光照。对于将发生的细胞毒性作用，必须也存在分子氧。当成功地将这三种因素(即，光敏剂、光和氧)结合时，发生光动力反应。光动力反应引起细胞毒性物种生成，其引起细胞死亡和组织损伤。

PDT被用于例如癌症的治疗。光动力反应的自由基中间体被生物组织中的氧清除，产生反应性氧物种(ROS)，如单线态氧(¹O₂)。¹O₂是具有高细胞毒性潜力的氧的短暂形式。因此，能够实现很大程度避免全身性副作用的高选择性细胞毒性治疗。

PCI基于与PDT相同的原理，但产生更少的ROS(例如，通过使用较低的光剂量)以诱导被困药物和大分子从核内体向胞液释放，而不因ROS导致显著的细胞死亡。在PCI中，光激发引起溶酶体和/或内体膜的选择性ROS介导损伤，和被困亲水性药物和大分子的释放。由此胞吞的分子能够得到释放，从而在溶酶体中降解之前到达其作用靶。

PCI已据显示可增强不容易穿透质膜的许多种大分子和其他分子的生物活性，这些分子包括I型核糖体失活蛋白、免疫毒素、化疗剂(如博莱霉素和多柔比星(Doxorubicin))、基因编码质粒和寡核苷酸。已经发现，与相应PDT相比，PCI可诱导更深组织层中的细胞毒性。由于靶向疗法与由优先积聚在实体瘤中的光敏剂诱导的光活化胞液递送相结合，因此PCI能够具有高度特异性，这也对增强的抗肿瘤疗效有助益。

临床应用中与PDT相关的常见问题之一是皮肤光敏性和不利的光敏剂生物分布。纳米载体，如树枝状高分子、脂质体和聚合胶束，已作为减少副作用和提高药代动力学的途径而被引入PDT中。

对于用于PCI和PDT方法中的改进的纳米载体和光敏剂仍存在需求。本发明满足了这一需求。本发明人已经开发了新型化合物，所述化合物基于光敏剂与壳聚糖的缀合物。该新型分子在PCI方法中具有令人意外的高疗效，其如以下实施例中所示，所述实施例证实了体外和体内的令人意外的高疗效。

因此，在第一方面中，本发明提供一种化合物，例如纳米载体，所述纳米载体包含光敏剂与壳聚糖的缀合物，其中所述化合物为式(I)化合物：

其中

n为大于或等于3的整数，

R在所述化合物中出现n次，并且

在总的Rn基团的0.1％～99.9％中，R各自为选自以下的基团A：

H，

其中a为1、2、3、4或5；并且X为Br、Cl或OH；

其中R₁各自可以相同或不同，选自H、CH₃和-(CH₂)_c-CH₃；b为1、2、3、4或5；并且c为0、1、2、3、4或5(其中反离子可以为例如Cl^-)；

其中Y为O；S；SO₂；–NCH₃；或-N(CH₂)_eCH₃；d＝1、2、3、4或5；并且e＝1、2、3、4或5；

其中R₂为-(CH₂)_h-CH₃或-CO-(CH₂)_h-CH₃；f为1、2、3、4或5；g为1、2、3、4或5；并且h为0、1、2、3、4或5；

其中R₃为-(CH₂)_j-CH₃，i为1～200的整数，优选为1～50或1～10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，或者至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200；j为0、1、2、3、4或5；并且k为1、2、3、4或5；

其中R₃为-(CH₂)_j-CH₃，i为如上所限定的整数；并且j为0、1、2、3、4或5；

其中R₃为-(CH₂)_j-CH₃，i为如上所限定的整数；j为0、1、2、3、4或5；并且R₁各自可以相同或不同，选自H、CH₃和-(CH₂)_c-CH₃；并且c为0、1、2、3、4或5；

其中R₃＝-(CH₂)_j-CH₃，i为如上所限定的整数；并且j为0、1、2、3、4或5；

其中R₃＝-(CH₂)_j-CH₃，i为如上所限定的整数；L为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且j为0、1、2、3、4或5；

和

其中m为1、2、3、4或5；

其中R基团各自可以相同或不同；并且

在总的Rn基团的0.1％～99.9％中，R各自为选自以下的基团B：

和

其中

p为0、1、2、3、4或5；q为1、2、3、4或5；并且r为1、2、3、4或5；R₄为选自以下的基团：

和

(优选的是，R₄选自：

和

W为选自O、S、NH或N(CH₃)的基团；

R₅为选自以下的基团：-(CH₂)_s-CO-；-(CH₂)_s-Z-(CH₂)_t-CO-和-(CH₂)_s-Z-(CH₂)_t-Z-CO-；其中s为0、1、2、3、4或5；t为0、1、2、3、4或5；

Z为NH、O、S或SO₂；

R₆为选自-CN和CH₃的基团；

R₇为选自以下的基团：

和

V为选自CO、SO₂、PO、PO₂H或CH₂的基团；

(优选的是，R₇选自：

和

R₈为下述基团(在邻、间或对位取代)，所述基团可以相同或不同，选自H、-OH、-OCH₃、-CH₃、-COCH₃、C(CH₃)₄、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂和-NCOCH₃(其中优选的是R₈各自为H或者至少一个R₈不为H)；

其中R基团各自可以相同或不同。

壳聚糖高分子具有至少3个单元(n＝3)。但是，优选的是n为至少10、20、50、100、500、1000，例如10～100或10～50。

如上所述，该缀合物中采用的光敏剂为卟啉和二氢卟吩衍生物，特别是TPP_a、TPC_a1、TPC_a2、TPP_c、TPC_c1和TPC_c2。优选的是，所述光敏剂衍生物R₄或R₇为TPC_a1、TPC_a2、TPC_c1或TPC_c，特别优选为TPC_a1或TPC_a2。

所述缀合物的壳聚糖衍生物能够具有不同的为以上R基团所取代的取代程度(DS)。例如，存在时，一个或多个上述R基团可以包含少于1％、优选0.1％～1.0％或大于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的壳聚糖取代。如上所述，基团A型和基团B型R基团各自提供总的Rn基团中的0.1％～99.9％(优选为0.5％～99.5％)。优选的是，基团A提供总的Rn基团中的至少50％、优选至少60％、70％、80％、90％或95％。特别优选的是，基团A提供总的Rn基团中的50％～95％，例如70％～95％。优选的是，基团B提供总的Rn基团中的小于50％，例如小于40％、30％、20％、10％或5％。特别优选的是，基团B提供总的Rn基团中的5％～30％，例如10％～25％。

基团A型R基团(或基团B型R基团)可以相同或不同。在例如基团A型R基团中存在不同基团的优选方面中，基团各自的比例可以不同。例如，一个R基团可以以例如75％～95％(的总Rn基团)的范围作为主要组分存在，而其他R基团可以以例如0.1％～10％(的总Rn基团)作为微量组分存在。但是，在替代方案中，所述主要组分可以以较低水平(例如，50％～90％)存在，并且所述微量组分可以以较高水平(例如，0.1％～50％)存在。优选的是，当存在的A型R基团反映出壳聚糖分子的乙酰化时，即R为时，其以<1％的总Rn基团存在。该R基团倾向于反映用于生成本发明的化合物的初始壳聚糖分子的乙酰化程度(DA)，因而其占有率可以不同。优选的是，其提供<60％的总Rn基团，优选小于30％或20％，例如0.1％～30％的总Rn基团。

如将理解的，由所有基团A型和B型R基团提供的总百分比为100％，并且在上述范围中进行相应的选择。

应该注意的是，取决于使用的合成方法，一些杂质或替代产物可能以较低水平存在，例如，痕量其他R基团或残余保护基团(例如TBDMS)可能残留于最终产物中。但是，这种痕量组分或化合物如果存在，其会以<1％总量(优选<0.1％)存在并且不影响官能度。包含这些痕量组分或化合物的化合物或组合物落在本发明的范围之内。

在本文所描述的优选实施方式中，提供了所选择的作为总Rn基团的一定比例的R基团的百分比。在此情形中，优选是一定的百分比范围(例如，以反映制造中的变化)。优选的是，该范围为5％，即，当提及90％的具有某种结构的A型R基团时，其扩展至具有85％～95％A型R基团的化合物，以此类推。

优选的A型R基团为：

其中，优选的是R₁各自为CH₃并且b为1；

其中优选的是Y为–NCH₃并且d为1；

其中优选的是j为0或1；i为3或6并且k为1；

其中优选的是j为1并且i为2；

其中优选的是j为0或1并且i为2、4或5(例如2或4)并且L为1；

和

其中优选的是m为1。

优选的是，以上R基团作为主要组分(即，大于75％的总Rn基团(如上所述))或微量组分(即，小于10％的总Rn基团(如上所述))。优选的是，基团仅作为微量基团存在。

优选的B型R基团为：

其中优选的是p为1；

其中优选的是p为1并且q为1；

其中优选的是p为1；

和

其中优选的是p为1。

特别优选的A型R基团为：

其中，优选的是R₁各自为CH₃并且b为1；

其中优选的是Y为–NCH₃并且d为1；

其中优选的是j为1并且i为2；和

其中优选的是j为0或1并且i为2、4或5(例如2或4)并且L为1。

特别优选的B型R基团为：

其中优选的是p为1；

其中优选的是p为1并且q为1；和

其中优选的是p为1。

优选的R基团及其在总Rn基团中的相关占有率(prevalence)提供在下表中，其中不同的可能的R基团被显示为与壳聚糖缀合。各种R基团的所占比例在括号中指出，其可在所指出的值的任一侧的5％以内变动。基团B型R基团具有附着的光敏剂基团R₄或R₇。

特别优选的本发明的化合物也显示在图1中，其中指出了R基团的占有率，但其可在指出值的任一侧的至多5％内变动。在每一情形中，具有附着的光敏剂的R基团具有较低的所指出的占有率。

在实施例中，本发明的化合物可以如本文中所述制备。合成方法采用本领域中的标准程序，其将为本领域技术人员所熟知，并将在以下实施例中描述。

用于提供相关R基团的聚乙二醇化(PEGylation)和四乙二醇化(TEGylation)可以根据本领域中的标准方法进行。本发明也延伸至本发明的化合物的制备方法，例如，如实施例和本文所述的方案中所述。

本发明的化合物具有低毒性，因此适合许多医学适应症。

本发明的化合物特别适合用于PCI方法。如本实施例中所列举，已经显示，本发明的化合物在将分子内化至细胞中方面具有令人惊讶的良好疗效。在实施例3中，显示了本发明的化合物的疗效显著优于单独使用敏化剂实现的疗效(在此情形中，使用的是光敏剂TPCS_2a，其为用于PCI而专门设计，并且正在针对癌症治疗进行临床开发(Berg等，2011,Photochem.Photobiol.Sci.,10,p1637-1651))。当与TPCS_2a相比时，本发明的化合物活性高达其至少10倍，即，即使以低10倍的浓度使用，该缀合物仍能提供显著大于用TPCS_2a所观察到的转染增强(参见图19和20)。

光化学内化(PCI)的基本方法描述于WO 96/07432和WO 00/54802中，通过援引将其并入本文中。总之，使拟内化的分子和光敏化剂(在此情形中作为本发明的化合物的一部分的光敏剂)与细胞进行接触。光敏化剂和拟内化的分子被带至细胞中细胞膜结合的亚区室中。一旦细胞暴露于适当波长的光，则光敏化剂被活化，其直接或间接生成反应性物种，后者破坏细胞内区室膜。这使内化的分子释放至细胞液中。

这些方法以下述方式利用光化学效应作为将否则不可透过(或很难透过)膜的分子引入细胞的胞液中的机制：如果该方法被适当调整以避免产生过多毒性物种(例如通过降低光照次数或光敏剂剂量)，则所述方式不会导致普遍的细胞破坏或细胞死亡。

因此，本发明也提供一种将分子引入细胞的细胞液中的方法，其包括：将所述细胞与拟引入的分子和本发明的化合物接触，并使用波长可使该化合物的光敏化剂有效活化的光照射细胞。一旦被活化，则含有所述化合物的所述细胞内的细胞内区室将这些区室中所包含的分子释放至细胞液中。本发明的化合物用于使期望被内化的分子内化(internalise)的用途也构成本发明的一部分。

PCI能够实现大量不同种类分子向细胞中的转染。例如，所述分子可以选自：DNA或反义DNA；寡(脱氧)核苷酸；RNA，如mRNA、siRNA、双链(ds)RNA、单链(ss)RNA或反义RNA；PNA、糖类；蛋白；肽；不透膜药物(membrane impermeable drug)；其他不透膜分子，或者上述分子的共价或非共价结合的组合。优选的是，拟引入的分子在无PCI辅助下很大程度上不被内化(即，进入细胞液中)，例如，其内化受到限制而使得少于50％(例如少于30％或10％)的对其应用了所述分子的细胞在4小时的时间段内将一个以上分子内化至胞液中。

可以选择拟内化的分子以实现不同结果，例如，改变(例如降低或提高)靶基因的表达，或者对细胞的性质或活力产生影响。为影响基因表达，拟转移的分子可以是正义或反义寡核苷酸或多核苷酸，例如，例如在质粒或反义寡核苷酸或siRNA分子中的基因序列。这些方法可用于治疗或预防疾病和病症，如癌症，也可以用于基因治疗应用。

本发明的方法实现将分子内化至胞液中的转运。然而，可以理解，将与细胞接触的每一个分子吸收至胞液中是无法实现的。然而，可以实现相对于不使用PCI或本发明的化合物的背景水平显著和提高的内化。

优选的是，本发明的方法可以以充分的水平或者通过对细胞的作用实现分子的内化，在所述充分的水平其作用例如在这些细胞的表达产物方面是明显的。可以调节与细胞接触的分子的适当浓度以实现此目标，例如，在一些应用中，可能期望的是实现细胞毒性分子引入后靶基因(或引入的基因)表达的升高或降低或者细胞死亡。降低或细胞死亡可以为在与细胞培养例如24、48、72或96小时(例如，24～48小时)后至少10％，例如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的降低(例如，就由靶基因编码的一种以上蛋白的表达而言)或细胞死亡。表达的升高可以相对于现有水平评估，所述现有水平在使用非内源性分子时可以为零，并可以实现数值上与以上关于降低所述的那些水平相似的水平。类似地，可以调节(本发明的)化合物种类和/或浓度以及照射时间，以实现以上所述的降低。

表达产物的水平可以例如通过利用本领域中已知的标准技术(如蛋白印迹)确定细胞中蛋白的水平来测量。蛋白减少的水平取决于蛋白的半衰期，即预先存在的蛋白将根据其半衰期而去除。细胞死亡可以通过任何适当手段确定。

引入的遗传物质的作用也可以就例如存在于细胞中的mRNA的表达水平而言进行测量，例如，可以进行该方法以实现与细胞一同温育例如24、48、72或96小时(例如24小时～48小时)之后，相对于在不添加该遗传物质的情况下在同一时间点的靶或引入序列的mRNA水平而言，mRNA水平升高或降低为至少10％，例如升高或降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。这也可以利用本领域中已知的标准技术测量，如杂交或印迹技术和RT-PCR。

本文中使用的术语“细胞”包括所有真核细胞(包括昆虫细胞和真菌细胞)。代表性“细胞”因而包括所有种类的哺乳动物和非哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞和原生动物。但是，优选的是，所述细胞为哺乳动物细胞，例如来自猫、狗、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、小鼠、大鼠、兔、豚鼠的细胞，但最优选的是来自人的细胞。

本文中所使用的“接触”是指使细胞与含有拟引入的本发明的化合物和/或分子的光敏化剂在适于内化至细胞中的条件下彼此物理接触，所述条件例如优选是在适当的营养培养基中于37℃进行，例如25℃～39℃。

“照射”细胞以活化光敏化剂是指如下文中所述直接或间接地施加光。因此，细胞可以例如直接(例如，对体外的单一细胞)或间接地用光源来光照，所述间接例如是在体内，其时细胞在皮肤表面下方或者处于不是其全部均可直接被光照(即，无其他细胞遮蔽)的一层细胞的形态。

活化光敏化剂的光照射步骤根据本领域公知的技术和程序进行。光的波长和强度根据所使用的光敏化剂选择。适当的人工光源是本领域中公知的，例如，使用蓝色(450nm～475nm)或红色(620mn～750nm)波长的光。

所本发明的方法中细胞暴露于光的时间可以不同。分子内化至胞液中的效率随曝光的增加而增加，直至达到最大值，超出该最大值后细胞损伤及由此细胞死亡会增加。

照射步骤的优选时间长度取决于下述因素，例如靶、光敏剂(在本发明的化合物中的光敏剂)、积聚在靶细胞或组织中的光敏剂的量，和光敏剂的吸收光谱与光源的发射光谱之间的重叠。通常，照射步骤的时长为数秒至数分钟或者高达数小时的量级，例如，优选至多60分钟，例如0.25分钟或1分钟～30分钟，例如0.5分钟～3分钟或1分钟～5分钟或1分钟～10分钟，例如3分钟～7分钟，并优选约3分钟，例如2.5分钟～3.5分钟。较短的照射时间也可以采用，例如1秒～60秒，例如10秒～50秒、20秒～40秒或25秒～35秒。

适当的光剂量可以由本领域技术人员选择，并且将同样取决于所使用的光敏剂(在本发明的化合物中的光敏剂)和在靶细胞或组织中积聚的光敏剂的量。例如，利用光敏剂光卟啉(Photofrin)和原卟啉(protoporphyrin)前体5-氨基乙酰丙酸的癌症光动力治疗中通常所用的光剂量在小于200mW/cm²的通量范围为50J/cm²～150J/cm²，以防止体温过高。当使用在可见光谱的红光区中具有较高消光系数的光敏剂时，光剂量通常较低。对于PCI方法，可以采用较低的剂量，例如，在75mW/cm²～150mW/cm²的通量范围为5J/cm²～25J/cm²的光剂量。此外，对于具有较少的积聚光敏剂的非癌组织的治疗，所需光的总量可能显著高于癌症治疗。此外，如果要保持细胞活力，则需避免生成过高水平的毒性物种，并且可以因此而调节相关参数。

本发明的PCI方法可能通过光化学治疗(即，通过PDT在毒性物种生成过程中对光敏化剂的活化作用)而不可避免地导致一定细胞杀伤。取决于所希望的用途，该细胞死亡可能并不重要，并可能实际上对于一些应用是有利的(例如，癌症治疗)。

在一个实施方式中，本发明提供一种实现细胞死亡的方法，所述方法包括将所述细胞与本发明的化合物接触，并用波长可使该化合物的光敏化剂有效活化的光照射该细胞，以生成引起所述细胞死亡的反应性氧物种。当要实现细胞死亡(由PDT所致)时，适当选择照射步骤的时机、强度和波长，以最优地实现靶细胞的细胞死亡。

然而，在本发明的一些实施方式中，例如当期望的是在不存在细胞毒性的情况下抑制基因表达或者如果改为通过引入的分子来实现细胞死亡时，避免细胞死亡。例如，在一些用途中，例如在一些基因治疗方法中，在不存在一般细胞毒性或对细胞活力的影响的情况下实现对基因表达或表达的抑制是非常有利的。可以改变本发明的方法，从而通过选择相对于光敏化剂(在本发明的化合物中的光敏化剂)的浓度的光剂量，可以调节存活细胞的分数或比例。同样，这种技术在领域中是公知的。

在期望活细胞的应用中，基本所有细胞或者绝大多数(例如，至少50％，更优选至少60％、70％、80％或90％的细胞)未被杀伤。PCI治疗后的细胞活力可以通过本领域已知的标准技术(如MTS试验)测量。

不管光敏剂的活化所诱导的细胞死亡量如何，在一些应用中，重要的是调节光剂量，使得其中表现出PCI效应的个体细胞中有一些未被单独的光化学治疗杀伤(虽然它们之后可能会被引入细胞中的分子杀伤，如果这些分子具有细胞毒性效应的话)。

细胞毒性效应可以通过采用例如引入细胞毒性分子(例如，细胞毒性肽，如白树毒素或博莱霉素)或基因疗法而实现，其中，例如基因、反义寡核苷酸或siRNA分子等试剂通过本发明的方法被内化至肿瘤细胞中。

本发明的化合物和方法可以在体外或体内使用，例如，用于原位治疗或离体治疗，随后将经治疗的细胞出于各种目的施用于身体，所述目的包括例如基因治疗方法中特定基因产物表达的抑制或升高。

因此，本发明的另一方面提供一种组合物，所述组合物含有本发明的化合物或缀合物，和可选地单独包含拟内化的分子。当所述组合物为药物组合物时，其含有一种或多种药用可接受的稀释剂或赋形剂。

在本发明的另一方面中，提供用于治疗的所述化合物或组合物。

本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包含如本文中所述的本发明的化合物或组合物和拟内化的分子。优选的是，所述试剂盒(或产品)可同时、分开或依次用于医学治疗，优选用于治疗癌症，或如下面将进一步详细描述的用于疫苗接种的目的。

因此，另一方面提供如本文中所限定的化合物或组合物和可选的拟内化的分子，其用于治疗或预防受试者的疾病、病症或感染，优选的是，其中明显有异常或过度的细胞生长，或者其中明显有异常升高或受抑制的基因表达，特别优选其中所述疾病为癌症。也涵盖了通过施用本发明的化合物或组合物和可选的拟内化的分子来对受试者的疾病、病症或感染进行治疗或预防的方法(其对应于本文中所述的用途)。优选的是，所述治疗或预防使用本文中所述的方法实现。

该方法可以采用PCI法进行，或者当以细胞死亡为最终目标时，可以采用PCI或PDT法。

因此，PCI法可以如上所述进行，即，使受试者细胞与拟引入的分子和所述化合物或组合物接触，并用波长可有效地活化该化合物的光敏化剂的光照射该细胞。优选的是，拟引入的分子为细胞毒性分子，优选为博莱霉素。

PDT方法可以通过下述方式进行，即，使受试者细胞与所述化合物或组合物接触，并用波长可有效活化该化合物的光敏化剂的光照射该细胞，以生成导致所述细胞死亡的反应性氧物种。

换言之，本发明提供了本文中所述的化合物或组合物和可选的拟内化至细胞中的分子在制备用于治疗或预防疾病、病症或感染的药剂中的用途。还提供了所述化合物或组合物在制备用于所述治疗或预防的药剂的制备中的用途，其中所述治疗或预防如本文中所述。优选的是，所述疾病、病症或感染表现出异常或过度的细胞生长或者异常升高或受抑制的基因表达，和/或将受益于细胞生长降低或者一个或多个基因表达的抑制或升高。

如本文中所述，异常或过度所参照的是年龄和性别匹配的正常个人或同一个人身体的其他正常部分中被认为正常之处。异常生长因此可以指癌、良性肿瘤，过度的细胞生长可以指如光化性角化病、尖锐湿疣和痣等皮肤病症。所述方法可应用的癌症包括头颈部癌、胆管癌、脑癌、黑色素瘤、皮肤转移癌(从不同的癌症)、肺癌、间皮瘤、胰腺癌、胃癌、直肠癌、肛门癌、阴茎癌、外阴癌和食道癌。因此，所述药剂可以用于治疗癌症。当拟内化的分子被使用时，其可以是抗癌化学治疗剂。

例如当拟内化的分子为基因、反义寡核苷酸或siRNA分子时，异常升高或受抑制的基因表达可以通过改变所述受试者一个或多个靶基因的表达来治疗。优选的是，所述药剂用于基因治疗，即，用于治疗或预防以异常的基因表达为代表或者将受益于一个或多个基因的抑制的疾病、病症或感染。所述改变包括所述表达的下调。

当使用PCI方法时，化合物(或本发明的组合物)和拟内化的分子能够同时或依次与患者(或受试者)的细胞或组织接触，并用波长可有效活化所述化合物的光敏化剂的光照射所述细胞，并且所述照射在将所述化合物和分子被细胞摄取至容有所述光敏化剂的细胞内区室中之前、期间或之后进行，优选在将所述转移分子被细胞摄取至任何细胞内区室中之前进行。

也构想了其中将被处理的细胞施用于受试者的方法。因此，在一个替代方面中，本发明提供一种治疗或预防患者的疾病、病症或感染的方法，所述方法包括根据如前所述的方法将本发明的化合物和可选的拟内化的分子在体外、体内或离体引入一个或多个细胞中，并且根据需要(即，当转染在体外或离体进行时)将所述细胞施用于所述患者。因此，生成的细胞可用于如前所述的疗法或特定用途中。

本文中所称的受试者是动物，优选哺乳动物，例如牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、猫、狗，特别优选的是人。

本文中所限定的“治疗”是指相对于治疗前的症状，降低、缓解或消除正在治疗的疾病、病症或感染的一种或多种症状。“预防”是指延迟或避免疾病、病症或感染的症状的发作。

本发明的组合物也可以包含细胞，所述细胞含有已通过本发明的方法内化至所述细胞的胞液中的分子。本发明还延伸至用于治疗、特别是癌症或基因治疗中的这类组合物。

因此，本发明的另一方面提供一种细胞或细胞群，所述细胞含有已内化至所述细胞的细胞液中的分子，所述细胞可以通过本发明的方法获得。

本发明的另一方面提供所述细胞或细胞群用于制备组合物或药剂的用途，所述组合物或药剂用于如前所述的治疗、优选癌症或基因治疗中。

本发明还提供一种对患者的治疗或预防的方法，所述方法包括对所述患者施用本发明的细胞或组合物，即，包括将分子引入如前所述的细胞中和将由此制备的所述细胞施用于所述患者的步骤的方法。优选的是，将所述方法用于治疗癌症或基因治疗(或用于下文所述的疫苗接种)。

在体内，可以采用本领域中常见或标准的任何施用方式，例如，注射、输注、局部施用、经皮施用(对内部和外部身体表面均可)等。对于体内应用，本发明可以对任何含有下述细胞的组织应用，所述细胞可被含有光敏化剂的化合物或拟内化的分子对其定位，所述组织包括体液所在之处，以及实体组织。所有组织均可被治疗，只要光敏剂被靶细胞吸收并且光能够被适当传递即可。

因此，本发明的组合物可以根据药物领域中已知的技术和程序以便捷的方式配制，例如，使用一种或多种药用可接受的稀释剂、载剂或赋形剂来配制。本文中所述的“药用可接受的”是指与组合物的其他成分相容并且接受者在生理上可接受的成分。组合物和载体或赋形剂材料的性质、剂量等可以根据选择和所期望的施用途径、治疗目的等以常规方式选择。剂量可以同样以常规方式确定，并且可以取决于分子性质、治疗目的、患者年龄、施用方式等。在光敏化剂方面，也应考虑照射时破坏膜的效力/能力。

本发明的化合物和组合物的另一用途在于疫苗接种规程方面，因为PCI方法可以用于将抗原提呈或表达在细胞表面上。因此，在拟通过PCI内化至细胞胞液中的分子转运和释放之后，可以将其转运至下述表面，在所述表面处其可被提呈在细胞外侧上，即在细胞表面上。该方法在疫苗接种领域具有特别的用途，其中疫苗组分(即抗原或免疫原)可以被引入细胞中以提呈在表面上，从而诱导、促进或增强免疫应答。

本发明因而提供一种在细胞、优选抗原提呈细胞的表面上表达抗原分子(例如，抗原)或其部分的方法，所述方法包括利用本文中所述的化合物和方法通过PCI将分子引入细胞胞液中，其中所述分子或其部分随后被提呈在所述细胞的表面上。

换言之，本发明提供一种将抗原分子或其部分表达在细胞表面上的方法，所述方法包括使所述细胞与所述抗原分子和如本文中所限定的化合物接触，并用波长可有效活化该化合物的光敏化剂的光照射该细胞，其中所述抗原分子被释放至细胞的胞液中，并且具有足以刺激免疫应答的尺寸的抗原分子或其部分被提呈在细胞表面上。

此处所用的“表达”是指抗原分子或其部分提呈在所述细胞表面上，其使得一部分该分子暴露于细胞周围的环境并能为其所接近。在“表面”上的表达可以得到实现，其中拟表达的分子与细胞膜和/或下述组分接触，所述组分可存在于该膜中或被致使存在于该膜中。

这种抗原提呈可以有利地引起免疫应答、优选的是下述免疫应答的刺激，所述免疫应答针对包含或含有所述抗原分子或其部分的实体的后续激发提供保护，因此本发明发现了作为疫苗接种方法的特别用途。

更具体而言，本发明的该方面提供一种将抗原分子或其部分表达在细胞表面上的方法，所述方法包括：

使所述细胞与所述抗原分子和与本发明的化合物接触，其中所述分子和所述化合物各自被摄取至所述细胞的细胞内膜限定的区室中；和

用波长可有效活化该化合物的光敏化剂的光照射所述细胞，使得所述细胞内区室的膜被破坏，将所述分子释放至细胞的胞液中，而不杀伤该细胞，

其中，所述释放的抗原分子或其部分随后被提呈在所述细胞的表面上。

本文中所用的“破坏的”区室是指对该区室的膜的完整性永久或临时的破坏，该破坏足以使其中容有的抗原分子释放。

或者认为，本发明的该方面也提供一种化合物或组合物，其用于将抗原分子或其部分表达在细胞表面上，例如用以治疗或预防受试者的疾病、病症或感染，优选用以产生或刺激免疫应答，优选的是一种疫苗接种的方法。所述组合物优选包含抗原分子和本发明的化合物。优选的是，所述组合物是药用可接受的，并且也含有如前所述的药用可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。优选的是，所述治疗或预防使用本文中所述的方法实现。

在另一方面中，本发明也提供抗原分子和/或本发明的化合物在制备药剂中的用途，所述药剂用于将所述抗原分子或其部分表达在细胞表面上，例如用以治疗受试者的疾病、病症或感染，优选用以产生或刺激免疫应答，优选的是一种疫苗接种的方法。优选的是，所述治疗或预防使用本文中所述的方法实现。也提供通过施用所述抗原分子和本发明的化合物的相应治疗或预防的方法。

本发明的另一方面提供一种产品，所述产品包含抗原分子和本发明的化合物作为组合制剂，所述组合制剂用于同时、分开或依次用于将所述抗原分子或其部分表达在细胞表面上，例如用以治疗受试者的疾病、病症或感染，优选用以刺激免疫应答。

本发明的另一方面提供一种用于将抗原分子或其部分表达在细胞表面上的试剂盒，所述试剂盒包括

第一容器，其容有所述抗原分子；和

第二容器，其容有本发明的化合物。

本发明中，抗原分子可以是任何分子，其中当以适当方式提呈至免疫系统时，该分子或其部分能够刺激免疫应答。因此有利的是，所述抗原分子将成为疫苗抗原或疫苗组分，如含有多肽的实体。

许多这种抗原或抗原疫苗组分在本领域中是已知的，并包括所有方式的细菌或病毒抗原，或者实际上任何致病菌种(包括原生动物或高等生物体)的抗原或抗原组分。虽然传统上疫苗的抗原组分已包括整个生物体(无论是活的、死的还是减毒的)，即全细胞疫苗，但是除此以外，亚基疫苗(sub-unit vaccine)，即，基于生物体的特定抗原组分(例如蛋白或肽，甚至碳水化合物)的疫苗已被广泛研究并报道在文献中。任何此类基于“亚基”的疫苗组分均可以用作根据本发明的抗原分子。

然而，本发明特别可用在肽疫苗领域中。因此，根据本发明的优选抗原分子是肽(其如本文中所限定，包括长度较短和较长的肽，即，肽、寡肽或多肽，以及蛋白分子或其片段，例如，5～500、例如10～250、如15～75或8～25个氨基酸的肽)。抗原分子被提呈或表达的部分优选包含由细胞中的抗原加工机构所生成的部分。但是这些部分可以通过其他手段生成，其可通过适当的抗原设计(例如，pH敏感带)或通过其他细胞加工手段而实现。便利地，这些部分具有足以产生免疫应答的尺寸，例如，在肽的情形中，尺寸方面大于5个、例如大于10或20个氨基酸。

非常大量的肽疫苗候选物已在文献中提出，例如在病毒性疾病和感染，如AIDS/HIV感染或流感、犬细小病毒、牛白血病病毒、肝炎等的治疗中(参见例如Phanuphak等，Asian Pac.J.Allergy.Immunol.1997,15(1),41-8；Naruse,Hokkaido Igaku Zasshi1994,69(4),811-20；Casal等，J.Virol.,1995,69(11),7274-7；Belyakov et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1998,95(4),1709-14；Naruse等，Proc.Natl.Sci.USA,199491(20),9588-92；Kabeya等，Vaccine 1996,14(12),1118-22；Itoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83(23)9174-8)。类似地，可以使用细菌肽，事实上也可以使用源于其他生物体或物种的肽抗原。

除源于病原微生物的抗原之外，肽也已被提出用作针对癌症或如多发性硬化症等其他疾病的疫苗。例如，突变癌基因肽非常有希望成为在细胞毒性T淋巴细胞的模拟中充当抗原的癌症疫苗(Schirrmacher,Journal of Cancer Research and ClinicalOncology1995,121,443-451；Curtis Cancer Chemotherapy and Biological ResponseModifiers,1997,17,316-327)。合成肽疫苗用于转移性黑色素瘤的治疗也已得到评价(Rosenberg等，Nat.Med.1998,4(3),321-7)。用于多发性硬化症的治疗的T细胞受体肽疫苗描述于Wilson等，J.Neuroimmunol.1997,76(1-2),15-28中。任何此类肽疫苗组分均可以用作本发明的抗原分子，事实上因为文献中描述或提出作为肽疫苗的任何肽也可以。肽因此可以是合成的或分离的肽，或者是源于生物体。

作为本发明的方法、用途等的对象的细胞可以是任何能够将被施用或转运至其胞液中的分子表达或提呈在其表面上的细胞。

便利的是，细胞是免疫效应细胞，即，免疫应答中所涉及的细胞。然而，其他细胞也可以将抗原提呈至免疫系统，并且它们也落在本发明的范围内。因此有利的是，根据本发明的细胞是抗原提呈细胞。抗原提呈细胞可以参与免疫应答的任何方面或“分支(arm)”，包括体液和细胞介导免疫，例如抗体产生的刺激，或细胞毒性或杀伤细胞的刺激，其可识别和破坏(或消除)在其表面上表达“外来”抗原的细胞。术语“刺激免疫应答”因而包括所有种类的免疫应答和刺激它们的机制。

细胞毒性细胞或抗体产生细胞的刺激需要通过抗原提呈细胞以特定方式(例如MHC I类提呈)刺激将要被提呈至细胞的抗原(例如，CD8⁺细胞毒性T细胞的活化需要MHC-1抗原提呈)。

抗原提呈细胞在本领域中是已知的并描述于文献中，包括例如淋巴细胞(T和B细胞)、树突细胞、巨噬细胞等。其他包括例如癌细胞，例如黑素瘤细胞。

对于通过抗原提呈细胞到达细胞毒性T细胞(CTL)的抗原提呈，抗原分子需要进入抗原提呈细胞的胞液中(Germain,Cell,1994,76,287-299)。本发明提供一种将抗原分子递送至胞液中的有效手段。

一旦通过光化学内化法释放在细胞胞液中，抗原分子可以通过细胞的抗原加工递呈而加工，并以适当方式(例如通过MHC I类)而递呈在细胞表面上。该加工可以涉及抗原的降解，例如蛋白或多肽抗原降解成肽，所述肽然后与用于提呈的MHC分子复合。因此，根据本发明表达或提呈在细胞表面上的抗原分子可以是被内化(胞吞)的抗原分子的部分或片段。

抗原可以通过胞吞作用而为抗原提呈细胞所摄取，并在胞吞泡中降解成肽。这些肽可以在胞内体中结合MHC II类分子，并被转运至细胞表面，在该处该肽-MHC II类分子复合体可以被CD4+T辅助细胞识别，并诱导免疫应答。作为另外一种选择，胞液中的蛋白可以例如通过蛋白酶降解并借助TAP(抗原提呈相关转运体)转运至内质网中，在该处肽可以结合MHC I类分子并被转运至细胞表面(Yewdell和Bennink,1992,Adv.Immunol.52:1-123)。如果肽源自外来抗原，则肽-MHC I类复合体将被CD8+细胞毒性T细胞(CTL)识别。CTL将结合肽-MHC(HLA)I类复合体并因而被活化，开始增殖并形成CTL的克隆。细胞表面上的靶细胞和具有相同肽-MHC I类络合物的其他靶细胞会被该CTL克隆杀死。如果足量的抗原能被引入胞液中，则可以建立针对外来抗原的免疫(Yewdell和Bennink,1992,见上；Rock,1996,Immunology Today 17:131-137)。这尤其是开发癌症疫苗的基础。最大的实际问题之一是要将足量的抗原(或抗原的部分)引入胞液中。这可以根据本发明来解决。

如前所述，这些方法可以在体外或体内使用。

因此，本发明的另一方面提供一种抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞将抗原分子或其部分表达在所述细胞的表面上，所述细胞通过如前所限定的方法可获得(或获得)。本发明的另一些方面提供此类细胞的群体或培养物，特别是此类细胞的有活力并且功能完好的群体或培养物，以及此类细胞(或细胞的群体或培养)在治疗中、特别是用于刺激免疫应答、尤其是用于刺激CTL的用途。

还提供此类细胞(或细胞的群体或培养)用于制备药剂(例如疫苗组合物)的用途，所述药剂用于刺激免疫响应、尤其是用于刺激CTL。

现在将参照以下附图在以下非限制性实施例中更加详细地描述本发明，附图中：

图1显示的是本发明的特别优选的化合物(TPC＝四苯基卟吩)。

图2显示的是方案1：合成化合物5的合成路线。试剂和条件：(a)丙酸，回流，1小时(20％)；(b)NaNO₂(1.8当量)，TFA，室温，3分钟(67％)；(c)SnCl₂·2H₂O，浓HCl，60℃，1小时(88％)；(d)溴乙酰溴，Et₃N，CH₂Cl₂，室温，1小时(64％)；(e)哌嗪，CH₂Cl₂，室温，1小时(94％)。

图3显示的是方案2：N-改性壳聚糖衍生物(TPP-CS-TMA&TPP-CS-MP)的合成。此处A-表示第1批化合物，B-表示第2批化合物。试剂和条件：(a)MeSO₃H/H₂O，10℃～室温，1小时，(90％)；(b)TBDMSCl，咪唑，DMSO，室温，24小时(96％)；(c)溴乙酰溴，Et₃N，CH₂Cl₂，-20℃，1小时(92％)；(d)化合物5，即TPP-NH-Pip(0.1或0.25当量)，Et₃N，CHCl₃，室温，2小时(92％～90％)；(e)NMe₃或1-甲基哌嗪，CHCl₃，室温，24小时；(f)TBAF，NMP，55℃，24小时或浓HCl/MeOH，室温，24小时。

图4显示的是TPPp_0.1-CS-MP_0.9(18A)合成中所有中间体和最终产物的代表性FT-IR光谱叠加图：(A)TPP-NH-Pip 5；(B)BrA-DiTBDMS-C 9；(C)TPPp_0.1-CH₂CO-DiTBDMS-C 10A；(D)TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-MP_0.914A；(E)TPPp_0.1-CS-MP_0.918A。

图5显示的是TPPp_0.1-CS-MP_0.9(18A)合成中所有中间体和最终产物的代表性¹HNMR谱叠加图：(A)DiTBDMS-C 8；(B)BrA-DiTBDMS-C 9；(C)TPPp_0.1-CH₂CO-DiTBDMS-C 10A；(D)TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-MP_0.914A；(E)TPPp_0.1-CS-MP_0.918A。

图6显示的是溶解于水:CHCl₃两相系统中的化合物的配分：(A)TPP(p-NH₂)₁3(B)TPPNH-Pip 5(C)TPPp_0.25-CS-TMA_0.7517A(D)TPPp_0.25-CS-MP_0.7519A。水相显示位于上部。

图7显示的是TPPp_0.25-CS-TMA_0.75(17B)和TPPp_0.25-CS-MP_0.75(19B)的代表性最终化合物的固态¹³C NMR谱。

图8显示的是I)TPPp_0.25-CS-TMA_0.7517B在下述溶剂中的¹H NMR谱：(A)DMSO-d₆:D₂O(98:2)；(B)DMSO-d₆:D₂O(75:25)；(C)DMSO-d₆:D₂O(50:50)；(D)DMSO-d₆:D₂O(25:75)；(E)DMSO-d₆:D₂O(0:100)；(II)TPPp_0.25-CS-TMA_0.7517B在下述共溶剂中处于恒定浓度(0.3mg/L)时的紫外-可见吸收光谱叠加图：(A)DMSO:H₂O(100:0)；(B)DMSO:H₂O(75:25)；(C)DMSO:H₂O(50:50)；(D)DMSO:H₂O(25:75)；(E)DMSO:H₂O(0:100)；(III)TPPp_0.25-CS-TMA_0.7517B处于恒定吸光度(0.85-0.90；数据未显示)并在下述共溶剂中在419nm(3-3狭缝)激发时的荧光发射光谱叠加图：(A)DMSO:H₂O(100:0)；(B)DMSO:H₂O(75:25)；(C)DMSO:H₂O(50:50)；(D)DMSO:H₂O(25:75)；(E)DMSO:H₂O(0:100)。

图9显示的是(A)TPP-CS-TMA的孤立的纳米颗粒的SEM照片；(B)TPP-CS-TMA树枝状纳米聚集体的SEM照片；(C)TPP-CS衍生物的接触角的图。

图10显示的是方案3–化合物1、3、20和21的合成方案。反应和条件：(a)丙酸，回流，1小时，(20％)；(b)NaNO₂(1.8当量)，TFA，室温，3分钟；(c)SnCl₂·2H₂O，浓HCl，60℃，1小时，(54％)；(d₁)对甲苯磺酰肼，K₂CO₃，吡啶，回流，24小时；(d₂)邻氯苯醌，CH₂Cl₂，室温，(80％)；(e)氯乙酰氯，Et₃N，CH₂Cl₂，室温，2小时，原位；(f)哌嗪，CH₂Cl₂，室温，12小时，(61％)。化合物20和21的所有衍生物将含有TPCa₁和TPCa₂异构体。但是仅TPCa₁结构显示在方案和结构图中。

图11显示的是方案4–化合物22～28的合成方案。反应和条件：(a)乙酰氯，MeOH，回流，24小时，(87％)；(b)BF₃·Et₂O，CHCl₃，室温，对氯苯醌，48小时，(14％)；(c)2N KOH(在MeOH中)，THF:吡啶(10:1)，回流，24小时(71％)；(d₁)对甲苯磺酰肼，K₂CO₃，吡啶，回流，24小时；(d₂)邻氯苯醌，CH₂Cl₂:MeOH(75:25)，室温，(70％)；(e)EDCI·HCl，HOBT，Et₃N，N-Boc-哌嗪5，DMF，室温，24小时(54％)；(f)TFA，CH₂Cl₂，室温，1小时(89％)。化合物26～28的所有衍生物将含有TPCc₁和TPCc₂异构体。但是仅TPCc₁结构显示在方案和结构图中。

图12显示的是方案5–化合物7～9的合成。试剂和条件：(a)MeSO₃H/H₂O，10℃～室温，1小时，(90％)；(b)TBDMSCl，咪唑，DMSO，室温，24小时，(96％)；(c)溴乙酰溴，Et₃N，CH₂Cl₂，-20℃，1小时，(92％)。

图13显示的是方案6A和6B。试剂和条件(6A)：(a)化合物21，即TPC-NH-Pip(0.1当量)，Et₃N，CHCl₃，室温，2小时(78％)；(b)NMe₃或1-甲基哌嗪，室温，24小时。试剂和条件(6b)：a)化合物28，即TPC-CO-Pip(0.1当量)，Et₃N，NMP，75℃，12小时(89％)；(b)NMe₃或1-甲基哌嗪，CHCl₃，室温，24小时。

图14显示的是TPC-CO-Pip(28)在CDCl₃中的¹H NMR谱。两种异构体被显示。

图15显示的是化合物21(TPC-NH-Pip)在CDCl₃中的¹H NMR谱(两种异构体被显示)。

图16显示的是化合物29在CDCl₃中的¹H NMR谱。该化合物含有TPCa1和TPCa2异构体。

图17显示的是化合物34在CDCl₃中的¹H NMR谱。该化合物含有TPCc1和PCc2异构体。

图18显示的是最终载体化合物(37、38、32和33)在d₆-DMSO/D₂O中的NMR谱。

图19显示的是利用pEGFP-N1在HCT116/LUC细胞中的转染。转染在通过流式细胞仪光照48小时后测量。细胞存活率通过MTT检测测量。(a)16A；0.1μg/ml TPP。(b)16B；0.1μg/ml TPP。(c)17A；0.01μg/ml TPP。(d)19A；0.01μg/ml TPP。(e)TPCS_2a；0.1μg/ml。

图20显示的是利用pEGFP-N1在HCT116/LUC细胞中的转染。转染在通过流式细胞仪光照48小时后测量。细胞存活率通过MTT检测测量。(a)化合物37；0.05μg/ml TPC。(b)化合物38；0.05μg/ml TPC。(c)化合物32；0.05μg/ml TPC。(d)化合物33；0.05μg/ml TPC。(e)TPCS_2a；0.1μg/ml。

图21显示的是利用pEGFP-N1在HCT116/LUC细胞中的转染。转染在通过流式细胞仪光照48小时后测量。细胞存活率通过MTT检测测量。化合物54以0.1μg/ml的浓度使用。

图22显示的是使用壳聚糖缀合物和博莱霉素对于荷瘤动物PCI治疗后的体内生物发光成像。动物的治疗如实施例3中材料和方法部分所述。各动物的治疗和成像的时间点(光敏剂注射后的天数)被指出。

图23显示的是使用化合物37、38或33和博莱霉素对荷瘤动物PCI治疗后肿瘤的生长。动物的治疗如实施例3中的材料和方法中所述。PS：光敏剂。

图24显示的是方案7–用于四乙二醇化和聚乙二醇化的试剂的合成。反应条件：(a)KOH，p-TsCl，THF/H₂O，室温，12小时；(b)哌嗪，CH₃CN，室温，12小时，(41％)；(c)Swern氧化：(COCl)₂，CH₂Cl₂，DMSO，Et₃N，-78℃。

图25显示的是方案8-DiTBDMS-壳聚糖的四乙二醇化。试剂和条件：(a)MeSO₃H/H₂O，10℃～室温，1小时，(90％)；(b)TBDMSCl，咪唑，DMSO，室温，24小时(96％)；(c)TEG-OTs 42，Cs₂CO₃，NMP，KI，50℃，24小时；(d)HCl/MeOH(30％体积比)，室温，24小时；(e)溴乙酰溴，Et₃N。CH₂Cl₂，-20℃，1小时(92％)，(f)TEG-Pip 46Et₃N，CH₂Cl₂，室温，24小时；(g)HCl/MeOH(30％体积比)，室温，24小时。

图26显示的是方案9–四乙二醇化壳聚糖-TPP缀合物的合成。试剂和条件：(a)溴乙酰溴，Et₃N，CH₂Cl₂，-20℃，1小时(92％)，(b)TPP-NH-Pip 5(0.1当量)，CH₂Cl₂，Et₃N，室温，(c)TEG-PIP(化合物46)(2当量)，CH₂Cl₂，Et₃N，室温，24小时(d)30％(体积比)HCl的MeOH溶液中，室温，12h；(e)化合物4(0.25当量)，NMP，50℃，Cs₂CO₃，24小时；(f)TEG-单乙醚-甲苯磺酸(化合物42)，NMP，50℃，KI，24小时(g)30％(体积比)HCl的MeOH溶液，室温，12小时。

图27显示的是化合物54的¹H NMR(400MHz，DMSO-d6:D₂O，96:4)。

图28显示的是在小鼠原代巨噬细胞中的IL-2生产，所述小鼠原代巨噬细胞与化合物32(A)和38(B)以及卵清蛋白OVA 257-264肽抗原在抗原特异性T细胞设定环境下与卵清蛋白特异性(OVA 257-264)CD8+T细胞克隆一同温育。来自活化CD8+T细胞的IL-2生产由ELISA进行分析。

实施例1.间四苯基卟啉-壳聚糖基纳米载体的合成

以7步程序，从作为原料的3,6-二-O-叔丁基二甲基甲硅烷基壳聚糖(DiTBDMS-CS)和5-(对氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉[TPP(p-NH₂)₁]开始，合成高度水溶性的缀有光敏剂间四苯基卟啉(TPP)的壳聚糖纳米载体。DiTBDMS-CS在CH₂Cl₂中是高度可溶的，并且高亲脂性光敏剂可以因此而引入定量反应中以提供0.1和0.25的取代度。之后将三甲基铵基和/或1-甲基哌嗪基引入至高分子骨架上，以提高最终经脱保护的载体的水溶性。该方法显示出高度可再现性，并且获得的材料可以由固态NMR、FT-IR和¹H NMR充分表征。UV-Vis、荧光和NMR研究显示，载体为动态结构，其在水溶液中形成纳米颗粒状结构，具有半固体π-堆叠的光敏剂核心。在亲脂性环境中，可能这些结构能够去折叠，并且光敏剂部分能够因此而插入细胞膜中。

通用材料和方法

壳聚糖高分子由冰岛Genis EHF捐赠，并用于合成[壳聚糖高分子GO 30626-2(95％DD，95cp)]。所有溶剂和试剂均为商购，在无进一步提纯下使用。NMR谱采用在298K的DRX 400MHz Bruker NMR谱仪记录，并且化学位移相对于所使用的氘代NMR溶剂而报道[¹HNMR:CDCl₃(7.26ppm),DMSO-d₆(2.50ppm)；¹³C NMR:CDCl₃(77.16ppm),DMSO-d₆(39.52ppm)]。将丙酮峰(2.22ppm)用作作为溶剂的D₂O的内部参照。卟啉的苯环上的质子(邻、间、对位)关于其相对于卟啉环系统的位置而不是相对于苯环上的取代基来鉴定。

化合物17B和19B的固态¹³C NMR由Durham大学化学系获得。这些光谱使用关于¹³C在100.56MHz运行的瓦里安VNMRS谱仪获得。交叉极化魔角旋转实验用6mm(转子外径)探测器进行。该谱在6.8kHz的旋转速率、1ms的接触时间、1.5s的循环延迟和“TOSS”旋转边带抑制下记录。通过将来自金刚烷的高频信号设定为38.5ppm，相对于纯四甲基硅烷的外部样品进行光谱参比。

质谱采用Bruker Autoflex III或Bruker micrOTOF-Q11记录。FTIR-测量使用AVATAR 370FT-IR仪器进行(Thermo Nicolet Corporation,Madison,美国)。将样品(2mg～3mg)与KBr充分捏合。使用Specac压缩机(Specac Inc.,Smyrna,美国)将样品压成片。熔点采用Buchi Melting Point B-540记录。使用Spectra/Por透析膜(MWCO:3500)透析高分子样品。

吸收和稳态荧光光谱

UV-Vis测量采用配备有Peltier Temperature Programmer的Perkin-ElmerLambda25UV-Vis光谱仪记录。荧光发射光谱使用SPEX FluoroMax光谱仪用比色池在170nm～2200nm的光谱范围内获得(Spectrocell Corporation,Oreland,PA,美国)。吸收光谱在20℃记录，并且荧光发射光谱在环境温度记录，其使用10mm光程的石英比色皿。所有荧光光谱利用恒定狭缝宽度记录，激发用狭缝宽度为1nm并且发射用狭缝宽度为1nm，并且对三次扫描的荧光光谱平均化以用于量子产率研究。但是对于图5(III)，荧光光谱利用3nm的激发用狭缝宽度和3nm的发射用狭缝宽度而获得。

化合物3、5、16A～19B(均在λex.＝λmax＝419nm激发)的荧光量子产率通过采用稳态比较法相对于标准蒽(Φ_F＝0.27，λex＝365.5nm)的无水乙醇溶液而确定。利用以下方程：

Φ_X＝Φ_ST(Grad_X/Grad_ST)(η_X ²/η_ST ²)

其中，下标ST和X分别表示标准和测试，Φ为荧光量子产率，Grad为来自积分荧光强度与吸光度关系的图的梯度，并且η为溶剂的折射率。

稳定性研究

对于物理稳定性研究，将17A溶于H₂O中(1mg/mL)，超声处理30分钟，离心分离(在HERMLE Z-320上，4000rpm 10分钟)，倾析并用铝箔包裹。在0～90天的时间段中，在λ_max＝419测量在H₂O中的UV-Vis吸光度。

通过¹H NMR确定取代度

为计算TPP-NH-Pip的取代度，发明人采用的是最终化合物的1H NMR。为计算的最终化合物16A～19B的DS，发明人采用的是TPP峰(来自TPP-NH-Pip部分)和H-1(来自壳聚糖部分)峰的积分值。考虑了TPP的积分(来自芳香区域的四个峰)，同时计算H-1基团的积分，并将其用在以下方程中：

在此情况下，高分子骨架被HDO峰部分地叠加，但由H-1峰与TPP峰的积分的相对比例可以以良好的精度确定DS。

为计算TPC-NH-Pip和TPC-CO-Pip的DS，发明人使用的是中间化合物29和34，并将TPC峰的积分(来自芳香族区域中的TPC-NH-Pip或TPC-CO-Pip以及α-吡咯NH峰的积分)和TBDMS峰的积分(来自壳聚糖)用在以下方程中：

为计算各种壳聚糖衍生物的四乙二醇化的DS，发明人采用的是相应的¹H NMR。考虑了壳聚糖的H-1峰的积分值和壳聚糖骨架上的(TEG的端乙基峰的)CH₃的积分值。乙基端三重态的积分值在取代度为100％时等于3。因此，方程如下：

DS(％)＝(∫乙基峰(端三重态,CH3)/3)/(∫H-1峰/1)*100％

SEM和椭圆光度法

在100级净室环境中使用常规旋转器在1000rpm将溶液旋涂至纯净硅<100>基板(15mm x 15mm)上。该硅具有约厚的一层原生氧化物。此外，将10μl相同溶液直接移液至硅基板上，并使其在室温于空气中干燥。使用透镜内检测器(in-lens detector)以10keV加速电压和2mm工作距离将该涂布基板在Zeiss LEO 1550扫描电子显微镜中成像。

水接触角测量

使用KSV CAM 200光学接触角计(KSV Instruments)确定水接触角。将5μl去离子水滴滴在硅晶片上，并基于拉普拉斯-杨氏方程(Laplace&Young equation)确定水接触角。测量在室温和环境湿度进行。

合成

参见用于TPP-NH-Pip合成的图2中的方案1

间四苯基卟啉(1)。按照文献程序(Adler,J Organic Chem 1967,32:476)。

5-(4-硝基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉[TPP(p-NO₂)₁](2)。按照文献程序(LuguyaR等，Tetrahedron 2004,60:2757)。

5-(4-氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉[TPP(p-NH₂)₁](3)。按照文献程序(LuguyaR等，Tetrahedron 2004,60:2757)。

5-(4α-溴乙酰酰氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉(4)。将化合物3(500mg，0.793mmol)在N₂气氛下溶解于CH₂Cl₂(15mL)中并搅拌。添加三乙胺(0.24mL，1.75mmol)，随后在室温逐滴添加溴乙酰溴(0.097mL，1.11mmol)并在室温连续搅拌1小时。将反应混合物在CH₂Cl₂(45mL)中稀释，用水(2x 25mL)和盐水(20mL)洗涤。然后将有机层在Na₂SO₄上方干燥并在真空中浓缩。将粗产物通过使用CH₂Cl₂和己烷作为洗脱液的硅胶柱色谱纯化，获得385mg(64％)的期望产物4。TLC(己烷/CH₂Cl₂3:7):Rf＝0.17；FT-IR,νcm^-1:3313(N-H),3049,3019(芳基C-H),1687,1594(CONH),1556,1514,1471,1439,1399,1348,1177,1153,964,798,726,699；¹H NMR(CDCl₃):δ＝8.88-8.91(m.8H,β-吡咯H),8.41(br s,1H,TPPNHCO),8.22-8.27(m,8H,四苯基H_O),7.91(d,J＝8Hz,2H,CONH-苯基-Hm),7.75-7.80(m,9H,三苯基-Hm,p),4.15(s,2H,COCH₂Br),-2.70(br s,2H,α-吡咯NH)ppm；¹³C NMR(CDCl₃):δ＝163.78,142.26,139.20,136.78,135.25,134.68,131.23,127.87,126.83,120.42,120.38,119.24,118.34,29.72ppm；MS(ESI):对于C₄₆H₃₃BrN₅O的计算m/z([M+H]⁺)750.1863，测得750.1864；UV-vis(DMSO):λ_max:417,517,542,597,650nm。

5-(4α-哌嗪乙酰酰氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉[TPP-NH-Pip](5)。将化合物4(275mg，0.366mmol)和过量哌嗪(158mg，1.83mmol)在N₂气氛下在CH₂Cl₂(10mL)中混合在一起，并在室温搅拌1小时。在反应完成之后，将反应混合物用CH₂Cl₂(85mL)稀释，并用水(2x40mL)和盐水(35mL)洗涤。将有机层在Na₂SO₄上方干燥并在真空下浓缩。粗产物通过使用1:12MeOH:CH₂Cl₂作为洗脱液的硅胶柱色谱纯化，得到作为紫色固体的标题化合物5(260mg，94％)。TLC(CH₂Cl₂/MeOH,9:1):Rf＝0.15；FT-IR(KBr):ν3442(pip.NH),3312(芳基N-H),3052,3022(芳基C-H),2903,2816(脂肪族CH2),1691,1596(CONH),1557,1517,1471,1439,1400,1349,1309,1179,1153,1071,1001,965,799,728,700cm^-1；¹H NMR(CDCl₃):δ＝9.51(br s,1H,TPP-NHCO),8.89-8.93(m,8H,β-吡咯H),8.23-8.26(m,8H,四苯基H_O),8.01(d,J＝8.0Hz,2H,Pip-NH-苯基-Hm),7.75-7.81(m,9H,三苯基-Hm,p),3.31(s,2H,COCH_2-Pip.),3.11(t,4H),2.77(br t,4H),2.60(br s,1H,哌嗪NH),-2.71(br s,α-吡咯2H)ppm；¹³C NMR(CDCl₃):δ＝168.75,142.30,138.26,137.44,135.33,134.68,131.26,127.86,126.83,120.32,119.66,117.89,62.87,54.53,46.24ppm；MS(ESI):对于C₅₀H₄₂N₇O的计算m/z([M+H]⁺)756.3445，测得756.3467；UV-vis(DMSO):λ_max:417,517,542,597,650nm。

参见图3中的方案2和图12中的方案5

壳聚糖甲磺酸盐(7)。根据发明人之前公布的程序合成(Song等，CarbohydratePolymers 2010,81:140)。

3,6-O-二叔丁基二甲基甲硅烷基壳聚糖[DiTBDMS-CS](8)。根据发明人之前公布的程序合成(Song等，Carbohydrate Polymers 2010,81:140)。

N-溴乙酰基-3,6-O-DiTBDMS-CS[BrA-DiTBDMS-CS](9)。将DiTBDMS-CS 8(1g，2.60mmol)在N₂气氛下溶解于圆底烧瓶中的无水CH₂Cl₂(15mL)中。然后利用冰/盐混合物将该反应混合物冷却至-20℃。添加Et₃N(1.81mL，13mmol)，然后缓缓逐滴添加溴乙酰溴(0.91mL，10mmol)。搅拌1小时。将该反应混合物用CH₂Cl₂稀释，并在真空中浓缩。将粗产物在乙腈中搅拌，过滤，并用新制乙腈洗涤。将干燥的材料溶解并萃取在CH₂Cl₂中，用水和盐水洗涤，并在Na₂SO₄上方干燥，在真空下浓缩。获得1.2g浅黄色粉末产物9(92％收率)。FT-IR(KBr):ν3402(br,NH),2957,2931,2886,2858(s,C–H TBDMS),1682(vs,C＝O酰胺I),1530(vs,C＝O酰胺II),1473,1391,1362,1311,1259,1101,1005,837,777(Si-C),669cm^-1；¹HNMR(CDCl₃)δppm:4.40(br s,H-1),4.02-3.26(m,H-2GlcN,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6’和2HGluNH-C＝OCH₂Br),0.90和0.88(br s,(CH₃)₃C),0.13和0.07(br s,(CH₃)₂Si)ppm。

(N-TPP-NH-Pip-乙酰基)_0.1-(N-溴乙酰基)_0.9-DiTBDMS-CS[TPPp_0.1-BrA_0.9-DiTBDMS-CS](10A)。将化合物9(700mg，1.38mmol)和化合物NH-pip-TPP 5(105mg，0.138mmol)在N₂气氛下溶解于CH₂Cl₂中。添加相对于5为精确等摩尔量的Et₃N(19.3μL，0.130mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌24小时。原料的完全消耗通过TLC确认。将该反应混合物用CH₂Cl₂稀释，萃取，并用水和盐水洗涤。将有机层在Na₂SO₄上方干燥，在真空下浓缩，获得730mg(92％)产物10A。FT-IR(KBr):ν3324(br,NH),2955,2929,2884,2856(s,C–HTBDMS),1678(vs,C＝O酰胺I),1600,1524(vs,C＝O酰胺II),1472,1403,1361,1311,1256,1098,1004,966,837,801,778,701,670,550cm^-1；¹H NMR(CDCl₃)δppm:9.30(s,TPPNHCO),8.85(m,β-吡咯H),8.23-8.20(m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),7.97(d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.79-7.73(m,三苯基-Hm,p),4.41(br s,H-1),4.13-3.50(m,H-2GlcN,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6’和2H GluNH-C＝O,TPPNHCOCH₂pip,CH₂CONGlc和哌嗪的(CH₂)₂),2.81-2.86(m,哌嗪-H),0.92,0.89(br s,(CH₃)₃C),0.14,0.07(br s,(CH₃)₂Si),-2.77(br s,α-吡咯NH)ppm；UV-vis(DMSO):λ_max:417,517,542,597,650nm。

TPPp_0.1-BrA_0.9-DiTBDMS-CS(10B)：使用中间体5(180mg，0.24mmol)和9(1.2g，2.4mmol)严格按照以上程序制备化合物10B(1.3mg，91％)。

TPPp_0.25-BrA _0.75-DiTBDMS-CS(11A)。将化合物9(550mg，1.09mmol)和化合物NH-pip-TPP 5(206mg，0.273mmol)在N₂气氛下溶解于CH₂Cl₂中。相对于5添加精确等摩尔量的Et₃N(38μL，0.27mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌24小时。原料的完全消耗通过TLC确认。将该反应混合物用CH₂Cl₂稀释，萃取，并用水和盐水洗涤。将有机层在Na₂SO₄上方干燥，并在真空下浓缩，获得670mg(91％)产物11A。FT-IR(KBr):ν3317(br,NH),2952,2926,2883,2855(s,C–H TBDMS),1680(vs,C＝O酰胺I),1598,1520,1471,1440,1402,1361,1309,1254,1096,1002,966,837,800,778,730,701,667,558cm^-1；¹H NMR(CDCl₃)δppm:9.30(s,TPPNHCO),8.85(m,β-吡咯H),8.22-8.20(m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),7.97(d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.80-7.75(m,三苯基-Hm,p),4.40(br s,H-1),4.06-3.63(m,H-2GlcN,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6’和2H GluNH-C＝O,TPPNHCOCH₂pip,CH₂CONGlc和哌嗪的(CH₂)₂),2.81-2.86(m,哌嗪-H),0.92,0.89(br s,(CH₃)₃C),0.14,0.10,0.07和0.02(br s,(CH₃)₂Si),-2.77(br s,α-吡咯NH)ppm；UV-vis(DMSO):λ_max:417,517,542,597,650nm。

TPPp_0.25-BrA_0.75-DiTBDMS-CS(11B)：使用中间体5(415mg，0.55mmol)和9(1.1g，2.18mmol)严格按照以上程序制备化合物11B(1.35g，92％)。

用于化合物12A、12B、13A和13B的合成的通用程序A

(N-TPP-NH-Pip-乙酰基)_0.1-(N-(N,N,N-三甲基铵基)乙酰基)_0.9-DiTBDMS-CS[TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-TMA_0.9](12A)。将化合物10A(350mg，0.61mmol)在N₂气氛下溶解于CH₂Cl₂中。添加过量的三甲胺溶液，并将该反应混合物在室温搅拌24小时。在真空中除去溶剂。将粗产物在高真空下完全干燥，获得作为紫色固体的粗产物12A(420mg，99％)。FT-IR(KBr):ν3426,3021,3011,2962,2855,27.7,2560,2438,1749,1689,1599,1563,1482,1443,1401,1360,1288,1254,1053,1010,966,922,901,837,797,779,744,701,671,552cm^-1。

TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-TMA_0.9(12B)。使用10B(600mg，1.04mmol)和NMe₃执行通用程序A，提供作为粗固体的12B(720mg，99％)。

TPPp_0.25-DiTBDMS-CS-TMA_0.75(13A)。使用11A(300mg，0.44mmol)和NMe₃执行通用程序A，提供13A粗固体(340mg，98％)。FTIR(KBr):ν3415,3021,3011,2962,2854,1749,1686,1598,1522,1482,1442,1402,1360,1311,1288,1252,1053,1010,966,922,901,837,798,779,744,701,671,558cm^-1。

TPPp_0.25-DiTBDMS-CS-TMA_0.75(13B)。使用11B(600mg，0.89mmol)和NMe₃执行通用程序A，提供作为粗固体的13B(685mg，99％)。

用于化合物14A、14B、15A和15B的通用程序B

(N-TPP-NH-Pip-乙酰基)_0.1-(N-(N-甲基哌嗪基)乙酰基)_0.9-DiTBDMS-CS[TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-MP_0.9](14A)。将化合物10A(350mg，0.61mmol)在N₂气氛下溶解于CH₂Cl₂中。添加过量的1-甲基哌嗪，并将该反应混合物在室温搅拌24小时。在真空中除去溶剂。然后将该粗产物在高真空下完全干燥，获得相应粗产物14A(425，105％)。FT-IR(KBr):ν3378,2950,2930,2884,2854,2798,2694,2608,2477,2223,1678,1617,1519,1461,1394,1371,1293,1253,1168,1092,1051,1003,966,939,920,837,801,779,701,671,612cm^-1。

TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-MP_0.9(14B)。使用10B(600mg，1.04mmol)和1-甲基哌嗪执行通用程序B，提供作为粗固体的14B(710mg，102％)。

TPPp_0.25-DiTBDMS-CS-MP_0.75(15A)。使用11A(250mg，0.37mmol)和1-甲基哌嗪执行通用程序B，提供作为粗固体的15A(290mg，104％)。FT-IR(KBr):ν3380,2950,2930,2884,2854,2800,2480,1677,1598,1519,1461,1400,1394,1371,1284,1252,1168,1089,1050,1003,966,939,920,837,801,779,732,701,671,591cm^-1。

TPP_0.25-DiTBDMS-CS-MP_0.75(15B)。使用11B(650mg，0.96mmol)和1-甲基哌嗪执行通用程序B，提供作为粗固体的15B(735mg，102％)。

用于化合物16A、17A、18A和19A(第1批化合物)的通用TBDMS脱保护程序

TPPp_0.1-CS-TMA_0.9(16A)。将材料12A(350mg，0.50mmol)溶解于MeOH(5mL～10mL)中，随后添加浓HCl(2mL～3mL)。将该反应混合物在室温搅拌12小时。将过量去离子水添加至反应混合物中并搅拌30分钟，然后对8％NaCl透析1天，并对去离子水透析3天。在此期间，溶液颜色由深绿色逐渐变为红色。然后将该红色溶液冷冻干燥，获得棕色海绵状材料。将该材料再次脱保护，离子交换，透析和冷冻干燥。利用相同条件重复该程序，以除去痕量TBDMS，获得16A(210mg，89％)棕色海绵材料。FT-IR(KBr):ν3419(br,O-H),3064(C-H),1683,1558,1506,1488,1473,1403,1296,1153,1112,1068,1032,966,911,800,730,701,618cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 96:4)δppm:8.81(br m,β-吡咯H),8.12-8.16(br m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),8.04(br d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.75-7.84(m,三苯基-Hm,p),4.66(br s,H-1),4.21(br s,BrCH₂C＝O),3.83-3.54(m,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′),3.32(s,⁺N(CH₃)₃))ppm。

TPPp_0.25-CS-TMA_0.75(17A)。使用13A(240mg，0.30mmol)和浓HCl/MeOH执行通用程序C，提供作为紫色固体的17A(120mg，71％)。FT-IR(KBr):ν3392,3061,2950,1683,1559,1506,1489,1473,1402,1350,1296,1154,1112,1068,1032,966,911,800,730,701,619cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 98:2)δppm:8.81(br m,β-吡咯H),8.12-8.16(br m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),8.04(br d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.79-7.87(m,三苯基-Hm,p),4.50(br s,H-1),4.15(br s,BrCH₂C＝O),3.27-3.65(m,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′),3.24(s,⁺N(CH₃)₃))ppm。

TPPp_0.1-CS-MP_0.9(18A)。使用14A(350mg，0.52mmol)和浓HCl/MeOH执行通用程序C，提供作为紫色固体的18A(200mg，87％)。FT-IR(KBr):ν3419(br,O-H),3057(C-H),1683,1558,1474,1403,1296,1234,1154,1112,1068,1032,966,930,911,799,730,701cm^-1；¹HNMR(DMSO-d₆:D₂O 96:4)δppm:8.83(br m,β-吡咯H),8.13-8.19(br m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),8.08(br d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.79-7.87(m,三苯基-Hm,p),4.48(brs,H-1),3.24-3.78(m,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′),3.92(dd,J＝12Hz,Pip-CH₂C＝O),2.30-2.67(m,哌嗪(CH₂)₄),2.48(br s,哌嗪,N-CH₃)ppm。

TPPp_0.25-CS-MP_0.75(19A)。使用15A(200mg，0.26mmol)和1-甲基哌嗪执行通用程序C，提供作为紫色固体的19A(80mg，58％)。FT-IR(KBr):ν3392,3056,2947,1683,1558,1520,1489,1472,1458,1400,1349,1309,1248,1154,1068,1031,1001,966,911,800,729,701,658cm^-1。¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 96:4)δppm:8.83(br m,β-吡咯H),8.14-8.20(br m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),8.08(br d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.78-7.86(m,三苯基-Hm,p),4.50(br s,H-1),3.24-3.78(m,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′),3.92(dd,J＝12Hz,Pip-CH₂C＝O),2.28-2.67(m,哌嗪(CH₂)₄),2.48(br s,哌嗪,N-CH₃)ppm。

用于最终化合物16B、17B、18B和19B(第2批化合物)的通用TBDMS脱保护程序(化合物16B作为代表)

TPPp_0.1-CS-TMA_0.9(16B)：将材料12B(600mg，0.86mmol)溶解于N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(5mL～10mL)，随后添加过量的四正丁基氟化铵(TBAF)。将该反应混合物在55℃搅拌24小时，并冷却以及用稀HCl酸化，并搅拌30分钟，然后对于8％NaCl(w/v)的去离子水溶液透析2天，并对于去离子水透析3天。在此期间，溶液颜色由灰色逐渐变为红色。然后将该红色溶液冷冻干燥，获得棕色海绵状材料。将该材料再次脱保护，离子交换，透析和冷冻干燥。利用相同条件重复该程序，以除去残留的痕量TBDMS，获得16B(350mg，87％)棕色海绵材料。FTIR(KBr):ν3405,2943,2817,1655,1528,1459,1401,1375,1308,1248,1153,1111,1068,1031,966,832,799,729,702cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 96:4)δppm:8.82(br m,β-吡咯H),8.12-8.16(br m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),8.04(br d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.75-7.84(m,三苯基-Hm,p),4.47(br s,H-1),4.04(br s,BrCH₂C＝O),3.24-3.55(m,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′),3.19(br s,⁺N(CH₃)₃))ppm。

TPPp_0.25-CS-TMA_0.75(17B)：使用13B(650mg，0.84mmol)和TBAF/NMP执行通用程序C，提供作为紫色固体的17B(400mg，87％)。FTIR(KBr):ν3396,2942,2829,1662,1526,1458,1441,1401,1310,1249,1068,1032,1002,966,800,730,701cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 98:2)δppm:8.81(br m,β-吡咯H),8.12-8.16(br m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),8.08(br d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.74-7.86(m,三苯基-Hm,p),4.51(br s,H-1),4.10(br s,BrCH₂C＝O),3.26-3.55(m,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′),3.22(br s,⁺N(CH₃)₃))ppm；固态¹³C NMR(100.56MHz):δ170.85,164.68,128.11,119.45,101.53,75.39,61.09,55.47。

TPPp_0.1-CS-MP_0.9(18B)：使用14B(600mg，0.90mmol)和TBAF/NMP执行通用程序C，提供作为紫色固体的18B(315mg，80％)。FTIR(KBr):ν3396,3315(br,OH,NH),2941,1655(vs,C＝O酰胺I),1534(vs,C＝O酰胺II),1522,1471,1440,1401,1375,1310,1244,1069,1030,1001,966,800,729,701cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 98:2)δppm:8.81(br m,β-吡咯H),8.13-8.19(br m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),8.07(br d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.79-7.85(m,三苯基-Hm,p),4.48(br s,H-1),3.24-3.72(m,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′),3.92(dd,J＝12Hz,Pip-CH₂C＝O),2.33-2.67(m,哌嗪(CH₂)₄),2.48(br s,哌嗪,N-CH₃)ppm。

TPPp_0.1-CS-MP_0.9(19B)：使用15B(700mg，0.93mmol)和TBAF/NMP执行通用程序C，提供作为紫色固体的19B(415mg，85％)。FTIR(KBr):ν3396,3315(br,OH,NH),2941,1655(vs,C＝O酰胺I),1534(vs,C＝O酰胺II),1522,1471,1440,1401,1375,1310,1244,1069,1030,1001,966,800,729,701cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 95:5)δppm:8.82(br m,β-吡咯H),8.13-8.19(br m,苯基-Ho&Pip-NHTPP-苯基-Hm),8.07(br d,J＝8.0Hz,RNTPP-苯基-Ho),7.79-7.87(m,三苯基-Hm,p),4.49(br s,H-1),3.24-3.78(m,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′),3.92(dd,J＝12Hz,Pip-CH₂C＝O),2.30-2.67(m,哌嗪(CH₂)₄),2.40(br s,哌嗪,N-CH₃)ppm；固态¹³C NMR(100.56MHz):δ171.63,138.74,127.97,119.74,101.93,75.54,61.54,55.42,45.34ppm。

结果和讨论

亲核性TPP中间体5。在当前的研究中，TPP 1已被大规模合成，并用作原料。使用1.8当量NaNO₂的TFA溶液将单硝基TPP(p-NO₂)₁2官能度区域选择性地引入，随后通过利用SnCl₂·2H₂O还原，以获得单氨基卟啉TPP(p-NH₂)₁3。通过避免还原步骤之前耗时的对粗材料2的纯化，简化了之前报道的程序。然后，在纯化后获得氨基卟啉3，而未影响其总收率(54％)。

已知氨基卟啉TPP(p-NH₂)₁3是弱亲核性的，在发明人最初的研究中，通过SN²攻击将该化合物连接于亲电性BrA-DiTBDMS-CS 9的尝试，即使在严苛的条件下，也未能给出所期望的结果。因此，为将光敏剂衍生物转化为更强力的亲核试剂，首先将TPP(p-NH2)₁酰基化以提供溴酰基-TPP 4，随后利用过量哌嗪进行亲核取代，以提供亲核性卟啉中间体TPP-NH-Pip 5。哌嗪基序在生理条件(水性pH 7.4)下具有正电荷。哌嗪部分也因具有与几个公知的代谢反应相关的低毒性和生物转化而适合作为间隔子。用于TPP-NH-Pip合成的总合成路线显示在图2的方案1中。

亲核性壳聚糖中间体9。如前所报道对壳聚糖改性，以获得DiTBDMS-CS 8。在羟基被保护后，该生物高分子的溶解度显著改变，并且其变得极易溶于如CH₂Cl₂等常见有机溶剂中，这促进了利用高度亲脂性部分的改性。因此，通过将8与2-溴乙酰溴反应而制备亲电性中间体BrA-DiTBDMS-CS 9(图3中的方案2)。该反应需要精确控制反应时间、温度和不同试剂的当量比，以避免如脱保护和酯化等副反应。在0℃进行1.5小时的8与溴乙酰溴的反应获得不溶于CH₂Cl₂中的材料，并且FT-IR分析揭示了在1760cm^-1处的酯峰和在1680cm^-1处的酰胺峰(数据未显示)。因此，需要精确地优化该反应，以避免副反应并获得极易溶的材料。该反应的优化的条件需要使用精确的4当量溴乙酰溴和5当量Et₃N，以及将反应温度在-20℃保持1小时。将所获得的中间体9完全溶解于CH₂Cl₂中，并可以通过¹H NMR和FT-IR分析来验证正确的结构。然后将化合物9用作壳聚糖载体合成中关键的亲电性中间体。

壳聚糖的TPP衍生物(16A～19B)。将总共八种壳聚糖化合物的TPP衍生物以两个分开批次合成，每个批次有四种不同的化合物。第1批(标记“A”)以80mg～200mg的规模合成，第2批(标记“B”)以略大的300mg～450mg的规模合成，以确认该程序的可再现性和一致性。

通过BrA-DiTBDMS-CS 9与亲核性TPP-NH-Pip 5中间体的反应，使亲脂性PS共价附接于高分子骨架。该反应是定量进行的，其可促进对所获得的材料的取代度的良好控制。初步研究显示，具有高卟啉取代度(DS)的载体不溶于水溶液，因此改性限于0.1和0.25DS(每葡糖胺单体单元)。因此，在受控方式下，使TPP-NH-Pip 5以0.1当量或0.25当量/个亲脂性壳聚糖中间体9单体单元反应，以分别获得所期望的产物TPPp_0.1-BrA_0.9-DiTBDMS-CS(10A/10B)或TPPp_0.25-BrA_0.75-DiTBDMS-CS(11A/11B)。反应的进度由TLC监控，并且当5不再存在时停止反应，以避免副反应。这些材料的¹H NMR分析与TPP共价连接于壳聚糖的定量反应一致。

然后将阳离子部分引入TPP取代的壳聚糖骨架上，以增强载体的水溶性，并提供对胞吞膜的亲合性。因此，化合物10A/10B和11A/11B与过量Me₃N(TMA)反应以分别提供具有固定的阳离子电荷的TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-TMA_0.9(12A/12B)和TPPp_0.25-DiTBDMS-CS-TMA_0.75(13A，13B)。类似地，化合物10A/10B和11A/11B与过量1-甲基哌嗪(MP)反应以分别提供TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-MP_0.9(14A/14B)和TPPp_0.25-DiTBDMS-CS-MP_0.75(15A,15B)。将粗材料直接用于最终的脱保护步骤。

最后，来自第1批12A～15A的粗材料在室温于MeOH中通过浓HCl脱保护12小时，而来自第2批12B～15B的粗材料在60℃通过TBAF/NMP脱保护24小时，这两种方法分别提供最终产物16A～19A和16B～19B。在这两种情形中，重复脱保护步骤以除去第一次脱保护步骤后仍存在的一些痕量TBDMS(1.5％～7％)。利用浓HCl在MeOH中脱保护以前即已在使用，但是近来，为避免可能有助于高分子骨架降解的高度酸性的条件，已经引入了较温和的DiTBDMS壳聚糖衍生物的TBAF/NMP脱保护。但是，后一方法的缺点在于，其需要漫长的透析过程来除去NMP溶剂。三甲基铵(Me₃N⁺)衍生物[TPPp_0.1-CS-TMA_0.9(16A，16B)和TPPp_0.25-CS-TMA_0.75(17A，17B)]比1-甲基哌嗪衍生物[TPPp_0.1-CS-MP_0.9(18A，18B)，TPPp_0.25-CS-MP_0.75(19A，19B)]更快地溶于水中。这可以归因于前一载体化合物中存在固定的离子电荷。

纳米载体的表征

FT-IR分析：代表性最终化合物TPPp_0.1-CS-MP_0.9(18A)的合成中各种中间体的FT-IR光谱的比较显示在图4中。示出的卟啉中间体TPP-NH-Pip 5(图4A)的特征峰为在3310cm^-1～3450cm^-1范围内的N-H伸缩以及在3022cm^-1和2816cm^-1处的芳香族和脂肪族C-H伸缩。在1691cm^-1和1595cm^-1处的峰与酰胺键相一致，并且在966cm^-1、799cm^-1和700cm^-1处的三个强峰是TPP环体系的特征(由箭头显示)。

BrA-DiTBDMS-CS中间体9中的主特征峰在2858cm^-1～2957cm^-1处观察到，其显示的是Si-CH₃的C-H伸缩，酰胺峰在1682cm^-1和1530cm^-1处。此外，在836cm^-1和777cm^-1处的峰表示Si-C伸缩和CH₃面内摇摆(rocking)(最后的这两个峰在图4B中由箭头指出)。

光谱中中间体TPPp_0.1-BrA_0.9-DiTBDMS-CS 10A的特征TPP峰的出现(图4C)确认了卟啉(TPP-NH-Pip 5)共价附接至壳聚糖(9)。当其被转化为粗TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-MP_0.914A时，光谱中未观察到显著的改变。但是，通过特征Si-CH₃峰的缺失和宽O-H峰的出现并且特征TPP峰保持不变，清楚表明了所述材料经最终TBDMS脱保护而得到TPPp_0.1-CS-MP_0.918A(图4E)。

¹H和¹³C(固态)核磁共振谱(NMR)分析

¹H NMR分析：TPP_0.1-CS-MP_0.918A合成中所有中间体和最终产物的¹H NMR谱的叠加的代表性实例显示在图5中。在TBDMS保护之后，材料(DiTBDMS-CS 8)变得完全溶解于CDCl₃中，并且也显示出壳聚糖骨架中每个质子的可明显分辨的峰(图5A)。0.90-0.89(br s)和0.13-0.05(br s)处的峰可以分别指认为(CH₃)₃C-Si和(CH3)₂Si。

DiTBDMS-CS溴乙酰化而得到BrA-DiTBDMS-CS 9以H-2(GluN)峰的低场转移为标志。此外，所有壳聚糖骨架峰H-1～H-6和COCH₂Br峰集中在4.40ppm～3.26ppm处，而TBDMS峰在其位置方面未显示出显著改变(图5B)。

TPPp_0.1-BrA_0.9-DiTBDMS-CS 10A中间体的¹H NMR谱(图5C)确认，TPP部分的特征峰可见于芳香族区域，并且还可以鉴别出在-2.7处的一个峰[图5C中未示出]，该峰通常与游离碱卟啉的核心中的两个吡咯内胺质子相关。另外，可以指认为哌嗪部分的环–CH₂基团的一半的明显的峰之一能够在2.81～2.86(m)ppm处观察到，并且哌嗪的其余环–CH₂基团落在壳聚糖部分的宽区域(3.3ppm～4.5ppm)内。

在TPPp_0.1-DiTBDMS-CS-MP_0.914A的谱图中，观察到1-甲基哌嗪部分的N-CH₃的新峰(图5D)。此阶段未进行纯化，该谱图因此显示出过量的1-甲基哌嗪。

在最终的脱保护步骤之后，获得具有优异水溶性的材料。在最终化合物TPPp_0.1-CS-MP_0.918A的¹H NMR谱中，壳聚糖骨架的所有峰和1-甲基哌嗪峰能够得到清楚的识别；但是不存在可观察到的TPP部分的NMR信号(图5E)。所有脱保护的最终化合物均观察到同样的结果(17A～19B)。在d₆-DMSO中，能够观察到TPP峰，但在该情形中，壳聚糖骨架峰拓宽，并且不可清楚识别。该载体在该溶剂中的溶解性也很差，并且发现最佳结果可能在使用这两种溶剂的混合物下获得(参见后面的讨论)。TPPp_0.1-CS-MP_0.918A具有深红色的颜色，这确认了PS的存在。配分(partitioning)实验显示，高亲脂性PS部分TPP-NH₂和TPP-NH-Pip未配分至两相H₂O/CHCl₃体系的水相中(图6)，而最终的(极性)TPP-CS-TMA和TPP-CS-MP载体是高极性的。它们完全溶解于水相中，并且不配分至有机相中。

固态¹³C NMR分析：最终的载体的碳峰能够在固态NMR中观察到(图7)。葡糖胺的C2-C6碳和COCH₂ 碳在60ppm～80ppm范围中观察到，并且C1峰在约102ppm处得到清晰分辨。115ppm～155ppm之间的峰能被指认为TPP部分的Cmeso(约119)、Cm,p(约128)、C_β(约131)、Co(约138)、Ci(约140)和Cα(约150)，并且这些指认与TPP-NH-Pip 5的溶液态¹³C NMR谱完全相当。羰基(CS-NH-C＝O和TPP-NH-C＝O)出现在160ppm～169ppm。在N-(2-(N,N,N-三甲基铵基)乙酰基)衍生物TPPp_0.25-CS-TMA_0.75(17B)中，能够观察到55.5ppm处的季甲基碳(⁺N(CH₃)₃)的强峰。在N-甲基-哌嗪基衍生物TPPp_0.25-CS-MP_0.75(19B)中，甲基碳(N-CH₃)能够在45ppm处观察到，并且环亚甲基(-CH₂-N)碳在50ppm～55ppm区域中与葡糖胺信号合并。该固态¹³C NMR因此与具有共价连接的PS的载体相一致。

取代度(DS)和转化效率。下表1显示的是最终载体化合物的DS。目的是利用步骤“e”中化合物5与9之间的当量比来控制DS(图3中的方案2)。最终的DS与基于反应中的当量的目标值在2％容限内相符合(0.1或0.25)，并表明了100％的反应效率。此前，已经研究了各种亲脂性部分与壳聚糖的共价连接。这包括：如多柔比星和紫杉醇等药物；如5α-胆甾烷酸(chlolanic acid)、5β-胆甾烷酸、脱氧胆酸和胆固醇等内源性生物分子；和如二氢卟吩e6(Ce6)和原卟啉IX(PpIX)等光敏剂。在大多数情形中，DS显著低于发明人在此关于高亲脂性TPP所报道的DS。此前的研究者也观察到，缀合效率将随取代度增加而显著降低。当前的方法具有下述优点，即，其使用的是高度可溶于有机溶剂的受保护壳聚糖，并因此而能够在温和条件下与亲脂性PS部分高效结合。该反应的优异的可再现性也得到确认，因为两个批次(A和B)中的DS在相同的2％容限内相符合。

表1：TPP改性壳聚糖载体16A～19B的取代度(DS)

*通过¹H NMR确定的DS

对载体自聚集形成纳米颗粒和载体纳米颗粒的去折叠的分析

芳香族卟啉能够形成π-π堆叠体系，其被定义为J(红移)型或H(蓝移)型聚集体。外围取代基能够有助于聚集机理。该聚集能够通过NMR、UV-Vis和荧光光谱观察。因此，关于羧基苯基卟啉(TCPP)聚集体、对磺酸苯基和苯基间位取代的卟啉和三种阳离子卟啉(TOPyP、TMPyP和APP)，已经报道了¹H NMR中峰的极度拓宽和峰的缺失。在亲脂性甲基丙烯酸正丁酯与聚环氧乙烷大单体的分散共聚中，观察到了类似的固定化所致的信号丧失。

在当前的工作中，在最终化合物16A～19B的D₂O溶液的¹H NMR中，芳香族区域中峰的缺失表明了π-π堆叠和疏水性相互作用所致的TPP部分在D₂O中的聚集。代表性TPPp_0.1-CS-TMA_0.916B化合物在DMSO-d₆:D₂O混合物中的NMR研究显示在图8中。在纯D₂O中，TPP部分的峰消失，在DMSO-d₆:D₂O(25:75)混合物中芳香族区域中仅观察到非常弱的峰，而壳聚糖骨架的峰能够被观察到。当将DMSO-d₆含量进一步增加至DMSO-d₆:D₂O(50:50)时，能够观察到宽峰(图8IC)。芳香族峰的相对强度随着该混合物中DMSO-d₆含量增加而增加，并且在几乎纯d₆-DMSO(仅2％D₂O v/v)中，芳香族TPP的峰与H-1和其余壳聚糖骨架的峰以及⁺NMe₃峰一起清晰可见(图8IA)。这也表明，载体在这些条件下完全去折叠。这种解析得到了UV-Vis和荧光研究的进一步支持(图8)。

溶于水中的纳米载体显示出π-π堆叠的光敏剂的宽Soret带，吸收最大值在417nm处(图8II)。当DMSO浓度增加时，该峰逐渐变尖并且略有移动(在100％DMSO中移至420nm)，并且该结构去折叠。

在纯水中，荧光几乎完全淬灭，这也与光敏剂部分的聚集一致。荧光强度显著增加，但随着DMSO含量增加至50％，荧光强度存在急剧增加，观察到其在DMSO浓度达到100％之前进一步逐渐增加(图8III)。

进行了通过扫描电子显微镜方法进一步表征纳米颗粒的尝试。将纳米载体溶液的液滴吸移至硅晶片表面上，并通过SEM使其干燥(图9A、B)。在一些样品中，可以观察到尺寸分布在10nm～200nm的纳米颗粒，无论其是孤立的(图9A)还是聚簇或结晶成树枝状结构(图9B)，这与干燥纳米颗粒悬浮液时通常所观察到的相似。为避免颗粒聚集，尝试了对样品进行旋涂，但在该情形中，观察到无特征的膜和少数颗粒。通过光谱椭偏仪，估计旋涂后的膜厚显著小于10nm。然而，表面上的溶液干燥之后形成的层的最大厚度被测量为100nm的级别。水接触角测量揭示了比较疏水的膜表面，并且该膜的疏水性取决于所涂覆的载体样品的浓度(图9C)。这些结果与涂布时去折叠的动态纳米颗粒一致，并且亲水性聚合物骨架将附着于将疏水性光敏剂部分从颗粒核心暴露出来的极性二氧化硅表面。

通常观察到引起不溶性聚集体形成的纳米颗粒聚集和物理不稳定性。监测了1mg/ml的TPPp_0.25-CS-MP_0.75(17A)水溶液在3个月的时期内的物理稳定性。未观察到该化合物的沉淀。

荧光量子产率

本文中，在DMSO(在419nm激发)中研究了TPP(p-NH₂)₁、TPP-NH-Pip和TPP的壳聚糖衍生物(16A～19B)的荧光量子产率。TPP(p-NH₂)₁的量子产率小于其衍生物TPP-NH-Pip以及TPP-CS-TMA和TPP-CS-MP衍生物的量子产率。这证实了TPP(p-NH₂)₁较之衍生物的高激发态淬灭程度。对于所有载体化合物(16A～19B)，Φ_F几乎相等，只有围绕针对中间体TPP-NH-Pip获得的值±0.004的微小波动。

但是，与一些文献公布的数据相比，TPP(p-NH₂)₁的Φ_F值(0.0002)较小。Bhaumik等(J Org Chem 2009,74:5894)报道其在DMF中在418nm激发时为0.05。他们报道荧光发射最大值在664nm处，这不同于发明人当前发现的650nm。他们使用TPP作为标准物，而发明人使用蒽作为标准物。当前工作中的低Φ_F可能归因于光敏剂的自缔合。下表2显示了TPP改性壳聚糖载体16A～19B的荧光量子产率(Φ_F)。

表2

*所有数据系在室温于DMSO中采集

λ–波长

结论

发明人已经显示，DiTBDMS壳聚糖能够用于带有间四苯基卟啉的壳聚糖基纳米载体的高效合成。这些载体的合成完全可再现，并且该方法可实现对于高亲脂性光敏剂的取代度的精确控制。NMR、荧光和UV-Vis研究与光敏剂部分的自缔合相一致。该载体是极性的，并显示出良好的水溶性和物理稳定性。在DMSO中，光敏剂由自缔合解离，并因此变为荧光性。在水溶液中，该载体将组装成纳米颗粒状结构，阳离子基团和高分子骨架形成外壳，围绕着由聚集的(π-π堆叠)亲脂性TPP部分构成的核。阳离子基团和高分子骨架在液体中具有比较自由的移动，因此能够被NMR观察到。相反，TPP核是半固态，具有非常受限的移动，因此仅能在固态NMR中检测到。该结构与展开的并且荧光形态处于动态平衡，所述形态在DMSO占主导地位，使得可通过NMR检测TPP。当该载体与细胞或胞吞膜接触时，该结构去折叠，并且亲脂性部分插入胞吞膜中，从而实现激发和光敏化，引起PDT和PCI效应。

实施例2.TPC-壳聚糖基纳米载体的合成

在适当情况下，通用材料和方法如关于实施例1所述。

合成

参见用于TPC-NH-Pip合成的图10中的方案3

间四苯基卟啉(1)。通过Journal of Organic Chemistry 1967,32,476中描述的程序制备化合物1(TPP)。

5-(4-氨基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉[TPP(p-NH₂)₁](3)。化合物3

按照Tetrahedron 2004,60,2757中的文献程序制备。

5-(4-氨基苯基)-10,15,20-三苯基二氢卟吩：[TPP(p-NH₂)₁](20)。将化合物3(1.5g，2.38mmol)在N₂气氛和黑暗环境下溶解于吡啶中。添加K₂CO₃(2.96g，21.5mmol)和对甲苯磺酰肼(0.887g，4.77mmol)，并将所获得的反应混合物加热至回流温度。在间隔2、4、6和8小时后添加另外量的对甲苯磺酰肼(0.887g，4.77mmol)。在回流温度继续搅拌24小时。将该反应混合物添加至1:1的EtOAc:H₂O混合物(2:1，900mL)中并回流1小时。在冷却至室温之后，将有机相分离，并用2N HCl(3x 200mL)洗涤，随后用水(2x 100mL)和饱和NaHCO₃水溶液(2x 150mL)洗涤。然后将有机相在Na₂SO₄上方干燥，并在真空中浓缩，提供1.3g粗混合物。粗产物的可见光谱分析显示，其为二氢卟吩(chlorine)和菌绿素的混合物(分别在651和738处的带)。此外，¹H NMR谱的分析显示，不存在残留的痕量卟啉原料。

将由上述反应步骤获得的粗材料(1.3g)(二氢卟吩/菌绿素混合物)溶解于CH₂Cl₂(100mL)中。然后将邻氯苯醌(420mg，2.7mmol)一次性全部添加至在室温搅拌的该有机溶液中，同时通过UV-vis监控反应的进展。在菌绿素的峰(738nm)完全消失后，将该反应混合物立即用5％亚硫酸氢钠水溶液(2x 125mL)洗涤，然后用水(100mL)、5％NaOH(2x 150mL)并且最后用水(150mL)洗涤。然后将有机相在Na₂SO₄上方干燥，并在真空中浓缩，以专门提供作为棕色固体的标题二氢卟吩化合物20(1.2g，80％)。化合物3可以以多于一种异构体存在。

TLC(己烷/CH₂Cl₂3:7):Rf＝0.23,¹H NMR(CDCl₃):δ＝7.86-8.66(m,14H,β-吡咯-H&苯基-Ho),7.63-7.73(m,9H,三苯基-Hm,p),7.00(d,J＝8Hz,2H,NH₂-苯基-Hm),4.14-4.23(m,4H,二氢卟吩β-吡咯-CH₂),3.95(br s,2H,NH₂),-1.38和-1.46(br s,2H,α-吡咯-NH)ppm；MS(ESI):针对C₄₄H₃₄N₅计算的m/z([M+H]⁺)632.2809，测得632.2792；UV-vis(DMSO):λ_max:422,524,553,600,652nm。

中间体TPC-NH-pip(21)的合成。将化合物20(600mg，0.95mmol)在N₂气氛下溶解于CH₂Cl₂(15mL)中并搅拌。添加Et₃N(0.32mL，2.27mmol)，然后在室温逐滴添加氯乙酰氯(0.092mL，1.15mmol)并在室温继续搅拌。2小时后，原位添加过量的哌嗪(0.328g，3.8mmol)，并继续搅拌过夜。将反应混合物用CH₂Cl₂(85mL)稀释，萃取，用水(3x 35mL)、盐水(35mL)洗涤，在Na₂SO₄上方干燥，过滤，并在真空下浓缩。然后将粗产物通过硅胶柱色谱纯化。将所期望的产物在作为洗脱液的MeOH:CH₂Cl₂(8:92)中分离，提供作为棕色固体的标题中间体21(440mg，61％)。

TLC(CH₂Cl₂:MeOH,9:1):R_f＝0.15；¹H NMR(CDCl₃):δ＝9.34,9.39(s,1H,TPC-NH),7.86-8.65(m,16H,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-NHTPC-苯基-Ho,m),7.66-7.73(m,9H,三苯基-Hm,p),4.18-4.19(br s,4H,二氢卟吩β-吡咯-CH₂),3.30(s,2H,ArNHCOCH₂-pip),3.17(br m,4H,哌嗪环-CH₂),2.81(br m,4H,哌嗪环-CH₂),-1.37(br s,2H,α-吡咯-NH)；¹³C NMR(CDCl₃):δ＝168.37,167.48,152.61,143.14,142.22,140.86,139.20,138.32,137.19,136.99,135.33,134.64,133.98,133.01,132.37,132.12,131.96,128.17,127.69,126.81,123.56,123.38,122.79,122.08,119.22,117.94,112.41,111.65,62.63,53.50,45.59,35.90ppm；UV-vis(DMSO):λ_max:421,521,549,598,651nm。

参见图11中的方案4

叔丁基哌嗪-1-羧酸酯(22)的合成。将哌嗪(6g，69.6mmol)溶解于CH₂Cl₂(120mL)中。将该溶液冷却至0℃，并逐滴添加Boc₂O(7.6g，34.8mmol)的CH₂Cl₂(80mL)溶液。使该反应混合物升至室温，并继续搅拌24小时。将沉淀物滤除并用CH₂Cl₂(2x 20mL)洗涤，将合并的滤液用水(3x 40mL)、盐水(30mL)分离和洗涤，并在Na₂SO₄上方干燥和在真空中浓缩，提供作为白色固体的标题化合物22(6.5g，50％)。

熔点44℃-46℃(文献熔点46℃-47℃)；¹H NMR(CDCl3):δ＝3.32(t,J＝4Hz,4H),2.74(t,J＝4Hz,4H),1.39(s,9H)；¹³C NMR(CDCl₃):δ＝154.85,80.00,79.52,45.96,44.45,28.45ppm；MS(ESI):对C₉H₁₉N₂O₂的计算m/z([M+H]⁺)187.1441，测得187.1412。

对(甲氧基羰基)苯甲醛(23)的合成。将4-羧基苯甲醛(4g，26.6mmol)在N₂下悬浮于60mL无水MeOH中并搅拌。将该反应混合物冷却至0℃并逐滴添加乙酰氯(9.5mL，133mmol)。将该反应混合物在室温搅拌12小时。在真空中除去MeOH，并将该粗混合物用EtOAc(120mL)稀释。将有机相用1N NaOH水溶液(5x 30mL)和盐水(2x 25mL)洗涤，并在Na₂SO₄上方干燥，过滤并在真空中浓缩。然后通过使用EtOAc和石油醚使粗固体再结晶，提供作为白色固体的酯23(3.8g，87％)。

TLC(己烷:CH₂Cl_2,3:7):R_f＝0.36；熔点:61℃-63℃(文献熔点59℃-64℃)；¹H NMR(CDCl₃):δ＝10.06(s,1H,CHO),8.15(d,J＝8.4Hz,2H),7.91(d,J＝8.4Hz,2H),3.92(s,3H)ppm；¹³C NMR(CDCl₃):δ＝191.66,166.07,139.21,135.13,130.23,129.55,52.62ppm。

5-(4-甲氧基羰基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉TPP(p-CO₂Me)₁(24)的合成。按照文献方法(J.Am.Chem.Soc.2008,130,4236-4237)。

5-(4-羰基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉TPP(p-CO₂H)₁(25)的合成

将化合物24(1.2g，1.78mmol)溶解于THF:吡啶混合物(10:1，100mL)中。添加2NKOH甲醇溶液(120mL)，并将反应混合物回流24小时。然后将该反应混合物冷却至室温，并用饱和柠檬酸水溶液中和。之后，将该反应混合物在真空中浓缩，直至MeOH和THF的去除完成。然后将该粗混合物用CH₂Cl₂(150mL)和水(120mL)稀释，并用CH₂Cl₂(3x 50mL)萃取水相。将合并的有机相用水(2x 40mL)和盐水(35mL)洗涤，在Na₂SO₄上方干燥，并在真空中浓缩。将粗混合物通过使用MeOH:CH₂Cl₂(100:0～96:4，作为洗脱液)的硅胶柱色谱纯化，提供作为紫色固体的标题酸25(0.83mg，71％)。

TLC(CH₂Cl₂:MeOH 95:5):R_f＝0.54；¹H NMR(DMSO-d₆):δ＝8.84(br s,8H,β-吡咯-H),8.33-8.39(m,4H,R-COTPP-苯基-Ho,m),8.21-8.23(m,6H,三苯基-Ho),7.81-7.88(m,9H,三苯基-Hm,p),-2.92(s,2H,NH)ppm；MS(ESI):对C₄₅H₃₁N₄O₂的计算m/z([M+H]⁺)659.2442，测得659.2420。

5-(4-羰基苯基)-10,15,20-三苯基二氢卟吩TPC(p-CO₂H)₁(26)的合成

将化合物25(600mg，0.9mmol)和无水K₂CO₃(1.13g，8.2mmol)在N₂气氛和黑暗环境下溶解于吡啶(42mL)中。然后添加甲苯-4-磺酰肼(340mg，1.8mmol)，并将该混合物在回流温度下搅拌。在间隔2、4、6、8和10小时反应后，添加另外量的甲苯-4-磺酰肼(340mg，1.8mmol)的3mL吡啶溶液。在回流温度继续该搅拌24小时。冷却至室温后，添加EtOAc(500mL)和去离子H₂O(250mL)，并再次回流该反应混合物1小时。在冷却至室温后，将有机相分离并先用2N HCl(2x 150mL)再用水(2x150mL)洗涤，在Na₂SO₄上方干燥并在真空中浓缩，提供565mg粗混合物。粗产物的可见光谱分析显示，其为二氢卟吩和菌绿素的混合物(分别在651和738处的带)。此外，¹H NMR谱的分析显示，不存在残留的痕量卟啉原料。

将由以上反应步骤获得的粗材料(二氢卟吩/菌绿素混合物，565mg)完全溶解于CH₂Cl₂:MeOH(75:25)混合物中。然后将邻氯苯醌(180mg，0.7mmol)一次性全部添加至在室温搅拌的有机溶液中，并同时通过UV-Vis监测该反应的进展。在菌绿素的吸收峰(738nm)消失之后，立即将有机相用5％亚硫酸氢钠水溶液(2x 150mL)洗涤，随后先用水(100mL)、再用5％NaOH水溶液(2x 150mL)并且最后用水(120mL)洗涤。如果观察到乳液，则将该有机相用饱和柠檬酸水溶液洗涤。将有机相在Na₂SO₄上方干燥，过滤，并在真空中浓缩，以专门提供作为棕色固体的标题二氢卟吩化合物26(420mg，70％)。化合物9以多于一种异构体存在。

TLC(CH₂Cl₂:MeOH,95:5):R_f＝0.54,¹H NMR(DMSO-d₆):δ＝7.91-8.58(m,16H,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-COTPC-苯基-Ho,m),7.68-7.77(m,9H,三苯基-Hm,p),4.12-4.13(m,4H,二氢卟吩β-吡咯-CH₂),-1.53和-1.60(2brs,2H,α-吡咯-NH)；¹H NMR(CDCl₃):δ＝7.87-8.60(m,16H,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-COTPC-苯基-Ho,m),7.64-7.74(m,9H,三苯基-Hm,p),4.16-4.18(m,4H,二氢卟吩β-吡咯-CH₂),-1.39和-1.49(2br s,2H,α-吡咯-NH)ppm；MS(ESI)对C₄₅H₃₃N₄O₂计算的([M+H]⁺)661.2598，测得661.2566；UV-vis(DMSO):λ_max:420,520,547,599,651nm。

中间体叔丁基N-[哌嗪-1-羧酸酯]-5-(4-羧基苯基)-10,15,20-三苯基二氢卟吩(27)的合成。将二氢卟吩化合物26(500mg，0.76mmol)和叔丁基哌嗪-1-羧酸酯22(155mg，0.83mmol)在N₂气氛和黑暗环境下溶解于DMF(4mL)中。向该反应混合物添加EDCI-HCl(174mg，0.91mmol)和HOBT(123mg，0.91mmol)，然后在室温添加Et₃N(0.26mL，1.82mmol)。然后将该反应混合物在室温搅拌过夜，之后其被缓缓注入搅拌下的水(100mL)中。将固体材料滤除，用充足的水洗涤，并充分干燥。将粗产物通过硅胶柱色谱纯化(CH₂Cl₂:MeOH 100:0～99:1)，提供作为棕色固体的标题酰胺化合物27(340mg，54％)。

TLC(CH₂Cl₂:MeOH 99:1):Rf＝0.74；¹H NMR(CDCl₃):δ＝7.74-8.59(m,16H,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-COTPC-苯基-Ho,m),7.65-7.72(m,9H,三苯基-Hm,p),4.16-4.17(m,4H,二氢卟吩β-吡咯-CH₂),3.78-3.86(br m,4H,哌嗪环-CH₂),3.63(br m,4H,哌嗪环-CH₂),1.53(s,9H,boc-(CH₃)₃),-1.39和-1.47(2brs,2H,α-吡咯-NH)ppm。

中间体TPC-CO-pip(28)的合成。将化合物27(320mg，0.39mmol)在N₂气氛和黑暗环境下溶解于CH₂Cl₂(8mL)中。添加CH₂Cl₂:TFA(1:1，4mL)并在室温搅拌1小时。将该反应混合物用CH₂Cl₂(40mL)稀释，并用水(2x 15mL)、饱和NaHCO₃水溶液(2x 15mL)和盐水(15mL)洗涤。将有机层在Na₂SO₄上方干燥并在真空中浓缩。然后将粗产物通过硅胶柱色谱纯化(CH₂Cl₂:MeOH 100:0～92:8，作为洗脱液)，提供作为棕色固体的标题中间体28(250mg，89％)。

TLC(CH₂Cl₂:MeOH,9:1):R_f＝0.35,¹H NMR(CDCl₃):δ＝7.74-8.59(m,16H,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-COTPC-苯基-Ho,m),7.64-7.72(m,9H,三苯基-Hm,p),4.16-4.17(m,4H,二氢卟吩β-吡咯-CH₂),3.73-3.90(br m,4H,哌嗪环-CH₂),3.04(br m,4H,哌嗪环-CH₂),-1.40和-1.47(2brs,2H,α-吡咯-NH)ppm；MS(ESI)对C₄₉H₄₂N₆O计算的([M+2H]⁺/2)365.1705，测得365.1707；UV-vis(DMSO):λ_max:420,520,546,599,651nm。

壳聚糖甲磺酸盐(7)。根据发明人之前公布的程序合成(CarbohydratePolymers2010,81:140-144)。

N-溴乙酰基-3,6-O-DiTBDMS-CS(BrA-DiTBDMS-CS,9)。将DiTBDMS-CS 8(1g，2.60mmol)在N₂气氛下溶解于圆底烧瓶中的无水CH₂Cl₂(15mL)中。利用冰/盐混合物将该反应混合物冷却至–20℃。添加Et₃N(1.81mL，13mmol)，然后缓缓逐滴添加溴乙酰溴(0.91mL，10mmol)。继续搅拌1小时。将该反应混合物用CH₂Cl₂稀释，并在真空中浓缩。将粗产物在乙腈中搅拌，过滤，并用新制乙腈洗涤。将该干燥的材料溶解并萃取在CH₂Cl₂中，用水和盐水洗涤，在Na₂SO₄上方干燥，并在真空中浓缩，提供作为浅黄色粉末固体的标题溴化合物26(1.2g，92％)。

FT-IR(KBr):ν3402(br,NH),2957,2931,2886,2858(s,C–H TBDMS),1682(vs,C＝O酰胺I),1530(vs,C＝O酰胺II),1473,1391,1362,1311,1259,1101,1005,837,777(Si-C),669cm^-1；¹H NMR(CDCl₃)δppm:4.40(br s,H-1),4.02-3.26(m,H-2GlcN,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6’和2H GluNH-C＝OCH₂ Br),0.90和0.88(br s,(CH₃)₃C-Si),0.13和0.07(br s,(CH₃)₂Si)ppm。

参见图13中的方案6A

中间体29的合成

(N-TPC-NH-Pip-乙酰基)_0.1-(N-溴乙酰基)_0.9-DiTBDMS-CS(TPC_NP0.1-BrA_0.9-DiTBDMS-CS,29)。将化合物9(800mg，1.58mmol)和化合物TPC-NH-Pip 21(120mg，0.158mmol)在N₂气氛和黑暗环境下溶解于CH₂Cl₂(25mL)中。相对于21添加精确等摩尔量的Et₃N(22μL，0.158mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌24小时。原料的完全消耗通过TLC确认。将该反应混合物用CH₂Cl₂(55mL)稀释，并用水(2x 25mL)和盐水(25mL)洗涤。将有机相在Na₂SO₄上方干燥，在真空中浓缩，提供化合物29(700mg，78％)。

¹H NMR(CDCl₃):δ＝9.21,9.25(s,TPCNHCO),7.86-8.60(m,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-NHTPC-苯基-Ho,m),7.65-7.73(m,三苯基-Hm,p),3.35-4.50[br m,壳聚糖(H-1,H-2GlcN,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6’和2H GluNH-C＝O,CH₂CONGlc),TPCNHCOCH₂-pip,哌嗪环-CH₂和二氢卟吩β-吡咯-CH₂],2.77-2.83(m,哌嗪环-CH₂),0.88-0.89[br s,(CH₃)₃C-Si],0.02-0.13[(br m,(CH₃)₂Si],-1.44(br s,2H,α-吡咯-NH)ppm。

参见图13中的方案6B

中间体34的合成

(N-TPC-CO-Pip-乙酰基)_0.1-(N-溴乙酰基)_0.9-DiTBDMS-CS(TPC_CP0.1-BrA_0.9-DiTBDMS-CS,34)。将化合物9(800mg，1.58mmol)在N₂气氛和黑暗环境下溶解NMP(25mL)中。在室温添加TPC-CO-Pip 28(125mg，0.173mmol)和NaHCO₃(0.29g，3.45mmol)。然后将该反应混合物在75℃加热，并搅拌过夜，之后将其冷却并注入搅拌的水中。将固体滤除，用充足的水洗涤，并抽气干燥。然后将所获得的固体溶解于CH₂Cl₂中，过滤并在Na₂SO₄上方干燥，并在真空中除去溶剂，提供作为棕色固体的化合物34(810mg，89％)。

¹H NMR(CDCl₃):δ＝7.75-8.60(m,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-COTPC-苯基-Ho,m),7.64-7.71(m,三苯基-Hm,p),3.38-4.5[br m,壳聚糖(H-1,H-2GlcN,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6’和2HGluNH-C＝O,CH₂CONGlc),哌嗪环-CH₂和二氢卟吩β-吡咯-CH₂],2.76-2.84(m,哌嗪环-CH₂),0.89-0.92[br s,(CH₃)₃C-Si],0.02-0.10[(br m,(CH₃)₂Si)],-1.40和-1.48(br s,α-吡咯-NH)ppm。

用于化合物30和35的通用程序A

(N-TPC-NH-Pip-乙酰基)_0.1-(N-(N,N,N-三甲基铵基)乙酰基)_0.9-DiTBDMS-CS(TPC_NP0.1-DiTBDMS-CS-TMA_0.9,30)。将化合物29(350mg，0.61mmol)在N₂气氛和黑暗环境下溶解于CH₂Cl₂(15mL)中。添加过量的三甲胺溶液，并将该反应混合物在室温搅拌24小时。在真空中除去溶剂。将粗产物在高真空下完全干燥，获得作为棕色固体的粗产物30(355mg，94％)。将该粗化合物以原样用于下一步骤。

(N-TPC-CO-Pip-乙酰基)_0.1-(N-(N,N,N-三甲基铵基)乙酰基)_0.9-DiTBDMS-CS(TPC_CP0.1-DiTBDMS-CS-TMA_0.9,35)。使用34(350mg，0.61mol)和三甲胺溶液执行通用程序A，提供作为粗固体的35(360mg，94％)。将该粗化合物以原样用于下一步骤。

用于化合物31和36的通用程序B

(N-TPC-NH-Pip-乙酰基)_0.1-(N-(N-甲基哌嗪基)乙酰基)_0.9-DiTBDMS-CS(TPC_NP0.1-DiTBDMS-CS-MP_0.9,31)。将化合物29(350mg，0.61mmol)在N₂气氛和黑暗环境下溶解于CH₂Cl₂(15mL)中。添加过量的1-甲基哌嗪，并将该反应混合物在室温搅拌24小时。在真空中除去溶剂。然后将该粗产物在高真空下完全干燥，获得相应粗产物31(330，89％)。将该粗化合物以原样用于下一步骤。

(N-TPC-CO-Pip-乙酰基)_0.1-(N-(N-甲基哌嗪基)乙酰基)_0.9-DiTBDMS-CS(TPC_CP0.1-DiTBDMS-CS-MP_0.9,36)。使用34(250mg，0.38mol)和1-甲基哌嗪执行通用程序B，提供作为粗固体的36(265mg，93％)。将该粗化合物以原样用于下一步骤。

最终产物(32、33、37和38)的合成

最终产物通过以下通用程序C获得：将化合物(30/31/35/36)在N₂气氛和黑暗环境下溶解于MeOH中。通过用N₂吹扫5分钟将该反应混合物脱气，随后冷却至0℃，然后添加4mL浓HCl。使该反应混合物升至室温，并搅拌12小时，然后将其在真空中完全浓缩。将粗残余物在N₂气氛和黑暗环境下再次溶解于MeOH中并脱气。将该反应混合物冷却至0℃，然后添加2mL浓HCl。使该反应混合物升至室温，并搅拌12小时。然后通过添加5％NaCl水溶液对该反应混合物稀释并离子交换1小时，之后将其对于8％NaCl水溶液透析24小时，然后对去离子水透析3天。之后将该清洁的棕色溶液冷冻干燥过夜，提供作为棕色松软材料的最终产物(分别是32/33/37/38)。

TPC_NP0.1-CS-TMA_0.90(32)。使用30(325mg，0.52mmol)和浓HCl/MeOH执行通用程序C，提供作为棕色固体的32(175mg，85％)。

¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 98:2):δ＝7.83-8.62(m,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-NHTPC-苯基-Ho,m),7.69-7.77(m,三苯基-Hm,p),4.52(br s,H-1),4.11-4.14(m,-CH₂CONGlc和二氢卟吩β-吡咯-CH₂),3.26-3.67(br m,与HDO峰部分重叠,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′,2H GluNH-C＝O,TPCNHCOCH₂-pip,哌嗪环-CH₂]3.24(s,⁺N(CH₃)₃))ppm；UV-vis(DMSO):λ_max:421,520,549,599,651nm。

TPC_NP0.1-CS-MP_0.90(33)。使用31(300mg，0.45mmol)和浓HCl/MeOH执行通用程序C，提供作为棕色固体的33(165mg，84％)。

¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 98:2):δ＝7.83-8.62(m,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-NHTPC-苯基-Ho,m),7.66-7.75(m,三苯基-Hm,p),4.50(br s,H-1),4.10-4.14(m,二氢卟吩β-吡咯-CH₂),2.92-3.55(m,与HDO峰部分重叠,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′,2H GluNH-C＝O,CH₂CONGlc,TPCNHCOCH₂-pip),2.33-2.63(m,与DMSO-d6峰部分重叠,哌嗪环-CH₂,哌嗪-N-CH₃)ppm；UV-vis(H₂O):λ_max:412,430,531,560,611,664nm；UV-vis(DMSO):λ_max:421,521,548,596,651nm。

TPC_CP0.1-CS-TMA_0.90(37)

使用35(300mg，0.48mmol)和浓HCl/MeOH执行通用程序C，提供作为棕色固体的37(170mg，89％)。

FT-IR(KBr):ν3353,3061,2950,1683,1580,1473,1440,1376,1291,1154,1112,1067,1032,970,911,794,703cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 98:2):δ＝7.89-8.62(m,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-COTPC-苯基-Ho,m),7.67-7.76(m,三苯基-Hm,p),4.50(br s,H-1),4.06-4.16(m,CH₂CONGlc和二氢卟吩β-吡咯-CH₂),3.26-3.75(m,与HDO峰部分重叠,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′,2H GluNH-C＝O,哌嗪环-CH₂),3.24(s,⁺N(CH₃)₃))ppm；UV-vis(DMSO):λ_max:420,520,547,599,651nm。

TPC_CP0.1-CS-MP_0.90(38)。使用36(240mg，0.38mmol)和浓HCl/MeOH执行通用程序C，提供作为棕色固体的38(85mg，52％)。

FT-IR(KBr):ν3349,2927,1644,1580,1461,1440,1374,1285,1070,1043,985,945,794719,703cm^-1；¹H NMR(DMSO-d₆:D₂O 98:2):δ＝7.86-8.63(m,β-吡咯-H,苯基-Ho&R-COTPC-苯基-Ho,m),7.67-7.76(m,三苯基-Hm,p),4.50(br s,H-1),4.08-4.14(m,二氢卟吩β-吡咯-CH₂),2.92-3.55(m,与HDO峰部分重叠,H-2GlcNAc,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6′,2HGluNH-C＝O,CH₂CONGlc)2.27-2.63(m,与DMSO-d6峰部分重叠,哌嗪环-CH₂,哌嗪-N-CH₃)ppm；UV-vis(DMSO):λ_max:421,520,547,599,651nm。

化合物32、33、37和38的TPP类似物

当将以下通用TBDMS脱保护程序D用于最终化合物32、33、37和38时观察到出乎意料的结果(TPC化合物由TBAF/NMP返氧化为TPP化合物)。

实例：化合物32(TPP_NP0.1-CS-TMA_0.9)的TPP类似物：将材料30(600mg，0.86mmol)溶解于N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(5mL～10mL)中，随后添加过量的四正丁基氟化铵(TBAF)。将该反应混合物在55℃搅拌24小时，并冷却以及用稀HCl酸化，并搅拌30分钟，然后对于8％NaCl(w/v)的去离子水溶液透析2天，并对于去离子水透析3天。在此期间，溶液颜色由灰色逐渐变为红色。然后将该红色溶液冷冻干燥，获得棕色海绵状材料。将该材料再次脱保护，离子交换，透析和冷冻干燥。然而，令人惊讶的是，由于返氧化，该化合物转化回至其TPP类似物，这通过UV-Vis得到确认(因为在650处的特征峰几乎完全消失)(数据未显示)。

结果

下表3显示的是最终载体化合物的DS。表4显示的是TPC改性壳聚糖载体的荧光量子产率(Φ_F)。图14显示的是TPC-CO-Pip(28)的1H NMR谱–两种异构体都被显示。图15～17分别显示的是化合物21、29和34的等效谱。图18显示的是最终载体化合物37、38、32和33在d₆-DMSO/D₂O中的NMR谱。

表3

*DS通过中间体29的¹H NMR确定

**DS通过中间体34的¹H NMR确定

表4

*所有数据系在室温于DMSO中采集

λ–波长

实施例3.体内和体外研究

材料

HCT116/LUC人结肠癌细胞株(用基因编码荧光素酶永久转染)由MohammedAmarzguioui博士(siRNAsense,Oslo,Norway)友情提供。MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四唑)来自Sigma-Aldrich(MO,USA；cat.no.M 2128)，其溶解在PBS中达到5mg/ml的浓度，并无菌过滤并在4℃储存。质粒pEGFP-N1购自Clontech Laboratories Inc.(CA,美国；目录号6085-1)，其由ELIM Biopharmaceuticals,Inc.(CA,美国)(lot#1002)制造，并以2mg/ml的浓度在无菌水中交付。将该储液等分，并在-20℃保存。聚-L-赖氨酸HBr(MW 15000-30000)来自Sigma-Aldrich(MO,美国；目录号P7890)。将聚-L-赖氨酸HBr溶解并稀释于蒸馏水中，通过过滤和在-20℃存储杀菌。

体外研究

细胞培养

在潮湿环境中于37℃和5％CO₂下，将HCT116/LUC在补充有10％胎牛血清(PAALaboratories GmbH,Pasching,澳大利亚)100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Sigma-Aldrich,MO,美国)的DMEM培养基(Lonza,Veviers,比利时)中培养。

细胞的处理

将HCT116/LUC细胞(1.5×10⁵个细胞/孔用于转染测量，3.75×10⁵个细胞/孔用于MTT检测)接种至6孔(转染)板和24孔(MTT)板(Nunc,Roskilde,丹麦)中，并温育24小时(5％CO₂，37℃)。然后将光敏剂TPCS_2a或壳聚糖缀合物(16A、16B、17A、19A、37、38、32或33)添加至细胞中，并将细胞温育18小时(5％CO₂，37℃)。然后将该细胞用细胞培养基洗涤三次，并在含有该质粒复合体的培养基中温育4小时(5％CO₂，37℃)。然后洗涤该细胞一次。在添加新制培养基后，用不同的光剂量对该细胞进行光照。温育48小时后，通过流式细胞仪分析EGFP(增强型绿色荧光蛋白)的表达。细胞存活率通过平行试验中的MTT检测测量。将该细胞暴露于(PCI Biotech,Oslo,挪威)的光下。被交付具有一排4个灯管(4x 18W Osram L18/67,Blue)，其主要发射峰值波长在420nm～435nm区域中的蓝光。

质粒/聚-L-赖氨酸复合体的制备

电荷比为2.2的质粒/聚-L-赖氨酸复合体通过将质粒DNA与聚-L-赖氨酸溶液温和混合而形成。将2.5μl DNA(储液2μg/μl)用47.5μl水稀释，并将6.92μl聚-L-赖氨酸(1μg/μl)用43.08μl水稀释。混合后，将该溶液在室温温育30分钟，然后用培养基稀释至最终体积为1ml，并将其添加至细胞中(1ml/孔)。

转染的测量

将该细胞在100μl胰蛋白酶(Trypsin-EDTA,Sigma-Aldrich,MO,USA)中胰蛋白酶消化，再悬浮于500μl细胞培养基中，并通过5ml具有细胞滤网盖(BD Falcon)(50μm目尼龙过滤器)的聚苯乙烯圆底烧试管过滤，之后在BD LSR流式细胞仪(Becton Dickinson,CA,USA)中分析。在488nm激发后通过425nm～475nm过滤器测量EGFP，在561nm激发后通过600nm～620nm过滤器测量碘化丙啶(Calbiochem Corporation,CA,美国)。碘化丙啶(1μg/ml)用于将死细胞与活细胞区分，并且进行脉冲处理以将细胞对(cell doublets)与单一细胞区分。对于每一样品采集10000次事件，并用BD FACSDiva软件(Becton Dickinson,CA,美国)分析数据。

细胞存活率的测量

细胞存活率通过下述方法测量，所述方法基于通过存在于活的、代谢活性细胞中的线粒体脱氢酶将水溶性四唑盐还原为紫色、不溶性甲臜(formazan)产物。将0.5ml含有0.125mg MTT的培养基添加至细胞中，随后在37℃、5％CO₂下温育2小时。通过添加500μlDMSO(Sigma-Aldrich,MO,USA)/孔将所获得的甲臜晶体溶解。将该板用PowerWave XS2微孔板分光光度计(BioTek Instruments,VT,USA)读取。细胞存活率被计算为对照组的百分比(无光照的平行实验)。

体内研究

动物。Hsd:无胸腺裸-Foxn1^nu雌性小鼠在挪威Radium医院动物部门饲养。将该小鼠保持在特定的无病原体条件下。水和食物无限制地提供。涉及小鼠的所有程序均按照挪威Radium医院动物保护委员会在国家伦理委员会关于动物福利的指南下审批的方案进行。

用于实验中时小鼠为22g～25g(5～8周龄)。转染之前HCT116/LUC细胞在潮湿环境中于37℃和5％CO₂下培养。将1.5×10⁶个细胞皮下注射至每只小鼠的右臀部。通过测量两个垂直的直径每周测量肿瘤大小二或三次。肿瘤体积利用下式计算：

V＝(W²x L)/2

其中W为所测量的肿瘤的宽径并且L为长径。

治疗

将壳聚糖稀释成1.25mg/ml TPC的PBS溶液(化合物37)和1.25mg/ml TPC的3％Tween 80溶液(化合物38和33)。当肿瘤体积已达到60mm³～100mm³时，在尾部静脉中静脉注射88μl～100μl(最终剂量5m/kg)。将TPCS_2a在3％Tween 80中稀释至1.25mg/ml，并当肿瘤体积已达到60mm³～100mm³时，在尾部静脉中静脉注射88μl～100μl(最终剂量5m/kg)。注射光敏剂96小时后，用652nm二极管激光器(Ceramoptec GmbH,Bonn,德国)以90mW/cm²的照度和15J/cm²的光剂量对肿瘤进行光照。对于接受PCI+博莱霉素治疗的动物，腹腔内注射100μl的1500IU博莱霉素(欧洲单位)。在BLM注射后，用652nm二极管激光器(Ceramoptec GmbH,Bonn,德国)以90mW/cm²的照度对肿瘤光照30分钟。用铝箔覆盖动物除肿瘤区外的部分，其中将箔的孔制成直径比肿瘤区大2mm。

体内成像系统

利用来自美国马萨诸塞州的Caliper Life Sciences的IVIS Lumina 100Series测量生物发光。将动物麻醉(Zoletil)并腹腔内注射200μl D-荧光素(Caliper LifeSciences)(20mg/ml的PBS溶液)。在D-荧光素注射10分钟后进行影像拍摄。从PS注射11天后起，大约每周测量一次生物发光。当肿瘤体积达到>1000mm³时或者当该动物显示出疼痛或反常行为的征兆时，将该动物处死。

利用Living Image 4.2软件(Caliper Life Sciences)分析数据。

在下述实验中检测TPP-壳聚糖缀合物16A和16B的生物效应，其中将缀合物用作光化学内化中的光敏化剂，以增强基因传递。实验细节描述于“实验和方法”下面。如图19((a)和(b))中可以看到的，缀合物16A和16B是优异的PCI用光敏剂，体现在低光剂量下观察到转染的充分增强。该效应相对于利用专门设计用于PCI的光敏剂TPCS_2a获得的效应而言得到增强，后者正处于用于癌症治疗的临床开发之中(Berg等，2011，见上)。因此，即使采用较高的光剂量，利用TPCS_2a也未实现相似的转染水平(图19(e))。

利用TPP-壳聚糖17A和19A进行了相似的实验(图19(c)和(d))。可以看到，这些缀合物比16A和16B更为强力。因此，与TPCS_2a相比，它们具有至少10倍的活性，体现在即使以低10倍的浓度使用，这些缀合物仍提供了显著高于利用TPCS_2a时所观察到的转染增强。这是十分令人惊讶的，因为人们曾经预料，壳聚糖缀合物中敏化剂分子附近将导致光敏化效应的淬灭，使所述缀合物与不受到这种淬灭效应的游离敏化剂分子相比效果较差。因此，光敏剂-壳聚糖缀合物与胞吞膜可能以某种未知的方式相互作用，所述方式使其特别适合用于PCI及相关方法。

如可从图20中看到的，利用TPC-壳聚糖缀合物(化合物37、38、32和33)获得了相似的结果，与TPP-缀合物相比，其具有下述优点：用红光光照也能使其活化，从而在体内使用时可实现更佳的组织穿透。这在较大病灶(例如，较大的肿瘤)的体内治疗中是一个重要特征，但在仅希望具有浅层光化学效果的情形(例如其中所期望的效果在于皮肤上层的疫苗接种方法)中是不利的。

如可从图21中看到的，利用化合物54也获得了相似的结果，表明含有PEG的缀合物在诱导PCI效应方面也是有效的。

TPC-缀合物也已在体内实验中进行了探索，所述实验研究了缀合物在基于PDT和PCI的治疗方法中是否起作用。图22显示的是受光照的单独使用缀合物38和33或者使用缀合物38和33和细胞毒性抗癌剂博莱霉素治疗的荷瘤小鼠的照片(具体内容参见“材料和方法”)。未治疗的动物和注射有TPCS_2a+博莱霉素的动物用作对照组。所使用的癌细胞被永久转染以表达荧光素酶，使得肿瘤的范围可以在注射荧光素后通过生物发光的成像来监控。如图22所示，在注射光敏剂11和15天后(光照7天和11天后)，未治疗的对照组和TPCS_2a+博莱霉素动物(分别是8和7)表现出强荧光性，表明肿瘤中存在大量活的癌细胞。在这些动物中，15天后肿瘤已经生长得大到必须出于人道而将这些动物杀死的地步。相反，对于使用壳聚糖缀合物治疗的动物，在第11天只有一只动物(动物3)有仅微弱的荧光性，表明纯光化学治疗(单独的PCI，类似于PDT治疗)和PCI+博莱霉素组合治疗均显著地减少了肿瘤细胞中的癌细胞量。在使用单独的PCI治疗的动物(动物3和5)中可以看到，荧光性在第15至20天增加，表明单独的PCI光化学治疗不足以杀伤所有肿瘤细胞。相反，使用PCI+博莱霉素治疗的动物(动物4和6)，显示出即使在第20天也基本上没有荧光性，显示出该组合明显比单独的PCI更为有效，这表明该壳聚糖缀合物诱导了强光化学内化作用；并且远强于正处于用于癌症治疗的临床开发中的光敏剂TPCS_2a所诱导的光化学内化作用。

在图23中，显示的是被治疗动物的肿瘤生长的曲线(也包括化合物37壳聚糖缀合物)，其确证了图22中的成像结果，并显示出在使用化合物38+博莱霉素或者化合物33+博莱霉素治疗的动物中，肿瘤似乎被彻底消除。这些结果再次表明，壳聚糖缀合物是远比TPCS_2a(其与博莱霉素的组合对于该实验中的肿瘤生长没有效果)更为有效的PCI用试剂。此外，可以看到，将博莱霉素添加至治疗方案显著改善了所测试的所有三种壳聚糖缀合物的疗效(与单独的光化学治疗相比)，表明了这些缀合物对于强光化学内化作用的诱导。这一增强的疗效是十分令人惊讶的，因为设计光敏剂-高分子缀合物的主要原因是基于所谓的EPR效应而获得更佳的治疗选择性。然而，应当预期的是，该有可能增强的选择性将带来的是低疗效，因为缀合物的大分子量导致比小分子光敏剂低得多的通过组织的扩散，并由此导致肿瘤细胞中敏化剂的较低浓度，以及在将该敏化剂递送至肿瘤中所有细胞方面的困难。而利用本发明中所述的壳聚糖缀合物，显然不是这样的情况。

实施例4

在适当情况下，通用材料和方法如关于实施例1所述。

参见图24中的方案7

三乙二醇单甲醚甲苯磺酸酯(40)的合成

(也称作2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯)

将三乙二醇单甲醚39(4.87mL，30.43mmol)溶解于THF(25mL)中。添加氢氧化钾(3.7g，65.95mmol)水溶液(25mL)，并将所获得的混合物冷却至0℃。然后，在30分钟的时间段内，通过滴液漏斗逐滴添加溶解于THF(50mL)中的对甲苯酰氯(6.86g，48.77mmol)。将该反应混合物在0℃再搅拌2小时，然后在室温搅拌过夜。将该反应混合物在真空中浓缩，以除去THF，之后用EtOAc(40mL)和水(30mL)稀释，并用EtOAc(2x 75mL)萃取。将合并的有机相在Na₂SO₄上方干燥，过滤，并在真空中浓缩，提供作为灰色混浊油状材料的化合物40(7.13g)。

FT-IR:2878,1598,1453,1356,1177,1097cm^-1；¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.80(d,J＝8Hz,2H),7.34(d,J＝8Hz,2H),4.16(t,2H,CH₂ OTs),3.67-3.70(m,2H,-CH₂ -CH₂OTs),3.58-3.62(m,6H,TEG OCH₂ _′s),3.37(s,3H,OCH₃ ),2.44(s,3H,Ar-CH₃ )ppm；¹³C NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝144.91,133.19,129.94,128.12,72.05,70.90,70.71,69.36,68.83,59.17,21.78ppm。

(三乙二醇单乙醚甲苯磺酸酯)(42)(也称作2-(2-(2-乙氧基乙氧基)乙氧基)乙基 4-甲基苯磺酸酯)的合成

将三乙二醇单乙醚41(4.9mL，28.1mmol)溶解于THF(30mL)中。添加氢氧化钾(3.7g，65.95mmol)水溶液。然后将该反应混合物冷却至0℃。然后，在30分钟的时间段内，通过滴液漏斗逐滴添加溶解于THF(50mL)中的对甲苯酰氯(6.86g，48.77mmol)。将该反应混合物在0℃再搅拌2小时，然后在室温搅拌过夜。将该反应混合物在真空中浓缩以除去THF，之后用EtOAc(40mL)和水(30mL)稀释，并用EtOAc(2x 75mL)萃取。将合并的有机相在Na₂SO₄上方干燥，过滤，并在真空中浓缩，提供作为灰色混浊油状材料的化合物42(6.83g)。

FT-IR:2870,2975,1598,1453,1358,1177,1110cm^-1；¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.77(d,J＝8Hz,2H),7.31(d,J＝8Hz,2H),4.13(t,2H,CH₂ OTs),3.64-3.67(m,2H,-CH₂ CH₂OTs),3.52-3.59(m,8H,TEG OCH₂ _′s),3.49(q,J＝8Hz,2H,-OCH₂ CH₃),2.42(s,3H,Ar-CH₃ ),1.17(t,J＝8Hz,3H,-OCH₂ CH₃ )ppm。

甲氧基聚乙二醇甲苯磺酸酯(44)的合成

将聚乙二醇单甲醚43(5g，14.29mmol，平均MW：350Da)溶解于THF(50mL)中。添加氢氧化钾(1.76g，31.44mmol)水溶液。然后将该反应混合物冷却至0℃。然后，在30分钟的时间段内，通过滴液漏斗逐滴添加溶解于THF(50mL)中的对甲苯酰氯(3.27g，17.14mmol)。将该反应混合物在0℃再搅拌2小时，然后在室温搅拌过夜。将该反应混合物在真空中浓缩，以除去THF，之后用EtOAc(40mL)和水(30mL)稀释，并用EtOAc(2x 75mL)萃取。将合并的有机相在Na₂SO₄上方干燥，过滤，并在真空中浓缩，提供作为灰色混浊油状材料的化合物44(5.91g)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝7.74(d,J＝8Hz,2H),7.29(d,J＝8Hz,2H),4.11(br t,2H,CH₂ OTs),3.49-3.65(m,28H,-CH₂ -CH₂OTs&PEG OCH₂ _′s),3.32(s,3H,OCH₃),2.39(s,3H,Ar-CH₃ )ppm。

三乙二醇单乙醚哌嗪(46)(也称作1-(2-(2-(2-乙氧基乙氧基)乙氧基)乙基)哌嗪 (46)(TEG-Pip)的合成

将哌嗪(10.4g，约120mmol)在氮气气氛下溶解于乙腈(150mL)中。逐滴添加溶解于乙腈(30mL)中的化合物42(5g，15.04mmol)。将所获得的混合物在室温搅拌12小时，之后在真空中浓缩以除去乙腈。将粗产物通过使用MeOH:CH₂Cl₂(8:92)作为洗脱液的快速硅胶柱色谱纯化，提供作为无色液体的纯化合物46(1.52g，41％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ＝3.54-3.64(m,10H,TEG OCH₂ _′s),3.50(q,J＝8Hz,2H,-OCH₂ CH₃),3.43(s,1H,NH),2.88(t,4H,哌嗪环-CH₂ ),2.55(t,2H,OCH2-CH₂ -哌嗪),2.46(brm,4H,哌嗪环-CH₂ ),1.18(t,J＝8Hz,3H,-OCH₂ CH₃ )ppm；¹³C NMR:70.76,70.70,70.47,69.92,68.86,66.73,58.47,54.89,50.55,45.99,15.25ppm；MS(ESI)对C₁₂H₂₇N₂O₃计算的([M+H]⁺)247.2016，测得247.2014。

2-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基)乙醛(45)的合成

将草酰氯(5mL，58.24mmol)在氮气气氛下溶解于CH₂Cl₂(75mL)中。利用干冰/丙酮混合物将所获得的混合物冷却至-78℃，然后小心滴逐滴添加稀释在CH₂Cl₂(15mL)中的DMSO(5mL)。在完全添加之后，将该反应混合物再搅拌10分钟，之后逐滴添加稀释在CH₂Cl₂(30mL)中的三乙二醇单甲醚39(5mL，31mmol)。在完全添加之后将该反应混合物搅拌15分钟。然后，在20分钟的时间段内，逐滴添加稀释在CH₂Cl₂(20mL)中的Et₃N(20mL，143mmol)，并在-78℃再搅拌30分钟，之后使其达到室温。然后将乳白色反应混合物用水(2x 45mL)并用盐水(40mL)洗涤。将有机相在Na₂SO₄上方干燥，过滤，并在真空中浓缩。将所获得的粗产物通过使用MeOH/EtOAc(0:100～10:90)作为洗脱液的硅胶柱色谱纯化，得到醛45(2.40g)。1H NMR分析揭示，化合物47被某种不可分离的杂质污染。

FT-IR:3436,2879,1734,1454,1353,1108,1028cm^-1；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:9.73(s,1H,CHO),4.16(s,2H),3.54-3.76(m,10H),3.38(s,3H)ppm(产物被原料污染，产物为约50％)。

2-(2-(2-乙氧基乙氧基)乙氧基)乙醛(47)的合成

执行与对以上化合物所用的相同程序；不同之处在于，所使用的原料为三乙二醇单乙醚(41)，而不是三乙二醇单甲醚(39)。化合物47(收率：2.34g，约42％)被某种不可分离的杂质污染。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δppm:9.67(s,1H,CHO),4.10(s,2H),3.52-3.69(m,10H),3.45(q,2H),1.15(t,3H)ppm(产物被原料污染，产物为约42％)。

通过3,6-二-O-TBDMS-壳聚糖的直接N-改性的壳聚糖的四乙二醇化

参见图25中的方案8。

N-(2-(2-(2-乙氧基乙氧基)乙氧基)乙基氨基壳聚糖TEG_0.41-CS(49a)的合成

将DiTBDMS-壳聚糖8(300mg，0.77mmol)溶解于NMP(5mL)中，并在反应管中加热至50℃。添加Cs₂CO₃(1g，3,07mmol)和催化量的碘化钾。然后，将反应管密封，并该反应混合物搅拌2小时，然后通过注射器添加化合物42(767mg，2.31mmol)。将该反应混合物搅拌48小时，然后冷却并注入冰水中，将所获得的沉淀物滤除，并使用真空烘箱干燥。粗产物48a(270mg)作为黄色粉末获得，并将其以原样用于如下所述的后续脱保护步骤。

为对羟基脱保护(去除甲硅烷基)，将粗产物48a悬浮于MeOH(15mL)中。在室温缓缓添加浓HCl(2mL)，并将所获得混合物搅拌12小时，之后将其在真空中浓缩。将所获得的粗产物再次悬浮于MeOH(15mL)中，并添加浓HCl(2mL)并搅拌12小时，之后用NaCl(5％，35mL)水溶液稀释和离子交换，然后再次对去离子水透析3天。在透析完成后，将该水溶性材料冷冻干燥，提供作为白色粘性材料的49a(125mg)。

FT-IR:3418,2874,1712,1631,1536,1378,1077cm^-1；¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝4.68和4.27(s,1H,壳聚糖H-1&H-1′),3.14-3.97(br m,10H,壳聚糖H-2to H-6,TEG(～41％DS)OCH₂ ′s和O-CH₂ CH₃),2.96-3.14(br m,1H,H-2&H-2′),1.21(t,1.24H(～41％DS)TEG O-CH₂ CH₃ )ppm。

N-(2-(2-(2-乙氧基乙氧基)乙氧基)乙基氨基壳聚糖TEG_0.27-CS(51b)(27％DS)的合成

通过利用与以上所述相同的程序制备化合物49b，不同之处在于使用1.5当量而不是3当量的三乙二醇甲苯磺酸酯(42)。化合物49b(27mg)作为白色粘性材料获得。

FT-IR:3417,2876,1602,1382,1259,1078,599cm^-1；¹H NMR(400MHz,D₂O:DCl,95:5)δ＝5.13和4.95(s,1H,壳聚糖H-1&H-1′),3.24-3.99(br m,12H,壳聚糖H-2to H-6,H-2′,TEG(27％DS)OCH₂ ′s和O-CH₂ CH₃),1.21(t,0.89H,TEG O-CH₂ CH₃ )ppm。

N-乙酰基溴-3,6-O-二TBDMS-壳聚糖(9)的合成

将DiTBDMS-壳聚糖8(3g，7.70mmol)(预先由Ingólfur Magnússon合成)在氮气气氛下溶于CH₂Cl₂(30mL)中。在使用注射器添加三乙胺(5.30ml，38mmol)之前将该所获得的混合物冷却至-20℃。搅拌10分钟后，使用注射器逐滴添加稀释在CH₂Cl₂(2.5mL)中的溴乙酰溴(2.65ml，30.51mmol)。然后将该反应混合物在-20℃搅拌1小时，之后用CH₂Cl₂(70mL)稀释并立即在真空中浓缩。然后，将该浓稠的棕色材料捣碎，并用乙腈(3x 35mL)洗涤，干燥，之后将其再溶解于CH₂Cl₂(40mL)中，并置于分离漏斗中，于其中用水(2x 25mL)及用盐水(35mL)洗涤。将有机相在Na₂SO₄上方干燥，过滤，并在真空中浓缩，提供作为棕色固体材料的溴酰基中间体9(2.57g)。

FT-IR(KBr):ν3404(br,NH),2956-2858(s,C–H TBDMS),1682(vs,C＝O酰胺I),1530(vs,C＝O酰胺II),1473,1391,1362,1311,1259,1101,1005,837,777(Si-C),669cm^-1；¹H NMR(CDCl₃)δppm:4.40(br s,1H,H-1),3.26-4.02(m,8H,H-2GlcN,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6’和GluNH-C＝OCH₂ Br),0.90和0.88(br s,18H,(CH₃)₃C-Si),0.13和0.07(br s,12H,CH_3-Si)ppm。

通过N-乙酰基溴-3,6-二TBDMS-壳聚糖上的亲核取代的壳聚糖的聚乙二醇化

N-(乙酰基哌嗪-TEG)-壳聚糖(51)

(i)将乙酰基溴壳聚糖9(200mg，0.397mmol)在氮气气氛下溶解于CH₂Cl₂(25mL)中。在室温逐滴添加稀释在CH₂Cl₂(10mL)中的化合物46(204mg，0.828mmol)。将所获得的混合物搅拌10分钟，之后添加三乙胺(115μL，0.828mmol)。在室温继续搅拌24小时，并通过检查在MeOH:CH₂Cl₂(1:9)中的TLC确认原料46的完全消耗。然后将该反应混合物置于分液漏斗中，并将有机相用水(2x35mL)和盐水(35mL)洗涤，在Na₂SO₄上方干燥，过滤，并在真空中浓缩，提供作为粗液体的化合物50(214mg)，将其以原样用于后续脱保护步骤。

(ii)为对羟基脱保护(去除甲硅烷基)，将粗化合物50悬浮于MeOH(15mL)中。在室温缓缓地添加浓HCl(2mL)，并将所获得混合物搅拌12小时，之后将其在真空中浓缩。将所获得的粗产物再次悬浮于MeOH(15mL)中，并添加浓HCl(2mL)并搅拌12小时，之后用NaCl(5％，35mL)水溶液稀释和离子交换，然后再次对于去离子水透析3天。在透析完成后，将该水溶性材料在真空中干燥，提供作为浅黄色透明粘性材料的51(112mg)。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δ＝4.63(s,1H,壳聚糖H-1),2.74-3.76(m,30H,壳聚糖H-2～H-6,GlcNHCOCH₂ -Pip-TEG,TEG OCH₂ ′s&O-CH₂ CH₃,哌嗪环-CH₂ ′s),1.21(t,3H,TEG O-CH₂ CH₃ )ppm；DS＝100％。

N-乙酰基-哌嗪四苯基卟啉(TPP-NH-Pip)(5)的合成

如实施例1和方案1中所述地进行。

TPP-NH-CO-CH₂-TBDMS-壳聚糖(55)的合成

参见图26中的方案9。

将DiTBDMS-壳聚糖(100mg，mmol)溶解于55℃的NMP(10mL)中。添加碳酸铯(500mg，1.54mmol)，并将该反应混合物搅拌15分钟，之后添加化合物4(72.2mg，0.096mmol)。添加催化量的碘化钾并继续搅拌24小时，之后添加催化量的DMAP并搅拌24小时，之后冷却并注入水中。将沉淀物滤除，并在真空烘箱中干燥，提供作为粗固体的化合物55。但是，观察到该水溶液为红色，表明该化合物有一些浪费在水中。这可能是因为NMP之故；因而在此阶段透析可能有用。

¹H NMR(400MHz,D₂O)δppm:8.84-8.86(br m,β-吡咯H),8.68(s,TPPNHCO),8.21-8.22(m,四苯基-Ho),7.99(d,J＝8.0Hz,RNHTPP-苯基-Hm),7.72-7.79(m,三苯基-Hm,p),2.72-4.80(m,壳聚糖H-2-H6,TPPNHCOCH₂),0.89-0.90(br s,(CH₃)₃C-Si),0.05-0.07(brs,12H,CH₃-Si)，-2.78(s,α-吡咯NH)；(TPP-NHCOCH₂的DS＝约5％)。

TPPp_0.1-BrA_0.9-DiTBDMS-CS(52)的合成

将化合物9(800mg，1.587mmol)在室温于氮气气氛下溶解于CH₂Cl₂(40mL)中。添加TPP-NH-Pip 5(120mg，0.158mmol)，随后添加三乙胺(30μl，0.216mmol)。将该反应混合物在室温搅拌24小时。原料5的完全消耗通过TLC(MeOH:CH₂Cl₂，1:9)得到确认。将反应混合物用CH₂Cl₂(75mL)稀释，用水(2x 35mL)及盐水(25mL)洗涤，在Na₂SO₄上方干燥，过滤，并在真空下浓缩，提供作为紫色固体的52(收率：716mg)。

¹H NMR(CDCl₃)δppm:9.31(s,TPPNHCO),8.84-8.86(m,β-吡咯H),8.20-8.23(m,四苯基-Ho),7.97(d,J＝8.0Hz,RNHTPP-苯基-Hm),7.74-7.79(m,三苯基-Hm,p),4.43(br s,H-1),3.50-4.14(m,壳聚糖H-2GlcN,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6’和H-2GluNHCO,TPPNHCOCH₂ -Pip,-CH₂ CONGlc和哌嗪环-CH₂ ’s),2.81-2.86(m,哌嗪环-CH₂ ’s),0.91,0.87(br s,(CH₃)₃C-Si),0.07,0.14(br s,CH_3-Si),-2.77(br s,α-吡咯NH)ppm；(TPP-NH-Pip的DS＝约10％)。

TPP-缀合的DiTBDMS-CS的四乙二醇化和脱保护

四乙二醇化N-(TPP-NH-CO-CH₂)-壳聚糖(57)的合成

(i)将粗化合物55(350mg，0.833mmol)溶解于反应管中50℃的NMP(10mL)中。添加Cs₂CO₃(1.09g，3.33mmol)并搅拌该反应混合物30分钟，之后添加化合物42(1.108g，4.16mmol)和催化量的碘化钾。继续搅拌12小时，之后将该反应混合物冷却，用水(30mL)稀释，并对去离子水透析3天，之后冷冻干燥，提供化合物56，将其以原样用于后续脱保护步骤。

(ii)将粗化合物56悬浮于MeOH(15mL)中。在室温缓缓地添加浓HCl(2mL)，并将所获得混合物搅拌12小时，之后将其在真空中浓缩。将所获得的粗产物再次悬浮于MeOH(15mL)中，并添加浓HCl(2mL)并搅拌12小时，之后用NaCl(5％，35mL)水溶液稀释和离子交换，然后再次对于去离子水透析3天。在透析完成后，将该部分水溶性材料在真空中干燥，提供作为棕色固体的57(115mg)。

四乙二醇化TPP-NH-Pip-壳聚糖TPPp_0.1-CS-TEG_0.9(54)的合成

(i)将化合物52(400mg，0.799mmol)在氮气气氛下溶解于CH₂Cl₂(35mL)中。添加化合物46(394mg，1.56mmol)，随后添加Et₃N(222μl，1.56mmol)，并将该反应混合物在室温搅拌24小时。然后，检查TLC，并添加Et₃N(222μl，1.56mmol)，以完成原料46的消耗，并继续再搅拌12小时。然后，将该反应混合物在真空中浓缩，提供作为粗材料的53(417mg)，将其以原样用于后续脱保护步骤。

(ii)将粗化合物53悬浮于MeOH(15mL)中。在室温缓缓地添加浓HCl(2mL)，并将所获得混合物搅拌12小时，之后将其在真空中浓缩。将所获得的粗产物再次悬浮于MeOH(15mL)中，并添加浓HCl(2mL)并搅拌12小时，之后用NaCl(5％，35mL)水溶液稀释和离子交换，然后再次对于去离子水透析3天。在透析完成后，将该水溶性材料冷冻干燥，提供作为紫红棕色固体的最终化合物54(252mg)。

FT-IR:3431,2869,1665,1529,1442,1308,1109,1070,1029,800,701,559cm^-1；¹HNMR(DMSO-d6:D₂O 96:4)δppm:8.83(br m,β-吡咯H),8.15-8.22(m,四苯基-Ho),8.11(d,J＝8.0Hz,RNHTPP-苯基-Hm),7.80-7.88(m,三苯基-Hm,p),4.55(br s,H-1),2.54-3.65(brm,与HDO峰部分重叠,壳聚糖H-2GlcN,H-3,H-4,H-5,H-6,H-6’和H-2GluNHCO,TPPNHCOCH₂ -pip,CH₂ CONGlc,哌嗪环-CH₂ ’s,TEG OCH₂’s和TEG OCH₂ CH₃),1.09(t,TEG OCH₂ CH₃ )ppm；(TPP-NH-Pip的DS＝约10％并且TEG的DS＝约90％)。

结构数据通过NMR、FT-IR和质量分析确认(数据未示出)。化合物54的代表性NMR谱图显示在图27中。

实施例5

体内体细胞活化检测

为测试壳聚糖-缀合物32和38对于MHC I类限制性抗原提呈和CD8+T细胞活化的作用，将小鼠原代巨噬细胞与缀合物32和38以及卵清蛋白OVA 257-264肽抗原在抗原特异性T细胞设定环境下与卵清蛋白特异性(OVA 257-264)CD8+T细胞克隆设定的抗原特异性T细胞中一同温育。来自活化CD8+T细胞的IL-2生产由ELISA来分析。

将骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)用作具有卵清蛋白特异性T细胞杂交瘤的抗原特异性T细胞设定环境中的抗原提呈细胞(APC)。通过将小鼠骨髓细胞在补充有20％L-292细胞系上清液的培养基中培养至少5天来产生BMDM。

在96孔板中以30,000APC/孔温育过夜，所述96孔板具有或不具有下述缀合物浓度的壳聚糖缀合物32和38，所述缀合物浓度可提供0.05μg/ml的TPC浓度。第二天，将APC用2μg/ml的抗原肽(OVA 257-264，来自Anaspec)温育4小时(所有刺激均为三份)。

将细胞洗涤，并暴露于不同剂量的蓝光(0；30、60、90、180秒)，之后每孔添加100,000个卵清蛋白特异性T细胞，并将其与APC共培养过夜。使用的是CD8+T细胞克隆RF33.70(OVA 257-264的MHC I类限制性识别)。

CD8+T细胞和APC的过夜共培养之后，获取来自细胞培养物的上清液。通过利用标准小鼠IL-2ELISA来分析上清液的来自活化T细胞的白细胞介素(IL)-2生产(IL-2ELISADuoset,RnD Systems，分析了来自每个板孔的T细胞培养物的一式两份试样，在每个ELISA板孔中分析25μl的未经稀释的上清液)。

结果(图28)显示，利用这两种缀合物，通过CD8+抗原特异性T细胞的IL-2生产在光照细胞中显著增加(例如，对于化合物32缀合物而言翻倍，图28A)。在利用不带抗原的所述缀合物温育的光照对照组细胞中，未看到这种增加(数据未示出)。这证实所观察到的效果是抗原依赖性的，而不是光化学处理的某一非特异性作用的结果，从而证实了APC表面上抗原肽的提呈增强是所观察到的IL-2生产增加的原因。

Claims

1.一种化合物，所述化合物含有光敏化剂与壳聚糖的缀合物，其中所述化合物为式(I)化合物：

其中

n为大于或等于3的整数，

R在所述化合物中出现n次，并且

在总的Rn基团的70％～90％中，R各自为选自以下的基团A：

其中R₁各自相同或不同，选自H、CH₃和-(CH₂)_c-CH₃；b为1、2、3、4或5；并且c为0、1、2、3、4或5；

其中Y为O；S；SO₂；NCH₃；或N(CH₂)_eCH₃；d＝1、2、3、4或5；并且e＝1、2、3、4或5；

其中R₃为-(CH₂)_j-CH₃，i为1～10的整数；j为0、1、2、3、4或5；并且k为1、2、3、4或5；

其中R₃＝-(CH₂)_j-CH₃，i为1～10的整数；并且j为0、1、2、3、4或5；

其中R₃＝-(CH₂)_j-CH₃，i为1～10的整数；L为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；并且j为0、1、2、3、4或5；

其中m为1、2、3、4或5；

其中R基团各自相同或不同；并且

在所述总的Rn基团的0.5％～30％中，R各自为选自以下的基团B：

其中

p为0、1、2、3、4或5；且q为1、2、3、4或5；

R₄为选自以下的基团：

W为选自O、S、NH或N(CH₃)的基团；

R₇为选自以下的基团：

V为选自CO、SO₂、PO、PO₂H或CH₂的基团；和

R₈为在邻位、间位或对位取代的基团，该基团相同或不同且选自H、-OH、-OCH₃、-CH₃、-COCH₃、C(CH₃)₄、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂和-NCOCH₃；

其中R基团各自相同或不同。

2.如权利要求1所述的化合物，其中n为10～100的整数。

3.如权利要求1或2所述的化合物，其中R₄选自

4.如权利要求1或2所述的化合物，其中R₇选自

5.如权利要求3所述的化合物，其中R₄为TPC_a1或TPC_a2。

6.如权利要求1或2所述的化合物，其中当基团A为

R₁各自为CH₃，且b为1。

7.如权利要求1或2所述的化合物，其中当基团A为

Y为NCH₃并且d为1。

8.如权利要求1或2所述的化合物，其中当基团A为

j为0或1，i为3或6并且k为1。

9.如权利要求1或2所述的化合物，其中当基团A为

j为1且i为2。

10.如权利要求1或2所述的化合物，其中当基团A为

j为0或1并且i为2、4或5并且L为1。

11.如权利要求1或2所述的化合物，其中当基团A为

m为1。

12.如权利要求1或2所述的化合物，其中，p为1，且当q存在时q为1。

13.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述化合物选自如下所示的化合物：

14.一种将分子引入细胞的细胞液中的方法，所述方法为非治疗性或非诊断性方法，所述方法包括：使所述细胞与拟引入的所述分子和权利要求1～13中任一项所述的化合物接触，并用使所述化合物的所述光敏化剂有效活化的波长的光照射所述细胞，从而将所述分子释放至所述细胞液中。

15.一种实现细胞死亡的方法，所述方法为非治疗性或非诊断性方法，所述方法包括：使所述细胞与权利要求1～13中任一项所述的化合物接触，并用使所述化合物的所述光敏化剂有效活化的波长的光照射所述细胞，以生成引起所述细胞死亡的反应性氧物种。

16.一种将抗原分子或其部分表达在细胞表面上的方法，所述方法为非治疗性或非诊断性方法，所述方法包括：使所述细胞与所述抗原分子和权利要求1～13中任一项所述的化合物接触，并用使所述化合物的光敏化剂有效活化的波长的光照射所述细胞，其中所述抗原分子被释放至所述细胞的细胞液中，并且具有足以刺激免疫应答的尺寸的所述抗原分子或其部分被提呈在所述细胞表面上。

17.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1～13中任一项所述的化合物和一种或多种药用可接受的载剂或赋形剂，和可选的拟内化的分子。

18.如权利要求1或2所述的化合物或者权利要求17所述的组合物，其用于治疗。

19.如权利要求18所述的化合物或组合物，其中所述治疗为基因治疗或者刺激免疫应答。

20.如权利要求18所述的化合物或组合物，其用于癌症治疗。

21.如权利要求1或2所述的化合物或者权利要求17所述的组合物，所述化合物或组合物与可选的拟内化的分子用于治疗或预防受试者的疾病或病症。

22.如权利要求21所述的化合物或组合物，其中所述疾病或病症是感染。

23.如权利要求21所述的化合物或组合物，其中，在所述疾病或病症中，明显有异常或过度的细胞生长，或者明显有异常的升高或受抑制的基因表达。

24.如权利要求23所述的化合物或组合物，其中所述疾病为癌症。

25.权利要求21所述的化合物或组合物，其中所述治疗或预防包括：使受试者中的细胞与拟内化的分子和所述化合物或组合物接触，并用使所述化合物的所述光敏化剂有效活化的波长的光照射所述细胞。

26.权利要求25所述的化合物或组合物，其中拟内化的所述分子为细胞毒性分子。

27.权利要求26所述的化合物或组合物，其中所述细胞毒性分子为博莱霉素。

28.权利要求21所述的化合物或组合物，其中所述治疗或预防包括：使受试者中的细胞与所述化合物或组合物接触，并用使所述化合物的所述光敏化剂有效活化的波长的光照射所述细胞，以生成引起所述细胞死亡的反应性氧物种。

29.如权利要求1或2所述的化合物或者权利要求17所述的组合物，其用于通过产生免疫应答来治疗或预防受试者的疾病或病症。

30.如权利要求29所述的化合物或组合物，其中所述疾病或病症是感染。

31.如权利要求29所述的化合物或组合物，其中通过免疫接种方法进行所述治疗或预防。

32.如权利要求29所述的化合物或组合物，其中所述治疗或预防包括：将受试者细胞与所述化合物或组合物和抗原分子接触，并用使所述化合物的所述光敏化剂有效活化的波长的光照射所述细胞，其中所述抗原分子被释放至所述细胞的细胞液中，并且具有足以刺激免疫应答的尺寸的所述抗原分子或其部分被提呈在所述细胞表面上。

33.一种细胞或细胞群，其可通过如权利要求14～16中任一项所述的方法获得。

34.如权利要求33所述的细胞或细胞群，其用于治疗。

35.如权利要求34所述的细胞或细胞群，其用于癌症治疗、基因治疗或刺激免疫应答。

36.化合物或组合物和可选的拟内化的分子在制备用于治疗或预防患者的疾病或病症的药物中的应用，其中所述化合物或组合物是权利要求1～13中任一项所述的化合物或权利要求17所述的组合物，其中所述治疗或预防包括：通过权利要求14所述的方法将所述化合物或组合物和可选的拟内化的分子在体外、体内或离体引入一个或多个细胞中，以及根据需要将所述细胞施用于所述患者。

37.如权利要求36所述的应用，其中所述疾病或病症是感染。

38.如权利要求36或37所述的应用，其中，在所述疾病或病症中，明显有异常或过度的细胞生长，或者明显有异常的升高或受抑制的基因表达。

39.如权利要求36所述的应用，其中所述疾病为癌症。

40.如权利要求36或37所述的应用，其中在所述治疗或预防中产生免疫应答。

41.如权利要求40所述的应用，其中所述治疗或预防为免疫接种。

42.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1～13中任一项所述的化合物或权利要求17所述的组合物和拟内化的分子。

43.如权利要求42所述的试剂盒，其用于同时、分开或依次应用来治疗或预防受试者的疾病或病症。

44.如权利要求43所述的试剂盒，其中所述疾病或病症是感染。

45.如权利要求42～44中任一项所述的试剂盒，其用于治疗。

46.如权利要求45所述的试剂盒，其应用于癌症治疗、基因治疗或刺激免疫应答。

47.化合物在制备用于将分子引入细胞的细胞液的药物中的应用，其中所述化合物是权利要求1～13中任一项所述的化合物，其中如下将所述分子引入所述细胞的细胞液中：使所述细胞与拟引入的所述分子和所述化合物接触，并用使所述化合物的所述光敏化剂有效活化的波长的光照射所述细胞，从而将所述分子释放至所述细胞液中。

48.化合物在制备用于实现细胞死亡的药物中的应用，其中所述化合物是权利要求1～13中任一项所述的化合物，其中如下实现所述细胞死亡：使所述细胞与所述化合物接触，并用使所述化合物的所述光敏化剂有效活化的波长的光照射所述细胞，以生成引起所述细胞死亡的反应性氧物种。

49.化合物在制备用于将抗原分子或其部分表达在细胞表面上的药物的应用，其中所述化合物是权利要求1～13中任一项所述的化合物，其中如下将所述抗原分子或其部分表达在所述细胞表面上：使所述细胞与所述抗原分子和所述化合物接触，并用使所述化合物的光敏化剂有效活化的波长的光照射所述细胞，其中所述抗原分子被释放至所述细胞的细胞液中，并且具有足以刺激免疫应答的尺寸的所述抗原分子或其部分被提呈在所述细胞表面上。