CN104777025A - 一种制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，通过清洗、脱水、脱乙醇、冷冻、干燥、镀金等工艺，使得制备得到的扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察室叶片表面结构清晰完整，图像立体感强，有利于开展家畜瘤胃降解后青贮玉米叶片超微结构的观察和研究，对于直观了解和评价家畜瘤胃微生物对植物叶片纤维结构的降解及提高秸秆饲料消化率有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备扫描电镜样品的方法，具体涉及一种制备家畜瘤胃降解后的青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，属于显微观察样品技术领域。
背景技术
农作物秸秆作为一种非竞争性资源，在我国年产农作物秸秆近6亿吨-7亿吨，大部分秸秆资源都未有效利用，由于秸秆的茎秆粗硬，粗纤维含量高，动物难以消化利用，造成巨大浪费和环境污染。通过对秸秆纤维结构技术的分析，将会带来巨大的社会效益和经济效益。
青贮玉米并不指玉米品种，而是鉴于用途，将新鲜玉米存放到青贮窖中(进行青贮)，经一段时间发酵制成的家畜饲料。用于青贮的玉米植株高大，以生产鲜秸秆为主。青贮玉米的最佳收获期为籽粒的乳熟末期至蜡熟前期，此时产量高，营养价值也最好。青贮玉米饲料可长期保存，不受季节限制，一年四季可保证饲料的平衡供应。但因其纤维含量及木质化程度较高，限制了家畜对青贮玉米的消化利用率。作为家畜饲料的主要来源，如何提高家畜对青贮玉米秸秆纤维的消化率至关重要。家畜对秸秆纤维消化利用率高低的反映除直接测定纤维素的降解率之外，还可通过观察秸秆纤维细胞壁在瘤胃微生物作用下结构的变化直观了解。
目前，对家畜瘤胃降解后植物叶片显微结构方面的研究技术尚不成熟，通过常规的制备扫描电镜观察样品的方法获得的样品，在扫描电镜下观察时存在植物叶片纤维结构不完整、图像不清晰的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备家畜瘤胃降解后的青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，该制备方法能够保证扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察室叶片表面结构清晰，图像立体感强。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、配制固定液：
取25v％戊二醛溶液、0.2M磷酸缓冲液和重蒸水，按比例配制获得2.5v％戊二醛固定液；
步骤2、清洗：
把经过家畜瘤胃降解过的青贮玉米叶片轻轻的逐个拨入盛有0.1mol/L pH 7.2磷酸缓冲液的小瓶中漂洗，反复更换缓冲液，直至叶片表面干净；
步骤3、固定：
在4℃的条件下，把漂洗干净的青贮玉米叶片用2.5v％戊二醛固定液固定1-3h；
步骤4、漂洗：
吸出固定液，重新加入0.1mol/L pH 7.2的磷酸缓冲液，反复更换缓冲液，直至将叶片表面彻底漂洗干净；
步骤5、脱水：
从小瓶中吸出缓冲液，加入不同浓度的乙醇脱水剂逐级梯度脱水；
步骤6、置换乙醇：
吸出乙醇，加入不同浓度叔丁醇脱乙醇；
步骤7、冷冻干燥：
将脱乙醇后的样品放入样品杯中，并置入-20℃下冷冻15-30min，然后放入冷冻干燥器中干燥，抽干为止；
步骤8、样品喷金镀膜：
将导电双面胶带粘贴到样品台上，用镊子轻夹干燥好的样品侧面，保证观察面向上，按顺序贴牢在胶带上，用离子喷金仪在样品表面喷一层金膜。
前述的制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，其特征在于，在步骤3中，前述青贮玉米叶片完全浸没在固定液中。
前述的制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，其特征在于，在步骤5中，前述脱水剂的乙醇的体积浓度依次为30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％，其中，使用乙醇的体积浓度为30％、50％、70％的脱水剂时在4℃下进行脱水，使用乙醇的体积浓度为80％、90％、95％的脱水剂时在室温下进行脱水，使用乙醇的体积浓度为100％的脱水剂时在室温下进行两次脱水，每个浓度下脱水15-30min。
前述的制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，其特征在于，在步骤6中，前述叔丁醇的体积浓度依次为20％-40％-60％-80％-85％-90％-95％-100％，每级脱乙醇5-10min。
本发明的有益之处在于：本发明的制备方法简单方便，成本低，制备得到的扫描电镜样品结构清晰，扫描电镜观察室叶片表面结构清晰，图像立体感强，有利于开展消化后青贮玉米叶片超微结构的观察和研究，这对于定性和定量了解和评价绵羊瘤胃微生物对青贮玉米叶片纤维结构的分解和提高家畜秸秆消化率有重要意义。
附图说明
图1是采用本发明的制备方法得到的一个样品的扫描电镜图像；
图2是采用本发明的制备方法得到的另一样品的扫描电镜图像；
图3是图1中的扫描电镜图像进一步放大后的图像；
图4是图2中的扫描电镜图像进一步放大后的图像。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
下面实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议的条件。
制备过程：
步骤1、配制固定液
取25v％戊二醛溶液、0.2M磷酸缓冲液和重蒸水，按比例配制获得2.5v％戊二醛固定液。
步骤2、清洗：
把经过家畜(本实施例使用的是绵羊)瘤胃降解过的青贮玉米叶片用镊子轻轻的逐个拨入盛有0.1mol/L pH 7.2磷酸缓冲液的青霉素小瓶中漂洗，反复更换缓冲液，直至叶片表面干净，若清洗不干净会影响到后续的拍照效果，一般漂洗1-1.5h，换液3-4次，本实施例漂洗1h，换液3次。
步骤3、固定
在4℃的条件下，把漂洗干净的青贮玉米叶片用2.5v％戊二醛固定液固定，一般固定时间为1-3h，本实施例固定时间控制在3h。
固定的过程中，青贮玉米叶片应完全浸没在固定液中。若有样品漂浮在固定液表面，应通过抽真空的方法让样品完全浸没在固定液中。
步骤4、漂洗
吸出固定液，重新加入0.1mol/L pH 7.2的磷酸缓冲液，反复更换缓冲液，直至将叶片表面彻底漂洗干净，以减少固定液与后期脱水剂之间的反应，一般漂洗1-1.5h，换液3-4次，本实施例漂洗1h，换液3次。
步骤5、脱水
脱水是将组织中的游离水彻底脱掉的过程，从小瓶中吸出缓冲液，加入不同浓度的乙醇脱水剂逐级梯度脱水。若脱水不彻底，在电镜下观看时图像不稳定，容易损害仪器。
脱水剂的乙醇的体积浓度依次为30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％。脱水的具体过程为：
(1)分别使用乙醇的体积浓度为30％、50％、70％的脱水剂，在4℃下进行脱水，一般每个浓度下脱水15-30min，本实施例中叶片在每级停留15min；
(2)分别使用乙醇的体积浓度为80％、90％、95％的脱水剂，在室温下进行脱水，一般每个浓度下脱水15-30min，本实施例中叶片在每级停留15min；
(3)使用乙醇的体积浓度为100％的脱水剂，在室温下进行两次脱水，一般每次脱水15-30min，本实施例中叶片停留15min。
脱水过程中应注意：
(1)逐级按浓度梯度脱水，不能急剧脱水；
(2)更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡，影响结构观察；
(3)脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70％脱水剂中，并在4℃保存。
步骤6、置换乙醇
吸出乙醇，加入不同浓度叔丁醇脱乙醇。
叔丁醇体积浓度依次为20％-40％-60％-80％-85％-90％-95％-100％，一般每级脱乙醇5-10min，本实施例中每级置换时间为10min。
步骤7、冷冻干燥
将脱乙醇后的样品放入样品杯中，并置入-20℃下冷冻，一般冷冻时间为15-30min，本实施例中冷冻时间为20min，然后放入冷冻干燥器(VFD-21S)中干燥。在冷冻前应先打开冷冻干燥器的开关，降温至0℃。
把冷冻好的样品放入冷冻干燥器中，打开EVAC按钮直到样品干燥20min(一般是15-20min)，然后调温度模式到warm至30℃，再调温度模式至stop，接着关闭EVAC按钮，2min后取出样品。
冷冻干燥过程要彻底，否则容易残留叔丁醇，会影响观察效果和图像的清晰度。
步骤8、样品喷金镀膜
将导电双面胶带粘贴到样品台上，用镊子轻夹干燥好的样品侧面，保证观察面向上，按顺序贴牢在胶带上。
新鲜样品自身就可导电，而经过干燥的生物样品不能导电。这种不导电的样品在SEM下观察时，会产生电荷积累而影响观察稳定性。因此，需要用离子喷金仪(msp-1s)在干燥的样品表面喷一层金膜。
离子喷金仪的电流为15mA，喷金时间为200s，完成镀金的样品即可在扫描电子显微镜下观察。
样品观察：
把喷金后制得的扫描电镜样品用S3400N(HITACHI)扫描电镜进行观察，图像模式为SE，加速电压1.00KV-2.00KV，样品台倾斜度为0，亮度对比度为自动加手动，聚焦手动，放大倍数可根据自己要看的结构而定，最小可看50倍。
拍照时，应该遵循高倍对焦，低倍拍照原则。
观察结果：
图1和图2是消化后剩下的纤维结构状况，也就是叶脉部分，从扫描电镜中可以看到清晰完整的结构，并且立体感强。
图3和图4是进一步放大以后的电镜图像，从扫描电镜中仍能够清晰的看到细胞的轮廓，并且立体感强。
由此可见，本发明的制备扫描电镜观察样品的方法，通过清洗、脱水、脱乙醇、冷冻、干燥、镀金等工艺，使得制备得到的扫描电镜样品结构完整，扫描电镜观察室叶片表面结构清晰完整，图像立体感强，有利于开展家畜瘤胃降解后青贮玉米叶片超微结构的观察和研究，对于直观了解和评价家畜瘤胃微生物对植物叶片纤维结构的降解及提高秸秆饲料消化率有重要意义。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、配制固定液：
取25v％戊二醛溶液、0.2M磷酸缓冲液和重蒸水，按比例配制获得2.5v％戊二醛固定液；
步骤2、清洗：
把经过家畜瘤胃降解过的青贮玉米叶片轻轻的逐个拨入盛有0.1mol/L pH 7.2磷酸缓冲液的小瓶中漂洗，反复更换缓冲液，直至叶片表面干净；
步骤3、固定：
在4℃的条件下，把漂洗干净的青贮玉米叶片用2.5v％戊二醛固定液固定1-3h；
步骤4、漂洗：
吸出固定液，重新加入0.1mol/L pH 7.2的磷酸缓冲液，反复更换缓冲液，直至将叶片表面彻底漂洗干净；
步骤5、脱水：
从小瓶中吸出缓冲液，加入不同浓度的乙醇脱水剂逐级梯度脱水；
步骤6、置换乙醇：
吸出乙醇，加入不同浓度叔丁醇脱乙醇；
步骤7、冷冻干燥：
将脱乙醇后的样品放入样品杯中，并置入-20℃下冷冻15-30min，然后放入冷冻干燥器中干燥，抽干为止；
步骤8、样品喷金镀膜：
将导电双面胶带粘贴到样品台上，用镊子轻夹干燥好的样品侧面，保证观察面向上，按顺序贴牢在胶带上，用离子喷金仪在样品表面喷一层金膜。
2.根据权利要求1所述的制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，其特征在于，在步骤3中，所述青贮玉米叶片完全浸没在固定液中。
3.根据权利要求1所述的制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，其特征在于，在步骤5中，所述脱水剂的乙醇的体积浓度依次为30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％，其中，使用乙醇的体积浓度为30％、50％、70％的脱水剂时在4℃下进行脱水，使用乙醇的体积浓度为80％、90％、95％的脱水剂时在室温下进行脱水，使用乙醇的体积浓度为100％的脱水剂时在室温下进行两次脱水，每个浓度下脱水15-30min。
4.根据权利要求1所述的制备青贮玉米叶片扫描电镜样品的方法，其特征在于，在步骤6中，所述叔丁醇的体积浓度依次为20％-40％-60％-80％-85％-90％-95％-100％，每级脱乙醇5-10min。
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2015
- 2015-04-24 CN CN201510205563.9A patent/CN104777025A/zh active Pending
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