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CN104769108A - 用于治疗、预防或缓解疼痛的融合蛋白和方法 - Google Patents

用于治疗、预防或缓解疼痛的融合蛋白和方法 Download PDF

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CN104769108A
CN104769108A CN201380045083.XA CN201380045083A CN104769108A CN 104769108 A CN104769108 A CN 104769108A CN 201380045083 A CN201380045083 A CN 201380045083A CN 104769108 A CN104769108 A CN 104769108A
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K·福斯特
J·查多克
R·K·奥基
L·斯图尔德
J·弗朗西斯
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Johnson and Johnson Surgical Vision Inc
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Syntaxin Ltd
Advanced Medical Optics Inc
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Abstract

一种单链、多肽融合蛋白，包含：非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够切割伤害性感觉传入神经的胞吐融合器的蛋白(例如，梭菌神经毒素L链或IgA蛋白酶)；甘丙肽靶向部分，其能够结合伤害性感觉传入神经上的结合位点，该结合位点能够经过胞吞作用以整合入伤害性感觉传入神经内的内体中(例如，GALR1、GALR2或GALR3受体)；蛋白酶切割位点，融合蛋白可在该位点处被蛋白酶切割，其中该蛋白酶切割位点位于非毒性蛋白酶和甘丙肽靶向部分之间；易位结构域，其能够将蛋白酶从内体内跨内体膜易位至伤害性感觉传入神经的细胞溶质中(例如，梭菌神经毒素的HN结构域)；位于非细胞毒性蛋白酶和蛋白酶切割位点之间的第一间隔子，所述第一间隔子包含4至25个氨基酸残基的氨基酸序列；位于甘丙肽靶向部分和易位结构域之间的第二间隔子，所述第二间隔子包含4至35个氨基酸残基的氨基酸序列。还描述了编码多肽融合蛋白的核酸序列，其制备方法及其应用(例如，治疗、预防或缓解疼痛)。

Description

用于治疗、预防或缓解疼痛的融合蛋白和方法
本发明涉及非细胞毒性融合蛋白及其作为止痛分子的治疗性应用。
根据毒素对目标分子的作用类型，通常可将毒素分为两组。具体而言，第一组毒素杀死其天然目标细胞并因此称为细胞毒性毒素分子。该组毒素的示例包括植物毒素(如蓖麻毒蛋白和相思豆毒蛋白)和细菌毒素(如白喉毒素和假单胞菌外毒素A)。细胞毒性毒素受到了用于治疗细胞疾病和病症(如癌症)的“魔术弹”设计(例如免疫偶联物，其包含细胞毒性毒素组分和结合目标细胞上特定标记的抗体)的大量关注。细胞毒性毒素通常通过抑制细胞的蛋白合成过程杀死其目标细胞。
第二组毒素称为非细胞毒性毒素，顾名思义，这类毒素不会杀死其天然目标细胞。与细胞毒性毒素相比，非细胞毒性毒素受到的商业关注较少，并通过抑制除蛋白合成以外的细胞过程来发挥其对目标细胞的作用。非细胞毒性毒素由多种植物和多种微生物(梭菌属(Clostridium sp.)和奈瑟球菌属(Neisseria sp.))产生。
梭菌神经毒素是通常具有150kDa分子量的蛋白。其由多种细菌生产，特别是属于梭菌属的细菌，最重要的是破伤风梭菌(C.tetani)和肉毒梭菌(C.botulinum)、丁酸梭菌(C.butyricum)和阿根廷梭菌(C.argentinense)的几种菌株。存在8种不同类型的梭菌神经毒素，即破伤风毒素，和肉毒菌神经毒素的血清型A、B、C1、D、E、F和G，且其都共有类似的结构和作用模式。
梭菌神经毒素代表非细胞毒性毒素分子的主要组且由宿主细菌以单个多肽的形式合成，所述多肽通过蛋白水解切割事件进行翻译后修饰以形成由二硫键连接在一起的两条多肽链。这两条链被称为重链(H链，其分子量为约100kDa)和轻链(L链或LC，其分子量为约50kDa)。
L链具有蛋白酶功能(锌依赖的内肽酶活性)并对胞吐过程中涉及的囊泡和/或质膜相关蛋白表现出高底物特异性。来自不同梭菌物种或血清型的L链可水解三种底物蛋白(即突触小泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25)之一中不同但特定的肽键。这些底物是神经分泌机制的重要组分。
奈瑟球菌属(最重要地，来自淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)物种)生成功能类似的非细胞毒性蛋白酶。这类蛋白酶的示例是IgA蛋白酶(参见WO99/58571)。
本领域中已充分证明，毒素分子可再次靶向不是该毒素天然目标细胞的细胞。再次靶向时，修饰的毒素能够结合所需目标细胞，随后易位至细胞溶质，能够对目标细胞发挥作用。所述再次靶向是通过使用不同的靶向部分(TM)代替毒素的天然TM来实现的。关于这一点，对TM进行选择使其结合所需目标细胞，并随后使修饰的毒素进入目标细胞内的内体。修饰的毒素也包含易位结构域以使非细胞毒性蛋白酶进入细胞溶质。该易位结构域可以是毒素的天然易位结构域或者起可以是获自具有易位活性的微生物蛋白的不同的易位结构域。
可通过本领域技术人员熟知的常规化学偶联技术实现上述TM替换。关于这一点，参见Hermanson,G.T.(1996)，Bioconjugate techniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(Academic Press)和Wong,S.S.(1991)，Chemistry of proteinconjugation and cross-linking(《蛋白偶联和交联的化学》)，CRC出版社(CRC Press)。或者，可使用重组技术，如WO98/07864中所述的那些。所有上述参考文献均通过引用纳入本文。
疼痛传感细胞具有大量受体类型。然而，不是所有的受体类型都适用于(至少是可用于)受体介导的胞吞。类似地，对于同一受体，不同TM之间的结合特性可广泛变化，这在不同TM和不同受体之间更为显著。
因此，需要研发能够解决一种或多种上述问题的修饰的非细胞毒性融合蛋白。特别感兴趣的是研发用于治疗疼痛的替代性/改良的非细胞毒性融合蛋白。
本发明试图通过提供独特的融合蛋白解决一种或多种上述问题。
本方面通过提供单链、多肽融合蛋白解决了一种或多种上述问题，包括：
a.非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶切割伤害性感觉传入神经的胞吐融合器(exocytic fusion apparatus)的蛋白；
b.结合伤害性感觉传入神经上结合位点的甘丙肽靶向部分，该结合位点胞吞整合入伤害性感觉传入神经内的内体；
c.蛋白酶切割位点，融合蛋白在该位点处被蛋白酶切割，其中蛋白酶切割位点位于非细胞毒性蛋白酶和甘丙肽靶向部分之间；
d.易位结构域，其将蛋白酶从内体内跨内体膜移至伤害性感觉传入神经的细胞溶质中，其中靶向部分位于蛋白酶切割位点和易位结构域之间；
e.位于非细胞毒性和蛋白酶切割位点之间的第一间隔子，所述第一间隔子包含4至25个氨基酸残基的氨基酸序列；
f.位于甘丙肽靶向部分和易位结构域之间的第二间隔子，所述第二间隔子包含4至35个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的非细胞毒性蛋白酶组分是非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够切割伤害性感觉传入神经的胞吐融合器的三种底物蛋白(即突触小泡蛋白、突触融合蛋白或SNAP-25)之一中不同但特定的肽键。这些底物是神经分泌机制的重要组分。优选地，本发明的非细胞毒性蛋白酶组分是奈瑟球菌IgA蛋白酶或梭菌神经毒素L链。术语非细胞毒性蛋白酶包括所述非细胞毒性蛋白酶的功能等同的片段和衍生物。特别优选的非细胞毒性蛋白酶组分是肉毒杆菌神经毒素(BoNT)L链。
本发明的易位组分能够使非细胞毒性蛋白酶(或其片段)易位至目标细胞中，从而在目标细胞的细胞溶质中发生蛋白酶活性的功能性表达。该易位组分优选能够在低pH条件下在脂膜中形成离子可渗透孔。优选地，已发现仅使用蛋白分子中能够在内体膜内形成孔的那些部分。该易位组分可获自微生物蛋白来源，特别是获自细菌或病毒蛋白来源。因此，在一个实施方式中，该易位组分是酶(如细菌毒素或病毒蛋白)的易位结构域。本发明的易位组分优选是梭菌神经毒素H链或其片段。更优选地，其是HN结构域(或其功能性组分)，其中HN表示梭菌神经毒素H链大致相对于H链的氨基端一半的一部分或片段，或者完整的H链中对应于该片段的结构域。
本发明的甘丙肽TM组分负责使本发明的融合蛋白结合目标细胞上的结合位点。因此，该甘丙肽TM组分是一种配体，本发明的融合蛋白通过其结合经选择的目标细胞。
在本发明的上下文中，该目标细胞是伤害性感觉传入神经，优选初级伤害性传入神经(例如A纤维(如Aδ纤维)或C纤维)。因此，本发明的融合蛋白能够抑制神经递质或神经调节因子[例如谷氨酸、底物P、降钙素基因相关肽(CGRP)和/或神经肽Y]从离散的伤害性感觉传入神经元群体中释放。使用中，该融合蛋白减少或阻止了感觉传入信号(如神经递质或神经调节因子)从外周至中枢疼痛纤维的传递，并因此可用作治疗疼痛(特别是慢性疼痛)的治疗性分子。
确定TM与伤害性感觉传入神经结合是常规的。例如，可使用简单的放射性替换实验，其中代表伤害性感觉传入神经的组织或细胞(例如DRG)在过量的未经标记配体存在的情况下接触经标记(如氚化)的配体。在这种实验中，可评估非特异性和特异性结合的相对比例，从而确定配体结合伤害性感觉传入神经目标细胞。任选地，该试验可包括一种或多种结合拮抗剂，且该试验还可包括观察配体结合的损失。这类实验的示例可参见Hulme,E.C.(1990)，Receptor-binding studies,a brief outline(《受体结合研究概要》)，第303-311页，Receptor biochemistry,APractical Approach(《受体生物化学，实践方法》)，E.C.Hulme编，牛津大学出版社(Oxford University Press)。
与对应的“游离”TM(如gal16)相比，本发明的融合蛋白通常显示降低的对甘丙肽受体(例如，GALR1)的结合亲和性(在最多10倍的范围内)。然而，虽然存在这项观察，但本发明的融合蛋白出乎意料的显示了良好的效力。这可归因于两个主要特性。首先，非细胞毒性蛋白酶是催化性的——因此少量这类分子的治疗性作用被迅速扩大。其次，伤害性感觉传入神经上存在的甘丙肽受体仅需作为治疗剂进入的通道，而无需被刺激至所需水平以实现配体-受体介导的药理反应。因此，本发明的融合蛋白可以比其他类型的止痛分子(如NSAIDS、吗啡和加巴喷丁)低得多的剂量给予。后几种分子通常以较高的微克至毫克(甚至数百毫克)的量给予，而本发明的融合蛋白可以低得多的剂量给予，通常至少低10倍，且更通常低100倍。
本发明的甘丙肽TM也可以作为伤害性感觉传入神经(更具体是初级伤害性传入神经)上存在的一个或多个甘丙肽受体的“激动剂”。通常，激动剂被认为是能够增加或降低细胞内活性的任何分子，即简单地引起细胞活性变化的任何分子。例如，激动剂的常规含义可包括能够与细胞上受体合并并起始反应或活性的化学物质，或者通过活化受体诱导活性应答(无论该应答是增加还是降低细胞活性)的药物。
然而，对于本发明的目的，激动剂可更具体地定义为能够刺激目标细胞中胞吐融合过程的分子，该过程易于被能够切割所述目标细胞中胞吐融合器蛋白的蛋白酶(或其片段)抑制。
因此，本发明的特定的激动剂定义排除了许多常规情况下被认为是激动剂的分子。例如，神经生长因子(NGF)是一种激动剂，其能够通过结合TrkA受体促进神经元分化。然而，根据上述标准评价时NGF不是一种激动剂，因为其不是胞吐融合的主要诱导因子。此外，NGF刺激的过程(即细胞分化)不易于被非细胞毒性毒素分子的蛋白酶活性抑制。
在一个实施方式中，本发明的融合蛋白显示优先结合受体和/或内化特性。这转而导致蛋白酶组分更高效地递送至疼痛感觉目标细胞。
由于副作用的存在，使用激动剂作为TM是自限制的。更具体地，激动剂TM与疼痛感觉目标细胞的结合增加了胞吐融合，其可能恶化疼痛感觉。然而，由激动剂结合刺激的胞吐过程随后被融合蛋白的蛋白酶组分降低或抑制。
可使用实施例9所述的方法确定TM结合伤害性传入神经上受体的激动剂特性。
本发明的靶向部分包含或由甘丙肽和/或甘丙肽衍生物组成。已发现甘丙肽受体(如GALR1、GALR2和GALR3)在DRG中前接合和后接合(Liu和Hokfelt，(2002),Trends Pharm.Sci.,23(10),468-74)，并在神经性疼痛期间表达增强。Xu等，(2000)Neuropeptides,34(3&4),137–147提供了甘丙肽相关的其他信息。所有上述参考文献均通过引用纳入本文。
在本发明的一个实施方式中，甘丙肽TM的靶标是GALR1、GALR2和/或GALR3受体。这些受体是G蛋白偶联受体家族成员并具有七次跨膜结构域结构。
在一个实施方式中，该甘丙肽TM是结合(优选特异性结合)GALR1、GALR2和/或GALR3受体的分子。更优选地，该甘丙肽TM是GALR1、GALR2和/或GALR3受体的“激动剂”。该上下文中术语“激动剂”如上文所定义。
野生型人甘丙肽是30个氨基酸的肽，在本文中缩写为“GA30”(示于SEQID NO:7)。在一个实施方式中，该甘丙肽TM包含或由SEQ ID NO:7组成。
本发明还包括上述甘丙肽TM的片段、变体和衍生物。这些片段、变体和衍生物基本保留了所述甘丙肽TM的特性(即，是功能等同的)。例如，这些片段、变体和衍生物保留了结合GALR1、GALR2和/或GALR3受体的能力。在一个实施方式中，本发明的甘丙肽TM包含或由全长甘丙肽的16个氨基酸片段组成并在本文中称作GA16(示于SEQ ID NO:8)。
在一个实施方式中，该甘丙肽TM包含或由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少70％，优选至少80％(如至少82、84、85、86、88或89％)，更优选至少90％(如至少91、92、93或94％)，且最优选至少95％(如至少96、97、98、99或100％)氨基酸序列相同性的氨基酸序列组成。
在一个实施方式中，该甘丙肽TM包含或由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列或者SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的片段具有至少70％(如至少80、82、84、85、86、88或89％)，更优选至少90％(如至少91、92、93或94％)，且最优选至少95％(如至少96、97、98、99或100％)氨基酸序列相同性的氨基酸序列组成，所述片段包含或由全长序列的至少10个(如至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个)毗连氨基酸残基组成。
在一个实施方式中，该甘丙肽靶向部分包含或由SEQ ID NO.7的氨基酸序列或者片段或者所述SEQ ID NO.7或所述片段的变体组成，所述片段包含SEQID NO.7的至少16个(如至少10、11、12、13、14或15个)毗连氨基酸残基，所述变体具有最多6个(如最多5、4、3、2或1个)保守性氨基酸取代。
本发明的蛋白酶切割位点使得融合蛋白在非细胞毒性蛋白酶组分和TM组分之间的位置处被切割(优选受控制的切割)。正是该切割反应将融合蛋白从单链多肽转化为二硫键连接的双链多肽。
根据本发明的优选实施方式，甘丙肽TM通过位于甘丙肽TM的C末端外的结构域或氨基酸序列进行结合。例如，相关结合结构域可包括位置靠近TM中部(即直链肽序列)的内结构域或氨基酸序列。优选地，相关结合结构域位于靠近甘丙肽TM的N末端处，更优选地在N末端处或靠近N末端。
在一个实施方式中，单链多肽融合可包括超过一个蛋白水解切割位点。然而，当存在两个或多个这类位点时，它们是不同的，从而基本阻止在单个蛋白酶存在的情况下出现多个切割事件。在另一个实施方式中，优选单链多肽融合具有单个蛋白酶切割位点。
可通过常规方法(如定点诱变)在DNA水平导入蛋白酶切割序列(和/或去除任何固有的切割序列)。可手动或在计算机软件(例如MapDraw程序，DNASTAR公司(DNASTAR Inc.))的辅助下进行筛选以确认存在切割序列。
虽然可使用任何蛋白酶切割位点，但优选以下位点：
在一个实施方式中，该蛋白酶切割位点是肠激酶切割位点(DDDDK↓)。在一个实施方式中，肠激酶蛋白酶用于切割肠激酶切割位点并激活融合蛋白。
术语蛋白酶切割位点还包括内含肽，其是一种自切割序列。该自剪接反应是可控的，例如通过改变存在的还原剂的浓度。
使用时，切割蛋白酶切割位点并暴露TM的N末端区域(优选N末端)。所得多肽具有带有N末端结构域或内结构域的TM，其基本不含融合蛋白的剩余部分。这种排列使得TM的N末端组分(或内结构域)能够直接与目标细胞上的结合位点相互作用。
在一个实施方式中，TM和蛋白酶切割位点在融合蛋白中相距最多10个氨基酸残基，更优选相距最多5个氨基酸残基，且最优选相距0个氨基酸残基。在一个实施方式中，TM和蛋白酶切割位点在融合蛋白中相距0-10个(如0-9、0-8、0-7、0-6、0-5、0-4、0-3、0-2个)氨基酸残基，且优选相距0-1个氨基酸残基。因此，在切割蛋白酶切割位点后，为融合体提供了TM，该TM具有N端结构域，其基本不含融合体的剩余部分。这种排列使得靶向部分的N末端组分可直接与目标细胞上的结合位点相互作用。
与上述激活步骤相关的一个优势在于在融合蛋白的蛋白水解切割发生后TM才易于发生N末端降解。此外，特定蛋白酶切割位点的选择使得多肽融合体被选择性激活为双链构象。
本发明的单链多肽融合体的构建将蛋白酶切割位点置于TM和非细胞毒性蛋白酶组分之间。
优选在单链融合体中，TM位于蛋白酶切割位点和易位组分之间。这确保TM与易位结构域相连(即如同在天然梭菌全毒素中存在的那样)，但在本发明中，两种组分的顺序是反转的面对面(vis-à-vis)天然全毒素。这种排列的另一个优势是TM位于融合蛋白中暴露的环区域中，这对于融合蛋白的构象具有最低的结构影响。在这方面，所述环被广泛称为接头、激活环、结构域间接头或只是表面暴露环(Schiavo等，2000,Phys.Rev.,80,717-766；Turton等，2002,Trends Biochem.Sci.,27,552-558)。
本发明的单链融合蛋白包含位于非细胞毒性蛋白酶和蛋白酶切割位点之间的第一间隔子，所述第一间隔子包含4-25个(如6-25、8-25、10-25、15-25或者4-21、4-20、4-18、4-15、4-12或4-10个)氨基酸残基的氨基酸序列(或由其组成)。在一个实施方式中，该第一间隔子包含至少4个(如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个)氨基酸残基的氨基酸序列(或由其组成)。在一个实施方式中，该第一间隔子包含至多25个(如至多24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10个)氨基酸残基的氨基酸序列(或由其组成)。所述第一间隔子使融合蛋白在蛋白酶切割位点处被切割。
在没有本发明的第一间隔子的情况下，融合蛋白的激活和蛋白酶切割明显较弱。不希望受理论的限制，有假说指出甘丙肽靶向部分可在空间上阻碍蛋白酶切割位点或与其相互作用，导致缺失本发明的第一间隔子的融合蛋白的弱激活。发明人相信，第一间隔子提供的灵活性为本发明融合蛋白提供了增强/改善的激活特性。刚性接头(如α螺旋接头)不会提供必需的灵活性。对于具有含有蛋白酶切割位点的“天然”间隔子序列的甘丙肽融合蛋白而言(其会重复不需要的刚性α螺旋接头结构)，这也是正确的。可通过多种方法确定多肽结构域的灵活性和移动性，包括测定X射线晶体B因子(参见基例如Smith等，2003Protein Science,12:1060-1072；其通过引用纳入本文)。本发明中具体选择的间隔子序列提供了超过任何“天然”间隔子序列的增强的激活。在该上下文中，激活指所述第一间隔子使融合蛋白在蛋白酶切割位点处被切割。用于第一间隔子的特别优选的氨基酸残基包括甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、脯氨酸、谷氨酸和/或赖氨酸。上述氨基酸被认为是最灵活的氨基酸，参见Smith等，2003Protein Science 2003；12:1060-1072。
在一个实施方式中，该第一间隔子的氨基酸残基选自甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸。在一个实施方式中，该第一间隔子的氨基酸残基选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸。在一个实施方式中，该第一间隔子的氨基酸残基选自甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸。特别优选甘氨酸和丝氨酸。在一个实施方式中，该第一间隔子包含或由一个或多个具有甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸残基的五肽组成。一种评估本发明的融合蛋白中第一间隔子是否具有所需灵活性的方法是进行简单的蛋白酶切割试验。对本领域技术人员而言，评估融合蛋白的切割/激活是常规方法，标准方法描述于例如实施例1。
在一个实施方式中，该第一间隔子选自GS5、GS10、GS15、GS 18、GS20、FL3和/或FL4间隔子。下表1提供了所述间隔子的序列。
表1
间隔子 序列
GS5 GGGGSA
GS10 GGGGSGGGGSA
GS15 ALAGGGGSGGGGSALV
GS18 GGGGSGGGGSGGGGSA
GS20 ALAGGGGSGGGGSGGGGSALV
FL3 LGGGGSGGGGSGGGGSAAA
FL4 LSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAAA
在一个实施方式中，该第一间隔子通过蛋白酶切割对融合蛋白进行了至少45％(如至少50、55、60、65、70、75、80、90、95、98、99或100％)的激活。在一个实施方式中，该第一间隔子通过蛋白酶切割对融合蛋白进行了至少70％的激活。
在一个实施方式中，该第一间隔子不是天然产生的间隔子序列。在一个实施方式中，该第一间隔子不包含或由天然(即野生型)梭菌神经毒素(如肉毒杆菌神经毒素)天然具有的氨基酸序列组成。换言之，该第一间隔子可以是非梭菌序列(即未发现于天然梭菌神经毒素中)。在一个实施方式中，该融合蛋白不包含或由作为第一间隔子的氨基酸序列GIITSK(BoNT/A)、VK(BoNT B)、AIDGR(BoNT/C)、LTK(BoNT/D)、IVSVK(BoNT/E)、VIPR(BONT/F)、VMYK(BoNT/G)和/或IIPPTNIREN(TeNT)组成。
在一个实施方式中，该第一间隔子在梭菌神经毒素L链中保守的半胱氨酸残基后第三个氨基酸残基处开始(参见下文表3)。在一个实施方式中，该第一间隔子在保守的半胱氨酸残基后使用sal1位点改造的非细胞毒性蛋白酶梭菌L链的VD氨基酸残基后开始。在一个实施方式中，该第一间隔子终止于标记上述蛋白酶切割位点开始的氨基酸残基处。
在一个实施方式中，该单链融合蛋白包含第二间隔子，其位于甘丙肽靶向部分和易位结构域之间。所述第二间隔子可包含4-35个(如6-35、10-35、15-35、20-35或者4-28、4-25、4-20或4-10个)氨基酸残基的氨基酸序列(或由其组成)。发明人出乎意料的发现，选择第二间隔子的大小使得(使用中)TM的C端和易位组分的N端彼此相隔40-105埃(优选50-100埃且更优选50-90埃)时，本发明的融合蛋白显示改善的结合活性。
可根据Crasto,C.J.和Feng,J.A.(2000)五月，13(5)，第309-312页所述常规地鉴定并获得合适的第二间隔子，也可参见http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html。在一个实施方式中，该第二间隔子选自GS5、GS10、GS15、GS18、GS20或HX27间隔子。下表2提供了所述间隔子的序列。
表2
间隔子 序列
GS5 GGGGSA
GS10 GGGGSGGGGSA
GS15 ALAGGGGSGGGGSALV
GS18 GGGGSGGGGSGGGGSA
GS20 ALAGGGGSGGGGSGGGGSALV
HX27 ALAAEAAAKEAAAKEAAAKAGGGGSALV
发明人出乎意料的发现，具有所述第一和第二间隔子的本发明的融合蛋白在重组表达期间显示了增强的激活特性和增加的产量。此外，与甘丙肽TM是易位结构域组分C端的融合蛋白相比，本发明的融合蛋白显示了增强的效力。
在一个实施方式中，本发明提供了一种单链多肽融合蛋白，其包含或由特定的氨基酸序列组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、53、56和/或59的氨基酸序列具有至少80％(如至少85、90、92、94、95、96、97、98、99或100％)序列相同性。
在一个实施方式中，本发明提供了一种单链多肽融合蛋白，其包含或由特定的氨基酸序列组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO:10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、53、56和/或59的全长氨基酸序列具有至少80％(如至少85、90、92、94、95、96、97、98、99或100％)序列相同性。
在一个实施方式中，在单链多肽中，非细胞毒性蛋白酶组分和易位组分通过二硫键连接在一起。因此，在蛋白酶切割位点的切割后，该多肽呈现双链构象，其中蛋白酶和易位组分仍通过二硫键连接在一起。为此，优选在单链融合蛋白中蛋白酶和易位组分彼此相距最多100个氨基酸残基，更优选最多80个氨基酸残基，特别优选最多60个氨基酸残基，且最优选最多50个氨基酸残基。
在一个实施方式中，非细胞毒性蛋白酶组分与融合蛋白的易位组分形成二硫键。例如，蛋白酶组分中形成二硫键的氨基酸残基位于蛋白酶组分的最后20个(优选最后10个)C末端氨基酸残基内。类似地，易位组分中形成二硫键第二部分的氨基酸残基可位于易位组分的最初20个(优选最初10个)N末端氨基酸残基内。
或者，在单链多肽中，非细胞毒性蛋白酶组分和TM通过二硫键连接在一起。为此，TM中形成二硫键的氨基酸残基优选位于远离TM的N末端处，更优选靠近TM的C末端。
在一个实施方式中，非细胞毒性蛋白酶组分与融合蛋白的TM组分形成二硫键。为此，蛋白酶组分中形成二硫键的氨基酸残基优选位于蛋白酶组分的最后20个(更优选最后10个)C末端氨基酸残基内。类似地，TM组分中形成二硫键第二部分的氨基酸残基优选位于TM的最后20个(更优选最后10个)C末端氨基酸残基内。
上述二硫键排列的优点是：使蛋白酶和易位组分以类似于天然梭菌神经毒素的方式排列。通过比较，参考天然梭菌神经毒素的一级氨基酸序列，相应半胱氨酸残基相隔8至27个氨基酸残基，获自Popoff,MR和Marvaud,J-C，1999，Structural&genomic features of clostridial neurotoxins(梭菌神经毒素的结构和基因组特性)，第9章，The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins(《细菌蛋白毒素的全面来源资料》)，Alouf和Freer编：
表3
1仅来自蛋白水解菌株的信息
该融合蛋白可包含一个或多个纯化标签，其位于蛋白酶组分的N末端侧和/或易位组分的C末端侧。
虽然可使用任何纯化标签，但优选以下标签：
His标签(如6×组氨酸)，优选作为C末端和/或N末端标签
MBP标签(麦芽糖结合蛋白)，优选作为N末端标签
GST标签(谷胱甘肽S-转移酶)，优选作为N末端标签
His-MBP标签，优选作为N末端标签
GST-MBP标签，优选作为N末端标签
硫氧还蛋白标签，优选作为N末端标签
CBD标签(几丁质结合结构域)，优选作为N末端标签。
根据本发明的其他实施方式，可在融合蛋白中包含一种或多种其他肽间隔子分子。例如，可在纯化标签和融合蛋白分子的剩余部分之间使用肽间隔子，例如在N末端纯化标签和本发明的蛋白酶组分之间；和/或在C末端纯化标签和本发明的易位组分之间。
根据本发明的第二方面，提供了编码上述单链多肽的DNA序列。在本发明的优选方面中，该DNA序列以DNA载体一部分的形式制备，其中该载体包含启动子和终止子。
在优选的实施方式中，该载体所具有的启动子选自：
本发明的DNA构建体优选通过计算机模拟构建，随后通过常规DNA合成技术合成。
任选地根据待使用的最终宿主细胞(如大肠杆菌)表达系统针对密码子偏好修饰上述DNA序列信息。
优选筛选DNA骨架中任何固有核酸序列，其转录和翻译时会生成对应于第二肽编码序列所编码蛋白酶切割位点的氨基酸序列。可手动或在计算机软件(例如MapDraw程序，DNASTAR公司(DNASTAR Inc.))的辅助下进行筛选。
根据本发明的其他实施方式，提供了制备非细胞毒性试剂的方法，该方法包括：
a.使本发明的单链多肽融合蛋白接触能够切割蛋白酶切割位点的蛋白酶；
b.切割该蛋白酶切割位点，从而形成双链融合蛋白。
该方面提供了双链多肽，其通常模拟了梭菌全毒素的结构。更具体地，所得双链多肽通常具有以下结构：
a.第一链包含非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够切割伤害性感觉传入神经的胞吐融合器的蛋白；
b.第二链包含甘丙肽TM和易位结构域，其能够将蛋白酶从内体内跨内体膜易位至伤害性感觉传入神经的细胞溶质中；且
第一和第二链通过二硫键连接在一起。
在本发明的一个方面，本发明的单链或双链多肽用作药物/治疗性分子。
使用时，本发明的单链或双链多肽治疗、预防或缓解疼痛。
使用时，给予患者治疗有效量的本发明的单链或双链多肽。
根据本发明的其他方面，提供了本发明的单链或双链多肽在生产治疗、预防或缓解疼痛的药物中的应用。
根据相关方面，提供了在对象中治疗、预防或缓解疼痛的方法，包括给予所述患者治疗有效量的本发明的单链或双链多肽。
本文所述化合物可用于治疗患有一种或多种类型的慢性疼痛的患者，包括神经性疼痛、炎性疼痛、头痛、躯体疼痛、内脏疼痛和牵涉性疼痛。
本文所用“治疗”指通过医学手段处理。其包括例如给予本发明的化合物以预防疼痛或减轻其严重程度。
本文所用术语“疼痛”指任何不适的感觉经历，通常与身体疾病相关。对临床医生而言，该身体疾病可以是或不是显而易见的。疼痛有两种类型：慢性的和急性的。“急性疼痛”是突然发生的短期疼痛。例如，一种类型的急性疼痛是由于皮肤或其他浅层组织损伤而感觉到的皮肤疼痛，如由切割或烧灼导致。皮肤伤害感受器终止于紧邻皮肤的下方，且由于高浓度的神经末稍，其产生规整且局部的短期疼痛。“慢性疼痛”是除急性疼痛以外的疼痛。慢性疼痛包括神经性疼痛、炎性疼痛、头痛、躯体疼痛、内脏疼痛和牵涉性疼痛。
I.神经性疼痛
本发明的化合物可用于治疗由以下任意神经性疼痛病症导致或与其相关的疼痛。“神经性疼痛”指来自外周神经系统、中枢神经系统或上述两者的异常感觉输入，导致不适。
A.神经疼痛的症状
神经疼痛的症状可涉及持续、自发的疼痛，以及异常性疼痛(对通常非痛苦刺激的疼痛应答)、痛觉过敏(对通常仅导致轻度不适的疼痛刺激(如针刺)的加重应答)或痛觉过度(hyperpathia)(短期不适变成长时间严重的疼痛)。
B.神经疼痛的原因
神经疼痛可由以下任意原因导致。
1.创伤性损伤，例如神经压迫损伤(如神经挤压、神经拉伸、神经卡压或不完整的神经横断)、脊髓损伤(如脊髓的半侧切除)、截肢、挫伤、炎症(如脊髓的炎症)或手术过程。
2.缺血事件，包括例如中风和心脏病。
3.感染物
4.接触毒剂，包括例如药物、醇、重金属(如铅、砷、汞)、工业试剂(如来自胶的烟气、溶剂)或一氧化二氮。
5.疾病，包括例如炎性疾病、赘生性肿瘤、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、莱姆病、麻疯病、代谢疾病、外周神经疾病(如神经瘤)、单神经病或多神经病。
C.神经疼痛的类型
1.神经痛
神经痛是沿一条或多条特定神经辐射的疼痛，通常在神经结构上不具有任何可见的病理性变化。神经痛的原因各异。化学刺激、炎症、外伤(包括手术)、邻近结构(例如肿瘤)的挤压和感染都可导致神经痛。然而，在许多情况下，该原因是未知的或不可鉴定的。神经痛在老年人中最为常见，但其可出现在任意年龄段中。神经痛包括但不限于三叉神经痛、疱疹后神经痛、疱疹后神经痛、舌咽神经痛、坐骨神经和非典型面部疼痛。
神经痛是神经分布中的疼痛。示例是三叉神经痛、非典型面部疼痛和疱疹后神经痛(由带状疱疹或疱疹导致)。受影响的神经负责感应从下颌到额头的面部区域中的接触、温度和压力。该疾病通常导致短期的极痛苦疼痛，通常持续少于两分钟且只在面部一侧。该疼痛可以多种方式描述，如“麻木”、“尖锐”、“闪电般”、“烧灼”，甚至“痒”。在非典型形式的TN中，疼痛也可以剧烈或单纯疼痛的形式存在并长期持续。与TN相关的疼痛被认为是经历的最痛苦的疼痛之一。
简单的刺激(如吃、谈话、洗脸或任何轻度触碰或感觉)可以导致发作(甚至感受到微风时也会发作)。该发作可以成簇发作或单独发作。
症状包括位于各处的尖锐、麻木疼痛或持续、烧灼疼痛，通常在身体表面或靠近身体表面，在各时期中处于相同位置；沿特定神经路径的疼痛；受影响的身体部分由于疼痛导致功能受损，或者由于伴随的运动神经损伤导致肌无力；皮肤的敏感性和受影响皮肤区域(感觉类似于局部麻醉，如使用奴佛卡因)的麻木增加；以及解释为疼痛的任何接触或压力。移动也可以是疼痛性的。
三叉神经痛是最常见的神经痛形式。其影响面部的主要感觉神经——三叉神经(“三叉”在字面上表示“三个来源”，指该神经分为3个分支)。该病症涉及脸部一侧突然发生短期的严重疼痛，疼痛沿该侧三叉神经所控制的区域。该疼痛发作可以严重至导致面部扭曲(facial grimace)，这通常称作疼痛性抽搐(痛性抽搐)。有时，三叉神经痛的原因是血管或小肿瘤压迫神经。其他疾病(如多发性硬化(影响脑和脊髓的炎性疾病)、某些形式的关节炎和糖尿病(高血糖))也可导致三叉神经痛，但原因并非始终都被能鉴定到。在该病症中，某些动作(如咀嚼、谈话、吞咽或接触面部区域)可导致极痛苦疼痛的痉挛。
一种相关但不常见的神经痛影响舌咽神经，其提供了针对喉部的感觉。该神经痛的症状是位于喉部的短期、电击样的疼痛。
神经痛可在感染后发生，如带状疱疹，其由水痘-带状疱疹病毒(一种类型的疱疹病毒)导致。该神经痛在带状疱疹愈合后产生持续的烧灼疼痛。该疼痛因移动或接触受影响区域而恶化。并非所有经诊断具有带状疱疹的患者都会经历比带状疱疹更疼痛的疱疹后神经痛。该疼痛和敏感性可持续数月甚至数年。该疼痛通常为对任何触摸(但尤其是轻度触摸)无法忍受的敏感性形式。疱疹后神经痛不限于面部，其可发生在身体各处但通常发生在带状疱疹位置。由于疾病期间的疼痛和社会隔离，抑郁并非罕见。
疱疹后神经痛可能在最初的疱疹感染消失后长时间后衰弱。其他可能导致神经痛的感染性疾病是梅毒和莱姆病。
糖尿病是神经痛的另一常见原因。这一非常常见的医学问题在几乎每20名美国成年人中就会影响一人。糖尿病损伤了向神经提供循环的小动脉，导致神经纤维功能障碍并有时导致神经缺失。糖尿病可产生几乎任何神经痛，包括三叉神经痛、腕管综合征(手和腕的疼痛和麻木)和感觉异常性股痛(由股外侧皮神经损伤导致的大腿麻木和疼痛)。严格控制血糖可预防糖尿病性神经损伤并可加速神经痛患者的恢复。
与神经痛相关的其他医学病症是慢性肾机能不全和卟啉症(一种遗传疾病，其中身体自身无法排出体内血液正常分解后生成的某些物质)。某些药物也可导致该问题。
2.传入神经阻滞
传入神经阻滞表示缺失来自身体一部分的感觉输入并可由外周感觉纤维或中枢神经系统神经的中断所导致。传入神经阻滞疼痛综合征包括但不限于脑或脊髓的损伤、中风后疼痛、幻痛、截瘫、臂丛撕脱损伤、腰椎神经根病变。
3.复合性局部疼痛综合征(CRPS)
CPRS是由交感神经维持疼痛所导致的慢性疼痛综合征并以两种形式存在。CRPS 1目前代替了术语“反射性交感神经营养不良综合征”。其是慢性神经疾病，通常在轻度或重度损伤后发生在手臂或大腿中。CRPS 1与受影响肢体中的严重疼痛、指甲、骨和皮肤的变化以及对触摸的敏感性增加相关。CRPS 2代替了术语灼性神经痛，并由经鉴定的神经损伤导致。CRPS包括但不限于I型CRPS(反射性交感神经营养不良)和II型CRPS(灼性神经痛)。
4.神经病
神经病是神经中的功能性或病理性变化，且在临床上以感觉或运动神经元异常为特征。
中枢神经病是中枢神经系统中的功能性或病理性变化。
外周神经病是一种或多种外周神经中的功能性或病理性变化。外周神经将信息从你的中枢神经系统(脑和脊髓)传输至肌肉和其他组织并将来自你的皮肤、关节和其他组织的信息传输回你的脑。当这些神经无法将信息传输至脑和脊髓或者无法传输来自脑和脊髓的信息时，发生外周神经病，导致疼痛、感觉丧失或无法控制肌肉。在一些情况下，神经无法控制血管、肠和其他器官导致异常血压、消化问题和其他基本身体过程丧失。神经病的风险因素包括糖尿病、酗酒和接触某些化学物质和药物。一些人具有神经病的遗传倾向。长时间压迫神经是形成神经损伤的另一风险。压迫损伤可由长时间不移动(如长手术过程或长期生病)或由铸件、夹板、手镯、拐杖或其他装置对神经的压迫导致。多神经病表示通常相等地影响身体两侧的广泛过程。症状取决于受影响神经的类型。三种主要类型的神经是感觉神经、运动神经和自主神经。神经病可影响所有三种类型的神经中的任一种或组合。症状还取决于病症影响整个身体或仅影响一条神经(如同来自损伤)。慢性炎性多神经病的原因是异常免疫应答。特定的抗原、免疫过程和触发因素是可变的且在许多情况下是未知的。其可与其他病症一起发生，如HIV、炎性肠病、系统性红斑狼疮、慢性活动性肝炎和血细胞异常。
外周神经病可涉及单个神经或神经组功能或病理性变化(单神经病)或者影响多个神经的功能或病理性变化(多神经病)。
外周神经病
遗传性疾病
恰克-马利-杜斯氏疾病
弗里德希氏共济失调
全身性或代谢紊乱
糖尿病(糖尿病性神经病)
膳食性缺乏(特别是维生素B-12)
酗酒(酒精性神经病)
尿毒症(来自肾衰竭)
癌症
感染性或炎性病症
AIDS
肝炎
科罗拉多壁虱热
白喉
格-巴二氏综合征
无AIDS发展的HIV感染
麻疯病
莱姆病
结节性多动脉炎
类风湿性关节炎
结节病
干燥综合征
梅毒
系统性红斑狼疮
淀粉样
接触毒性化合物
嗅膏或其他毒性化合物
一氧化二氮
工业试剂——特别是溶剂
重金属(铅、砷、汞等)
继发于药物的神经病(如止痛剂肾病)
多方面原因
缺血(氧气减少/血流减少)
长时间接触低温
a.多神经病
多神经病是涉及多个外周神经损伤或破坏所致某一区域运动或感觉丧失的外周神经病。多神经病疼痛包括但不限于小儿麻痹后遗症(post-poliosyndrome)、乳房切除术后遗症(postmastectomy syndrome)、糖尿病性神经病、酒精性神经病、淀粉样、毒素、AIDS、甲状腺功能减退症、尿毒症、维生素缺乏、化疗诱导的疼痛、2',3'-双脱氧胞苷(ddC)处理、格-巴二氏综合征或法布瑞氏症。
b.单神经病
单神经病是涉及单个外周神经或神经组损伤或破坏所致某一区域运动或感觉丧失的外周神经病。单神经病最通常由损伤或外伤导致的局部区域损伤所致，但偶尔全身性疾病也可导致单独的神经损伤(如同多数性单神经炎)。常见原因是直接损伤、长时间压迫神经和由附近身体结构的溶胀或损伤压迫神经。损伤包括神经髓鞘(覆盖)或部分神经细胞(轴突)的破坏。该损伤延缓或阻止了脉冲沿神经的传导。单神经病可涉及任何身体部分。单神经病疼痛包括但不限于坐骨神经功能障碍、常见的腓骨神经功能障碍、桡神经功能障碍、尺骨神经功能障碍、颅神经单神经病VI、颅神经单神经病VII、颅神经单神经病III(压迫型)、颅神经单神经病III(糖尿病型)、腋神经功能障碍、腕管综合症、股神经功能障碍、胫神经功能障碍、贝耳氏麻痹、胸廓出口综合征、腕管综合症和第六(外展)神经麻痹。
c.广义外周神经病
广义外周神经病是对称的，通常由于影响外周神经系统整体的多种全身性疾病和疾病过程。它们可进一步细分为数个类别：
i.远端轴索病是神经元的一些代谢或毒性紊乱的结果。其原因可以是代谢疾病(如糖尿病)、肾衰竭、缺陷综合症(如营养不良和酒精中毒)或毒素或药物的影响。远端轴索病(即逆死性神经病)是一种类型的外周神经病，其是外周神经系统(PNS)神经元的一些代谢或毒性紊乱的结果。这是神经对代谢或毒性紊乱的最常见应答，且同样地其原因可以是代谢疾病(如糖尿病)、肾衰竭、缺陷综合症(如营养不良和酒精中毒)或毒素或药物的影响。远端轴索病的最常见原因是糖尿病，最常见的远端轴索病是糖尿病性神经病。
ii.髓鞘质病是由于对髓磷脂的初次攻击(primary attack)，该攻击导致脉冲传导的急性衰竭。最常见的原因是急性炎性脱髓鞘多神经病(AIDP，即格-巴二氏综合征)，而其他原因包括慢性炎性脱髓鞘综合征(CIDP)、遗传性代谢紊乱(如脑白质营养不良)或毒素。髓鞘质病是由于髓磷脂或髓鞘性施旺(Schwann)细胞的初次破坏，其结果是轴突完整但导致脉冲传导的急性衰竭。该脱髓鞘延缓或完全阻断了电脉冲沿神经的传导。最常见的原因是急性炎性脱髓鞘多神经病(AIDP，更常见的名称是格-巴二氏综合征)，而其他原因包括慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、遗传性代谢紊乱(如脑白质营养不良或恰克-马利-杜斯氏疾病)或毒素。
iii.神经元损伤(Neuronopathy)是外周神经系统(PNS)神经元破坏的结果。其原因可以是运动神经元疾病、感觉神经元损伤(如带状疱疹病毒)、毒素或自主功能障碍。神经毒素可导致神经元损伤，如化疗剂长春新碱。神经元损伤是由于外周神经系统(PNS)神经元损伤的功能障碍，其导致外周神经损伤。其原因可以是运动神经元疾病、感觉神经元损伤(如带状疱疹病毒)、毒性物质或自主功能障碍。具有神经元损伤的人可以不同方式存在，这取决于病因、其影响神经细胞的方式和受影响程度最大的神经细胞的类型。
iv.病灶嵌压性神经病(如胸廓出口综合征)
II.炎性疼痛
本发明的化合物可用于治疗由以下任意炎性病症导致或与其相关的疼痛。
A.关节炎疾病
关节炎疾病包括例如类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、痛风性关节炎、硬皮病、骨关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、莱特综合征(反应性关节炎)、成人斯蒂尔病、来自病毒感染的关节炎、来自细菌感染的关节炎(如淋病性关节炎和非淋病性细菌关节炎(脓毒性关节炎))、三级莱姆病(Tertiary Lyme disease)、结核性关节炎和来自真菌感染的关节炎(如芽生菌病)。
B.自身免疫疾病
自身免疫疾病包括，例如格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、恶性贫血、阿狄森氏病、I型糖尿病、系统性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、红斑狼疮、多发性硬化、重症肌无力、莱特综合征和格拉夫斯病(Grave’s disease)。
C.结缔组织疾病
结缔组织疾病包括例如脊柱关节炎、皮肌炎和纤维肌痛。
D.损伤
损伤(包括例如组织或关节的挤压、穿刺、拉伸)导致的炎症可导致慢性炎性疼痛。
E.感染
感染(包括例如结核病或间质性角膜炎)导致的炎症可导致慢性炎性疼痛。
F.神经炎
神经炎是一种影响神经或神经组的炎性过程。症状取决于所涉及的神经，但可包括疼痛、感觉异常、轻度瘫痪或感觉减退(麻木)。
示例包括：
a.臂丛神经炎
b.眼球后神经病，影响紧跟眼球后方的部分视神经的炎性过程。
c.视神经病，影响视神经的炎性过程，其导致受影响眼睛的视力突然减弱。视神经炎的原因未知。视神经(连接眼睛和脑的神经)的突发性炎症导致髓鞘的破坏和溶胀。该炎症偶尔可以是病毒感染的结果，或者其可以由自身免疫疾病(如多发性硬化)导致。风险因素与可能的原因相关。
d.前庭神经炎，导致影响前庭神经的炎性过程的病毒感染。
G.关节炎症
例如，关节炎症(如由黏液囊炎或肌腱炎导致的关节炎症)可导致慢性炎性疼痛。
III.头痛
本发明的化合物可用于治疗由以下任意头痛病症导致或与其相关的疼痛。头痛(医学上称为头痛(cephalgia))是头部发生的轻度至重度疼痛病症，有时颈部或上背部疼痛也可被解释为头痛。其可显示潜在的局部或全身性疾病或可能是疾病本身。
A.肌肉性/肌原性头痛
肌肉性/肌原性头痛似乎涉及面部和颈部肌肉的拉紧或紧张，其可辐射至额头。紧张性头痛是最常见的肌原性头痛形式。
紧张性头痛是一种涉及头、头皮或颈部疼痛或不适的病症，通常与这些区域中的肌肉紧张相关。紧张性头痛由颈部和头皮肌肉的收缩导致。该肌肉收缩的一个原因是对压力、抑郁或焦虑作出应答。引起头部长时间固定于一个位置而没有移动的任何活动都可导致头痛。这类活动包括打字或使用计算机、使用手的精细工作和使用显微镜。在寒冷的房间里睡觉或睡觉时颈部处于不正常位置也可触发该类型的头痛。紧张型头痛包括但不限于偶发性紧张性头痛和慢性紧张性头痛。
B.血管性头痛
最常见的血管性头痛类型是偏头痛。其他类型的血管性头痛包括丛集性头痛(其导致重复发生紧张性疼痛)和高血压导致的头痛。
1.偏头痛
偏头痛是一种通常涉及复发性头痛的异质性疾病。偏头痛与其他头痛不同，因为其发生时具有其他症状，如恶心、呕吐或对光敏感。在大多数人中，仅在头部一侧感觉到搏动性疼痛。在患有不同的潜在病理生理学和遗传学机制的患者亚组中，可以看到某些临床特征，如先兆症状的类型、存在前驱症状或诸如眩晕的相关症状。偏头痛包括但不限于，无先兆的偏头痛(常见偏头痛)、有先兆的偏头痛(经典偏头痛)、月经性偏头痛、偏头痛等位发作(无头性头痛)、复杂型偏头痛、腹型偏头痛和混合型紧张性偏头痛。
2.丛集性头痛
丛集性头痛影响头部一侧(单侧)且与眼睛撕裂和鼻塞相关。其成簇发作，每天在同一时间重复发生，持续数周然后缓解。
D.高血压性头痛
E.牵引性和炎性头痛
牵引性和炎性头痛通常是其他疾病的症状，其范围从中风到鼻窦感染。
F.激素性头痛
G.反弹性头痛
反弹性头痛也称作药物滥用性头痛，在过于频繁地使用药物以缓解头痛时发生。反弹性头痛通常每天发生且可以是非常疼痛。
H.慢性鼻窦炎性头痛
鼻窦炎是鼻旁窦的炎症，包括细菌、真菌、病毒、过敏或自身免疫类型。慢性鼻窦炎是常见的感冒中最常见的并发症之一。症状包括：鼻塞、面部疼痛、头痛、发烧、全身不适、深绿色或黄色排泄物、感觉到面部“丰满”(弯腰时更加严重)。在少量病例中，慢性上颌鼻窦炎也可由来自牙齿感染的细菌扩散所导致。慢性增生性嗜酸性鼻窦炎是慢性鼻窦炎的非感染形式。
I.器质性头痛
J.癫痫性头痛
癫痫性头痛是与癫痫发作相关的头痛。
IV.躯体疼痛
本发明的化合物可用于治疗由以下任意躯体疼痛病症导致或与其相关的疼痛。躯体疼痛来源于韧带、腱、骨、血管甚至神经本身。其可使用躯体伤害感受器检测。这些区域中疼痛受体的缺乏产生了比皮肤疼痛持续时间更长的钝性、位置不确定的疼痛；示例包括扭伤和骨折。其他示例包括以下这些。
A.过度肌肉紧张
过度肌肉紧张可由例如扭伤或拉伤导致。
B.重复性运动障碍
重复性运动障碍的原因可以是手、腕、肘、肩、颈、背、臀、膝、脚、大腿或脚踝的过度使用。
C.肌肉疾病
肌肉疾病导致的躯体疼痛包括例如多肌炎、皮肌炎、狼疮、纤维肌痛、风湿性多肌痛和横纹肌溶解。
D.肌痛
肌痛是肌肉疼痛并且是许多疾病和病症的症状。最常见的肌痛原因是过度使用或过度拉伸肌肉或肌肉组。没有外伤病史的肌痛通常是由于病毒感染。长期肌痛可能指示代谢性肌病、一些营养缺乏或慢性疲劳综合征。
E.感染
感染可导致躯体疼痛。这类感染的示例包括肌肉中脓肿、旋毛虫病、流感、莱姆病、疟疾、落矶山斑疹热、禽流感、常见的感冒、社区获得性肺炎、脑膜炎、猴痘、严重急性呼吸道综合征、中毒性休克综合征、旋毛虫病、伤寒和上呼吸道感染。
F.药物
药物可导致躯体疼痛。这类药物包括例如可卡因、用于降低胆固醇的他汀类药物(如阿托伐他汀、辛伐他汀和洛伐他汀)和用于降低血压的ACE抑制剂(如依那普利和卡托普利)。
V.内脏疼痛
本发明的化合物可用于治疗由以下任意内脏疼痛病症导致或与其相关的疼痛。内脏疼痛来源于身体的内脏或器官。内脏伤害感受器位于身体器官和内腔中。该区域中甚至更严重的内脏感受器缺乏产生疼痛，该疼痛通常比躯体疼痛更疼痛并持续更长时间。内脏疼痛极难定位，且对内脏组织的一些损伤表现出“牵涉性”疼痛，此时感觉位于与损伤位点完全不相关的区域。内脏疼痛的示例包括以下。
A.功能性内脏疼痛
功能性内脏疼痛包括例如肠易激综合征和慢性功能性腹痛(CFAP)，功能性便秘和功能性消化不良，非心脏性胸痛(NCCP)和慢性腹痛。
B.慢性胃肠炎症
慢性胃肠炎症包括例如胃炎、炎性肠病(例如克罗恩病、溃疡性结肠炎、显微结肠炎、憩室炎和胃肠炎)、间质性膀胱炎、肠缺血、胆囊炎、阑尾炎、胃食管返流、溃疡、肾石病、尿道感染、胰腺炎和疝气。
C.自身免疫性疼痛
自身免疫性疼痛包括例如结节病和血管炎。
D.器质性内脏疼痛
器质性内脏疼痛包括例如肠道的外伤性、炎性或退化性损伤导致的疼痛或者由肿瘤冲击感觉神经支配产生的疼痛。
E.治疗诱导的内脏疼痛
治疗诱导的内脏疼痛包括例如化疗产生的疼痛或放疗产生的疼痛。
VI.牵涉性疼痛
本发明的化合物可用于治疗由以下任意牵涉性疼痛病症导致或与其相关的疼痛。
牵涉性疼痛来源于独立于疼痛刺激位点的区域的疼痛。通常，当神经在其来源处或附近受到压迫或损伤时产生牵涉性疼痛。在该情况下，疼痛的感觉通常在神经支配的区域中被感受到，甚至当损伤起源于他处时也是如此。常见的示例出现在椎间盘突出症中，其中起源于脊髓的神经根受到附近的盘材料压迫。虽然疼痛起源于损伤的盘本身，但疼痛还会在受压迫神经所支配区域中被感受到(例如大腿、膝或脚)。减轻神经根上的压迫可缓解牵涉性疼痛，前提是未出现永久性神经损伤。心肌梗塞(缺失了至一部分心肌组织的血流)可能是最熟知的牵涉性疼痛示例；感觉可以受限制的感觉发生在上胸部，或是左肩、手臂甚至手痒。
本发明涉及广泛的疼痛病症，特别是慢性疼痛病症。优选的病症包括癌性和非癌性疼痛、炎性疼痛和神经性疼痛。本发明的阿片类药物融合体特别适用于炎性疼痛，但对神经性疼痛的适宜性较差。甘丙肽融合体更适用于神经性疼痛。
使用时，本发明的多肽通常以与药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂联用的药物组合物的形式使用，但可根据给药模式调整组合物的精确形式。优选给予哺乳动物，更优选给予人。
例如，该多肽可以无菌溶液的形式使用，用于关节内给药或颅内给药。优选脊椎注射(例如硬膜外或鞘内)。
本发明多肽给药的剂量范围是产生所需治疗作用的那些剂量。应理解，所需剂量范围取决于组分的确切性质、给药途径、制剂的性质、患者的年龄、患者病症的性质、程度或严重性、禁忌症(如果有)和主治医师的判断。
合适的每日剂量为0.0001-1mg/kg的范围，优选0.0001-0.5mg/kg，更优选0.002-0.5mg/kg，且特别优选0.004-0.5mg/kg。单位剂量可在低至1微克至30mg之间变化，但通常在每剂量0.01至1mg的区域中，其可每日给予或优选以更低的频率给予，如每周或每六月。
特别优选的剂量方案是基于以2.5ng的融合蛋白作为1X剂量。为此，优选的剂量是1X–100X范围(即2.5-250ng)。该剂量范围显著低于其他类型的麻醉分子(如NASIDS、吗啡和加巴喷丁)所用剂量范围(即至少低10倍，通常低100倍)。此外，当基于摩尔进行相同比较时，上述差异被显著放大，这是因为本发明的融合蛋白的Mw显著大于常规的“小”分子治疗剂。
然而，预期所需剂量会出现广泛变化，这取决于组分的确切性质和各种给药途径的不同效率。
可使用标准经验程序调节这些剂量水平的变化以进行优化，这是本领域所熟知的。
适用于注射的组合物可以是溶液、悬浮液或乳液形式，或者是使用前溶解或悬浮于合适载剂中的干粉。
通常使用无热原的无菌载剂制备流体单位剂量形式。根据所使用的载剂和浓度，可将活性成分溶解或悬浮于载剂中。
在制备可给予的溶液过程中，可将多肽溶解在载剂中，需要时通过加入氯化钠将溶液制备为等渗并采用无菌技术使用无菌滤器进行过滤以对溶液进行灭菌，之后填充至合适的无菌药瓶或安瓿瓶中并密封。或者，如果溶液稳定性是足够的，则可通过高压灭菌对密封在容器内的溶液进行灭菌。
优选地，可将添加剂溶解在载剂中，如缓冲剂、溶解剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、悬浮剂或乳化剂。
使用前溶解或悬浮于合适载剂中的干粉可通过在无菌区域中使用无菌技术将预灭菌的药物物质和其他成分填充至无菌容器内来制备。
或者，可将多肽和其他成分溶解在水性载剂中，在无菌区域中使用无菌技术通过过滤对溶液进行灭菌并分配至合适的容器中。随后冷冻干燥产物并无菌密封容器。
以基本相同的方式制备适用于肌肉内、皮下或皮内注射的胃肠道外悬浮液，不同之处在于将无菌组分悬浮而非溶解在无菌载剂中，且不可通过过滤进行灭菌。组分可以无菌状态分离，或者可在分离后对其进行灭菌，例如通过伽玛射线辐照。
优选地，可在组合物中包含悬浮剂(如聚乙烯基吡咯烷酮)以促进组分的均匀分布。
定义部分
靶向部分(TM)表示与特定试剂相关的任何化学结构，所述试剂与结合位点功能性相互作用以导致试剂和目标细胞表面之间的物理连接。在本发明的上下文中，目标细胞是伤害性感觉传入神经。术语TM包括能够结合目标细胞上结合位点的任何分子(即天然产生的分子或其化学/物理修饰的变体)，该结合位点能够内化(如内体形成)——也称为受体介导的胞吞作用。该TM可具有内体膜易位功能，其中本发明的试剂中无需存在单独的TM和易位结构域组分。
本发明的TM结合(优选特异性结合)伤害性感觉传入神经(如初级伤害性传入神经)。为此，特异性结合指TM与伤害性感觉传入神经(如初级伤害性传入神经)的结合亲和性高于其与其他神经元(如非疼痛传入神经)和/或运动神经元(即梭菌神经毒素全毒素的天然靶标)的结合亲和性。术语“特异性结合”还指给定TM结合给定受体(例如甘丙肽受体，如GALR1、GALR2和/或GALR3受体)的结合亲和性(Ka)为106M-1或更高，优选107M-1或更高，更优选108M-1或更高，且最优选109M-1或更高。
出于本发明的目的，激动剂被定义为能够刺激目标细胞中胞吐融合过程的分子，该过程易于被能够切割所述目标细胞中胞吐融合器蛋白的蛋白酶抑制。
因此，本发明的特定的激动剂定义排除了许多常规情况下被认为是激动剂的分子。
例如，神经生长因子(NGF)是一种激动剂，其能够通过结合TrkA受体促进神经元分化。然而，根据上述标准NGF不是一种激动剂，因为其不是胞吐融合的主要诱导物。此外，NGF刺激的过程(即细胞分化)不易于被非细胞毒性毒素分子的蛋白酶活性抑制。
与蛋白联用时，术语“片段”指具有所用蛋白的至少35个，优选至少25个，更优选至少20个且最优选至少19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸残基的肽。
与蛋白联用时，术语“变体”指含有一个或多个氨基酸类似物(如非天然氨基酸)或经取代连接的肽或蛋白的肽片段。
与蛋白联用时，术语“衍生物”指包含所用蛋白和其他肽序列的蛋白。该其他肽序列优选应不干扰基础折叠和原始蛋白的构象结构。两种或多种肽(或片段、或变体)可连接在一起以形成衍生物。或者，可将肽(或片段、或变体)与不相关分子(如第二、不相关的肽)相连。衍生物可以是化学合成的，但通常通过重组核酸方法制备。可包括其他组分，如脂和/或多肽和/或多肽组分。
术语非细胞毒性指所用蛋白酶分子不会杀死其重新靶向的目标细胞。
本发明的蛋白酶包括所有天然产生的非细胞毒性蛋白酶，其能够切割真核细胞中胞吐融合器的一种或多种蛋白。
本发明的非细胞毒性蛋白酶优选是细菌蛋白酶。在一个实施方式中，该非细胞毒性蛋白酶选自梭菌属或奈瑟球菌属(如梭菌L链，或奈瑟球菌IgA蛋白酶，优选来自淋病奈瑟球菌)。术语蛋白酶包括其功能等同的片段和分子。
本发明还包括经修饰的非细胞毒性蛋白酶，其包括不在天然中出现的氨基酸序列和/或合成的氨基酸残基，前提是该经修饰的蛋白酶仍表现出上述蛋白酶活性。
本发明的蛋白酶优选表现出丝氨酸或金属蛋白酶活性(如内肽酶活性)。该蛋白酶优选是对SNARE蛋白(如SNAP-25、突触小泡蛋白/VAMP或突触融合蛋白)特异的。
值得一提的是神经毒素的蛋白酶结构域，例如细菌神经毒素的蛋白酶结构域。因此，本发明包括天然产生的神经毒素结构域的应用以及所述天然产生的神经毒素的经重组制备的形式。
示例性神经毒素由梭菌生成，且术语梭菌神经毒素包括由破伤风梭菌(C.tetani)(TeNT)和肉毒梭菌(C.botulinum)(BoNT)血清型A-G生成的神经毒素，以及由巴拉提尼梭菌(C.baratii)和丁酸梭菌(C.butyricum)生成的密切相关的BoNT样神经毒素。上述缩写在本说明书全文中使用。例如，名称BoNT/A指BoNT(血清型A)的神经毒素来源。相应的命名应用于其他BoNT血清型。
术语L链或LC片段指神经毒素的L链的组分，该片段表现出金属蛋白酶活性且能够通过蛋白水解切割胞吐作用中涉及的囊泡和/或质膜相关蛋白。
易位结构域是能够将蛋白酶(或其片段)易位至目标细胞中的分子，使得蛋白酶活性在目标细胞的细胞溶质中得到功能性表达。可通过任意一种常规试验确定任何分子(如蛋白或肽)是否具有本发明所需的易位功能。
例如，Shone C.(1987)描述了使用脂质体的体外试验，其中使用测试分子进行攻击。通过脂质体中释放的容易监测的K+和/或标记的NAD来确认是否存在所需的易位功能[参见Shone C.(1987)Eur.J.Biochem；卷167(1)：第175-180页]。
Blaustein R.(1987)提供了其他示例，其描述了使用平面磷脂双层膜的简单体外试验。使用测试分子攻击膜并通过跨所述膜传导的增加确定所需易位功能[参见Blaustein(1987)FEBS Letts；卷226，1号：第115-120页]。
适用于本发明的评估膜融合并从而鉴定易位结构域的其他方法参见Methods in Enzymology(《酶学中的方法》)卷220和221，Membrane FusionTechniques(《膜融合技术》)，部分A和B，学术出版社(Academic Press)1993。
该易位结构域优选能够在低pH条件下在脂膜中形成离子渗透孔。优选地，已发现仅使用蛋白分子中能够在内体膜内形成孔的那些部分。
该易位结构域可获自微生物蛋白来源，特别是获自细菌或病毒蛋白来源。因此，在一个实施方式中，该易位结构域是酶(如细菌毒素或病毒蛋白)的易位结构域。
文献记载了细菌毒素分子的某些结构域能够形成这类孔。还已知某些病毒表达的膜融合蛋白的易位结构域能够形成这类孔。本发明中可使用这类结构域。
该易位结构域可以是梭菌来源，即HN结构域(或其功能性组分)。HN表示梭菌神经毒素的H链的一部分或片段，大致相对于H链的氨基末端一半，或者对应于完整H链中该片段的结构域。优选H链基本缺失H链的HC组分的天然结合功能。为此，可通过删除HC氨基酸序列来去除HC功能(通过核酸酶或蛋白酶处理在DNA合成水平或在合成后水平上)。或者，可通过化学或生物处理灭活HC功能。因此，该H链优选无法结合目标细胞上天然梭菌神经毒素(即全毒素)结合的结合位点。
在一个实施方式中，该易位结构域是梭菌神经毒素的HN结构域(或其片段)。合适的梭菌易位结构域的示例包括：
肉毒菌A型神经毒素-氨基酸残基(449-871)
肉毒菌B型神经毒素-氨基酸残基(441-858)
肉毒菌C型神经毒素-氨基酸残基(442-866)
肉毒菌D型神经毒素-氨基酸残基(446-862)
肉毒菌E型神经毒素-氨基酸残基(423-845)
肉毒菌F型神经毒素-氨基酸残基(440-864)
肉毒菌G型神经毒素-氨基酸残基(442-863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-879)
对于肉毒梭菌和破伤风梭菌中毒素产生的遗传基础的其他详细信息，我们参考了Henderson等(1997)The Clostridia:Molecular Biology and Pathogenesis(《梭菌：分子生物学和发病机制》)，学术出版社。
术语HN包括天然产生的神经毒素HN部分和具有天然中未出现的氨基酸序列和/或合成的氨基酸残基的经修饰的HN部分，只要该经修饰的HN部分仍显示上述易位功能。
或者，该易位结构域可以是非梭菌来源(参见表4)。非梭菌易位结构域来源的示例包括但不限于白喉毒素的易位结构域[O＝Keefe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89,6202-6206；Silverman等，J.Biol.Chem.(1993)269,22524-22532；和London,E.(1992)Biochem.Biophys.Acta.,1112,25-51页]，thetranslocation domain of Pseudomonas exotoxin type A(A型假单胞菌外毒素的易位结构域)[Prior等.Biochemistry(1992)31,3555-3559]，the translocationdomains of anthrax toxin(炭疽毒素的易位结构域)[Blanke等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93,8437-8442]，a variety of fusogenic or hydrophobic peptides oftranslocating function(多种易位功能的促融合或疏水性肽)[Plank等，J.Biol.Chem.(1994)269,12918-12924；和Wagner等(1992)PNAS,89,7934-7938页]和两亲肽[Murata等(1992)Biochem.,31,1986-1992页]。该易位结构域可以是天然产生的蛋白中存在的易位结构域的镜像，或者可包括氨基酸变体，只要该变体不破坏易位结构域的易位能力。
适用于本发明的病毒易位结构域的具体示例包括某些病毒表达的膜融合蛋白的易位结构域。例如，Wagner等(1992)和Murata等(1992)描述了来源于流感病毒血凝素N末端区域的多种促融和两亲肽的易位(即膜融合和囊泡形成)功能。已知具有所需易位活性的其他病毒表达的膜融合蛋白是西门利克森林病毒(SFV)促融肽的易位结构域、水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的易位结构域、SER病毒F蛋白的易位结构域和泡沫病毒包膜糖蛋白的易位结构域。在本发明的上下文中，病毒编码的Aspike蛋白具有特定的应用，例如SFV的E1蛋白和VSV的G蛋白的G蛋白。
下表中所列易位结构域的应用包括其序列变体的应用。变体可包含一个或多个保守性核酸取代和/或核酸缺失或插入，前提是该变体具有所需的易位功能。变体还可包含一个或多个保守性氨基酸取代和/或氨基酸缺失或插入，只要该变体具有所需的易位功能。
现在对附图进行简要说明，其图示了本发明的各方面和/或各实施方式。
图1-LC/A-间隔子-甘丙肽-间隔子-HN/A融合蛋白的纯化
使用实施例3所述方法，从大肠杆菌BL21细胞中纯化LC/A-GS18-甘丙肽-GS20-HN/A融合蛋白。简言之，将细胞裂解后获得的可溶物质施加于镍填充亲和捕获柱。结合的蛋白使用100mM咪唑洗脱，使用肠激酶处理以激活融合蛋白并使用因子Xa处理以除去麦芽糖结合蛋白(MBP)标签。随后将激活的融合蛋白重新施加于第二镍填充亲和捕获柱。通过SDS-PAGE(A图)和Western印迹(B图)评估来自纯化步骤的样品。抗甘丙肽抗血清(获自阿柏堪穆公司(Abcam))和抗his标签抗血清(获自凯杰公司(Qiagen))用作Western印迹的一抗。含有或不含还原剂的最终经纯化材料分别示于图A中标记了[-]和[+]的泳道。图A，泳道1＝基准梯标记物；2＝可溶性组分；3＝第一His产物；4＝激活的经纯化蛋白；5＝第二His产物；6＝最终经纯化蛋白5μl；7＝最终经纯化蛋白10μl；8＝最终经纯化蛋白20μl；9＝最终经纯化蛋白5μl+DTT；10＝最终经纯化蛋白10μl+DTT。图B，泳道1＝基准梯标记物；2＝可溶性组分；3＝第一His产物；4＝激活的经纯化蛋白；5＝第二His产物；6＝最终经纯化蛋白2μl；7＝最终经纯化蛋白5μl；8＝最终经纯化蛋白10μl；9＝最终经纯化蛋白2μl+DTT；10＝最终经纯化蛋白5μl+DTT。
图2-LC/C-间隔子-甘丙肽-间隔子-HN/C融合蛋白的纯化
使用实施例3所述方法，从大肠杆菌BL21细胞中纯化LC/C-甘丙肽-HN/C融合蛋白。简言之，将细胞裂解后获得的可溶物质施加于镍填充亲和捕获柱。结合的蛋白使用100mM咪唑洗脱，使用肠激酶处理以激活融合蛋白并随后重新施加于第二镍填充亲和捕获柱。通过SDS-PAGE(A图)和Western印迹(B图)评估来自纯化步骤的样品。抗甘丙肽抗血清(获自阿柏堪穆公司)和抗his标签抗血清(获自凯杰公司)用作Western印迹的一抗。含有或不含还原剂的最终经纯化材料分别示于图A中标记了[-]和[+]的泳道。图A，泳道1＝基准梯标记物；2＝可溶性组分；3＝第一柱产物；4＝肠激酶激活的蛋白；5＝最终产物0.1mg/ml(5μl)；6＝最终产物0.1mg/ml+DTT(5μl)；7＝最终产物0.1mg/ml(10μl)；8＝最终产物0.1mg/ml+DTT(10μl)。图B，泳道1＝Magic标记；2＝可溶性组分；3＝第一His标签柱产物；4＝激活的融合体；5＝经纯化的0.1mg/ml(5μl)；6＝经纯化的0.1mg/ml+DTT(5μl)；7＝经纯化的0.1mg/ml+100mm DTT(10μl)；8＝经纯化的0.1mg/ml+100mm DTT(10μl)+DTT。
图3–LC-间隔子-甘丙肽-间隔子-HN融合蛋白与LC-HN-甘丙肽融合蛋白的SNARE切割效力的比较
图A和B：评估了CHO GALR1SNAP25细胞中甘丙肽融合体切割SNAP-25的能力。转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞使其表达GALR1受体。进一步转染所述细胞以表达SNARE蛋白(SNAP-25)。使转染的细胞接触不同浓度的不同甘丙肽融合蛋白，持续24小时。对细胞蛋白通过SDS-PAGE分离，进行Western印迹并使用抗SNAP-25探测以促进SNAP-25切割的评估。通过密度计量分析计算经切割的SNAP-25的百分比。数据清楚地显示，LC-间隔子-甘丙肽-间隔子-HN融合体(融合体1)比LC-HN-甘丙肽融合体和未结合配体的LC/A-HN/A对照分子更有效。
图4–使用具有不同血清型骨架的本发明甘丙肽融合蛋白的CHO-GALCHO-GALR1SNAP-25切割试验中的GALR1受体激活研究
转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞使其表达GALR1受体和SNAP-25。所述细胞用于测量使用甘丙肽配体激活受体时出现的cAMP缺失，该测量使用基于FRET的cAMP试剂盒(来自帕金埃尔默公司(Perkin Elmer)的LANCE试剂盒)。使转染的细胞接触不同浓度的具有不同血清型骨架的甘丙肽(GA16)融合蛋白(即肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C和D)，持续2小时。随后加入检测混合物并在室温下孵育24小时以检测cAMP水平，该检测混合物含有荧光标记的cAMP示踪剂(铕-链霉亲和素/生物素-cAMP)和荧光(Alexa)标记的抗cAMP抗体。随后在320nM处激发样品并在665nM处测量发射的光以测定cAMP水平。该数据显示具有不同血清型骨架的本发明甘丙肽融合蛋白激活了GALR1受体。
图5–在CHO-GALR1SNAP-25切割试验中通过甘丙肽(GA16和GA30)融合蛋白切割SNARE蛋白
转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞使其表达GALR1受体。进一步转染所述细胞以表达SNARE蛋白(SNAP-25)。使转染的细胞接触不同浓度的不同甘丙肽融合蛋白，持续24小时。对细胞蛋白通过SDS-PAGE分离，进行Western印迹并使用抗SNAP-25探测以促进SNAP-25切割的评估。通过密度计量分析计算经切割的SNAP-25的百分比。该数据显示具有甘丙肽-16和甘丙肽-30配体的甘丙肽融合蛋白切割SNARE蛋白。此外，该数据确认了在非细胞毒性蛋白酶组分和蛋白酶切割位点之间具有GS5、GS10和GS18间隔子的甘丙肽融合蛋白是有功能的。
图6–使用甘丙肽融合蛋白的体内爪守卫试验(paw guarding assay)的结果
伤害性屈肌反射(也称为爪守卫试验)是一种快速回缩运动，其构建了针对可能的肢损伤的保护性机制。可通过使用低剂量辣椒素麻醉的大鼠中肌电图(EMG)应答、电刺激或辣椒素敏化的电应答的评估对其进行定量。对300-380g雄性SD大鼠使用本发明融合蛋白进行足底内预处理(24小时)。通过在10秒内注射0.006％辣椒素(10μl，在PBS中(7.5％DMSO))实现爪守卫的诱导。这产生了来自二头肌肌肉的强烈反射应答。伤害性屈肌反射的减少/抑制显示测试物质表现出抗伤害性作用。该数据显示了本发明的甘丙肽融合蛋白的抗伤害性作用。
图7–辣椒素诱导的热痛觉过敏试验中的甘丙肽融合蛋白效力
评价了不同的本发明甘丙肽融合蛋白抑制辣椒素诱导的热痛觉过敏的能力。对SD大鼠使用融合蛋白进行足底内预处理并在24小时后注射0.3％辣椒素并将大鼠置于25℃玻璃板上(大鼠置于丙烯盒内，放在25℃玻璃板上)。光束(可调节的光强度)聚焦在后爪上。传感器检测了爪的移动，停止计时器。爪回缩延时是将爪从热源处移开的时间(截留值为20.48秒)。爪回缩延时的减少/抑制显示测试化合物表现出抗伤害性作用。编号1＝LC-HN-GA16；编号2＝LC-HN-GA30；编号3＝LC-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN-HT；编号4＝LC-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN-HT；编号5＝BOTOX；编号6＝吗啡。该数据显示，与C末端具有配体的融合蛋白相比，本发明的甘丙肽融合蛋白具有增强的抗伤害性作用。
图8–辣椒素诱导的热痛觉过敏试验中的甘丙肽融合蛋白效力
评价了不同的本发明甘丙肽融合蛋白抑制辣椒素诱导的热痛觉过敏的能力。对SD大鼠使用融合蛋白进行足底内预处理并在24小时后注射0.3％辣椒素并将大鼠置于25℃玻璃板上(大鼠置于丙烯盒内，放在25℃玻璃板上)。光束(可调节的光强度)聚焦在后爪上。传感器监测了爪的移动，停止计时器。爪回缩延时是将爪从热源处缩回所需时间(截留值为20.48秒)。爪回缩延时的减少/抑制显示测试物质表现出抗伤害性作用。该数据显示了具有不同血清型骨架(即A、B、C和D)的本发明甘丙肽融合蛋白的抗伤害性作用。
图9–具有单个和两个间隔子的甘丙肽融合蛋白的激活
在非细胞毒性蛋白酶组分和靶向部分组分之间缺少本发明的第一间隔子(间隔子1)的甘丙肽融合蛋白难以使用蛋白酶激活(图A和B)。图C显示了同时具有第一间隔子(间隔子1)和第二间隔子(间隔子2)的本方面甘丙肽融合蛋白的增强的激活。图A和B：1)基准梯标记物；2)未激活的对照；3)未激活的对照+DTT；4)蛋白酶激活的蛋白+0.0mM ZnCl2；5)蛋白酶激活的蛋白+0.0mM ZnCl2+DTT；6)蛋白酶激活的蛋白+0.2mM ZnCl2；7)蛋白酶激活的蛋白+0.2mM ZnCl2+DTT；8)蛋白酶激活的蛋白+0.4mM ZnCl2；9)蛋白酶激活的蛋白+0.4mM ZnCl2+DTT；10)蛋白酶激活的蛋白+0.8mM ZnCl2；11)蛋白酶激活的蛋白+0.8mM ZnCl2+DTT。图C：1)基准梯标记物；2)未激活的对照25℃；3)未激活的对照25℃+DTT；4)蛋白酶激活的蛋白25℃；5)蛋白酶激活的蛋白25℃+DTT；6)基准梯标记物。
SEQ ID NO
当以下任意SEQ ID NO中显示初始的Met氨基酸残基或相应初始密码子时，所述残基/密码子是可选的。
实施例
实施例1–甘丙肽融合蛋白的构建和激活
LC/A和HN/A骨架克隆的制备
以下方法制备了LC和HN片段，其用作用于多结构域融合表达的组分骨架。该实施例是基于制备基于血清型A的克隆(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)，但该方法和过程可等同地应用于其他血清型(即A、B、C、D和E血清型)，如血清型B(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)和血清型C(SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)的序列表所示。
克隆和表达载体的制备
pCR 4(英杰公司(Invitrogen))是选择的标准克隆载体，选择的原因是该载体内缺少限制性序列以及用于简易构建体确认的邻近测序引物位点。该表达载体是基于pMAL(NEB公司)表达载体，其在多克隆位点内具有用于构建体插入的正确方向的所需限制性序列(BamHI-SalI-PstI-HindIII)。已删除表达载体的片段以产生不可流通的(non-mobilisable)质粒且已插入多种不同的融合标签以增加纯化选项。
蛋白酶(如LC/A)插入的制备
通过以下两种方法之一生成LC/A(SEQ ID NO1)：
通过LC/A氨基酸序列的回译(back translation)来设计DNA序列[LC/A氨基酸序列获自可自由使用的数据库来源，如GenBank(登录号P10845)或Swissprot(登录位点BXA1_CLOBO)，其中使用多种反向翻译软件工具之一(例如EditSeqbest大肠杆菌反向翻译(DNASTAR公司)或Backtranslation工具v2.0(恩特勒孔公司(Entelechon)))]。将BamHI/SalI识别序列分别整合入序列的5’和3’端，同时维持正确的阅读框。在回译期间筛选DNA序列中整合的限制性酶切割序列(使用软件，如MapDraw，DNASTAR公司)。从提出的编码序列中手动删除被发现与克隆系统所需的那些序列共同的任何切割序列，确保维持共同的大肠杆菌密码子使用。通过软件程序(如图形密码子使用分析器(Graphical Codon Usage Analyser)(基因技术公司(Geneart)))评估大肠杆菌密码子使用，并通过参考已公开的密码子使用表(例如GenBank Release 143，2004年9月13日)评估GC百分比含量和密码子使用率。随后商业合成含有LC/A开放阅读框(ORF)的优化的DNA序列(例如通过恩特勒孔公司、基因技术公司或西格玛吉诺思公司(Sigma-Genosys))并在pCR 4载体中提供。
替代性方法是从现有DNA序列中进行PCR扩增，其中5’和3’PCR引物中分别整合有BamHI和SalI限制性酶序列。完整的寡核苷酸引物由供应商(如MWG公司或西格玛吉诺思公司)化学合成，使得各引物对都能够与梭菌目标DNA延伸侧向的相对链(3’端彼此“相向”)杂交，两条DNA链各自对应一个寡核苷酸。为生成PCR产物，将对梭菌DNA序列特异的短寡核苷酸引物对与梭菌DNA模板和其他反应组分混合并置于可自动改变反应试管孵育温度的仪器中(“PCR仪”)，在约94℃(用于变性)、55℃(用于寡核苷酸退火)和72℃(用于合成)之间循环。PCR产物扩增所需的其他试剂包括DNA聚合酶(如Taq或Pfu聚合酶)，等摩尔含量(50-200μM)的构建DNA嵌段的四种寡核苷酸dNTP以及适用于针对Mg2+浓度(0.5-5mM)进行优化的酶的缓冲液。
使用用于Taq PCR产物的TOPO TA克隆或用于Pfu PCR产物的Zero BluntTOPO克隆将扩增产物克隆至pCR 4中(两种试剂盒都可购自英杰公司)。通过测序检查所得克隆。随后可使用定点诱变删除与克隆系统不相容的任何其他限制性片段[例如使用Quickchange(司查塔基公司(Stratagene Inc.))]。
易位(如HN)插入的制备
通过以下两种方法之一生成HN/A(SEQ ID NO2)：
通过HN/A氨基酸序列的回译来设计DNA序列[HN/A氨基酸序列获自可自由使用的数据库来源，如GenBank(登录号P10845)或Swissprot(登录位点BXA1_CLOBO)]，其中使用多种反向翻译软件工具之一[例如EditSeq best大肠杆菌反向翻译(DNASTAR公司)或Backtranslation工具v2.0(恩特勒孔公司)]。将PstI限制性序列添加至N末端并将XbaI-终止密码子-HindIII添加至C末端以确保维持正确的阅读框。在回译期间筛选DNA序列中整合的限制性酶切割序列(使用软件，如MapDraw，DNASTAR公司)。从提出的编码序列中手动删除被发现与克隆系统所需的那些序列共同的任何序列，确保维持共同的大肠杆菌密码子使用。通过软件程序(如图形密码子使用分析器(Graphical Codon Usage Analyser)(基因技术公司))评估大肠杆菌密码子使用，并通过参考已公开的密码子使用表(例如GenBank Release 143，2004年9月13日)评估GC百分比含量和密码子使用率。随后商业合成优化的DNA序列(例如通过恩特勒孔公司、基因技术公司或西格玛吉诺思公司)并在pCR 4载体中提供。
替代性方法是从现有DNA序列中进行PCR扩增，其中5’和3’PCR引物中分别整合有PstI和XbaI-终止密码子-HindIII限制性酶序列。如上文所述进行PCR扩增。将PCR产物插入pCR 4载体中并通过测序检查。随后可使用定点诱变删除与克隆系统不相容的任何其他限制性片段[例如使用Quickchange(司查塔基公司)]。
LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A融合体的制备
为生成LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A构建体，合成了添加有用于激活的肠激酶位点的血清型A接头，其排列为BamHI-SalI-GS18–蛋白酶位点-GS20-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII。使用BamHI+SalI限制性酶切割编码该接头的pCR 4载体。该切割的载体随后用作同样被BamHI+SalI切割的LC/A DNA(SEQID NO1)的插入和连接的接受者。随后使用BamHI+HindIII切割该构建物并将其插入表达载体(如pMAL质粒(NEB公司)或基于pET的质粒(诺瓦基公司(Novagen)))中。随后使用PstI+XbaI限制性酶切割所得质粒DNA并随后使用PstI+XbaI限制性酶切割HN/A DNA(SEQ ID NO2)并将其插入以类似方式切割的pMAL载体中以生成pMAL-LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A-XbaI-His标签-终止密码子-HindIII。最终构建体含有GS18-EN-CPGA16-GS20间隔子ORF，用于表达序列为SEQ ID NO10的蛋白。
激活试验
使用NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(10、12和15孔预制凝胶)以分析使用蛋白酶处理后融合蛋白的激活。使用NuPAGE 4X LDS样品缓冲液制备蛋白样品，通常至终体积100μl。根据蛋白浓度稀释样品或制备为纯样(75μl的样品，25μl的样品缓冲液)。在加载至凝胶前混合样品并随后在加热块上95℃加热5分钟。加载5-20μl的样品和5μl的蛋白标记物(购自英杰公司的BenchmarkTM蛋白标记物)。通常将凝胶在200V下运行50分钟。将凝胶浸入dH2O中并以最大功率微波处理2分钟。清洗凝胶并重复微波步骤。将凝胶转移至染色盒中并浸没在简单蓝色安全染料(Simply Blue Safe Stain)(英杰公司)中。以最大功率微波处理1分钟并放置0.5-2小时以进行染色。随后倒出安全染料并使用dH2O清洗凝胶以进行脱色。将凝胶置于dH2O中脱色过夜，并在GeneGnome成像仪(新基公司(Syngene))上获取图像。通过比较对应于非还原和还原条件下全长融合蛋白(蛋白酶处理后)的条带的密度来计算总的激活的蛋白。
实施例2–具有可变间隔子长度的LC/A-GS18-EN-CPGA16-GS20-HN/A融合蛋白家族的制备
使用与实施例1相同的策略制备编码甘丙肽16和可变间隔子含量的多种DNA接头。使用多种反向翻译软件工具之一[例如EditSeq best大肠杆菌反向翻译(DNASTAR公司)或Backtranslation工具v2.0(恩特勒孔公司)]，以确定编码间隔子1-蛋白酶位点-配体-间隔子2区域的DNA序列。随后将限制性位点整合至DNA序列中并排列为BamHI-SalI-间隔子1-蛋白酶位点-CPGA16-NheI-间隔子2-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII。重要的是确保间隔子、GA16和限制性序列维持正确的阅读框，且XbaI序列前面没有TC碱基(否则会导致DAM甲基化)。扫描DNA序列的限制性序列整合并从剩余的序列中手动删除任何额外序列，确保维持共同的大肠杆菌密码子使用。通过软件程序(如图形密码子使用分析器(Graphical Codon Usage Analyser)(基因技术公司))评估大肠杆菌密码子使用，并通过参考已公开的密码子使用表(例如GenBank Release 143，2004年9月13日)评估GC百分比含量和密码子使用率。随后商业合成优化的DNA序列(例如通过恩特勒孔公司、基因技术公司或西格玛吉诺思公司)并在pCR 4载体中提供。
生成的间隔子-接头包括：
作为示例，为生成LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A融合构建体(SEQ IDNO12)，使用BamHI+SalI限制性酶切割编码BamHI-SalI-GS5-蛋白酶位点-GS20-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII接头的pCR 4载体。该切割的载体随后用作同样被BamHI+SalI切割的LC/A DNA(SEQ ID NO1)的插入和连接的接受载体。随后使用BamHI+HindIII限制性酶切割所得质粒DNA并将LC/A-接头片段插入使用类似方法切割的含有独特的多克隆位点(针对BamHI、SalI、PstI和HindIII)的载体(如pMAL载体(NEB公司)或pET载体(诺瓦基公司))中。随后使用PstI+HindIII限制性酶切割HN/A DNA(SEQ ID NO2)并将其插入使用类似方法切割的pMAL-LC/A-接头构建体中。最终构建体含有LC/A-GS5-EN-CPGA16-GS20-HN/A ORF，用于表达序列为SEQ ID NO13的蛋白。
实施例3–甘丙肽融合蛋白的纯化方法
解冻含有25ml 50mM HEPES pH 7.2、200mM NaCl和约10g大肠杆菌BL21细胞体的Falcon管。使用50mM HEPES pH 7.2、200mM NaCl将解冻的细胞体制备为80ml并在冰上超声，超声在22微米(micron)的功率下进行10个循环(每个循环开30秒关30秒)以确保样品维持冷却。将裂解的细胞在4℃下18000rpm离心30分钟。将上清液加载至使用50mM HEPES pH 7.2、200mM NaCl平衡的充满0.1M NiSO4的螯合柱上(20-30ml柱体积是足够的)。使用10和40mM咪唑的梯度洗去非特异性结合的蛋白并使用100mM咪唑洗脱融合蛋白。将洗脱的融合蛋白针对5L的50mM HEPES pH 7.2、200mM NaCl在4℃下透析过夜并测量经透析的融合蛋白的OD。如果该融合蛋白含有麦芽糖结合蛋白，则向每100μg纯化的融合蛋白添加1μg的肠激酶(1mg/ml)并向每mg纯化的融合蛋白添加10μl的因子Xa。在25℃下静置孵育过夜。加载至使用50mM HEPES pH 7.2、200mMNaCl平衡的充满0.1M NiSO4的螯合柱上(20-30ml柱体积是足够的)。使用50mMHEPES pH 7.2、200mM NaCl将柱清洗至基线。使用10和40mM咪唑的梯度洗去非特异性结合的蛋白并使用100mM咪唑洗脱融合蛋白。将洗脱的融合蛋白针对5L的50mM HEPES pH 7.2、200mM NaCl在4℃下透析过夜并将融合蛋白浓缩至约2mg/ml，分装样品并在-20℃下冷冻。
实施例4–具有血清型A激活序列的LC/C-GA16-HN/C融合蛋白的制备
根据实施例1和2中所用方法，生成了LC/C(SEQ ID NO5)和HN/C(SEQID NO6)并将其插入排列为BamHI-SalI-间隔子1-蛋白酶位点-GA16-NheI-间隔子2-SpeI-PstI-XbaI-终止密码子-HindIII的血清型A接头中。最终构建体含有LC-间隔子1-GA16-间隔子2-HN ORF，用于表达序列为SEQ ID NO25的蛋白。
实施例5–IgA蛋白酶-GA16-HN/A融合蛋白的制备
IgA蛋白酶氨基酸序列获自可自由使用的数据库来源，如GenBank(登录号P09790)。关于淋病奈瑟氏球菌IgA蛋白酶基因结构的信息可在文献中获得(Pohlner等，Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeaeIgA protease(淋病奈瑟氏球菌IgA蛋白酶的基因结构和胞外分泌)，Nature,1987,325(6103),458-62)。使用Backtranslation工具v2.0(恩特勒孔公司)确定修饰用于大肠杆菌表达的编码IgA蛋白酶的DNA序列。在IgA DNA的5’端整合BamHI识别序列并在IgA DNA的3’端整合编码半胱氨酸的密码子和SalI识别序列。在回译期间使用MapDraw(DNASTAR公司)筛选DNA序列中整合的限制性酶切割序列。从提出的编码序列中手动删除被发现与克隆所需的那些序列共同的任何切割序列，确保维持共同的大肠杆菌密码子使用。使用图形密码子使用分析器(Graphical Codon Usage Analyser)(基因技术公司)评估大肠杆菌密码子使用，并通过参考已公开的密码子使用表评估GC百分比含量和密码子使用率。随后商业合成这一含有IgA开放阅读框(ORF)的优化的DNA序列(SEQ ID NO51)。
使用BamHI和SalI限制性酶将IgA(SEQ ID NO51)插入LC-GS5-CPGA16–GS20-HN ORF以使用IgA蛋白酶DNA代替LC。最终构建体含有IgA-GS5-CPGA16-GS20-HN ORF，用于表达序列为SEQ ID NO53的蛋白。
实施例6–含有破伤风来源的LC结构域的甘丙肽靶向内肽酶融合蛋白的制备
通过破伤风毒素LC氨基酸序列的回译来设计获自可自由使用的数据库来源(如GenBank(登录号X04436)的DNA序列，其中使用多种反向翻译软件工具之一[例如EditSeq best大肠杆菌反向翻译(DNASTAR公司)或Backtranslation工具v2.0(恩特勒孔公司))]。将BamHI/SalI识别序列分别整合入序列的5’和3’端，同时维持正确的阅读框(SEQ ID NO57)。在回译期间筛选DNA序列中整合的限制性酶切割序列(使用软件，如MapDraw，DNASTAR公司)。从提出的编码序列中手动删除被发现与克隆系统所需的那些序列共同的任何切割序列，确保维持共同的大肠杆菌密码子使用。通过软件程序(如图形密码子使用分析器(GraphicalCodon Usage Analyser)(基因技术公司))评估大肠杆菌密码子使用，并通过参考已公开的密码子使用表(例如GenBank Release 143，2004年9月13日)评估GC百分比含量和密码子使用率。随后商业合成含有破伤风毒素LC开放阅读框(ORF)的优化的DNA序列(例如通过恩特勒孔公司、基因技术公司或西格玛吉诺思公司)并在pCR 4载体(英杰公司)中提供。使用BamHI和SalI切割编码TeNT LC的pCR 4载体。随后将BamHI–SalI片段插入已同样使用BamHI和SalI切割的LC/A-GA16-HN/A载体中。最终构建体含有TeNT LC-GS5-GA16-GS20-HN ORF序列，用于表达序列为SEQ ID NO58的蛋白。
实施例7–CHO-K1GALR1和GALR2受体激活试验和SNAP-25切割试验的构建
细胞系制备
稳定表达人甘丙肽1受体(CHO-K1-Gal-1R；产品号ES-510-C)或人甘丙肽2受体(CHO-K1-Gal-2R；产品号ES-511-C)的CHO-K1细胞购自英国巴克斯的帕金埃尔默公司(Perkin-Elmer)。
需要时使用LipofectamineTM 2000用SNAP-25DNA转染细胞并孵育4小时，之后更换培养基。24小时后，将细胞转移至T175烧瓶。再经过24小时后加入100ug/ml零霉素以开始SNAP-25表达细胞的选择，并加入5ug/ml杀稻瘟菌素以维持受体的选择压力。将细胞维持在含有选择试剂的培养基中两周，每两至三天传代一次以维持30-70％汇合。随后在选择培养基中将细胞稀释至96孔微量板中每孔0.5个细胞。数天后，在显微镜下检查板并标记含有单克隆的那些孔。每周更换这些孔中的培养基。当细胞在孔中汇合时，将其转移至T25烧瓶。当其充分扩张时，将各克隆接种至96孔板的24个孔中，并制备冻存小瓶。将本发明的甘丙肽融合蛋白和LC/A-HNA对细胞应用24小时，随后进行Western印迹以检测SNAP-25切割。来自SNAP-25条带的克隆较强且切割水平较高，并维持融合以用于进一步研究。对这些克隆绘制全剂量曲线，并选择甘丙肽融合蛋白和LC/A-HNA切割水平之间差异最高的克隆。
GALR1受体激活试验
GALR1受体激活试验测量了转染的CHO-K1细胞中GALR1受体处配体的效力和内在功效，具体方法为使用基于FRET的cAMP定量毛喉素刺激的胞内cAMP的减少(帕金埃尔默公司的LANCE试剂盒)。刺激后，向裂解缓冲液中的细胞添加荧光标记的cAMP示踪剂(铕-链霉亲和素/生物素-cAMP)和荧光(Alexa)标记的抗cAMP抗体。来自细胞的cAMP与cAMP示踪剂竞争抗体结合位点。读取时，320nm处的光脉冲激发cAMP示踪剂的荧光部分(铕)。从铕中发射的能量转移至结合在示踪剂上的Alexa fluor标记抗体，生成665nm处的TR-FRET信号(时间分辨荧光共振能量转移是基于供体标记、铕和受体标记、Alexa fluor的接近，其已通过特异性结合反应连接在一起)。来自铕的残余能量产生615nm处的光。在激动剂处理的细胞中，存在较少的cAMP与示踪剂竞争，所以与单独使用毛喉素处理的样品相比，会观察到665nm处信号的剂量依赖的增加。通过对各实验中均包含的cAMP标准曲线进行内插法来将665nm处信号转化为cAMP浓度。
在含有10μM毛喉素的试验缓冲液中，在EP 500μl深孔lo-bind平板的前两列孔中，使用吉尔森(Gilson)移液器和Sigmacoted或lo-bind吸头将测试材料和标准品稀释至适当浓度。第一和第二列中选定的浓度相差半个log单位。为此，沿平板进行连续的1:10稀释(使用电动八通道移液器和sigmacote或lo-bind吸头)直至创建了半个log间隔的11个浓度。在第12列中，仅加入试验缓冲液作为“基线”。使用12通道数码移液器将来自lo-bind平板的10μl样品转移至光学平板(optiplate)96孔微量板。
向含有标准曲线的孔中使用多通道数码移液器加入10ul的试验缓冲液。向含有测试材料的孔中加入10ul适当浓度的含细胞的试验缓冲液。将平板密封并在室温下孵育120分钟，第一个小时期间放置在设置为最大速度的IKA MTS 2/4轨道振荡器上。
将LANCE Eu-W8044标记的链霉亲和素(Eu-SA)和生物素-cAMP(b-cAMP)稀释于cAMP检测缓冲液中(两者都来自帕金埃尔默公司的LANCEcAMP试剂盒)以分别制备稀释比为1:17和1:5的子储液(sub-stock)。将两种子储液以1:125的比例稀释至检测缓冲液中以制备最终的检测混合物。将该混合物在室温下孵育15-30分钟，随后加入1:200Alexa647-抗cAMP抗体(Alexa-Fluor Ab)。简单涡旋混合后，立即使用数码多通道移液器取20μl加入各孔中。应用平板密封物并将平板在室温下孵育24小时(第一个小时期间放置在设置为最大速度的IKA MTS 2/4轨道振荡器上)。在Envision上读取前除去平板密封物。
GALR2受体激活试验
GALR2受体激活试验测量了转染的CHO-K1细胞中GALR2受体处配体的效力和内在功效，具体方法为测量受体激活时发生的钙动员(calciummobilisation)。处理前使用钙敏感染料(FLIPR)预加载转染的细胞。使用Flexstation 3酶标仪(分子装置公司(Molecular Devices))读取时，485nm处的光脉冲激发荧光染料并引起525nm处的发射。这提供了来自胞内钙变化的实时荧光数据。在激动剂处理的细胞中存在受体激活，导致钙动员增加。这将被测量为525nm处相对荧光单位(RFU)的增加。
用于受体激活试验的细胞培养：
将细胞接种并培养于含有Ham F12的T175烧瓶中，其含有GLUTAMAX、10％胎牛血清、5μg ml-1杀稻瘟菌素和100μg ml-1零霉素。将烧瓶在含有5％CO2的潮湿环境中在37℃下孵育直至60-80％汇合。在收获那天除去培养基并使用25ml PBS清洗细胞两次。通过加入10ml的Tryple Express并在37℃下孵育10分钟随后轻柔拍击烧瓶以移出细胞。将移出的细胞转移至50ml离心管中并向使用10ml培养基清洗两次的烧瓶中加入细胞悬浮液。将试管1300x g离心3分钟并除去上清液。将细胞温和重悬于10ml培养基(使用冷冻的细胞时)或试验缓冲液(在试验中使用“新鲜”细胞时)中，并移出样品以使用细胞计数仪(CM公司(ChemoMetec))进行计数。将试验中“新鲜”使用的细胞在试验缓冲液中进一步稀释至适当浓度。将收获用于冷冻的细胞重新离心(1300x g；3分钟)，除去上清液并在4℃下将细胞重悬于Synth-a-freeze中至3x 106个细胞/ml。将含有1ml悬浮液的冷冻管各自置于冷冻的Nalgene MrFrosty冷藏容器中((-1℃/分钟冷却速率)，并在-80℃冰箱中放置过夜。第二天将药瓶转移至气相的液氮储存罐中。
图4显示了具有不同甘丙肽配体(即甘丙肽-16和甘丙肽-30)和不同血清型骨架(即LC/A-HN/A、LC/B-HN/B、LC/C-HN/C和LC/D-HN/D)的本发明甘丙肽融合蛋白激活GALR1受体。
CHO-K1GALR1SNAP-25切割试验
使细胞培养物接触不同浓度的甘丙肽融合蛋白，持续24小时。通过SDS-PAGE对细胞蛋白进行分离，使用抗SNAP-25抗体进行Western印迹以促进SNAP-25切割的评估。通过密度计量分析(新基公司)计算SNAP-25切割。
培养细胞
以2x10e5个细胞/ml制备细胞并以125μl/孔接种于96孔板中。使用以下培养基：500ml Gibco Ham F12，其含有Glutamax(产品代码31765068)、50mlFBS、5ug/ml杀稻瘟菌素(来自冰箱中盒子的250μl分装，G13)(卡巴开公司(Calbiochem)#203351，10ml，10mg/ml)、100ug/ml零霉素(来自冰箱中盒子的500μl，G35)(英杰公司，得自费氏公司(Fisher)，1g，在8x 1.25ml试管中，100mg/ml，产品代码VXR25001)。使细胞生长24小时(37℃，5％CO2，潮湿的气氛)。
细胞处理
对各测试蛋白的剂量范围制备测试蛋白的稀释品(制备两倍(2x)的所需终浓度，因为125μl将直接施加在各孔中已存在的125μl培养基上)。对CHOCALR1维持培养液进行过滤除菌(20ml注射器、0.2μm注射过滤器)以制备稀释物。使用吉尔森移液器或多重分液器将过滤的培养基加入5个标记的bijoux(7ml试管)中，每管0.9ml。将储液测试蛋白稀释至2000nM(工作储液1)和600nM(工作储液2)。使用吉尔森移液器制备各工作储液的10倍连续稀释液，具体方法为向连续稀释液的下一个浓度加入100μl。使用移液器吹打混匀。重复以获得溶液1的4个连续稀释和溶液2的3个连续稀释。还制备0nM对照(仅过滤的接种培养基)以作为各平板的阴性对照。对各测试蛋白重复上述步骤。在各实验中，必须包括“标准”批次的材料以作为对照/参考材料，即未配体化的LC/A-HN/A。
将稀释的样品施加于CHO CALR1平板
每孔施加125μl的测试样品(两倍浓度)。各测试样品应施加于三个重复孔且各剂量范围应包括0nM对照。孵育24小时(37℃、5％CO2、潮湿气氛)。
细胞裂解
制备新鲜的裂解缓冲液(每块平板20mls)，其含有25％(4x)NuPAGELDS样品缓冲液、65％dH2O和10％1M DTT。倒扣在废液缸上以除去CHOGALR1平板中的培养基。使用精细吸头的移液器除去各孔中剩余的培养基。使用多重分液移液器在每孔中加入125μl的裂解缓冲液以裂解细胞。最少20分钟后，将各孔中的缓冲液移至1.5ml微量离心管中。对试管进行编号以在整个印迹过程中追踪CHO GALR1处理。A1-A3向下至H1-H3编号为1-24，A4-A6向下至H4-H6编号为25-48，A7-A9向下至H7-H93编号为49-72，A10-A12向下至H10-H12编号为73-96。对各样品涡旋并在预热的加热块中在90℃下加热5-10分钟。储存于-20℃或在同一天用于SDS凝胶。
凝胶电泳
如果样品已被储存过夜或更长，将其在预热至90℃的加热块中加热5-10分钟。设置SDS page凝胶，每12个样品使用1块凝胶，制备运行缓冲液(1x，英杰公司NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液(20x)(NP0001))，约800ml/凝胶槽。向上缓冲液槽中加入500μl的NuPAGE抗氧化剂。将15ul样品从左至右加载至凝胶泳道上并加载2.5ul的英杰公司Magic Marker XP和5ul的英杰公司See BluePlus 2前染标准品和15ul未处理的对照。SDS_PAGE期间最大化分离分辨率是重要的。这可通过在200V对12％bis-tris凝胶运行1小时25分钟来实现(直至粉色(17kDa)标记物达到槽底部)。
Western印迹
完成半干转移：使用英杰公司iBlot(使用iBlot程序3，6分钟)。将硝酸纤维素膜置于单个小托盘中。将膜与封闭缓冲液(5g Marvel奶粉/100ml 0.1％PBS/吐温)在室温下在摇晃器上孵育1小时。施加一抗(抗SNAP-25，1:1000稀释)并将膜与一抗(稀释于封闭缓冲液中)在室温下在摇晃器上孵育1小时。使用PBS/吐温(0.1％)对膜清洗3次。随后施加二抗(抗兔HRP偶联物，1:1000稀释)并将膜与二抗(稀释于封闭缓冲液中)在室温下在摇晃器上孵育1小时。使用PBS/吐温(0.1％)对膜清洗3次，最后一次清洗时至少持续20分钟。使用Syngene检测结合的抗体：排干印迹膜上的PBS/吐温，1:1混合WestDura试剂并添加至印迹，反应5分钟。确保足够的溶液添加至膜以完全覆盖。将膜置于Syngene托盘中，设置Syngene软件，使曝光时间为5分钟。
图3和5显示本发明的甘丙肽融合蛋白有效地切割SNAP-25。
实施例8–甘丙肽融合体的体内效力的评估
伤害性屈肌反射(也称为爪守卫试验)是一种快速撤回运动，其构建了针对可能的肢损伤的保护性机制。可通过使用低剂量辣椒素麻醉的大鼠中肌电图(EMG)应答、电刺激或辣椒素敏化的电应答的评估对其进行定量。对300-380g雄性SD大鼠使用本发明融合蛋白进行足底内预处理(24小时)。通过在10秒内注射0.006％辣椒素(10μl，在PBS中(7.5％DMSO))实现爪守卫的诱导。这产生了来自二头肌肌肉的强烈反射应答。伤害性屈肌反射的减少/抑制显示测试物质表现出抗伤害性作用。该数据以百分比的形式证明了本发明的甘丙肽融合蛋白的抗伤害性作用(图6)。
评价了本发明的不同甘丙肽融合蛋白抑制辣椒素诱导的热痛觉过敏的能力(图7和8)。对SD大鼠使用融合蛋白进行足底内预处理并在24小时后注射0.3％辣椒素并将大鼠置于25℃玻璃板上(大鼠置于丙烯盒内，放在25℃玻璃板上)。光束(可调节的光强度)聚焦在后爪上。传感器检测到了爪的移动，停止计时器。爪回缩延时是将爪从热源处缩回所需时间(截留值为20.48秒)。爪回缩延时的减少/抑制显示测试化合物表现出抗伤害性作用。该数据显示，与C末端具有配体的融合蛋白相比，本发明的甘丙肽融合蛋白具有增强的抗伤害性作用。
实施例9–通过测量神经元细胞培养物中释放的物质P确定TM激动剂活性。
材料
物质P EIA获自英国的R&D系统公司(R&D Systems)。
方法
如先前所述建立eDRG的主要神经元培养物(Duggan等，2002)。基本如先前所述通过EIA评估培养物中释放的物质P(Duggan等，2002)。将感兴趣的TM添加至神经元培养物(在处理前已建立至少2周)；通过加入载剂代替TM对对照培养物平行进行实验。获得对照和经TM处理培养物的物质P的经刺激(100mM KCl)和基线释放，以及总细胞裂解内容物。根据生产商的说明书，使用物质P酶免疫试验试剂盒(美国的卡曼化学公司(Cayman ChemicalCompany)或英国的R&D系统公司)测量物质P免疫反应性。
将感兴趣的TM存在的情况下神经元细胞释放的物质P的量与存在和不存在100mM KCl的情况下获得的释放相比较。感兴趣的TM对物质P释放的刺激在基线释放以上，这说明感兴趣的TM是本说明书中定义的“激动剂配体”。需要时，可将感兴趣的TM对的物质P释放的刺激与使用天然ORL-1受体配体痛敏肽(托克李斯公司(Tocris))产生的标准物质P释放曲线相比较。
实施例10
一种治疗、预防或缓解对象中疼痛的方法，包括给予所述患者治疗有效量的融合蛋白，所述疼痛选自：恶性疾病引起的慢性疼痛、并非由恶心疾病(外周神经病)引起的慢性疼痛。
患者A
通过外周注射融合蛋白以降低神经末梢突触处的神经递质释放以减少疼痛，从而治疗患有肝后性神经痛所致严重疼痛的73岁女性。该患者在所述注射后2小时内经历的良好的止痛作用。
患者B
通过外周注射融合蛋白以减少疼痛，从而治疗患有汽车事故后左臂截肢所致幻肢痛的32岁男性。该患者在所述注射后1小时内经历的良好的止痛作用。
患者C
通过外周注射融合蛋白以降低神经末梢突触处的神经递质释放以减少疼痛，从而治疗患有糖尿病性神经病的55岁男性。该患者在所述注射后4小时内经历的良好的止痛作用。
患者D
通过外周注射融合蛋白以降低神经末梢突触处的神经递质释放以减少疼痛，从而治疗患有癌性疼痛的63岁女性。该患者在所述注射后4小时内经历的良好的止痛作用。
本文引用的全部文件、书、手册、文章、专利、已公开的专利申请、指南、摘要和其他参考材料都通过引用全文纳入本文。虽然前述说明书使用用于说明目的的实施例教导了本发明的原理，但本领域技术人员应理解，通过阅读该公开材料，可进行多种形式和细节的变化而不背离本发明的真正范围。

Claims (20)

1.一种单链、多肽融合蛋白，其包含：
a.非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶切割伤害性感觉传入神经的胞吐融合器的蛋白；
b.结合所述伤害性感觉传入神经上结合位点的甘丙肽靶向部分，所述结合位点胞吞整合入所述伤害性感觉传入神经内的内体；
c.蛋白酶切割位点，所述融合蛋白在所述位点处被蛋白酶切割，所述蛋白酶切割位点位于所述非细胞毒性蛋白酶和所述甘丙肽靶向部分之间；
d.易位结构域，所述易位结构域将所述蛋白酶从所述内体内跨内体膜易位至所述伤害性感觉传入神经的细胞溶质中，其中所述靶向部分位于所述蛋白酶切割位点和所述易位结构域之间；
e.位于所述非细胞毒性蛋白酶和所述蛋白酶切割位点之间的第一间隔子，所述第一间隔子包含4至25氨基酸残基的氨基酸序列；
f.位于所述甘丙肽靶向部分和所述易位结构域之间的第二间隔子，所述第二间隔子包含4至35个氨基酸残基的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，所述第一间隔子包含6至16个氨基酸残基的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，所述第一间隔子的所述氨基酸残基选自甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、脯氨酸、谷氨酸和/或赖氨酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，所述第一间隔子的所述氨基酸残基选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的融合蛋白，所述第一间隔子选自GS5、GS10、GS15、GS18或GS20间隔子。
6.如权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，所述甘丙肽靶向部分特异性结合GALR1、GALR2和/或GALR3受体。
7.如权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白，所述甘丙肽靶向部分包含或由与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8具有至少70％序列相同性的氨基酸序列组成。
8.如权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白，所述甘丙肽靶向部分包含：SEQ ID NO.7的氨基酸序列或其片段，所述片段包含或由至少14或16个毗连氨基酸残基组成；或者包含具有最多5或6个保守性氨基酸取代的所述SEQ IDNO:7或所述片段的变体氨基酸序列。
9.如权利要求1-8中任一项所述的融合蛋白，所述非细胞毒性蛋白酶是梭菌神经毒素L链或IgA蛋白酶。
10.如权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白，所述易位结构域是梭菌神经毒素的HN结构域。
11.如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白，所述融合蛋白包含与选自SEQ ID NO:10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、53、56和/或59的氨基酸序列具有至少90％序列相同性的氨基酸序列。
12.编码权利要求1-11中任一项所述多肽融合蛋白的多核苷酸分子。
13.一种表达载体，其包含启动子、权利要求12所述的多核苷酸分子以及位于所述多核苷酸分子下游的终止子，其中所述多核苷酸分子位于所述启动子的下游。
14.一种制备单链多肽融合蛋白的方法，所述方法包括：
a.使用权利要求13所述的表达载体转染宿主细胞，以及
b.在促进所述表达载体表达所述多肽融合蛋白的条件下培养所述宿主细胞。
15.一种制备非细胞毒性试剂的方法，所述方法包括：
a.使权利要求1-11中任一项所述的单链多肽融合蛋白接触能够切割蛋白酶切割位点的蛋白酶；
b.切割所述蛋白酶切割位点，从而形成双链融合蛋白。
16.一种非细胞毒性多肽，获自权利要求15所述的方法，所述多肽是双链多肽，且其中：
a.第一链包含非细胞毒性蛋白酶，所述蛋白酶能够切割伤害性感觉传入神经的胞吐融合器的蛋白；
b.第二链包含甘丙肽TM和易位结构域，其能够将所述蛋白酶从内体内跨内体膜易位至所述伤害性感觉传入神经的细胞溶质中；且
所述第一和第二链通过二硫键连接在一起。
17.一种治疗、预防或缓解对象中疼痛的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白。
18.如权利要求17所述的方法，所述疼痛是慢性疼痛，选自神经性疼痛、炎性疼痛、头痛、躯体疼痛、内脏疼痛和牵涉性疼痛。
19.一种治疗、预防或缓解对象中疼痛的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的权利要求16所述的多肽。
20.如权利要求19所述的方法，所述疼痛是慢性疼痛，选自神经性疼痛、炎性疼痛、头痛、躯体疼痛、内脏疼痛和牵涉性疼痛。
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