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CN104761642A - 人il-23抗原结合蛋白 - Google Patents

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CN104761642A
CN104761642A CN201510065612.3A CN201510065612A CN104761642A CN 104761642 A CN104761642 A CN 104761642A CN 201510065612 A CN201510065612 A CN 201510065612A CN 104761642 A CN104761642 A CN 104761642A
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seq
antigen
binding proteins
variable region
separation
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J.E.托恩
J.D.郑
J.C.奥奈尔
张宇
孙雨
H.塞尔恩
D.E.皮珀
R.R.克彻姆
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Original Assignee
Amgen Inc
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Abstract

本发明提供与人IL-23蛋白结合的抗原结合蛋白。亦提供编码所述抗原结合蛋白的核酸、编码所述抗原结合蛋白的载体和细胞以及IL-23抗原结合蛋白用于诊断和治疗目的的用途。

Description

人IL-23抗原结合蛋白
本申请为分案申请，原申请的申请日为2010年10月26日，申请号为201080059062.X(PCT/US2010/054148)，发明名称为“人IL-23抗原结合蛋白”。
相关申请的交叉引用
本申请依据35 U.S.C.119(e)，要求保护于2009年10月26日提交的美国专利申请号61/254,982和于2010年9月9日提交的美国专利申请号61/381,287的权益，所述申请通过引用并入本文中。
背景
白介素23 (IL-23)这种异二聚体细胞因子是促炎细胞因子的有效诱导物。IL-23与异二聚体细胞因子白介素12 (IL-12)有关，二者都共有共同的p40亚基。在IL-23中，独特的p19亚基与p40亚基共价结合。在IL-12中，独特的亚基为p35 (Oppmann等，Immunity, 2000, 13: 713-715)。IL-23异二聚体蛋白为分泌性的。象IL-12一样，IL-23由抗原呈递细胞(例如树突细胞和巨噬细胞)因响应激活刺激例如CD40连接、Toll样受体激动剂和病原体而表达。IL-23结合异二聚体受体，所述受体包含IL-12Rβ1亚基(其与IL-12受体共有)和独特的受体亚基IL-23R。IL-12受体由IL-12Rβ1和IL-12Rβ2组成。IL-23结合其异二聚体受体，并通过JAK2和Tyk2传导信号以激活STAT1、3、4和5 (Parham等，J. Immunol. 2002, 168:5699-708)。所述受体亚基主要在激活的或记忆T细胞和自然杀伤细胞上共表达，在树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、角质形成细胞和滑膜成纤维细胞上亦以较低水平表达。IL-23和IL-12对不同的T细胞亚群起作用，在体内起基本上不同的作用。
IL-23对激活的和记忆T细胞起作用，并促进T细胞亚群Th17的存活和扩增。Th17细胞产生包括IL-6、IL-17、TNFα、IL-22和GM-CSF在内的促炎细胞因子。IL-23亦对自然杀伤细胞、树突细胞和巨噬细胞起作用，以诱导促炎细胞因子表达。不象IL-23，IL-12诱导幼稚CD4+ T细胞分化为成熟的产IFNγ效应细胞Th1，并通过刺激IFNγ生产诱导NK和细胞毒性T细胞的功能。先前认为在很多自身免疫性疾病中由IL-12驱动的Th1细胞为病原性T细胞亚群，然而，最近在炎性肠病、银屑病、炎性关节炎和多发性硬化症模型中的动物研究(其中评估了IL-12与IL-23相比的单独贡献)，坚定地确定在自身免疫/炎性疾病中是IL-23而不是IL-12为关键驱动者(Ahern等，Immun. Rev. 2008 226:147-159；Cua等，Nature 2003 421:744-748；Yago等，Arthritis Res and Ther. 2007 9(5): R96)。认为IL-12在针对很多细胞内病原体和病毒的保护性先天免疫应答和适应性免疫应答发展中及在肿瘤免疫监视中起关键作用。参见Kastelein等，Annual Review of Immunology, 2007, 25: 221-42；Liu,等，Rheumatology, 2007, 46(8): 1266-73；Bowman等，Current Opinion Infectious Diseases, 2006 19:245-52；Fieschi和Casanova, Eur. J. Immunol. 2003 33:1461-4；Meeran等，Mol. Cancer Ther. 2006 5: 825-32；Langowski等，Nature 2006 442: 461-5。因此，与IL-12及IL-23双重抑制相比，IL-23特异性抑制(宽免IL-12或共享的p40亚基)应该具有潜在更优越的安全特性。
因此，抑制人IL-23而宽免IL-12的IL-23特异性拮抗剂(例如至少结合IL-23的独特的p19亚基或结合IL-23的p19和p40亚基二者的抗体)的使用，应该提供等于或大于IL-12拮抗剂或p40拮抗剂的效力而无与抑制IL-12关联的可能风险。业已阐述了选择用于抑制重组IL-23的鼠、人源化和噬菌体展示抗体；参见例如美国专利7,491,391、WIPO公开号WO1999/05280、WO2007/0244846、WO2007/027714、WO 2007/076524、WO2007/147019、WO2008/103473、WO 2008/103432、WO2009/043933和WO2009/082624。然而，需要能够抑制天然人IL-23的完全人治疗剂。所述治疗剂对靶标高度特异性，尤其是在体内。完全抑制体内靶标可导致产生较低剂量的制剂、更低频率和/或更有效给药，进而导致降低成本并提高效力。本发明提供这样的IL-23拮抗剂。
简述
提供结合IL-23尤其是天然人IL-23的抗原结合蛋白。人IL-23抗原结合蛋白可降低、抑制、干扰和/或调节至少一种与IL-23相关的生物反应，如此，用于改善IL-23相关疾病或病症的影响。可例如将IL-23抗原结合蛋白用于降低、抑制、干扰和/或调节IL-23信号传导、IL-23对Th17细胞的激活、IL-23对NK细胞的激活或诱导促炎细胞因子产生。
亦提供包括细胞系在内的表达系统用于生产IL-23抗原结合蛋白，并提供诊断和治疗与人IL-23相关疾病的方法。
提供的结合IL-23的一些抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区并包含至少一个轻链可变区，所述重链可变区包含选自以下的CDRH1、CDRH2和CDRH3：与表3中所示的CDRH1相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRH1；与表3中所示的CDRH2相差不超过3个、2个或1个氨基酸取代、插入和/或缺失的CDRH2；与表3中所示的CDRH3相差不超过3个、2个或1个氨基酸取代、插入和/或缺失的CDRH3；所述至少一个轻链可变区包含选自以下的CDRL1、CDRL2和CDRL3：与表3中所示的CDRL1相差不超过3个、2个或1个氨基酸取代、插入和/或缺失的CDRL1；与表3中所示的CDRL2相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRL2；与表3中所示的CDRL3相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRL3。在一个实施方案中，提供分离的抗原结合蛋白，其包含：选自SEQ ID NO: 91、94、97、100和103的CDRH1；选自SEQ ID NO: 92、95、98、101、104、107和110的CDRH2；选自SEQ ID NO: 93、96、99、102和105的CDRH3；选自SEQ ID NO: 62、65、68、71和74的CDRL1；选自SEQ ID NO: 63、66、69、72、75和78的CDRL2；和选自SEQ ID NO: 64、67、70和73的CDRL3。在另一实施方案中，提供分离的抗原结合蛋白，其包含：选自SEQ ID NO: 91、106、109、112和115的CDRH1；选自SEQ ID NO: 113、116、118、120、121和122的CDRH2；选自SEQ ID NO: 108、111、114、117和119的CDRH3；选自SEQ ID NO: 77、80、83、85、86、87、88、89和90的CDRL1；为SEQ ID NO: 81的CDRL2；和选自SEQ ID NO: 76、79、82和84的CDRL3。在另一实施方案中，提供包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区的分离的抗原结合蛋白。在又一实施方案中，提供如上所述的分离的抗原结合蛋白，其包含至少两个重链可变区和至少两个轻链可变区。在又一实施方案中，提供分离的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白与标记基团偶联。
亦提供结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，其选自：a)具有CDRH1为SEQ ID NO: 129、CDRH2为SEQ ID NO: 132、CDRH3为SEQ ID NO: 136和CDRL1为SEQ ID NO: 123、CDRL2为SEQ ID NO: 81和CDRL3为SEQ ID NO: 76的抗原结合蛋白；b)具有CDRH1为SEQ ID NO: 131、CDRH2为SEQ ID NO: 134、CDRH3为SEQ ID NO: 137和CDRL1为SEQ ID NO: 124、CDRL2为SEQ ID NO: 126和CDRL3为SEQ ID NO: 128的抗原结合蛋白；c) a)具有CDRH1为SEQ ID NO: 130、CDRH2为SEQ ID NO: 133、CDRH3为SEQ ID NO: 99和CDRL1为SEQ ID NO: 68、CDRL2为SEQ ID NO: 69和CDRL3为SEQ ID NO: 67的抗原结合蛋白；和d)具有CDRH1为SEQ ID NO: 91、CDRH2为SEQ ID NO: 135、CDRH3为SEQ ID NO: 138和CDRL1为SEQ ID NO: 125、CDRL2为SEQ ID NO: 127和CDRL3为SEQ ID NO: 64的抗原结合蛋白。
亦提供结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，其包含选自以下的至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区：包含SEQ ID NO: 31的31-35、50-65和99-113位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 1的23-36、52-58和91-101位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 34的31-35、50-65和99-110位氨基酸残基的重链可变区、包含SEQ ID NO: 36的31-35、50-66和99-110位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 4的23-36、52-62和97-105位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 38的31-35、50-66和99-114位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 7的23-34、50-61和94-106位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 40的31-35、50-66和99-114位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 9的24-34、50-56和94-106位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 42的31-35、50-66和99-114位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 11的23-34、50-61和94-106位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 44的31-35、50-65和98-107位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 13的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 46或SEQ ID NO: 153的31-37、52-67和100-109位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO15的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 48的31-37、52-67和100-109位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 17的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 50的31-37、52-67和101-109位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 19的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 52的31-35、50-65和98-107位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 21的24-34、50-56和98-107位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 54的31-37、52-67和100-109位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 23的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；包含SEQ ID NO: 56的31-37、52-67和100-109位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 25的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；以及包含SEQ ID NO: 58的31-37、52-57和100-109位氨基酸残基的重链可变区，和包含SEQ ID NO: 27的24-34、500-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区。
本文提供结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，其包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区序列与表2中所示的重链可变区序列相差不超过13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加和/或缺失；和其中轻链可变区序列与表1中所示的轻链可变区序列相差不超过13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代、添加和/或缺失。
亦提供结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，其选自：a) SEQ ID NO: 140重链可变区和SEQ ID NO: 30轻链可变区；b) SEQ ID NO: 141重链可变区和SEQ ID NO: 61轻链可变区；c) SEQ ID NO: 142重链可变区和SEQ ID NO: 4轻链可变区；和d) SEQ ID NO: 143重链可变区和SEQ ID NO: 139轻链可变区。
亦提供包含重链可变区及轻链可变区的分离的抗原结合蛋白，所述重链可变区由与SEQ ID NO: 31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列组成；所述轻链可变区包含与SEQ ID NO: 1、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。在另一实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 44、46、48、50、52、54、56、58和153的重链可变区，及选自SEQ ID NO: 13、15、17、19、21、23、25和27的轻链可变区。在又一实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO: 31、34、36、38、40的和42的重链可变区和选自SEQ ID NO: 1、4、7、9和11的轻链可变区。
亦提供结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，其包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：a) SEQ ID NO: 31重链可变区和SEQ ID NO: 1轻链可变区；b) SEQ ID NO: 34或36重链可变区和SEQ ID NO: 4轻链可变区；c) SEQ ID NO: 38重链可变区和SEQ ID NO: 7轻链可变区；d) SEQ ID NO: 40重链可变区和SEQ ID NO: 9轻链可变区；e) SEQ ID NO: 42重链可变区和SEQ ID NO: 11轻链可变区；f) SEQ ID NO: 44重链可变区和SEQ ID NO: 13轻链可变区；g) SEQ ID NO: 46或SEQ ID NO: 153重链可变区和SEQ ID NO: 15轻链可变区；h) SEQ ID NO: 48重链可变区和SEQ ID NO: 17轻链可变区；i) SEQ ID NO: 50重链可变区和SEQ ID NO: 19轻链可变区；j) SEQ ID NO: 52重链可变区和SEQ ID NO: 21轻链可变区；k) SEQ ID NO: 54重链可变区和SEQ ID NO: 23轻链可变区；l) SEQ ID NO: 56重链可变区和SEQ ID NO: 25轻链可变区；和m) SEQ ID NO: 58重链可变区和SEQ ID NO: 27轻链可变区。
亦提供结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁(covered patch)包含SEQ ID NO: 15的30、31、32、49、50、52、53、56、92和94位的残基接触，其中残基接触具有大于或等于10 Å2的差值，其如通过溶剂暴露表面积所测定。在一个实施方案中，残基接触包含SEQ ID NO: 46的31-35、54、58-60、66和101-105位的残基。
亦提供结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含SEQ ID NO: 1的31-34、51、52、55、68、93和98位的残基接触，其中残基接触具有大于或等于10 Å2的差值，其如通过溶剂暴露表面积所测定。在一个实施方案中，残基接触包含SEQ ID NO: 31的1、26、28、31、32、52、53、59、76、101、102和104-108位残基。
亦提供结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 46的32-35、54、58-60、66和101-105位残基5 Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。在一个实施方案中，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 46的31-35、54、56、58-60、66和101-105位残基5 Å或更近。
亦提供结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 15的30-32、49、52、 53、91-94和96位残基5 Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。在一个实施方案中，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 15的30-32、49、50、52、53、56、91-94和96位残基5 Å或更近。
亦提供结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 31的26-28、31、53、59、102和104-108位残基5 Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。在一个实施方案中，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 31的1、26-28、30-32、52、53、59、100和102-108位残基5 Å或更近。
亦提供结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 1的31-34、51、52、55、68和93位残基5 Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。在一个实施方案中，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 1的29、31-34、51、52、55、68、93和100位残基5 Å或更近。
亦提供如上所述的分离的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白为抗体。在一个实施方案中，提供分离的抗原结合蛋白，其中抗体为单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。在另一实施方案中，提供分离的抗原结合蛋白，其中抗体片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体(diabody)或单链抗体分子。在又一实施方案中，提供分离的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白为人抗体。在再一实施方案中，提供分离的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白为单克隆抗体。在另一实施方案中，提供分离的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白属于IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在又一实施方案中，提供分离的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白属于IgG1型或IgG2型。
亦提供编码如上所述抗原结合蛋白的分离的核酸分子。在一个实施方案中，提供分离的核酸分子，其中至少一个重链可变区由选自以下的分离的核酸分子编码：SEQ ID NO: 32、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和152，至少一个轻链可变区由选自以下的分离的核酸分子编码：SEQ ID NO: 2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28。在另一实施方案中，提供其中核酸分子与调控序列可操作地连接的核酸分子。在另一实施方案中，提供包含如上所述核酸分子的载体。在又一实施方案中，提供包含如上所述核酸分子的宿主细胞。在另一实施方案中，提供包含如上所述载体的宿主细胞。在又一实施方案中，提供足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物的分离的多核苷酸，其为如上所述核酸分子的片段或其互补序列。
亦提供制备如上所述抗原结合蛋白的方法，所述方法包括从分泌所述抗原结合蛋白的宿主细胞制备所述抗原结合蛋白的步骤。
亦提供结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含如SEQ ID NO: 145中所述的人IL-23p19亚基的46-58位残基内的残基接触、112-120位残基内的残基接触和155-163位残基内的残基接触，其中所述残基接触具有大于或等于10Å2的差值，其如通过溶剂暴露表面积所测定。在一个实施方案中，提供其中当抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含如SEQ ID NO: 145中所述的人IL-23p19亚基的46-58位残基内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个残基接触，112-120位残基内的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基接触，和155-163位残基内的1、2、3、4、5、6、7、8或9个残基接触。在另一实施方案中，提供其中当抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含如SEQ ID NO: 147中所述的人IL-23p40亚基的121-125位残基内的残基接触。在相关实施方案中，其中在抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含如SEQ ID NO: 147中所述的人IL-23p40亚基的121-125位残基内的1、2、3、4或5个残基接触。在另一实施方案中，提供其中在抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含SEQ ID NO: 145的46、47、49、50、53、112-116、118、120、155、156、159、160和163位的残基接触。在另一实施方案中，提供其中在抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含SEQ ID NO: 145的46、47、49、50、53、112-118、120、155、156、159、160和163位的残基接触。在另一实施方案中，提供其中在抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含SEQ ID NO: 145的46、47、49、50、53-55、57、58、112-116、118-120、155、156、159、160、162和163位残基。在相关实施方案，提供其中在抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含如SEQ ID NO: 147中所述的人IL-23p40亚基的122位的残基接触。在另一相关实施方案中，提供其中在抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含如SEQ ID NO: 147中所述的人IL-23p40亚基122和124位的残基接触。在又一相关实施方案中，提供其中在抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含如SEQ ID NO: 147中所述的人IL-23p40亚基的121-123和125位的残基接触。在再一相关实施方案中，提供其中在抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含如SEQ ID NO: 147中所述的人IL-23p40亚基的121-123、125和283位残基接触。
亦提供结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离如SEQ ID NO: 145中所述的人IL-23p19亚基的46-58位残基内的残基、112-123位残基内的残基和155-163位残基内的残基5Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。在一个实施方案中，当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离如SEQ ID NO: 145中所述的人IL-23p19亚基的以下残基5Å或更近：46-58位残基内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个残基；112-123位残基内的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基；和155-163位残基内的1、2、3、4、5、6、7、8或9个残基。在另一实施方案中，当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 145的46-50、113-116、120、156、159、160和163位残基5Å或更近。在另一实施方案中，当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 145的46-50、112-120、156、159、160和163位残基5Å或更近。在相关实施方案中，当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 145的46-50、53、112-120、156、159、160和163位残基5Å或更近。在另一实施方案中，当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 145的46-50、53-55、58、113-116、120、121、156、159、160、162和163位残基5Å或更近。在相关实施方案中，当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 145的46-51、53-55、57、58、112-116、118-121、123、155、156、159、160、162和163位残基5Å或更近。在再一实施方案中，当抗原结合蛋白与人IL-23结合时，抗原结合蛋白离如SEQ ID NO: 147中所述的人IL-23p40亚基的121-125位残基内的残基5Å或更近，其如X射线晶体学所测定。在相关实施方案中，当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 147的122和124位残基5 Å或更近。在另一实施方案中，当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 147的121-123和125位残基5Å或更近。
亦提供如上所述的分离的抗原结合蛋白，其中抗原结合蛋白具有选自以下的至少一种特性：a)降低人IL-23活性；b)降低促炎细胞因子的产生；c)以KD≤ 5×10-8 M与人IL-23结合；d)具有≤ 5×10-6 1/s的Koff速率；和d)具有≤ 400 pM的IC50。
提供包含至少一种如上所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一个实施方案中，提供的药物组合物进一步包含标记基团或效应基团。在又一实施方案中，提供这样的药物组合物，其中标记基团选自：同位素标记、磁性标记、氧化还原活性部分、光学染料、生物素化基团和被第二报道分子识别的预定多肽表位。在又一实施方案中，提供这样的药物组合物，其中效应基团选自：放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗基团和化疗基团。
亦提供用于治疗或预防患者中的与IL-23有关的病况的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效量的如上所述的至少一种分离的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，提供这样的方法，其中病况选自：炎性病症、风湿病、自身免疫性疾病、肿瘤病症和胃肠道病症。在又一实施方案中，提供这样的方法，其中病况选自：多发性硬化症、类风湿性关节炎、癌症、银屑病、炎性肠病、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、银屑病关节炎、自身免疫性心肌炎；1型糖尿病和强直性脊柱炎。在再一实施方案中，提供其中分离的抗原结合蛋白质单独或作为联合疗法给予的方法。
亦提供降低患者的IL-23活性的方法，所述方法包括给予有效量的至少一种如上所述的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，提供降低IL-23活性的方法，其中所述IL-23活性诱导产生促炎细胞因子。
附图简述
图1A：用重组人IL-23进行的STAT-萤光素酶报道分子测定的结果。所有抗体完全抑制重组人IL-23。
图1B：用天然人IL-23进行的STAT-萤光素酶报道分子测定的结果。仅一半完全抑制重组人IL-23的抗体能够完全抑制天然人IL-23。
详述
本发明提供与IL-23抗原结合蛋白有关的组合物、试剂盒和方法，所述IL-23抗原结合蛋白包括拮抗IL-23的分子，例如抗IL-23抗体、抗体片段和抗体衍生物，例如拮抗性抗IL-23抗体、抗体片段或抗体衍生物。亦提供：包含编码结合IL-23的多肽的全部或部分的核酸序列的多核苷酸及其衍生物和片段，例如，编码抗IL-23抗体、抗体片段或抗体衍生物的全部或部分的多核苷酸；包含所述核酸的质粒和载体；和包含所述多核苷酸和/或载体和质粒的细胞或细胞系。提供的方法包括例如制备、鉴别或分离IL-23抗原结合蛋白(例如抗IL-23抗体)的方法，测定分子是否与IL-23结合的方法，测定分子是否拮抗IL-23的方法，制备包含IL-23抗原结合蛋白的组合物例如药物组合物的方法，和用于将IL-23抗原结合蛋白给予受试者的方法，例如用于治疗由IL-23介导的病况及用于在体内或体外拮抗IL-23的生物活性的方法。
除非本文另外定义，否则与本发明有关使用的科学和技术术语，应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。与细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质和核酸化学和本文所述杂交关联使用的术语及这些的技术，通常众所周知并在本领域常用。除非另外指出，否则本发明方法和技术通常按照本领域熟知及在本说明书各处所引用和讨论的各种通用和更具体参考文献所述的常规方法来实施。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)；和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)；和Harlow和Lane 的Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)。按照厂商说明书、如本领域通常所实现或如本文所述来实施酶促反应及纯化技术。与本文所述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学关联使用的术语及这些的实验室程序和技术众所周知，并在本领域常用。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送及治疗患者。
为阐述及揭示例如可连同本文所述信息使用的在所述出版物中阐述的方法学目的，所有专利及其它标明的出版物通过引用以其整体明确并入本文。
本领域已知人IL-23 p19亚基(SEQ ID NO: 144和145)、共有p40亚基(SEQ ID NO: 146和147)、人IL-23受体异二聚体亚基IL-12Rβ1 (SEQ ID NO: 150和151)和IL-23R (SEQ ID NO: 148和149) 的多核苷酸和蛋白质序列，参见例如GenBank登记号AB030000、M65272、NM_005535、NM_144701，来自其它哺乳动物物种的那些亦是如此。业已阐述或可自商业来源获得重组IL-23和包括单链和Fc 蛋白在内的IL-23受体蛋白以及表达IL-23受体的细胞。(参见例如，Oppmann等，Immunity, 2000, 13: 713-715；R&D Systems, Minneapolis. Minnesota；United States Biological, Swampscott, Massachusetts；WIPO公开号WO 2007/076524)。可自人细胞例如树突细胞用包括本文所述的方法在内的本领域已知方法获得天然人IL-23。
IL-23为由与共有的p40亚基共价结合的独特的p19亚基组成的异二聚体细胞因子。p19亚基包含四个α-螺旋“A”、“B”、“C”和“D”，其呈由A和B螺旋之间、B和C螺旋之间和C和D螺旋之间的三个内部螺旋环连接的上-上-下-下基序，参见Oppmann等，Immunity, 2000, 13: 713-715和Beyer等，J Mol Biol, 2008. 382(4): 942-55。认为4个螺旋束细胞因子的A和D螺旋参与受体结合。p40亚基包含3个β-折叠夹层结构域D1、D2和D3 (Lupardus和Garcia, J. MOL. Biol., 2008、382:931-941)。
术语“多核苷酸”包括单链和双链核酸两种，并包括基因组DNA、RNA、mRNA、cDNA或合成来源或其某种组合，所述组合与通常在自然界发现的序列无关联。包含特定序列的分离的多核苷酸除特定序列外，还可包括多达10个或甚至多达20个其它蛋白质或其部分的编码序列，或可包括控制所述核酸序列的编码区的表达的可操作地连接的调控序列，和/或可包括载体序列。构成多核苷酸的核苷酸可为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或核苷酸任一种类型的经修饰的形式。修饰包括碱基修饰，例如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，例如2',3'-双脱氧核糖；和核苷酸间键修饰，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。
术语“寡核苷酸”意指包含100个或更少核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸为10-60个碱基长。在其它实施方案中，寡核苷酸为12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个核苷酸长。寡核苷酸可为单链或双链的，例如用于构建突变体基因。寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可包括用于检测测定的可检测标记，例如放射性标记、荧光标记、半抗原或抗原标记。寡核苷酸可例如作为PCR引物、克隆引物或杂交探针使用。
术语“多肽”或“蛋白质”意指具有天然蛋白质的氨基酸序列的大分子，也就是说，由天然存在及非重组的细胞产生的蛋白质；或其由遗传工程改造或重组的细胞产生并包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子；或已自天然序列缺失一个或多个氨基酸残基、将一个或多个氨基酸残基插入到天然序列和/或取代天然序列的一个或多个氨基酸残基的分子。该术语亦包括氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸为相应的天然存在的氨基酸的化学类似物和聚合物。术语“多肽”和“蛋白质”包括IL-23抗原结合蛋白(例如抗体)，和已自所述抗原结合蛋白序列缺失一个或多个氨基酸残基、将一个或多个氨基酸残基添加到所述抗原结合蛋白序列和/或取代所述抗原结合蛋白序列的一个或多个氨基酸残基的序列。术语“多肽片段”是指与全长天然蛋白质比较，具有氨基末端缺失、羧基末端缺失和/或内部缺失的多肽。所述片段与天然蛋白质比较亦可含有经修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段为约5-500个氨基酸长。例如，片段可为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。有用的多肽片段包括抗体的免疫学功能片段，包括结合结构域。在IL-23抗原结合蛋白例如抗体情况下，有用的片段包括但不限于一个或多个CDR区、重链或轻链的可变结构域、抗体链的部分、包括不到3个CDR的可变区的部分、等等。
“氨基酸”包括其在本领域的通常含义。20种天然存在的氨基酸及其缩写遵照常规用法。参见Immunology-A Synthesis, 第2版, (E. S. Golub和D. R. Gren编辑), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991)。20种常规氨基酸、非天然氨基酸例如[α]-、[α]-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸和其它非常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸)亦可为合适的多肽组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、[γ]-羧基谷氨酸、[ε]-N,N,N-三甲基赖氨酸、[ε]-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、[σ]-N-甲基精氨酸和其它相似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽标记法中，左手方向为氨基末端方向，右手方向为羧基末端方向，与标准用法和常规一致。
术语“分离的蛋白质”是指自蛋白质或多肽或会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其它用途的其它污染物纯化的蛋白质(例如抗原结合蛋白，其实例可为抗体)。本文所用“基本上纯的”意指所述分子种类为所存在的主要种类，也就是说，在摩尔基础上其比同一混合物中的任何其它单独种类更丰富。在某些实施方案中，基本上纯的分子为其中目标种类占所有存在的大分子种类的至少50% (基于摩尔)的组合物。在其它实施方案中，基本上纯的组合物包含所述组合物中存在的所有大分子种类的至少80%、85%、90%、95%或99%。在某些实施方案中，基本上同质的物质被纯化到通过常规检测方法不能在所述组合物中检测到污染种类的程度，因此所述组合物由单一可检测的大分子种类组成。
多肽(例如抗原结合蛋白，例如抗体)“变体”包含如下氨基酸序列：其中相对于另一多肽序列，将一个或多个氨基酸残基插入到所述氨基酸序列、自所述氨基酸序列缺失一个或多个氨基酸残基和/或取代所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。变体包括融合蛋白。多肽“衍生物”为以不同于插入、缺失或取代变体的某种方式经化学修饰例如经由与另一化学部分的缀合的多肽。
本说明书通篇与生物学物质例如多肽、核酸、宿主细胞等关联使用的术语“天然存在的”或“天然的”，是指在自然界发现的物质，例如天然人IL-23。在某些方面，提供结合天然IL-23的重组的抗原结合蛋白。在这种情况下，“重组蛋白质”为用重组技术即通过本文所述重组核酸的表达制备的蛋白质。用于生产重组蛋白质的方法和技术在本领域众所周知。
术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白，或其可与完整抗体竞争与靶标抗原特异性结合的片段，包括例如嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体和双特异性抗体。因此，抗体为抗原结合蛋白种类。除非另外指出，否则术语“抗体”除包括包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白，其实例在下面阐述。完整抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包含更少的链，例如骆驼(camelid)中天然存在的抗体，其可仅包含重链。抗体可仅自单一来源获得，或可为“嵌合的”，即抗体的不同的部分可自两个不同的抗体获得，其在下面进一步阐述。可在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过酶促或化学裂解完整抗体来产生抗原结合蛋白、抗体或结合片段。
本文所用术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)的“功能片段”(或简而言之“片段”)，为包含缺乏全长链中存在的至少一些氨基酸但能够特异性与抗原结合的抗体部分(不管该部分是如何获得或合成的)的抗原结合蛋白。所述片段具生物学活性，因为它们与靶标抗原特异性结合，并可与其它抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争与给定表位的特异性结合。在一个方面，所述片段保留全长轻链或重链中存在的至少一个CDR，在一些实施方案中，包含单一重链和/或轻链或其部分。可通过重组DNA技术产生这些生物学活性片段，或可通过酶促或化学裂解抗原结合蛋白(包括完整抗体)来产生这些生物学活性片段。片段包括但不限于免疫学功能片段，例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并可自任何哺乳动物来源获得，所述哺乳动物来源包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼或兔。进一步预期本文所公开的抗原结合蛋白的功能部分例如一个或多个CDR，可与第二蛋白质或与小分子共价结合，以创造针对体内特定靶标并具有双功能治疗特性或具有延长血清半衰期的治疗剂。
术语“竞争”当在抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)上下文中使用时，意指通过以下测定所测定的抗原结合蛋白之间的竞争，所述测定中在试验中的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如IL-23 蛋白或其片段)特异性结合。可使用众多类型的竞争性结合测定，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983, Methods in Enzymology 92:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (参见例如Kirkland等，1986, J. Immunol. 137:3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane, 1988, Antibodies, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记的固相直接标记RIA (参见例如Morel等，1988, Molec. Immunol. 25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA (参见例如Cheung等，1990, Virology 176:546-552)；和直接标记RIA (Moldenhauer等，1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82)。通常所述测定涉及使用与固体表面结合的纯化的抗原或荷有以下抗原结合蛋白中的任一种的细胞：未标记的试验抗原结合蛋白和标记的参考抗原结合蛋白。
通过在试验抗原结合蛋白存在下测定与固体表面或细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。通常试验抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白，包括与参考抗原结合蛋白结合相同表位的抗原结合蛋白，和与足够靠近参考抗原结合蛋白结合的表位的邻近表位结合以发生位阻的抗原结合蛋白。通常当竞争抗原结合蛋白过量存在时，其会抑制参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合达至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情况下，抑制结合达至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。
术语"表位"或"抗原决定簇"是指抗原结合蛋白结合的抗原上的位点。表位可由相邻氨基酸或通过蛋白质的三级折叠而并置的不相邻氨基酸形成。由相邻氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时仍保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时失去。表位决定簇可包括分子的化学活性表面聚簇(grouping)，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并可具有特殊的三维结构特点和/或特殊的电荷特点。表位通常包括呈独特空间构象的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35个氨基酸。可用本领域已知方法来测定表位。
IL-23抗原结合蛋白
本文所用“抗原结合蛋白”意指特异性结合特定靶标抗原的蛋白质；本文提供的抗原为IL-23，尤其是人IL-23，包括天然人IL-23。本文提供的抗原结合蛋白与IL-23的独特的p19亚基的至少一部分互相作用，可检测地结合IL-23；但不以任何显著性与IL-12 (例如IL-12的p40和/或p35亚基)结合，因此“宽免IL-12”。因而，本文提供的抗原结合蛋白能够影响IL-23活性，而没有可能出现抑制IL-12或共有的p40亚基的可能风险。抗原结合蛋白可影响IL-23与其受体相互作用的能力，例如通过影响与受体的结合，例如通过干扰受体缔合。具体而言，所述抗原结合蛋白完全或部分降低、抑制、干扰或调节IL-23的一种或多种生物活性。与不存在抗原结合蛋白时的反应相比，存在抗原结合蛋白时所述抑制或中和破坏生物反应，其可用本领域已知和本文所述的测定来测定。本文提供的抗原结合蛋白抑制IL-23诱导的促炎细胞因子产生，例如全血细胞中IL-23诱导的IL-22产生和NK及全血细胞中IL-23诱导的IFNγ表达。生物活性的降低可为约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。
抗原结合蛋白可包含与抗原结合的部分，任选包含允许抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白与所述抗原结合的构象的支架或构架部分。抗原结合蛋白实例包括抗体、抗体片段(例如抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可包含具嫁接CDR或CDR衍生物的备选蛋白质支架或人工支架。所述支架包括但不限于：源自抗体的支架，其包含引入以例如稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变；以及全合成支架，其包含例如生物相容聚合物。参见例如Korndorfer等，Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, (2003) 第53卷, 第1期:121-129；Roque等，Biotechnol. Prog., 2004, 20:639-654。另外，可使用肽抗体模拟物(“PAM”)以及基于抗体模拟物的支架，其用纤连蛋白组分作为支架。
本文所述某些抗原结合蛋白为抗体或源自抗体。所述抗原结合蛋白包括但不限于：单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体(minibody)、结构域抗体、合成抗体、抗体模拟物、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物、抗体缀合物、单链抗体及其各自的片段。在一些情况下，抗原结合蛋白为抗体的免疫学片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv)。本文进一步阐述及定义各种结构。
提供的某些抗原结合蛋白可包含一个或多个本文所述的CDR (例如1、2、3、4、5、6或更多个CDR)。在一些情况下，抗原结合蛋白包含：(a)多肽结构；和(b)被插入到多肽结构中和/或与多肽结构连接的一个或多个CDR。多肽结构可采取多种不同的形式。例如，其可为或包含天然存在的抗体或其片段或变体的构架，或可实际上完全合成。下文进一步阐述各种多肽结构的实例。
当解离平衡常数(KD)≤ 10-8 M时，认为本发明抗原结合蛋白“特异性结合”其靶标抗原。当KD≤ 5 × 10-9 M时，抗原结合蛋白以“高亲和力”特异性结合抗原，当KD≤ 5 × 10-10 M时，抗原结合蛋白以“极高亲和力”特异性结合抗原。在一个实施方案中，抗原结合蛋白将以≤ 5 × 10-12 M的KD与人IL-23结合，在又一实施方案中，其将以KD≤ 5 × 10-13 M结合。在本发明另一实施方案中，抗原结合蛋白具有≤ 5 × 10-12 M的KD和约≤5×10-6 1/s的Koff。在另一实施方案中，Koff为≤ 5×10-71/s。
另一方面提供具有至少一天体外或体内(例如当给予人受试者时)半衰期的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白具有至少三天的半衰期。在另一实施方案中，抗体或其部分具有4天或更长的半衰期。在另一实施方案中，抗体或其部分具有8天或更长的半衰期。在另一实施方案中，衍生或修饰抗体或其抗原结合部分使得其与未衍生或未修饰的抗体相比具有更长的半衰期。在另一实施方案中，抗原结合蛋白含有点突变以提高血清半衰期，例如在WIPO公开号WO 00/09560中所述。
在其中抗原结合蛋白用于治疗应用的实施方案中，抗原结合蛋白可降低、抑制、干扰或调节IL-23的一种或多种生物学活性，例如诱导促炎细胞因子产生。IL-23具有很多不同的生物学作用，其可在不同细胞类型中以很多不同测定来测量；已知所述测定的实例，其在本文中提供。
提供的一些抗原结合蛋白具有通常与天然存在的抗体相关的结构。这些抗体的结构单元通常包含一个或多个四聚物，每一个由两个相同的多肽链对组成，但哺乳动物的一些物种亦产生仅具有单个重链的抗体。在典型的抗体中，每双或每对包括一条全长“轻”链(在某些实施方案中，约25 kDa)和一条全长“重”链(在某些实施方案中，约50-70 kDa)。每一单独的免疫球蛋白链由若干“免疫球蛋白结构域”组成，每一个结构域由大约90-110个氨基酸组成并表现特征性的折叠模式。这些结构域为组成抗体多肽的基本单位。每条链的氨基末端部分通常包括负责抗原识别的可变区。羧基末端部分比链的其它末端在进化上更保守，被称为“恒定区”或“C区”。通常将人轻链分为κ和λ轻链，这些中的每一个含有一个可变区和一个恒定结构域(CL1)。通常将z重链分为μ、δ、γ、α或ε链，这些限定抗体的同种型分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgM和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。在人中，IgA和IgD同种型含有四条重链和四条轻链；IgG和IgE同种型含有两条重链和两条轻链；IgM同种型含有五条重链和五条轻链。重链恒定区(CH)通常包含可负责效应子功能的一个或多个结构域。重链恒定区结构域的数量视同种型而定。例如，IgG重链每一条含有3个CH区结构域，称为CH1、CH2和CH3。提供的抗体可具有任何这些同种型和亚型，例如IL-23抗原结合蛋白为IgG1、IgG2或IgG4亚型的。若期需IgG4，亦可期需将点突变(CPSCP->CPPCP)引入铰链区(如Bloom等，1997, Protein Science 6:407中所述)，以降低形成可导致IgG4抗体的异质性的H链内二硫键的倾向。可用亚类转换方法将属于一种类型的本文提供的抗体改变为不同的类型。参见例如Lantto等，2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316。
在全长轻链和重链中，可变区和恒定区由约12或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链亦包括约10多个氨基酸的“D”区。参见例如Fundamental Immunology, 第2版, 第7章(Paul, W.编辑) 1989, New York: Raven Press。每一轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。
可变区
本文提供的各种重链和轻链可变区(或结构域)在表1和2中描述。这些可变区中的每一个可例如与上述重链和轻链恒定区连接。另外，如此产生的重链和轻链序列中的每一个可组合以形成完全抗原结合蛋白结构。
提供含有至少一个重链可变区(VH)和/或至少一个轻链可变区(VL)的抗原结合蛋白，所述重链可变区选自：VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15和VH16；所述轻链可变区选自：VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15和VL16，其如下表1和2所示。
表2中所列重链可变区的每一种可与表1中所示的任何轻链可变区组合，以形成抗原结合蛋白。在一些情况下，抗原结合蛋白包括来自表1和2中所列的那些的至少一个重链可变区和/或一个轻链可变区。在一些情况下，抗原结合蛋白包括来自表1和2中所列的那些的至少两个不同的重链可变区和/或轻链可变区。重链可变区的各种组合可与任何轻链可变区的各种组合组合。
在其它情况下，抗原结合蛋白含有两个相同的轻链可变区和/或两个相同的重链可变区。举例而言，抗原结合蛋白可为抗体或免疫学功能片段，其包含如表1和2中所列的轻链可变区对和重链可变区对的组合中的两个轻链可变区和两个重链可变区。所述包含两个相同的重链和轻链可变区的抗原结合蛋白实例包括：抗体A VH14/ VL14；抗体B VH9/ VL9；抗体C VH10/ VL10；抗体D VH15/ VL15；抗体E VH1/ VL1；抗体F VH11/ VL11；抗体G VH12/ VL12；抗体H VH13/ VL13；抗体I VH8/ VL8；抗体J VH3/ VL3；抗体K VH7/ VL7；抗体L VH4/ VL4；抗体M VH5/ VL5和抗体N VH6/ VL6。
提供的一些抗原结合蛋白包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区和/或轻链可变区包含仅以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基与选自表1和2的重链可变区和/或轻链可变区的序列不同的氨基酸序列，其中每一所述序列差异独立为一个氨基酸的缺失、插入或取代。在一些抗原结合蛋白中，轻链和重链可变区包含与表1和2提供的氨基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。其它抗原结合蛋白，例如，抗体或免疫学功能片段，亦包括本文所述的变体重链区形式和/或变体轻链区形式。
术语“同一性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个多核苷酸的序列之间的关系，其通过比对和比较序列来测定。“同一性百分比”意指被比较的分子的氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，基于正被比较的最小分子的大小来计算
。
对于这些计算，应该通过特定数学模型或计算机程序(即“算法”)来解决比对中的空位(如果有的话)。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性方法的包括以下文献中所述方法：Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M.编辑), 1988, New York: Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W.编辑), 1993, New York: Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M.和Griffin, H. G.编辑), 1994, New Jersey: Humana Press；von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press；Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M.和Devereux, J.编辑), 1991, New York: M. Stockton Press；和Carillo等，1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073。
在计算同一性百分比过程中，以提供序列间的最大匹配的方式来比对正被比较的序列。用于计算同一性百分比的计算机程序为GCG程序包，其包括GAP (Devereux等，1984, Nucl. Acid Res. 12:387；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。用计算机算法GAP来比对待测定其序列同一性百分比的两个多肽或多核苷酸。针对其各自的氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨距(matched span)”，其由算法测定)比对序列。空位开放罚分(其计算为3乘以平均对角线(average diagonal)；其中“平均对角线”是所采用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过特定比较矩阵指派给各完美氨基酸匹配的分值或数值)和空位延伸罚分(通常是空位开放罚分的1/10)以及比较矩阵例如PAM 250或BLOSUM 62与算法联用。在某些实施方案中，算法亦使用标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，参见Dayhoff等，1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352；对于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)。
用GAP程序测定多肽或核苷酸序列同一性百分比的推荐参数如下：算法：Needleman等，1970, J. MOL. Biol. 48:443-453；比较矩阵： 来自Henikoff等，1992, 见上的BLOSUM 62；空位罚分：12 (但无末端空位罚分)；空位长度罚分：4；相似性阀值：0。用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可导致仅两个序列的短区域匹配，这种小比对区可使即使两个全长序列间无显著关系也具有极高序列同一性。因此，若需要的话，可调整所选择的比对方法(GAP程序)以导致跨越靶标多肽的至少50个相邻氨基酸的比对。
本文所公开的重链和轻链可变区包括源自相关抗原结合蛋白组的共有序列。分析了重链和轻链可变区的氨基酸序列的相似性。出现四个组，一个组具有κ轻链可变区(VH9/ VL9、VH10/ VL10、VH11/ VL11、VH13/ VL13、VH14/ VL14和VH15/ VL15)，三个组具有λ轻链可变区：λ组1 (VH5/ VL5、VH6/ VL6和VH7/ VL7)、λ组2 (VH3/ VL3和VH4/ VL4)和λ组3 (VH1/ VL1和VH2/ VL2)。代表的轻链种系包括VK1/A30和VK1/L19。代表的轻链λ种系包括VL1/1e、VL3/3p、VL5/5c和VL9/9a。代表的重链种系包括VH3/3-30、VH3/3-30.3、VH3/3-33、VH3/3-48、VH4/4-31和VH4/4-59。本文所用“共有序列”是指具有在多种序列中共有的保守氨基酸和在给定氨基酸序列内变化的可变氨基酸的氨基酸序列。用标准系统发生分析对应于本文所公开的IL-23抗原结合蛋白的轻链和重链可变区来测定共有序列。
κ组的轻链可变区共有序列为DX1QX2TQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGX3X4SX5WX6AWYQQKPGX7APX8LLIYAASSLQSGVPSRFSGSX9SGTX10FTLTISSLQPX11DFATYX12CQQANSFPFTFGPGTKVDX13K (SEQ ID NO: 30)，其中X1选自I或S；X2选自M或L；X3 选自G或V；和X4选自S、F或I；X5 选自S或G；X6选自F或L；X7 选自K或Q；X8选自K、N或S；X9选自G或V；X10 选自D或E；X11选自E或A；X12 选自Y或F；和X13 选自I、V或F。
λ组1的轻链可变区共有序列为QPX1LTQPPSASASLGASVTLTCTLX2SGYSDYKVDWYQX3RPGKGPRFVMRVGTGGX4VGSKGX5GIPDRFSVLGSGLNRX6LTIKNIQEEDESDYHCGADHGSGX7NFVYVFGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 61)，其中X1选自V或E；X2选自N或S；X3 选自Q或L；X4选自I或T；X5 选自D或E；X6选自Y或S；和X7 选自S或N。
λ组3的轻链可变区共有序列为QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNX1GAGYDVHWYQQX2PGTAPKLLIYGSX3NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTX4RLTVL (SEQ ID NO: 139)，其中X1选自T或I；X2选自V或L；X3 选自G或N；和X4选自R或K。
κ组的重链可变区共有序列为QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIX1SGGYYWX2WIRQHPGKGLEWIGX3IX4YSGX5X6YYNPSLKSRX7TX8SVDTSX9NQFSLX10LSSVTAADTAVYYCAX11X12RGX13YYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 140)，其中X1选自N或S；X2选自S或T；X3 选自Y或H；X4选自Y或H；X5 选自S或N；X6选自S或T；X7 选自V或I；X8选自I或M；X9选自K或Q；X10 选自K或S；X11选自R或K；X12 选自D或N；和X13 选自H、F或Y。
λ组1的重链可变区共有序列为EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCX1X2SGFTFSX3X4SMNWVRQAPGKGLEWVSYISSX5SSTX6YX7ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRIAAAGX8X9X10YYYAX11DVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 141)，其中X1选自A或V；X2选自A或V；X3 选自T或S；和X4选自Y或F；X5 选自S或R；X6选自R或I；X7 选自H、Y或I；X8选自P或G；X9选自W或F；X10 选自G或H；和X11选自M或L。
λ组2的重链可变区共有序列为QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYX1MHWVRQAPGKGLEWX2X3VISX4DGSX5KYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERTTLSGSYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 142)，其中X1选自G或A；X2选自V或L；X3 选自A或S；和X4选自F或H；和X5 选自L或I。
λ组3的重链可变区共有序列为QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNX1YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYX2SSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 143)，其中X1选自E或K；和X2选自T或S。
互补测定区
互补测定区或“CDR”包埋在重链和轻链可变区的构架中，其中它们构成负责抗原结合和识别的区。同一物种的免疫球蛋白链的可变结构域例如通常表现出相似的总体结构；包含由高可变CDR区连接的相对保守的构架区(FR)。抗原结合蛋白可具有1、2、3、4、5、6或更多个CDR。例如，以上讨论的可变区通常包含三个CDR。通常通过构架区使来自重链可变区和轻链可变区的CDR定位以形成在靶标抗原(例如IL-23)上特异性结合的结构。天然存在的轻链和重链可变区二者通常从N-末端到C-末端符合以下这些元件次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在表1和2中突出显示了例示性轻链可变结构域和重链可变结构域的CDR和FR区。应认识到CDR和FR区的边界可自那些突出显示的那些变化。设计编号系统以给在这些结构域的每一个中占有位置的氨基酸指派编号。可用这些系统鉴别给定抗原结合蛋白的互补决定区和构架区。在以下文献中定义编号系统：Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美国卫生与公众服务部(US Dept. of Health and Human Services), PHS, NIH, NIH出版号91-3242, 1991；或Chothia & Lesk, 1987, J. MOL. Biol. 196:901-917；Chothia等，1989, Nature 342:878-883。用于免疫球蛋白链中的氨基酸的其它编号系统包括IMGT® (国际免疫遗传学信息系统(the international ImMunoGeneTics information system)；Lefranc等，Dev. Comp. Immunol. 2005, 29:185-203)；和AHo (Honegger和Pluckthun, J. MOL. Biol. 2001, 309(3):657-670)。本文提供的CDR不仅可用于界定传统抗体结构的抗原结合结构域，而且还可包埋在本文所述的多种其它多肽结构中。
本文所公开的抗原结合蛋白为可将一个或多个CDR嫁接、插入、包埋和/或连接于其中的多肽。抗原结合蛋白可具有例如：一个重链CDR1 (“CDRH1”)，和/或一个重链CDR2 (“CDRH2”)，和/或一个重链CDR3 (“CDRH3”)，和/或一个轻链CDR1 (“CDRL1”)，和/或一个轻链CDR2 (“CDRL2”)，和/或一个轻链CDR3 (“CDRL3”)。一些抗原结合蛋白包含CDRH3和CDRL3二者。特定实施方案通常利用非重复性的CDR的组合，例如，抗原结合蛋白通常不用一个可变重链区中的两个CDRH2区来形成等等。抗原结合蛋白可包含一个或多个氨基酸序列，其等同于表3中提呈的一个或多个CDR的氨基酸序列，或仅以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基不同于表3中提呈的一个或多个CDR的氨基酸序列，其中每一个所述序列差异独立为缺失、插入或取代一个氨基酸。在一些抗原结合蛋白中，CDR包含与表3中所列CDR序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一些抗原结合蛋白中，CDR包埋在“构架”区中，其定向一个或多个CDR以使实现所述CDR 的合适抗原结合特性。
表 3
例示性 CDRH 和 CDRL 序列
本文提供包含以下氨基酸残基的CDR1区：SEQ ID NO: 7和11的23-34位氨基酸残基；SEQ ID NO: 9、13、15、17、19、21、23、25、27和29的24-34位氨基酸残基；SEQ ID NO: 1、3和4的23-36位氨基酸残基；SEQ ID NO: 31、33、34、38、40、44、52和60的31-35位氨基酸残基；和SEQ ID NO: 46、48、50、54、56和58的31-37位氨基酸残基。
提供包含以下氨基酸残基的CDR2区：SEQ ID NO: 9、13、15、17、19、21、23、25、27和29的50-56位氨基酸残基；SEQ ID NO: 7和11的50-61位氨基酸残基；SEQ ID NO: 4的52-62位氨基酸残基；SEQ ID NO: 31、33、44和52的50-65位氨基酸残基；SEQ ID NO: 36、38、40、42和60的50-66位氨基酸残基；SEQ ID NO: 1和3的52-58位氨基酸残基；和SEQ ID NO: 46、48、50、54、56和58的52-67位氨基酸残基。
亦提供包含以下氨基酸残基的CDR3区：SEQ ID NO: 13、15、17、19、21、23、25、27和29的89-97位氨基酸残基；SEQ ID NO: 1和3的91-101位氨基酸残基；SEQ ID NO: 7、9和11的94-106位氨基酸残基；SEQ ID NO: 44和52的98-107位氨基酸残基；SEQ ID NO: 4的97-105位氨基酸残基；SEQ ID NO: 34和36的99-110位氨基酸残基；SEQ ID NO: 112的99-112位氨基酸残基；SEQ ID NO: 31和33的99-113位氨基酸残基；SEQ ID NO: 38、40和42的99-114位氨基酸残基；SEQ ID NO: 46、48、54、56和58的100-109位氨基酸残基；和SEQ ID NO: 50的101-019位氨基酸残基。
本文所公开的CDR包括源自相关序列组的共有序列。如前所述，鉴别了可变区序列的四个组，即κ组和三个λ组。来自κ组的CDRL1共有序列由RASQX1X2SX3WX4A (SEQ ID NO: 123)组成，其中X1选自G或V；X2选自I、F或S；X3 选自S或G；和X4选自F或L。来自λ组1的CDRL1共有序列由TLX1SGYSDYKVD (SEQ ID NO: 124)组成，其中X1选自N或S。来自λ组3的CDRL1共有序列由TGSSSNX1GAGYDVH (SEQ ID NO: 125)组成，其中X1选自I或T。
来自λ组1的CDRL2共有序列由VGTGGX1VGSKGX2 (SEQ ID NO: 126)组成，其中X1选自I或T，X2选自D或E。来自λ组3的 CDRL2共有序列由GSX1NRPS (SEQ ID NO: 127)组成，其中X1选自N或G。
CDRL3共有序列包括GADHGSGX1NFVYV (SEQ IDN NO:128)，其中X1为S或N。
来自κ组的CDRH1共有序列由SGGYYWX1 (SEQ ID NO: 129)组成，其中X1选自S或T。来自λ组1的CDRH1共有序列由X1X2SMN (SEQ ID NO: 131)组成，其中X1选自S或T，X2选自Y或F。来自λ组2的CDRH1共有序列由SYX1MH (SEQ ID NO: 130)组成，其中X1选自G或A。
来自κ组的CDRH2共有序列由X1IX2YSGX3X4YYNPSLKS (SEQ ID NO: 132)组成，其中X1选自Y或H；X2选自Y或H；X3 选自S或N，X4选自T或S。来自λ组1的共有序列由YISSX1SSTX2YX3ADSVKG (SEQ ID NO: 134)组成，其中X1选自R或S，X2选自I或R，X3选自I、H或Y。来自λ组2的共有序列由VISX1DGSX2KYYADSVKG (SEQ ID NO: 133)组成，其中X1为F或H，X2为L或T。来自λ组3的CDRH2共有序列由VIWYDGSNX1YYADSVKG (SEQ ID NO: 135)组成，其中X1选自K或E。
来自κ组的CDRH3共有序列由X1RGX2YYGMDV (SEQ ID NO: 136)组成，其中X1选自N或D，X2选自H、Y或F。来自λ组1的CDRH3共有序列由RIAAAGX1X2X3YYYAX4DV (SEQ ID NO: 137)组成，其中X1选自G或P；X2选自F或W；X3 选自H或G；和X4选自L和M。来自λ组3的CDRH3共有序列由DRGYX1SSWYPDAFDI (SEQ ID NO: 138)组成，其中X1选自S或T。
单克隆抗体
提供的抗原结合蛋白包括与IL-23结合的单克隆抗体。可用本领域已知的任何技术生产单克隆抗体，例如通过使自完成免疫方案后的转基因动物收获的脾细胞永生化。可用本领域已知的任何技术使脾细胞永生化，例如通过让它们与骨髓瘤细胞融合来产生杂交瘤。用于产生杂交瘤的融合程序中的骨髓瘤细胞优选不产生抗体，具有高融合效率并缺乏酶，这使得它们不能够在仅支持所期需的融合细胞(杂交瘤)生长的某种选择性培养基中生长。用于小鼠融合的合适的细胞系实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul；用于大鼠融合的细胞系实例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。可用于细胞融合的其它细胞系为U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
在一些情况下，如下产生杂交瘤细胞系：通过用IL-23免疫原免疫动物(例如具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)；从免疫的动物收获脾细胞；让收获的脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，由此产生杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，鉴别产生结合IL-23多肽同时宽免IL-12的抗体的杂交瘤细胞系。所述杂交瘤细胞系及由其产生的抗IL-23单克隆抗体是本申请的多个方面。
可用本领域已知的任何技术来纯化杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。可进一步筛选杂交瘤细胞或mAb以鉴定具有特殊特性(例如抑制IL-23诱导的活性的能力)的mAb。
嵌合抗体和人源化抗体
亦提供基于前述序列的嵌合和人源化抗体。可以以多种方式在使用前修饰用作治疗剂的单克隆抗体。一个实例为嵌合抗体，其为由来自不同的抗体的蛋白质区段组成的抗体，所述蛋白质区段共价连接以产生功能免疫球蛋白轻链或重链或其免疫学功能部分。通常所述重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。关于与嵌合抗体有关的方法，参见例如美国专利号4,816,567；和Morrison等，1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855。CDR嫁接阐述于例如美国专利号6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101中。
一种有用的嵌合抗体类型为“人源化”抗体。通常人源化抗体自最初在非人动物中产生的单克隆抗体产生。修饰该单克隆抗体中的某些氨基酸残基，通常为来自抗体的非抗原识别部分的氨基酸残基，以使其与相应同种型的人抗体的相应残基同源。可例如用各种方法通过取代啮齿动物可变区的至少一部分为相应的人抗体区来实施人源化(参见例如美国专利号5,585,089和5,693,762；Jones等，1986, Nature 321:522-525；Riechmann等，1988, Nature 332:323-27；Verhoeyen等，1988, Science 239:1534-1536)。
在某些实施方案中，可使用来自除人以外的物种的恒定区和人可变区一起产生杂合抗体。
完全人抗体
亦提供完全人抗体。可获得用于在无需将人暴露至给定抗原的情况下制备对所述抗原特异的完全人抗体(“完全人抗体”)的方法。提供用于实施生产完全人抗体的一种特异性手段为使小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座引入其中内源Ig基因业已失活的小鼠，是在小鼠中产生完全人单克隆抗体(mAb)的一种手段，所述小鼠为可用任何期需抗原免疫的动物。用完全人抗体可使免疫原性反应和变态反应最小化，所述免疫原性反应和变态反应有时可因将小鼠mAb或小鼠衍生的mAb作为治疗剂给予人而引起。
可通过免疫能够在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体库的转基因动物(通常为小鼠)来产生完全人抗体。用于该目的的抗原通常具有6个或更多个相邻氨基酸，并任选与载体例如半抗原缀合。参见例如Jakobovits等，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555；Jakobovits等，1993, Nature 362:255-258；和Bruggermann等，1993, Year in Immunol. 7:33。在所述方法的一个实例中，通过使其中编码小鼠重链和轻链免疫球蛋白链的内源小鼠免疫球蛋白基因座无能力，并将含有编码人重链和轻链蛋白的基因座的人基因组 DNA插入到小鼠基因组大片段中，来产生转基因动物。然后让具有少于人免疫球蛋白基因座完全互补序列的经部分修饰的动物杂交，获得具有全部所期需免疫系统修饰的动物。当给予免疫原时，这些转基因动物产生对所述免疫原具有免疫特异性但具有人而不是鼠的氨基酸序列(包括可变区)的抗体。关于所述方法的进一步详细资料参见例如WIPO专利公开号WO96/33735和WO94/02602。与用于制备人抗体的转基因小鼠有关的另外方法阐述于以下文献中：美国专利号5,545,807；6,713,610；6,673,986；6,162,963；5,545,807；6,300,129；6,255,458；5,877,397；5,874,299和5,545,806；WIPO专利公开号WO91/10741、WO90/04036和EP 546073B1和EP 546073A1。
上述转基因小鼠含有编码未重排的人重链([μ]和[γ])和[κ]轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微小基因座(minilocus)，以及使内源[μ]和[κ]链基因座失活的靶向突变(Lonberg等，1994, Nature 368:856-859)。因此，所述小鼠表现出降低的小鼠IgM或[κ]表达及对免疫的反应性，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，以产生高亲和力人IgG [κ]单克隆抗体(Lonberg等，见上；Lonberg和Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93；Harding和Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546)。所述小鼠的制备详细阐述于以下文献中：Taylor等，1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen等，1993, International Immunology 5:647-656；Tuaillon等，1994, J. Immunol. 152:2912-2920；Lonberg等，1994, Nature 368:856-859；Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101；Taylor等，1994, International Immunology 6:579-591；Lonberg和Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93；Harding和Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546；Fishwild等，1996, Nature Biotechnology 14:845-85。另外参见以下文献：美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；以及美国专利号5,545,807；WIPO公开号WO 93/1227；WO 92/22646；和WO 92/03918。用于在这些转基因小鼠中产生人抗体的技术亦公开于WIPO公开号WO 98/24893和Mendez等，1997, Nature Genetics 15:146-156中。例如，可使用HCo7和HCo12 转基因小鼠品系来产生抗IL-23抗体。
用杂交瘤技术，可自转基因小鼠例如上述转基因小鼠产生和选择具所期需特异性的抗原特异性人mAb。可用合适的载体和宿主细胞克隆和表达所述抗体，或可自培养的杂交瘤细胞收获所述抗体。
完全人抗体亦可源自噬菌体展示文库(例如以下所揭示：Hoogenboom等，1991, J. MOL. Biol. 227:381；Marks等，1991, J. MOL. Biol. 222:581；WIPO公开号WO 99/10494)。噬菌体展示技术通过在丝状噬菌体表面上展示抗体谱并随后通过其与所选择的抗原的结合选择噬菌体，来模拟免疫选择。
双特异性或双功能抗原结合蛋白
“双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗原结合蛋白或抗体分别为杂合抗原结合蛋白或抗体，具有两个不同的抗原结合位点，例如如上所述的一个或多个CDR或一个或多个可变区。在一些情况下，它们为具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。多特异性抗原结合蛋白或“多特异性抗体”为靶向不止一个抗原或表位的抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白和抗体为多特异性抗原结合蛋白抗体的种类，可通过多种方法产生，所述方法包括但不限于杂交瘤融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai和Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321；Kostelny等，1992, J. Immunol. 148:1547-1553。
免疫学片段
抗原结合蛋白亦包括抗体的免疫学片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2或scFv)。“Fab片段”由一条轻链(轻链可变区(VL)及其相应恒定结构域(CL))和一条重链(重链可变区(VH)和第一恒定结构域(CH1))组成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的一部分，所述一条重链的一部分亦含有CH1和CH2结构域之间的区域，使得可在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab')2分子。由此，“F(ab')2片段”由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab'片段组成。“Fv片段” 由抗体单臂的可变轻链区和可变重链区组成。单链抗体“scFv”为其中重链和轻链可变区已通过柔性接头连接以形成单一多肽链的Fv分子，所述单一多肽链形成抗原结合区。在以下文献中详细论述单链抗体：WIPO公开号WO 88/01649；美国专利号4,946,778和5,260,203；Bird, 1988, Science 242:423；Huston等，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879；Ward等，1989, Nature 334:544, de Graaf等，2002, Methods Mol Biol. 178:379-387；Kortt等，1997, Prot. Eng. 10:423；Kortt等，2001, Biomol. Eng. 18:95-108和Kriangkum等，2001, Biomol. Eng. 18:31-40。“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键并通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
亦包括结构域抗体，即仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫学功能免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区与肽接头共价连接形成二价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH区可靶向相同或不同的抗原。双抗体为包含两条多肽链的二价抗体，其中每一条多肽链包含由接头连接的VH和VL结构域，所述接头太短而不允许在同一条链的两个结构域之间配对，因此允许每一个结构域与另一多肽链上的互补结构域配对(参见例如Holliger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993和Poljak等，Structure 2:1121-23, 1994)。同样地，三链抗体(tribody)和四链抗体(tetrabody)为分别包含三条和四条多肽链的抗体，分别形成可相同或不同的三个和四个抗原结合位点，Maxibody包含与IgG1的Fc区共价连接的二价scFv (参见例如Fredericks等，2004, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106；Powers等，2001, Journal of Immunological Methods, 251:123-135；Shu等，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999；Hayden等，1994, Therapeutic Immunology 1:3-15)。
各种其它形式
亦提供以上公开的抗原结合蛋白的变体形式，一些抗原结合蛋白在表1和2中列出的一个或多个重链或轻链、可变区或CDR中具有例如一个或多个保守氨基酸取代。
可基于共有侧链特性将天然存在的氨基酸分类为：疏水(正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile)；中性亲水(Cys、Ser、Thr、Asn、Gln)；酸性(Asp、Glu)；碱性(His、Lys、Arg)；影响链定向的残基(Gly、Pro)；和芳族(Trp、Tyr、Phe)。
保守氨基酸取代可涉及这些类别之一的成员与同一类别的另一成员交换。保守氨基酸取代可包括非天然存在的氨基酸残基，其通常通过化学肽合成而不是通过在生物系统中的合成来引入。这些包括模拟肽(peptidomimetics)和氨基酸部分的其它反向或颠倒形式。可通过在重链和轻链氨基酸序列中产生取代来实现本文所述抗原结合蛋白的功能和/或生物化学特性的这类实质修饰，所述取代在其对保持以下方面的作用中明显不同：(a)取代区域中的分子骨架的结构，例如作为片层或螺旋构象；(b)靶标位点的分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小(bulkiness)。
非保守取代可涉及以上类别之一的成员与另一类别的成员的交换。可将所述取代的残基引入与人抗体同源的抗体的区域，或引入所述分子的非同源区。
在进行所述变化时，按照某些实施方案，可考虑氨基酸的亲水指数。通过为每一个氨基酸指派一个数值(“亲水指数”)，然后沿肽链重复对这些值取平均值来计算蛋白质的亲水特性。基于其疏水性和电荷特性为每一氨基酸指派亲水指数。其为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺 (-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域理解亲水特性在赋予蛋白质相互作用生物功能方面的重要性(参见例如Kyte等，1982, J. MOL. Biol. 157:105-131)。已知某些氨基酸可用具有相似亲水指数或记分的其它氨基酸取代，并仍保留相似的生物活性。在基于亲水指数进行变化时，在某些实施方案中包括其亲水指数在±2之内的氨基酸的取代。在一些方面包括±1之内的氨基酸的取代，在其它方面包括±0.5之内的氨基酸的取代。
本领域亦要理解，基于亲水性可有效进行类似氨基酸的取代，尤其是在藉此产生的生物学功能的蛋白质或肽意欲用于免疫学实施方案时，如在本发明情况下。在某些实施方案中，由其邻近氨基酸的亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原结合或免疫原性有关联，也就是说，与所述蛋白质的生物特性有关联。
指派给这些氨基酸残基以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺 (+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行变化时，在某些实施方案中包括其亲水性值在±2之内的氨基酸的取代，在其它实施方案中包括在±1之内的氨基酸的取代，在又其它实施方案中包括在±0.5之内的氨基酸的取代。在一些情况下，亦可基于亲水性由一级氨基酸序列的鉴别表位。这些区域亦被称为“表位核心区”。
例示性保守氨基酸取代示于表4中。
表 4
保守氨基酸取代
技术人员将能够用众所周知的技术确定本文所示多肽的合适变体，其如。本领域技术人员可鉴别可通过靶向认为对活性不重要的区域而被改变却又不破坏活性的分子的合适区域。技术人员亦能够鉴别在相似多肽中保守的分子的残基和部分。在另外的实施方案中，甚至可让对生物活性或结构重要的区域经历保守氨基酸取代而不破坏生物活性或不有害地影响多肽结构。
另外，本领域技术人员可回顾鉴别相似多肽中对活性或结构重要的残基的结构-功能研究。鉴于这类比较，可预测与在类似蛋白质中对活性或结构重要的氨基酸残基相应的蛋白质中的氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可针对这类预测的重要氨基酸残基选择化学上类似的氨基酸取代。
本领域的技术人员还可分析3维结构和与类似多肽中的3维结构有关的氨基酸序列。鉴于这类信息，本领域的技术人员可根据其3维结构预测抗体的氨基酸残基的排列。本领域的技术人员可选择不对预测位于蛋白质表面的氨基酸残基进行重大改变，因为这类残基可参与与其它分子的重要相互作用。此外，本领域的技术人员可产生在各个所需氨基酸残基上含有单个氨基酸取代的试验变体。然后可采用针对IL-23活性的测定法(参见下文的实例)筛选这些变体，由此得到可改变哪些氨基酸和不能改变哪些氨基酸的信息。换句话说，根据从这类例行试验收集的信息，本领域的技术人员可容易地确定其中单独的或与其它突变组合的进一步取代应予以避免的氨基酸位置。
许多科技出版物致力于预测二级结构。参见Moult，1996，Curr. Op. in Biotech. 7:422-427；Chou等，1974，Biochemistry 13:222-245；Chou等，1974，Biochemistry 113:211-222；Chou等，1978，Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148；Chou等，1979，Ann. Rev. Biochem. 47:251-276；以及Chou等，1979，Biophys. J. 26:367-384。此外，目前可获得辅助预测二级结构的计算机程序。预测二级结构的一种方法基于同源性建模。例如，序列同一性大于30%或相似性大于40%的2个多肽或蛋白质通常具有相似的拓扑结构。蛋白质结构数据库(PDB)的最新增长，提高二级结构的可预测性，包括多肽或蛋白质结构内折叠的可能数目。参见Holm等，1999，Nucl. Acid. Res. 27:244-247。研究表明(Brenner等，1997，Curr. Op. Struct. Biol. Biol. 7:369-376)，在给定多肽或蛋白质中存在有限数目的折叠，一旦解析出结构的临界值，则结构预测将变得明显更准确。
预测二级结构的其它方法包括“穿线法(threading)” (Jones，1997，Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87；Sippl等，1996，Structure 4:15-19)；“概况分析(profile analysis)” (Bowie等，1991，Science 253:164-170；Gribskov等，1990，Meth. Enzym. 183:146-159；Gribskov等，1987，Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358)和“进化连锁(evolutionary linkage)” (参见Holm，1999，同上；以及Brenner，1997，同上)。
在一些实施方案中，进行这样的氨基酸取代，其：(1)降低对蛋白质水解的易感性；(2)降低对氧化的易感性；(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力；(4)改变配体或抗原结合亲和力；和/或(4)赋予或改变所述多肽的其它物理化学或功能特性，例如保持取代区域中分子骨架的结构，例如作为片层或螺旋构象；保持或改变分子在靶标位点的电荷或疏水性；或保持或改变侧链的大小。
例如，可在天然存在的序列中进行单个或多个氨基酸取代(在某些实施方案中为保守氨基酸取代)。可在位于形成分子间接触的一个或多个结构域外的抗体部分中进行取代。在所述实施方案中，可使用保守氨基酸取代，所述取代基本上不改变母体序列的结构特性(例如不破坏表征母体或天然抗原结合蛋白的二级结构的一个或多个置换氨基酸)。本领域公认的多肽二级和三级结构实例阐述于以下文献中：Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton编辑), 1984, W. H. New York: Freeman and Company；Introduction to Protein Structure (Branden和Tooze编辑), 1991, New York: Garland Publishing；和Thornton等，1991, Nature 354:105。
另外的变体包括半胱氨酸变体，其中自母体或天然氨基酸序列缺失一个或多个半胱氨酸残基或用另一种氨基酸(例如丝氨酸)取代一个或多个半胱氨酸残基。当抗体(例如)必需再次折叠为生物学活性构象时，半胱氨酸变体尤其有用。半胱氨酸变体可比天然蛋白质具有更少的半胱氨酸残基，通常具有偶数个以使因不配对半胱氨酸而产生的相互作用最小化。
可将所公开的重链和轻链可变区和CDR用于制备含有可与IL-23多肽特异性结合的抗原结合区的抗原结合蛋白。“抗原结合区”意指特异性结合特定抗原的蛋白质或蛋白质部分，例如含有与抗原相互作用并将其对靶标抗原的特异性和亲和力赋予所述抗原结合蛋白的氨基酸残基的区域。抗原结合区可包括一个或多个CDR，某些抗原结合区亦包括一个或多个“构架”区。例如，可将表3中所列的一个或多个CDR共价或非共价掺入分子(例如多肽)中以进行免疫粘附。免疫粘附可掺入CDR作为较大多肽链的部分，可让CDR与另一多肽链共价连接，或可非共价掺入CDR。CDR使得免疫粘附能够与目的特定抗原(例如IL-23多肽)特异性结合。
其它抗原结合蛋白包括基于本文所述的可变区和CDR的模拟物(例如“肽模拟物”或“模拟肽”)。这些类似物可为肽、非肽或肽及非肽区的组合。Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29；Veber和Freidinger, 1985, TINS 第392页；和Evans等，1987, J. Med. Chem. 30:1229。可将结构上与治疗有用的肽相似的肽模拟物用于产生相似的治疗或预防作用。通常借助计算机化分子建模来开发所述化合物。模拟肽通常为结构上与展示所期需生物活性(例如结合IL-23的能力)的抗原结合蛋白相似的蛋白质，但模拟肽具有一个或多个肽键接，所述肽键任选通过本领域熟知方法被选自例如以下的键置换：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。在某些实施方案中可利用用同一类型的D-氨基酸对共有序列的一个或多个氨基酸的系统取代(例如D-赖氨酸取代L-赖氨酸)，以产生更稳定的蛋白质。另外，可通过本领域已知方法产生包含共有序列或基本上同一的共有序列变异的受约束的肽(Rizo和Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387)，例如通过加入能够形成使肽环化的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基。
亦提供本文所述抗原结合蛋白的衍生物。衍生的抗原结合蛋白可包含赋予抗原结合蛋白或片段所期需特性(例如在特定用途中增加的半衰期)的任何分子或物质。衍生的抗原结合蛋白可包含例如可检测(或标记)部分(例如放射性分子、比色分子、抗原分子或酶分子、可检测珠粒(例如磁珠或电子致密(例如金)珠)或与另一分子(例如生物素或链霉亲和素)结合的分子)、治疗或诊断部分(例如放射性部分、细胞毒性部分或药学活性部分)或为特定用途(例如给予受试者，例如人受试者或其它体内或体外用途)增加抗原结合蛋白的合适性的分子。可用于衍生抗原结合蛋白的分子实例包括白蛋白(例如人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。可用本领域熟知技术来制备抗原结合蛋白的白蛋白连接的和PEG化的衍生物。在一个实施方案中，抗原结合蛋白与甲状腺素运载蛋白(TTR)或TTR变体缀合或以其它方式连接。可用例如选自以下的化学物质对TTR或TTR变体进行化学修饰：葡聚糖、聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇。
其它衍生物包括IL-23抗原结合蛋白与其它蛋白质或多肽的共价或聚集缀合物，其例如通过包含与IL-23抗原结合蛋白的N-末端或C-末端融合的异源多肽的重组融合蛋白的表达来实现。例如，缀合肽可为异源信号(或前导)多肽，例如酵母α-因子前导肽，或为例如表位标签等的肽。含有IL-23抗原结合蛋白的融合蛋白可包含被加入以促进纯化或鉴定IL-23抗原结合蛋白的肽(例如聚-His)。亦可让IL-23抗原结合蛋白与FLAG肽连接，FLAG肽阐述于：Hopp等，1988, Bio/Technology 6:1204；和美国专利号5,011,912。FLAG肽具高抗原性，提供被特异性单克隆抗体(mAb)可逆地结合的表位，这使得能够快速测定和容易地纯化表达的重组蛋白。可市购可用于制备其中FLAG肽与给定的多肽融合的融合蛋白的试剂(Sigma, St. Louis, MO)。
可采用含有一个或多个IL-23抗原结合蛋白的寡聚物作为IL-23拮抗剂。寡聚物可呈共价连接或非共价连接的二聚物、三聚物或更高的寡聚物的形式。预期使用包含两个或更多个IL-23抗原结合蛋白的寡聚物，一个实例为同型二聚体。其它寡聚物包括异型二聚体、同型三聚体、异型三聚体、同型四聚体、异型四聚体等。亦包括包含多个IL-23结合蛋白的寡聚物，所述多个IL-23结合蛋白经由与IL-23抗原结合蛋白融合的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接。所述肽可为肽接头(间隔基)，或具有促进寡聚化的性质的肽。合适的肽接头中有阐述于美国专利号4,751,180和4,935,233中的肽接头。亮氨酸拉链和源自抗体的某些多肽属于可促进与其连接的IL-23抗原结合蛋白的寡聚化的肽。适于产生可溶性寡聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的实例阐述于以下文献中：WIPO公开号WO 94/10308；Hoppe等，1994, FEBS Letters 344:191；和Fanslow等，1994, Semin. Immunol. 6:267-278。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达包含与亮氨酸拉链肽融合的IL-23抗原结合蛋白片段或衍生物的重组融合蛋白，自培养物上清液回收形成的可溶性寡聚IL-23抗原结合蛋白片段或衍生物。
所述寡聚物可包含两种到四种IL-23抗原结合蛋白。寡聚物的IL-23抗原结合蛋白部分可呈上述任何形式，例如变体或片段。优选寡聚物包含具有IL-23结合活性的IL-23抗原结合蛋白。可用源自免疫球蛋白的多肽制备寡聚物。例如在以下文献中阐述了包含某些与源自抗体的多肽的多个部分(包括Fc结构域)融合的异源多肽的融合蛋白的制备：Ashkenazi等，1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535；Byrn等，1990, Nature 344:677；和Hollenbaugh等，1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins (免疫球蛋白融合蛋白的构建)"，载于Current Protocols in Immunology, 增补本4, 第10.19.1-10.19.11页。
亦包括包含通过使IL-23抗原结合蛋白与抗体的Fc区融合产生的两个融合蛋白的二聚物。可如下制备二聚物：通过例如将编码融合蛋白的基因融合物插入到合适的表达载体，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合物，并允许表达的融合蛋白非常类似抗体分子地组装，由此在Fc部分之间形成链间二硫键，得到二聚物。所述Fc多肽包括源自抗体Fc区的多肽的天然形式和突变蛋白形式。亦包括含有促进二聚化的铰链区的所述多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(及由其形成的寡聚物)提供易于通过在蛋白A或蛋白G柱上的亲和色谱纯化的优点。阐述于WIPO公开号WO 93/10151和美国专利号5,426,048和5,262,522中的一种合适的Fc多肽，为自N-末端铰链区延伸到人IgG1抗体Fc区的天然C-末端的单链多肽。另一有用的Fc多肽为阐述于美国专利号5,457,035和Baum等，1994, EMBO J. 13:3992-4001中的Fc 突变蛋白。该突变蛋白的氨基酸序列等同于WIPO公开号WO 93/10151中呈提的天然Fc序列的氨基酸序列，但19位氨基酸从Leu变为Ala，20位氨基酸从Leu变为Glu，22位氨基酸从Gly变为Ala。突变蛋白表现出降低的Fc受体亲和力。
糖基化
抗原结合蛋白可具有不同于天然物种中发现的糖基化模式或自该糖基化模式改变的糖基化模式。如本领域所知，糖基化模式可视蛋白质序列(例如下述特定糖基化氨基酸残基存在与否)或其中产生所述蛋白质的宿主细胞或生物体二者而定。特定表达系统如下所述。
多肽糖基化通常为N联或O联的。N联是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基侧链连接。三-肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)，是碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中存在这些三-肽序列的任一种产生可能的糖基化位点。O联糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸连接，所述羟基氨基酸最常见为丝氨酸或苏氨酸，但亦可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列以使其含有一个或多个上述三-肽序列(用于N联糖基化位点)，来适宜地实现将糖基化位点加到抗原结合蛋白。亦可通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基加到起始序列或用该残基取代起始序列进行改变(用于O联糖基化位点)。为了简易的目的，可通过在DNA水平上的变化，尤其是通过在预选定碱基处使编码靶标多肽的DNA突变以使产生翻译成所期需氨基酸的密码子，来改变抗原结合蛋白氨基酸序列。
通过让糖苷与蛋白质化学偶联或酶促偶联是增加抗原结合蛋白上的碳水化合物部分数量的另一手段。这些方法有利，因为其不需要在具有用于N联和O联糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。视所使用的偶联方式而定，糖可连接至：(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离的羧基；(c)游离的巯基，例如半胱氨酸中的巯基；(d)游离的羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸中的羟基；(e)芳族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法阐述于PCT公开号WO 87/05330和Aplin和Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., 第259-306页中。
可在化学上或酶学上实现起始抗原结合蛋白上存在的碳水化合物部分的去除。化学去糖基化需要让蛋白质与化合物三氟甲磺酸或等同化合物接触。该处理导致裂解除了连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)外的大部分或所有糖，同时保留多肽的完整性。由Hakimuddin等，1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52和Edge等，1981, Anal. Biochem. 118:131阐述了化学去糖基化。可通过使用多种内切及外切糖苷酶来实现多肽上的碳水化合物部分的酶促裂解，如Thotakura等，1987, Meth. Enzymol. 138:350所述。可通过使用化合物衣霉素来防止在可能的糖基化位点的糖基化，如Duskin等，1982, J. Biol. Chem. 257:3105所述。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
因此，多个方面包括抗原结合蛋白的糖基化变体，其中与母体多肽的氨基酸序列相比，改变了糖基化位点的数目和/或类型。在某些实施方案中，抗原结合蛋白变体包含比母体多肽更多或更少数目的N联糖基化位点。消除或改变该序列的取代将防止加入在母体多肽中存在的N联碳水化合物链。例如，可通过缺失Asn或通过用不同的氨基酸取代Asn来减少糖基化。抗体通常在Fc区具有N联糖基化位点。
标记和效应基团
抗原结合蛋白可包含一个或多个标记。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测标记。一般而言，取决于其中它们被检测的测定，将标记分为多种种类：a)同位素标记，其可为放射性或重同位素；b)磁性标记(例如磁性颗粒)；c) 氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化的基团；和f)被第二报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔基臂与抗原结合蛋白偶联，以降低可能的位阻。用于标记蛋白质的各种方法为本领域所知。合适的标记基团实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基或被第二报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔基臂与抗原结合蛋白偶联，以降低可能的位阻。用于标记蛋白质的各种方法为本领域所知，如认为合适就可使用。
术语“效应基团”意指作为细胞毒性剂起作用的与抗原结合蛋白偶联的任何基团。合适的效应基团实例为放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。其它合适的基团包括毒素、治疗基团或化疗基团。合适基团的实例包括卡奇霉素、auristatins、格尔德霉素(geldanamycin)和美登素。在一些实施方案中，效应基团经由各种长度的间隔基臂与抗原结合蛋白偶联，以降低可能的位阻。
编码 IL-23 抗原结合蛋白的多核苷酸
亦提供编码本文所述抗原结合蛋白或其部分的多核苷酸，其包括：编码抗体的一条链或两条链或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的多核苷酸；编码重链可变区或仅CDR的多核苷酸；足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物以用于鉴别、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的多核苷酸；抑制多核苷酸表达的反义核酸；和前述多核苷酸的互补序列。多核苷酸可为任何长度。它们可为例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、85、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000或更多个核酸长(包括之间的所有值)，和/或可包含一个或多个另外的序列，例如调控序列和/或为较大多核苷酸例如载体的部分。多核苷酸可为单链或双链，可包含RNA和/或DNA核酸及其人工变体(例如肽核酸)。
可自用IL-23或其免疫原片段免疫的小鼠的B-细胞分离编码某些抗原结合蛋白或其部分(例如全长抗体、重链或轻链、可变结构域或CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3)的多核苷酸。可通过常规程序例如聚合酶链式反应(PCR)分离多核苷酸。噬菌体展示是已知技术的另一实例，由此可制备抗体衍生物和其它抗原结合蛋白。在已知方法中，在任何合适的重组表达系统中表达作为目的抗原结合蛋白组分的多肽，并让表达的多肽装配形成抗原结合蛋白分子。亦使用噬菌体展示经由链改组得到具有不同特性(即改变对与其结合的抗原的亲和力)的抗原结合蛋白，参见Marks等，1992, BioTechnology 10:779。
由于遗传密码的简并，亦通过除提供的多核苷酸序列之外的大量其它多核苷酸序列来编码本文描绘的每一种多肽序列。例如，可由多核苷酸序列 SEQ ID NO: 32、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59编码本文提供的重链可变结构域。可由多核苷酸序列 SEQ ID NO: 2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28编码轻链可变结构域。因此，本领域一般技术人员应了解，本申请提供充分的书面描述，并允许每一个简并核苷酸序列编码每一个抗原结合蛋白。
一方面进一步提供在特定杂交条件下与其它多核苷酸分子杂交的多核苷酸。本领域熟知用于杂交核酸的方法、影响杂交条件选择的基本参数和用于设计合适条件的指南。参见例如Sambrook、FRitsch和Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；和Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel等，编辑, John Wiley & Sons, Inc.。如本文所定义，中等严格的杂交条件使用：含有5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)的预洗涤溶液；约50%甲酰胺、6x SSC的杂交缓冲液；和55℃的杂交温度(或其它相似杂交溶液例如含有约50%甲酰胺的杂交溶液且42℃的杂交温度)；和在0.5x SSC、0.1% SDS中60℃的洗涤条件。严格杂交条件在6x SSC中于45℃杂交，接着在0.1x SSC、0.2% SDS中于68℃一次或多次洗涤。此外，本领域技术人员可操作杂交和/或洗涤条件以增加或降低杂交严格性，使得包含彼此至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%(包括之间的所有数值)同一性的核酸序列的多核苷酸，通常彼此保持杂交。
可通过突变将变化引入到多核苷酸中，藉此导致其编码的多肽(例如抗原结合蛋白或抗原结合蛋白衍生物)的氨基酸序列的变化。可用本领域已知的任何技术引入突变，例如位点定向诱变和随机诱变。可表达突变体多肽并针对所期需特性对其进行选择。可将突变引入到多核苷酸而不显著改变其编码的多肽的生物活性。例如，非必需氨基酸残基处的取代。或者，可将一个或多个突变引入多核苷酸，其选择性改变其编码的多肽的生物活性。例如，突变可定量或定性改变生物活性，例如增加、降低或消除活性和改变抗原结合蛋白的抗原特异性。
另一方面提供适于用作引物或杂交探针以检测核酸序列的多核苷酸。多核苷酸可仅包含编码全长多肽的核酸序列的一部分，例如，可用作探针或引物的片段或编码多肽的活性部分(例如IL-23结合部分)的片段。可将基于核酸序列的探针用于检测所述核酸或相似核酸，例如检测编码多肽的转录物。探针可包含标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。可将这类探针用于鉴别表达多肽的细胞。
表达抗原结合蛋白的方法
可通过多种常规技术中的任何一种来制备本文提供的抗原结合蛋白。例如，可通过重组表达系统用本领域已知的任何技术来产生IL-23抗原结合蛋白。参见例如Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet等(编辑) Plenum Press, New York (1980)；和Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow和Lane (编辑), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)。
本文亦提供呈包含如上所述的至少一种多核苷酸的质粒、表达载体、转录盒或表达盒形式的表达系统和构建体，以及包含所述表达系统或构建体的宿主细胞。本文所用“载体”意指适用于将蛋白质编码信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。载体实例包括但不限于质粒、病毒载体、非附加型哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。表达载体例如重组表达载体可用于转化宿主细胞，并含有(与宿主细胞一起)指导和/或控制一个或多个与其可操作地连接的异源编码区的表达的核酸序列。表达构建体可包括但不限于影响或控制转录、翻译和若存在内含子则影响与其可操作地连接的编码区的RNA剪接的序列。“可操作地连接”意指该术语所应用于的组分处于允许所述组分完成其固有功能的关系中。例如，安排在载体中与蛋白质编码序列“可操作地连接”的调控序列例如启动子，使得调控序列的正常活性导致蛋白质编码序列的转录，这导致重组表达所编码的蛋白质。
另一方面提供引入了表达载体例如重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞可为任何原核细胞(例如大肠杆菌(E. coli))或真核细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞(例如CHO细胞))。可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞。对于稳定转染哺乳动物细胞，已知视所用表达载体和转染技术而定，仅少部分细胞可将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴别和选择这些整合体，通常将编码选择标记(例如用于抵抗抗生素)的基因连同目的基因一起引入到宿主细胞中。优选选择标记包括赋予对药物的抗性的标记，所述药物为例如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。可通过药物选择(例如引入选择标记基因的细胞将存活而其余细胞死亡)等方法来鉴别用引入的多核苷酸稳定转染的细胞。
可在杂交瘤细胞系(例如特别是可在杂交瘤中表达抗体)或不同于杂交瘤的细胞系中表达抗原结合蛋白。可将编码抗原结合蛋白的表达构建体用于转化哺乳动物、昆虫或微生物宿主细胞。可用将多核苷酸引入到宿主细胞的任何已知方法实施转化，所述方法包括例如将多核苷酸包装入病毒或噬菌体，并通过本领域已知转染程序(如美国专利号4,399,216；4,912,040；4,740,461；4,959,455所举例的转染程序)用构建体转染宿主细胞，。所用的最佳转化程序应视被转化的宿主细胞类型而定。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞的方法在本领域众所周知，包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封到脂质体内、让核酸与带正电荷的脂质混合和将DNA直接显微注射到细胞核中。
重组表达构建体通常包含编码多肽的多核苷酸。所述多肽可包含以下中的一个或多个：一个或多个CDR，例如本文所提供的CDR；轻链可变区；重链可变区；轻链恒定区；重链恒定区(例如CH1、CH2和/或CH3)；和/或IL-23抗原结合蛋白的另一支架部分。用标准连接技术将这些核酸序列插入到合适的表达载体中。在一个实施方案中，将重链或轻链恒定区附加到本文提供的重链或轻链可变区的C-末端，并连接到表达载体中。通常选择在采用的特定宿主细胞中具有功能的载体(即载体与宿主细胞机构相容，允许基因扩增和/或表达可发生)。在一些实施方案中，使用以下载体，其采用用蛋白质报道分子例如二氢叶酸还原酶(参见例如美国专利号6,270,964)的蛋白质-片段互补测定。可例如自Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)或BD Biosciences (San Jose, CA)购买合适的表达载体。用于克隆并表达抗体及片段的其它有用载体包括阐述于Bianchi和McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44的载体。另外的合适的表达载体例如在Methods Enzymol., 第185卷 (D. V. Goeddel编辑), 1990, New York: Academic Press中论述。
通常任何宿主细胞中使用的表达载体含有用于维护质粒和用于克隆并表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施方案中，统称为“侧翼序列”的这类序列通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起始点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的多核苷酸的多接头区和选择标记元件。可自起始载体例如市购载体构建提供的表达载体。这类载体可含或不含所有所期需的侧翼序列。当本文所述的一个或多个侧翼序列并非已经存在于载体中时，其可单独获得，并被连接到载体中。用于获得每一侧翼序列的方法为本领域技术人员所熟知。
任选载体可含有编码“标签”的序列，即位于IL-23抗原结合蛋白编码序列的5’或3’端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码聚His (例如六聚His)或另一“标签”例如FLAG®、HA (血凝素流感病毒(hemaglutinin influenza virus))或myc，对于它们而言存在市售抗体。该标签通常在表达多肽时与多肽融合，可用作自宿主细胞亲和纯化或检测IL-23抗原结合蛋白的手段。可例如通过柱色谱用针对标签的抗体作为亲和基质来实施亲和纯化。任选可随后通过各种手段例如用某些肽酶裂解从纯化IL-23抗原结合蛋白除去标签。
侧翼序列可以是同源的(即来自与宿主细胞相同的物种和/或品系)、异源的(即来自非宿主细胞物种或品系的物种)、杂合的(即来自不止一种来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。因此，侧翼序列的来源可以是任何原核生物或真核生物、任何脊椎生物或无脊椎生物或任何植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机构中是有功能的，并可被宿主细胞机构激活。
可用于载体中的侧翼序列可通过本领域众所周知的若干方法的任一种获得。通常，先前已通过作图和/或通过限制性内切核酸酶消化来鉴定本文可用的侧翼序列，因此可使用合适的限制性内切核酸酶将其从合适的组织来源中分离出来。在一些情况下，侧翼序列的完全核苷酸序列可以是已知的。在此，侧翼序列可采用本文描述的用于核酸合成或克隆的方法来合成。
不论侧翼序列的全部是已知的还是仅一部分是已知的，都可使用聚合酶链式反应(PCR)和/或通过用合适的探针(例如来自相同物种或另一物种的寡核苷酸和/或侧翼序列片段)筛选基因组文库获得。如果侧翼序列是未知的，则可从可含有例如编码序列或甚至另一种或多种基因的较大片DNA中分离含有侧翼序列的DNA片段。可通过限制性内切核酸酶消化以产生合适的DNA片段，接着采用琼脂糖凝胶纯化、Qiagen®柱色谱法(Qiagen, Chatsworth, CA)或技术人员已知的其它方法进行分离，来实现分离。实现该目的的合适酶的选择对于本领域普通技术人员而言是很显而易见的。
复制起点通常是市面上购买的那些原核表达载体的一部分，该复制起点有助于载体在宿主细胞中扩增。如果选定的载体不含复制起点位点，则可根据已知序列以化学法合成一个，并与载体连接。例如，质粒pBR322 (New England Biolabs，Beverly，MA)的复制起点适于大多数革兰氏阴性菌，而各种病毒起点(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒例如HPV或BPV)可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。对于哺乳动物表达载体，一般不需要复制起点组分(例如常常使用SV40起点，仅因为它还含有病毒早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区的3’端，并用于终止转录。原核细胞中的转录终止序列通常是富含G-C的片段接着是聚T序列。虽然该序列易从文库克隆或甚至在市面上作为载体的部分购买，但是它还可容易采用核酸合成方法例如本文描述的核酸合成方法合成。
选择标记基因编码生长在选择性培养基中的宿主细胞存活和生长所必需的蛋白质。典型的选择标记基因编码以下蛋白质，其：(a)赋予原核宿主细胞对抗生素或其它毒素(例如氨苄西林、四环素或卡那霉素)的抗性；(b)补充细胞的营养缺陷；或(c)供给从复合培养基或确定成分培养基中不可得到的关键营养物。具体的选择标记为卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因和四环素抗性基因。有利的是，新霉素抗性基因也可用于在原核和真核宿主细胞两者中进行选择。
其它选择基因可用来扩增将要表达的基因。扩增是其中基因在重组细胞连续世代的染色体内前后重复的过程，所述基因是产生对生长或细胞存活至关重要的蛋白质所必需的。用于哺乳动物细胞的合适选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子的胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中仅转化体由于存在于载体中的选择基因而唯一适于存活。通过在培养基中选择剂的浓度逐步增加的条件下，培养转化细胞，来施加选择压力，从而导致选择基因和编码另一基因(例如与IL-23结合的抗原结合蛋白)的DNA两者扩增。结果，从扩增的DNA中合成增加量的多肽(例如抗原结合蛋白)。
核糖体结合位点通常是rnRNA翻译起始所必需的，且特征在于Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元件通常位于启动子的3’和待表达多肽的编码序列的5’。
在一些情况下，例如在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化时，可操作各种前序列(presequence)或序列原(prosequence)以改进糖基化或产量。例如，可以改变特定信号肽的肽酶切割位点，或加入还可影响糖基化的序列原。最终的蛋白质产物可在-1位置(相当于成熟蛋白质的第一氨基酸)上具有易发生表达的一个或多个额外氨基酸，其可不被完全除去。例如，最终的蛋白质产物可具有与氨基端连接的存在于肽酶切割位点上的一个或两个氨基酸残基。或者，如果酶在成熟多肽内切割这类区域，则一些酶切割位点的使用可产生所需多肽的稍微截短的形式。
表达和克隆通常可含有被宿主生物识别并与编码IL-23抗原结合蛋白的分子可操作地连接的启动子。启动子是非转录序列，位于结构基因的起始密码子的上游(即5’) (一般在约100-1000 bp的范围内)，其控制结构基因的转录。按惯例将启动子归类为两类中的一种：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子在响应培养条件的一些变化(例如存在或缺乏营养物或温度改变)时，启动在其控制下的自DNA的增加水平的转录。另一方面，组成型启动子一致转录与之可操作地连接的基因，也就是说，对基因表达几乎没有控制或没有控制。被各种潜在宿主细胞识别的很多启动子是众所周知的。通过用限制性内切酶消化移出来源DNA的启动子，并将所需启动子序列插入载体，使合适的启动子与编码IL-23抗原结合蛋白的重链可变区或轻链可变区的DNA可操作地连接。
与酵母宿主一起使用的合适启动子也是本领域众所周知的。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子是众所周知的，包括但不限于得自病毒基因组的启动子，所述病毒为例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和猿猴病毒40 (SV40)。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热激启动子和肌动蛋白启动子。
可感兴趣的其它启动子包括但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon, 1981, Nature 290:304-310)；CMV启动子(Thornsen等，1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663)；劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等，1980, Cell 22:787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445)；来自金属硫蛋白(metallothionine)基因的启动子和调控序列(Prinster等，1982, Nature 296:39-42)；和原核启动子，例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等，1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)。亦感兴趣的是具有组织特异性并已用于转基因动物的下列动物转录调控区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因调控区(Swift等，1984, Cell 38:639-646；Ornitz等，1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409；MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)；在胰β细胞中有活性的胰岛素基因调控区(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因调控区(Grosschedl等，1984, Cell 38:647-658；Adames等，1985, Nature 318:533-538；Alexander等，1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444)；在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒调控区(Leder等，1986, Cell 45:485-495)；在肝中有活性的白蛋白基因调控区(Pinkert等，1987, Genes and Devel. 1 :268-276)；在肝中有活性的甲胎蛋白基因调控区(Krumlauf等，1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648；Hammer等，1987, Science 253:53-58)；在肝中有活性的α 1-抗胰蛋白酶基因调控区(Kelsey等，1987, Genes and Devel. 1:161-171)；在髓样细胞中有活性的β-珠蛋白基因调控区(Mogram等，1985, Nature 315:338-340；Kollias等，1986, Cell 46:89-94)；在脑少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白质基因调控区(Readhead等，1987, Cell 48:703-712)；在骨髓肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因调控区(Sani, 1985, Nature 314:283-286)；以及在丘脑下部有活性的促性腺素释放素基因调控区(Mason等，1986, Science 234:1372-1378)。
可将增强子序列插入载体中以增加经由高等真核生物的转录。增强子是作用于启动子以增加转录的DNA的顺式作用元件，长度通常约为10-300 bp。增强子是相对的方向和位置独立性的，已在转录单元的5’和3’位置二者发现增强子。已知可获自哺乳动物基因的若干增强子序列(例如珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。本领域已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是活化真核启动子的示例性增强元件。虽然增强子在载体中可定位于编码序列的5’或3’，但通常位于启动子的位点5’上。可将编码合适的天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列掺入到表达载体中，以促进抗体的胞外分泌。信号肽或前导序列的选择视其中待产生抗体的宿主细胞类型而定，异源信号序列可取代天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中有功能的信号肽实例包括以下：阐述于美国专利号4,965,195的白介素-7的信号序列；阐述于Cosman等，1984, Nature 312:768的白介素-2受体信号序列；阐述于欧洲专利号0367 566的白介素-4受体信号肽；阐述于美国专利号4,968,607的I型白介素-1受体信号肽；阐述于欧洲专利号0 460 846的II型白介素-1受体信号肽。
在构建载体后，可将完成的载体插入到合适的宿主细胞用于扩增和/或多肽表达。可通过众所周知的方法将抗原结合蛋白的表达载体转化到选择的宿主细胞中，所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知技术。所选择的方法可随待使用的宿主细胞的类型而变化。这些方法和其它合适的方法为技术人员所熟知，并例如在以下文献中提出：Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)。
当在合适条件下培养时，宿主细胞合成蛋白质，其可随后自培养基(若宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接自产生其的宿主细胞(如果不分泌)收集。合适的宿主细胞的选择将视多种因素而定，所述因素为例如所需表达水平、活性所需要或必需的多肽修饰(例如糖基化或磷酸化)和折叠为生物学活性分子的容易程度。
可作为表达宿主获得的哺乳动物细胞系为本领域熟知，包括但不限于可自美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和多种其它细胞系。在某些实施方案中，可通过测定哪些细胞系具有高表达水平并组成型产生具IL-23结合特性的抗原结合蛋白来选择细胞系。在另一实施方案中，亦可选择来自不产生其自身抗体但却具有产生和分泌异源抗体的能力的B细胞谱系的细胞系。
人 IL-23 抗原结合蛋白用于诊断和治疗目的的用途
抗原结合蛋白可用于检测生物样品中的IL-23，并用于鉴别产生IL-23的细胞或组织。可将与IL-23特异性结合的抗原结合蛋白用于在有需要的患者中诊断和/或治疗与IL-23相关的疾病。举例来说，IL-23抗原结合蛋白可用于诊断测定例如结合测定，以检测和/或定量血液、血清、细胞或组织中表达的IL-23。另外，可将IL-23抗原结合蛋白用于降低、抑制、干扰或调节细胞或组织中的IL-23的一种或多种生物活性。因此，与IL-23结合的抗原结合蛋白可具有减轻与IL-23相关疾病的治疗用途。
适应症
本发明亦涉及IL-23抗原结合蛋白用于预防性或治疗性治疗医学病症的用途，所述医学病症为例如本文所公开的医学病症。IL-23抗原结合蛋白可用于治疗多种病况，其中IL-23与潜在疾病或病症有关或起促进潜在疾病或病症的作用或以其它方式促进消极症状。
被IL-23抗原结合蛋白有效治疗的病况在炎性反应中起作用。这类炎性病症包括：牙周病；肺病症，例如哮喘；皮肤病症，例如银屑病、特应性皮炎、接触性皮炎；风湿病，例如类风湿性关节炎、进行性系统性硬化病(硬皮病)；系统性红斑狼疮；脊椎关节炎，包括强直性脊柱炎、银屑病关节炎、肠病性关节炎和反应性关节炎。亦预期葡萄膜炎，包括Vogt-Koyanagi-Harada病、特发性前葡萄膜炎和后葡萄膜炎和与脊椎关节炎有关的葡萄膜炎。亦预期IL-23抗原结合蛋白用于治疗自身免疫性疾病的用途，所述自身免疫性疾病包括多发性硬化症；自身免疫性心肌炎；1型糖尿病和自身免疫性甲状腺炎。
可用IL-23抗原结合蛋白治疗或预防胃肠系统的变性病况。所述胃肠道病症包括炎性肠病：克罗恩病、溃疡性结肠炎和乳糜泻。
亦包括IL-23抗原结合蛋白在治疗移植物抗宿主病及并发症(例如因实体器官移植(例如心脏、肝脏、皮肤、肾脏、肺或其它移植，包括骨髓移植)而产生的移植排斥)中的用途。
本文亦提供将IL-23抗原结合蛋白用于治疗各种肿瘤病症的方法，所述肿瘤病症包括各种形式的癌症，包括结肠癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、子宫颈癌和卵巢癌和肺癌(SCLC和NSCLC)。亦包括实体瘤包括肉瘤、骨肉瘤，和癌，例如腺癌和鳞状细胞癌、食道癌、胃癌、胆囊癌，白血病包括急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、髓细胞性白血病、慢性或急性成淋巴细胞性白血病和毛细胞性白血病和多发性骨髓瘤。
诊断方法
所述抗原结合蛋白可用于诊断目的以检测、诊断或监测与IL-23有关的疾病和/或病况。可用于检测IL-23的存在情况的方法实例包括免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。
对于诊断应用，通常用可检测标记基团标记抗原结合蛋白。合适的标记基团包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基或被第二报道分子识别的预定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记基团经由各种长度的间隔基臂与抗原结合蛋白偶联，以降低可能的位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知并可使用。
提供用于鉴别表达IL-23的一种细胞或多种细胞的其它诊断方法。在特定实施方案中，用标记基团标记抗原结合蛋白，并检测所标记的抗原结合蛋白与IL-23的结合。在另一特定实施方案中，体内检测抗原结合蛋白与IL-23的结合。在另一特定实施方案中，用本领域已知技术分离并测量IL-23抗原结合蛋白。参见例如Harlow 和 Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (编于1991年和周期性增补本)；John E. Coligan 编辑, 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons。
提供用于检测与提供的抗原结合蛋白竞争结合IL-23的测试分子的存在情况的其它方法。一种所述测定的实例将涉及检测在存在或缺乏测试分子时含有一定量的IL-23的溶液中游离抗原结合蛋白的量。游离的抗原结合蛋白(即不与IL-23结合的抗原结合蛋白)的量增加，将表明测试分子能够与抗原结合蛋白竞争结合IL-23。在一个实施方案中，用标记基团标记抗原结合蛋白。或者，标记测试分子并在存在和缺乏抗原结合蛋白时监测游离的测试分子的量。
治疗方法：药物制剂、给药途径
提供包含治疗有效量的一种或多种抗原结合蛋白和药学上可接受的赋形剂、稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂的药物组合物。另外，包括通过给予所述药物组合物来治疗患者的方法。术语“患者”包括人患者。术语“治疗”包括缓解或预防至少一种症状或病症的其它方面或减轻疾病严重程度等等。术语“治疗有效量”或“有效量”是指所确定的在哺乳动物中产生任何治疗反应的IL-23抗原结合蛋白的量。所述治疗有效量易于由本领域一般技术人员确定。
对于构成可行的治疗剂，抗原结合蛋白不必起完全治愈作用或根除疾病的每一种症状或表现。如有关领域所公认，用作治疗剂的药物可降低给定疾病状态的严重程度，但不必根除疾病的每一种表现，就被视为有用的治疗剂。同样，为于构成可行的预防剂，预防性给予的治疗不必完全有效防止病况的发作。仅降低疾病的影响(例如通过降低其症状的数量或严重程度或通过增加另一治疗的有效性或通过产生另一有益作用)或降低疾病在受试者中将发生或恶化的可能性就足够了。本文提供的某些方法包括以足以诱导相对于反映特定病症严重程度的指标的基线持续改进的量及时间给予患者IL-23拮抗剂(例如本文所公开的抗原结合蛋白)。
如有关领域所理解，以适合适应症的方式将包含本发明分子的药物组合物给予患者。可通过任何合适的技术给予药物组合物，所述技术包括但不限于胃肠外、局部或通过吸入。若注射，可例如经由关节内、静脉内、肌内、损害内、腹膜内或皮下途径通过推注或连续输注来给予药物组合物。预期局部给予，例如在疾病或损伤位点，同样预期透皮递送和自植入物持续释放。通过吸入的递送包括例如鼻吸入或口腔吸入、利用喷雾器、以气雾剂形式吸入拮抗剂等等。其它备选包括滴眼剂；口腔制剂，包括丸剂、糖浆剂、锭剂或口香糖；和局部制剂，例如洗剂、凝胶剂、喷雾剂和软膏剂。
亦预期在离体程序中使用抗原结合蛋白。例如，可让患者血液或其它体液离体与结合IL-23的抗原结合蛋白接触。抗原结合蛋白可与合适的不溶性基质或固相支持体材料结合。
有利的是，以包含一种或多种另外组分例如生理上可接受载体、赋形剂或稀释剂的组合物形式给予抗原结合蛋白。任选组合物另外包含一种或多种生理活性剂用于联合疗法。药物组合物可包含IL-23抗原结合蛋白连同一种或多种选自以下的物质：缓冲剂；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量多肽(例如具有少于10个氨基酸的肽)、蛋白质、氨基酸；碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖或糊精；螯合剂例如EDTA；谷胱甘肽、稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或与同种血清白蛋白混合的盐水为合适的稀释剂的实例。依照合适的工业标准，亦可加入防腐剂例如苄醇。可用合适的赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂将组合物调配为冻干产物。合适的组分为在所用的剂量及浓度下对受者无毒。可用于药物制剂的组分的另外实例呈提于包括第21版(2005)在内的任何版本的Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA中。
用于被医学从业人员使用的试剂盒包括IL-23抗原结合蛋白和关于用于治疗本文论述的任何病况的标签或其它说明书。在一个实施方案中，试剂盒包括一种或多种IL-23结合抗原结合蛋白的无菌制剂，其可呈如上所公开的组合物形式，并可在一个或多个小瓶中。
给药剂量和给药频率可视例如以下因素而变化：给药途径、所用的特定抗原结合蛋白、待治疗的疾病的特性及严重程度、病况是急性还是慢性和受试者的大小及一般情况。可例如在可涉及剂量递增研究的临床试验中通过相关领域已知程序测定合适的剂量。
典型剂量可介于约0.1 μg/kg到多达约30 mg/kg或更多，这视上述因素而定。在特定实施方案中，剂量可介于0.1 μg/kg到多达约30 mg/kg，任选1 μg/kg到多达约30 mg/kg，任选10 μg/kg到多达约10 mg/kg，任选约0.1 mg/kg 到5 mg/kg，或任选约0.3 mg/kg到3 mg/kg。
给药频率视所用制剂中特定人IL-23抗原结合蛋白的药代动力学参数而定。临床医生给予组合物直到达到获得所需效果的剂量。因此，可按单剂量、或者随时间按两剂或更多剂(其可含或不含相同量的所需分子)、或者按通过植入装置或导管连续输注，来给予组合物。可通过利用合适剂量反应数据来确定合适的剂量。可例如一次或不止一次例如以在一定时期内的定期间隔给予本发明IL-23抗原结合蛋白。在特定实施方案中，经至少1个月或更久例如1、2或3个月或甚至无限期的时间给予IL-23抗原结合蛋白。为了治疗慢性病况，通常长期治疗最有效。然而，为了治疗急性病况，较短时期例如1到6周的给予可能足够。一般而言，给予抗原结合蛋白直到患者相对于所选择的一种或多种指标的基线表现出医学上相应程度的改善。
预期以足以诱导在反映待治疗的病症的严重程度的至少一个指标方面的改进(优选持续改进)的量和时间给予患者IL-23抗原结合蛋白。可评估反映患者疾病、病症或病况程度的不同指标，用于确定治疗的量及时间是否足够。所述指标包括例如临床上公认的讨论中病症的疾病严重程度、症状或表现的指标。在一个实施方案中，如果受试者在由2-4周分开的至少两个时期表现出改善，则认为改善是持续的。改善程度通常由医生来确定，医生可基于征象、症状、活组织检查或其它测试结果来作出该决定，医生亦可采用给予受试者的问卷，例如针对给定疾病开发的生活质量问卷。
本发明方法和组合物的特定实施方案涉及利用IL-23抗原结合蛋白和一种或多种另外的IL-23拮抗剂，例如两种或更多种本发明抗原结合蛋白，或一种本发明抗原结合蛋白和一种或多种其它IL-23拮抗剂。亦提供单独给予或与可用于治疗患者遭受的病况的其它作用剂联合给予的IL-23抗原结合蛋白。所述作用剂实例包括蛋白质药物和非蛋白质药物两种。所述作用剂包括具有抗炎特性的治疗部分(例如非甾体抗炎剂、类固醇、免疫调节剂和/或其它细胞因子抑制剂，例如拮抗例如IFN-γ、GM-CSF、IL-6、IL-8、IL-17、IL-22和TNF的抑制剂)或IL-23抗原结合蛋白和一种或多种其它治疗(例如手术、超声或有效降低炎症的治疗)的治疗部分。当多种治疗共同给予时，可按照相关领域公认或已知的方法相应地调整剂量。可与IL-23抗原结合蛋白组合的有用作用剂包括：用于治疗例如克罗恩病或溃疡性结肠炎的作用剂，例如氨基水杨酸盐(例如美沙拉嗪)、皮质类固醇(包括泼尼松(predisone))、抗生素例如甲硝唑或环丙沙星(或可用于治疗例如罹患瘘管的患者的其它抗生素)和免疫抑制剂例如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、他克莫司和环孢霉素。可经口或通过另一途径例如经由栓剂或灌肠剂给予所述作用剂。可与IL-23结合蛋白联合用于治疗银屑病的作用剂包括皮质类固醇、卡泊三烯和其它维生素D衍生物、异维A酸(acetretin)和其它视黄酸衍生物、甲氨蝶呤、他克莫司和环孢霉素，其局部或全身使用。可同时、连续、交替或按照使总疗程有效的任何其它方案给予所述作用剂。
除人患者以外，IL-23抗原结合蛋白还可用于治疗非人动物，例如家养宠物(狗、猫、鸟、灵长类等)、家养农场动物(马、牛、绵羊、猪、鸟等)。在所述情况下，可按照动物体重确定合适的剂量。例如，可使用0.2-1 mg/kg的剂量。或者，按照动物表面积确定剂量，例示性剂量介于0.1-20 mg/m2，或更优选5-12 mg/m2。对于小动物，例如狗或猫，合适的剂量为0.4 mg/kg。每周一次或多次通过注射或其它合适的途径给予IL-23抗原结合蛋白(优选从源自受体物种的基因构建)，直至动物病况得到改进，或其可无限期给予。
仅为了阐明目的提供包括所进行的实验和所获得的结果在内的以下实施例，其不应理解为限制随附权利要求的范围。
实施例
实施例 1
人 IL-23 抗体的产生
用XenoMouseTM技术(Amgen, Thousand Oaks, CA)来开发识别和抑制天然人IL-23活性同时宽免人IL-12的人单克隆抗体。所述抗体亦识别和抑制重组猕猴(cynomologous) IL-23，但不识别鼠或大鼠 IL-23。
用下述STAT-萤光素酶报道分子测定来选择识别和完全抑制自源自人单核细胞的树突细胞(MoDC)获得的天然人IL-23的抗体。用阴性选择(单核细胞分离试剂盒II, Miltenyi Biotec, Auburn, CA)自健康供体的外周血单核细胞分离人单核细胞。通过让单核细胞与人GM-CSF (50 ng/ml)和人IL-4 (100 ng/ml)在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中培养7天产生MoDC。然后用PBS洗涤MoDC两次，接着用人CD40L (1μg/ml)再刺激48小时。CD40L-刺激的MoDC上清液含有IL-23、IL-12和IL-12/23p40。用ELISA来测定IL-12p70 (R&D SYSTEM, Minneapolis, MN), IL-23 (eBiosciences, San Diego, CA)和IL-12/23p40 (R&D SYSTEMs)的量。STAT-萤光素酶测定对IL-23有响应，对IL-12或游离的IL-12/23p40无响应，因此，可将该测定用于粗上清液来评估IL-23活性。为了在下述NK细胞测定中使用，用IL-23亲和柱接着是大小排阻色谱纯化天然人IL-23的粗上清液。用IL-23特异性ELISA (eBiosciences)测定浓度。
亦在STAT-萤光素酶测定中针对重组人(rhu) IL-23和重组猕猴(cyno) IL-23测试纯化的抗体上清液。在完全抑制重组人IL-23的所测抗体中，只有一半抗体识别并完全抑制天然人IL-23。识别和完全抑制重组人IL-23不能预测识别和完全抑制天然人IL-23，也与其不相关。如图1A和1B所示，完全抑制重组人IL-23的抗体的上清液中，仅一半抗体完全抑制天然人IL-23。选择识别并完全抑制天然人IL-23的抗体用于进一步表征。
实施例 2
功能测定
a) STAT- 萤光素酶测定
已知IL-23结合其异二聚体受体并通过JAK2和Tyk2传导信号，以激活STAT 1、3、4和5。在该测定中，使用用STAT/萤光素酶报道基因转染的细胞来评估IL-23抗体抑制IL-23诱导的生物活性的能力。
用STAT-萤光素酶报道分子过夜瞬时转染表达人IL-23受体的中国仓鼠卵巢细胞。将IL-23抗体系列稀释(自37.5 μg/ml开始1:4系列稀释的12个点)到96孔板中。以2 ng/ml浓度将天然人IL-23 (制备方法在实施例1描述)加入到各孔中，并在室温孵育15-20分钟。将瞬时转染的细胞加入(8 × 103细胞)到最终100 μl/孔的体积中，并在37℃、10% CO2孵育5小时。孵育后用100 μL/孔Glo裂解缓冲剂(1x) (Promega, Madison, Wisconsin)在室温裂解细胞5分钟。将50微升细胞裂解液连同50 μL Bright-Glo萤光素酶底物(Promega)加到96孔板，并在光度计上读数。
可用GraphPad PRISM软件(GraphPad Software, La Jolla, CA)进行统计学分析。结果可以以平均值±标准偏差(SD)来表示。
如表5中所看到的，所有IL-23抗体以剂量依赖方式有效并完全抑制天然人IL-23诱导的STAT/萤光素酶报道分子。所述抗体亦有效并完全抑制重组人(rhu) IL-23和重组猕猴(cyno) IL-23。所述抗体全部具有皮摩尔范围内的IC50值。
表 5.在STAT-萤光素酶测定中IL-23抗体的平均IC50 (pM)值的表格
b) NK 细胞测定
已知IL-23 对自然杀伤细胞起作用以诱导促炎细胞因子例如干扰素γ (IFNγ)的表达。在本测定中，使用人初级天然杀伤(NK)细胞来评估IL-23抗体在表达人IL-23天然受体的细胞中抑制IL-23诱导的IFNγ活性的能力。
经由阴性选择(NK细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec, Auburn, CA)自多种人供体分离NK细胞。将纯化的NK细胞(1 × 106个细胞/ml)加入到6孔板的RPMI 1640加10%胎牛血清的完全培养基中至最终体积为10ml/孔，所述培养基补充有重组人IL-2 (10ng/ml, R&D SYSTEMs,Minneapolis, MN)。让细胞在37℃、5% CO2中培养7天。然后用rhuIL-23或cyno IL-23 (10 ng/ml)和重组人IL-18 (20ng/ml, R&D SYSTEMs, Minneapolis, MN)在IL-23抗体的系列稀释物(从3μg/ml开始以1:3系列稀释的11个点)存在下刺激IL-2活化的NK细胞达24小时。通过IFNγ ELISA (R&D Sysetms,Minneapolis, MN)按照厂商说明书测量上清液中的IFNγ水平。
可用GraphPad PRISM软件进行统计学分析。结果可以平均值±标准偏差(SD)表示。
如表6中所看到的，所有抗体在NK细胞中以剂量依赖方式有效抑制rhuIL-23和cyno IL-23诱导的IFNγ 表达。所有抗体都具有皮摩尔范围内的IC50值。用天然人IL-23 (30μg/ml，制备方法在实施例1中描述)和rhuIL-18 (40 ng/ml, R&D Systems)对抗体亚群实施测定，得到表6所示的结果。与对IL-23特异性抗体的选择一致，使用上述测定，这些抗IL-23抗体在NK细胞中对IL-12刺激的IFNγ产生没有作用，而IL-12p35特异性中和抗体mAb219 (R&D Systems,Minneapolis, MN)则有效抑制重组人IL-12。
表 6. NK细胞测定中IL-23抗体的平均IC50 (pM)值的表格
c) 人全血测定
用Refludan® (Bayer Pittsburgh, PA)作为抗凝剂自多个健康供体采集人全血。全血中Refludan®的最终浓度为10 μg/ml。将RPMI 1640 + 10% FBS中的rhuIL-23或cyno IL-23 (最终浓度1 ng/ml) + rhuIL-18 (最终浓度20 ng/ml) + rhuIL-2 (最终浓度5 ng/ml)的刺激混合物加入到96孔板中，最终体积为20 μl/孔。以20μl/孔加入系列稀释的IL-23抗体(自3μg/ml开始以1:3系列稀释的11个点)，将其在室温与刺激混合物孵育30分钟。然后加入(120 μl/孔)全血，用RPMI 1640 + 10% FBS将最终体积调整为200 μl/孔。全血的最终浓度为60%。让板在37℃、5% CO2下孵育24小时。收获无细胞的上清液，通过IFNγ ELISA (R&D Systems)按照厂商说明书自上清液测量IFNγ水平。
可用GraphPad PRISM软件进行统计学分析。结果可以平均值±标准偏差(SD)表示。
如表7中所看到的，所有抗体在全血细胞中以剂量依赖方式有效抑制rhuIL-23-诱导的和cyno-IL-23-诱导的IFNγ表达。抗体全部具有皮摩尔范围内的IC50值。
表 7.在IFNγ人全血测定中的IL-23抗体的平均IC50 (pM)值的表格
d) IL-22 测定
已知IL-23为促炎细胞因子的有效诱导物。IL-23对活化的T细胞和记忆T细胞起作用，并促进产生包括IL-22在内的促炎细胞因子的Th17细胞的存活及扩增。在本测定中，使用人全血来评估IL-23抗体抑制IL-23诱导的IL-22产生的能力。
用与上述相同的方法实施全血测定，其中的改良为用1ng/ml的rhuIL-23或cynoIL-23和10ng/ml的rhuIL-18来诱导IL-22产生。通过IL-22 ELISA (R&D Systems,Minneapolis, MN)来测定IL-22浓度。
如表8中所看到的，抗体在全血细胞中以剂量依赖方式有效抑制rhuIL-23诱导的和cyno IL-23诱导的IL-22产生。抗体全部具有皮摩尔范围内的IC50值。
表 8.在IL-22人全血测定中IL-23抗体的平均IC50 (pM)值的表格
实施例 3
用 KinExA 技术测定抗 IL-23 抗体的平衡解离常数 (KD)
用动态排除测定法(kinetic exclusion assay，KinExA测定, Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID)评估rhuIL-23与IL-23抗体的结合亲和力。用rhuIL-23预包被正常人血清(NHS)活化的琼脂糖4快速珠粒(Amersham Biosciences, GE Healthcare的一部分, Uppsala, Sweden)，用含10mg/mL BSA的1m Tris 缓冲液封闭。让50pM的IL-23抗体与rhuIL-23 (从800 pM开始1:2稀释的12个点)在室温孵育72小时，然后让其通过rhuIL-23包被的琼脂糖珠粒。通过荧光(Cy5)标记的山羊抗人-Fc抗体(Jackson Immuno Research, West Grove, Pa.)定量结合珠粒的抗体的量。结合信号与平衡时的游离抗体的量成比例。
用KinExA Pro软件自曲线拟合获得解离平衡常数(KD)和结合速率(Kon)。解离速率(Koff)源自：KD=Koff/Kon
如表9所看到的，抗体具有与人IL-23结合的高亲和力。所有的KD值在低pM至亚pM范围中。
表 9 KD (pM)、Kon (1/MS)和Koff (1/s)速率
抗体 KD (pM) Kon (1/MS) Koff (1/s)
E 0.131 9.12E+05 1.4E-07
D 0.126 1.72E+06 2.2E-07
B 3.99 1.17E+06 4.7E-06
C 2.56 1.36E+06 4.1E-06
F 2.62 5.69E+05 1.5E-06
L 1.08 3.34E+06 3.7E-06
G 2.00 4.00E+05 8.1E-07
实施例 4
用 X 射线晶体学测定结构
测定抗体-抗原复合物结构的一种方法是用X射线晶体学，参见例如Harlow和Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), 第23页。业已确定IL-23的晶体结构(参见Lupardus和Garcia, J Mol Biol, 2008、382: 931-941)，业已揭示IL-23/Fab复合物的晶体结构(参见Beyer等， J Mol Biol, 2008. 382(4): 942-55)。用X射线晶体学获得含本文要求保护的抗体的Fab片段的IL-23的结构测定。
用于结晶的蛋白质
将重组来源的人IL-23异二聚体用于结晶研究(参见Beyer等，同上)。人p19亚基序列由SEQ ID NO: 145的20-189位残基、SEQ ID NO: 154信号序列和C-末端6-His标签SEQ ID NO: 155组成。让人p40亚基序列自SEQ ID NO: 147的222位天冬酰胺突变为谷氨酰胺，以防止该位点的糖基化(Beyer等，见上)。
在掺入胱天蛋白酶裂解位点的IgG1支架上表达源自抗体B和抗体E的Fab。借助蛋白酶裂解来处理Fab。
复合物形成和结晶
通过让2X摩尔过量的抗体B Fab与上述人异二聚体IL-23混合来制备IL-23-抗体B Fab复合物。通过大小排阻色谱纯化该复合物以除去过量的抗体B Fab，并浓缩到约12 mg/ml用于结晶。在0.1 M Hepes pH 7、8% PEG 8000中让IL-23-抗体B Fab复合物结晶。
通过让2X摩尔过量的抗体E Fab与上述人异二聚体IL-23混合来制备IL-23-抗体E Fab复合物。用JBS甲基化试剂盒按照厂商说明书(Jena Bioscience, Jena, Germany)让该复合物甲基化。然后用PNG酶处理复合物以使蛋白质去糖基化。在这些处理后，通过大小排阻色谱纯化复合物以除掉过量的抗体E Fab，并浓缩到13.5 mg/ml用于结晶。在0.1 M Tris pH 8.5、0.2 M氯化镁、15% PEG 4000中让IL-23-抗体E Fab复合物结晶。
数据采集和结构测定
在具a=70.93、b=71.27、c=107.37 Å、β=104.98°的晶胞大小的P21空间群中让IL-23-抗体B Fab晶体生长，并以2.0 Å分辨率衍射。通过用程序MOLREP (CCP4, The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1994. 50(Pt 5):第760-3页)实施的分子置换来解析IL-23-抗体B Fab结构，该程序用IL-23结构(Beyer等，同上)作为起始搜索模型。让IL-23溶液保持固定，用抗体可变结构域作为搜索模型。保持IL-23-抗体可变结构域溶液固定，用抗体恒定结构域作为搜索模型。用多轮利用Quanta进行的模型构建和用cnx进行的细化来改进完全结构(Brunger,等，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1998, 54(Pt 5): 第905-21页)。
用程序 PyMOL (DeLano, W.L. The PyMOL Graphics System. Palo Alto, 2002) (Schrodinger, LLC；New York, NY))计算蛋白质原子之间的距离。如果至少一个原子位于伙伴蛋白质的所需距离阀值之内，则选择该氨基酸。
当与抗体B Fab结合时，IL-23的p19亚基的A、B、C和D螺旋边界包括SEQ ID NO: 145的A螺旋的 28-47位残基、B 螺旋的86-105位残基、C螺旋的119-134位残基和D螺旋的154-187位残基。
当与抗体B Fab结合时IL-23p19亚基上的相互作用区域包括SEQ ID NO: 145的Ser46-Glu58、Glu112-Glu123和Pro155-Phe163内的残基。
含距离抗体B Fab为4 Å或更近的原子的IL-23p19亚基氨基酸残基包括SEQ ID NO :145的Ser46、Ala47、His48、Pro49、Leu50、His53、Met54、Asp55、Glu58、Pro113、Ser114、Leu115、Leu116、Pro120、Val121、Trp156、Leu159、Leu160、Arg162和Phe163。含离抗体B Fab在4 Å和5 Å之间的原子的IL-23p19亚基氨基酸残基包括SEQ ID NO :145的Val51、Arg57、Glu112、Asp118、Ser119、Gln123、Pro155。
含距离抗体B Fab为4Å或更近的原子的IL-23p40亚基氨基酸残基包括SEQ ID NO: 147的Glu 122和Lys 124。
含距离IL-23异二聚体为4 Å或更近的原子的抗体B Fab重链氨基酸残基包括SEQ ID NO: 46的Gly32、Gly33、Tyr34、Tyr35、His54、Asn58、Thr59、Tyr60、Lys66、Arg101、Gly102、Phe103、Tyr104和Tyr105。含距离IL-23异二聚体≤ 5 Å的原子的抗体B Fab重链氨基酸残基包括SEQ ID NO: 46的Ser31、Gly32、Gly33、Tyr34、Tyr35、His54、Ser56、Asn58、Thr59、Tyr60、Lys66、Arg101、Gly102、Phe103、Tyr104和Tyr105。
含距离IL-23异二聚体为4 Å或更近的原子的抗体B Fab轻链氨基酸残基包括SEQ ID NO: 15的Ser30、Ser31、Trp32、Tyr49、Ser52、Ser53、Ala91、Asn92、Ser93、Phe94和Phe96。含距离IL-23异二聚体≤ 5 Å的原子的抗体B Fab轻链氨基酸残基包括SEQ ID NO: 15的Ser30、Ser31、Trp32、Tyr49、Ala50、Ser52、Ser53、Ser56、Ala91、Asn92、Ser93、Phe94和Phe96。
在具a=61.60、b=97.59、c=223.95 Å的晶胞大小的P2221空间群中让IL-23-抗体E Fab复合物晶体生长，并以3.5 Å分辨率衍射。通过用程序Phaser (CCP4, 见上)实施的分子置换来解析IL-23-抗体E Fab复合物结构，该程序如上所述用IL-23结构、抗体可变结构域和抗体恒定结构域作为三个起始搜索模型。用多轮利用Quanta进行的模型构建和用cnx进行的细化来改进完全结构(Brunger等，见上)。由于该部分蛋白质极贫乏的电子密度，忽略抗体E Fab恒定结构域的最后细化结构。
当与抗体E Fab结合时鉴定的IL-23p19亚基上的相互作用区域包括SEQ ID NO: 145的Ser46-His53、Glu112-Val120和Trp156-Phe163内的残基。
含距离抗体E Fab为4Å或更近的原子的IL-23p19氨基酸残基包括SEQ ID NO: 145的Ser46、Ala47、His48、Pro49、Leu50、Glu112、Pro113、Ser114、Leu115、Leu116、Pro117、Asp118、Ser119、Pro120、Trp156、Leu159、Leu160和Phe163。含距离抗体E Fab在4 Å和5 Å之间的原子的IL-23p19氨基酸残基包括SEQ ID NO: 145的His53。
含距离抗体E Fab为4Å或更近的原子的IL-23p40氨基酸残基包括SEQ ID NO: 147的Lys121、Glu 122、Pro123和Asn 125。
含距离IL-23异二聚体为4Å或更近的原子的抗体E Fab重链氨基酸残基包括SEQ ID NO: 31的Gly26、Phe27、Thr28、Ser31、Tyr53、Tyr59、Tyr102、Ser104、Ser105、Trp106、Tyr107和Pro108。含距离IL-23异二聚体为5 Å的原子的抗体E Fab重链氨基酸残基包括SEQ ID NO: 31的Gln1、Gly26、Phe27、Thr28、Ser30、Ser31、Tyr32、Trp52、Tyr53、Tyr59、Arg100、Tyr102、Thr103、Ser104、Ser105、Trp106、Tyr107和Pro108。
含距离IL-23异二聚体为4Å或更近的原子的抗体E Fab轻链氨基酸残基包括SEQ ID NO: 1的Ala31、Gly32、Tyr33、Asp34、Tyr51、Gly52、Asn55、Lys68和Tyr93。含距离IL-23异二聚体≤ 5 Å的原子的抗体B Fab轻链氨基酸残基包括SEQ ID NO: 1的Thr29、Ala31、Gly32、Tyr33、Asp34、Tyr51、Gly52、Asn55、Lys68、Tyr93和Trp100。
实施例 5
通过溶剂可接近表面积差异测定 IL-23- 抗体复合物接触残基
用溶剂可接近表面积差异来测定互补位(识别抗原的抗体部分)与被人IL-23-抗体B Fab复合物及人IL-23-抗体E Fab复合物中的互补位结合的抗原部分的残基接触。用分子操作环境(Molecular Operating Environment) (Chemical Computing Group, Montreal, Quebec)实施溶剂可接近表面积计算。
通过按照所需集合(set)设定抗体B Fab残基，来计算IL-23-抗体B Fab复合物中的互补位的溶剂可接近表面积差异。使用实施例4中所获得的IL-23-抗体B Fab复合物的结构信息，计算在IL-23异二聚体存在时的抗体B Fab的氨基酸残基的残基溶剂可接近表面积，其代表该集合的“结合面积”。
计算缺乏IL-23抗原时每一抗体B Fab残基的残基溶剂可接近表面积，其代表该集合的“游离面积”。
然后从“游离面积”减去“结合面积”，获得该集合中的每一残基的“溶剂暴露表面积差异”。表面积没有变化或零差异的抗体B Fab残基，复合时与IL-23抗原残基没有接触。认为具有≥10 Å2差值的抗体B Fab残基与IL-23抗原中的残基有有效接触，使得当抗体B Fab与人IL-23结合时，这些抗体B Fab残基被至少部分至完全闭塞。抗体B Fab残基的该集合构成“覆盖补丁”，当抗体B Fab与人IL-23结合时，所述残基参与界面结构，参见表10和11。在该覆盖补丁中的抗体B Fab残基可不参与与IL-23抗原残基的结合相互作用，但覆盖补丁内的任何单个残基突变可引入将影响抗体B Fab与人IL-23的结合的能量差异。除Tyr49外，所有残基都位于抗体B Fab轻链和重链的CDR区。这些残基亦在离与抗体B Fab结合时的Il-23抗原5Å或更近距离内，如实施例4所述。
表 10抗体B Fab轻链的溶剂可接近表面积差异
表 11抗体B Fab重链的溶剂可接近表面积差异
如上所述计算IL-23-抗体E Fab复合物中残基的溶剂可接近表面积差异。认为具有≥10 Å2差值的抗体E Fab残基与IL-23抗原中的残基有显著接触，当抗体E Fab与人IL-23结合时，这些抗体E Fab残基被至少部分至完全闭塞。抗体E Fab残基的该集合构成覆盖补丁，当抗体E Fab与人IL-23结合时，所述残基参与界面结构，参见表12和13。在该覆盖补丁中的抗体E Fab残基可不参与与IL-23抗原残基的结合相互作用，但覆盖补丁内的任何单个残基突变可引入将影响抗体E Fab与人IL-23的结合的能量差异。就绝大部分而言，这些覆盖补丁残基位于抗体E Fab重链和轻链的CDR区。这些残基亦在离与抗体E Fab结合时的IL-23抗原5Å或更近距离内，如实施例4所述。
表 12抗体E Fab轻链的溶剂可接近表面积差异
表 13抗体E Fab重链的溶剂可接近表面积差异
通过按照所需集合设定IL-23异二聚体残基，来计算抗体B Fab的互补位所结合的IL-23异二聚体部分的溶剂可接近表面积差异。使用实施例4中所获得的抗体B Fab-IL-23复合物的结构信息，计算在抗体B Fab存在时的IL-23异二聚体的氨基酸残基的残基溶剂可接近表面积，其代表该集合的“结合面积”。
计算缺乏抗体B Fab时每一IL-23异二聚体残基的残基溶剂可接近表面积，其代表该集合的“游离面积”。
如上所述，从“游离面积”减去“结合面积”，获得每一IL-23残基的“溶剂暴露表面积差异”。表面积没有变化或零差异的IL-23异二聚体残基，复合时与抗体B Fab残基没有接触。认为具有≥10 Å2差值的IL-23异二聚体残基与抗体B Fab的残基有显著接触，并且当人IL-23异二聚体与抗体B Fab结合时，这些IL-23异二聚体残基被至少部分至完全闭塞。IL-23异二聚体残基的该集合构成“覆盖补丁”，当人IL-23异二聚体与抗体E Fab结合时，所述残基参与界面结构，参见表14。在该覆盖补丁中的IL-23异二聚体残基可能并非所有都参与与抗体B Fab残基的结合相互作用，但覆盖补丁内的任何单个残基突变可引入将影响抗体B Fab与人IL-23的结合的能量差异。这些残基亦在离抗体B Fab 4Å或更近距离内，如实施例4所述。
表 14 IL-23异二聚体残基的溶剂可接近表面积差异
p19残基(SEQ ID NO: 145) 溶剂暴露表面积差异(Å2)
Ser46 26.5
Ala47 12.7
Pro49 59.6
Leu50 122.2
His53 47.8
Met54 13.9
Asp55 20.5
Arg57 14.6
Glu58 96.5
Glu112 29.7
Pro113 64.8
Ser114 30.0
Leu115 31.4
Leu116 60.0
Asp118 14.4
Ser119 19.7
Pro120 64.7
Pro155 19.4
Typ156 61.9
Leu159 72.8
Leu160 27.0
Arg162 14.4
Phe163 67.5
p40残基(SEQ ID NO: 147)
Glu122 29.1
Lys124 60.9
如上所述计算被抗体E Fab的互补位结合的IL-23异二聚体部分的溶剂可接近表面积差异。认为具有≥10 Å2差值的IL-23异二聚体残基与抗体E Fab残基有显著接触，并且当人IL-23异二聚体与抗体E Fab结合时，这些Il-23异二聚体残基被至少部分至完全闭塞。IL-23异二聚体残基的该集合构成覆盖补丁，当人IL-23异二聚体与抗体E Fab时，所述残基参与界面结构，参见表15。在该覆盖补丁中的Il-23异二聚体残基可能并非所有都参与与抗体E Fab残基的结合相互作用，但覆盖补丁内的任何单个残基突变可引入将影响抗体E Fab与人IL-23的结合的能量差异。这些残基亦在离抗体E Fab 5Å或更近距离内，如实施例4所述。
表 15 IL-23异二聚体残基的溶剂可接近表面积差异
。

Claims (69)

1.一种结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区包含选自以下的CDRH1、CDRH2和CDRH3：
a)与表3中所示的CDRH1相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRH1；
b)与表3中所示的CDRH2相差不超过3个氨基酸取代、插入和/或缺失的CDRH2；
c)与表3中所示的CDRH3相差不超过3个氨基酸取代、插入和/或缺失的CDRH3；
所述轻链可变区包含选自以下的CDRL1、CDRL2和CDRL3：
d)与表3中所示的CDRL1相差不超过3个氨基酸取代、插入和/或缺失的CDRL1；
e)与表3中所示的CDRL2相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRL2；
f)与表3中所示的CDRL3相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRL3。
2.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区，亦包含至少一个轻链可变区，所述重链可变区包含选自以下的CDRH1、CDRH2和CDRH3：
a)与表3中所示的CDRH1相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRH1；
b)与表3中所示的CDRH2相差不超过2个氨基酸取代、插入和/或缺失的CDRH2；
c)与表3中所示的CDRH3相差不超过2个氨基酸取代、插入和/或缺失的CDRH3；
所述轻链可变区包含选自以下的CDRL1、CDRL2和CDRL3：
d)与表3中所示的CDRL1相差不超过2个氨基酸取代、插入和/或缺失的CDRL1；
e)与表3中所示的CDRL2相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRL2；
f)与表3中所示的CDRL3相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRL3。
3.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区，亦包含至少一个轻链可变区，所述重链可变区包含选自以下的CDRH1、CDRH2和CDRH3：
a)与表3中所示的CDRH1相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRH1；
b)与表3中所示的CDRH2相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRH2；
c)与表3中所示的CDRH3相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRH3；
所述轻链可变区包含选自以下的CDRL1、CDRL2和CDRL3：
d)与表3中所示的CDRL1相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRL1；
e)与表3中所示的CDRL2相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRL2；
f)与表3中所示的CDRL3相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失的CDRL3。
4.一种结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白选自：
a)具有CDRH1为SEQ ID NO: 129、CDRH2为SEQ ID NO: 132、CDRH3为SEQ ID NO: 136及CDRL1为SEQ ID NO: 123、CDRL2为SEQ ID NO: 81和CDRL3为SEQ ID NO: 76的抗原结合蛋白；
b)具有CDRH1为SEQ ID NO: 131、CDRH2为SEQ ID NO: 134、CDRH3为SEQ ID NO: 137及CDRL1为SEQ ID NO: 124、CDRL2为SEQ ID NO: 126和CDRL3为SEQ ID NO: 128的抗原结合蛋白；
c) a)具有CDRH1为SEQ ID NO: 130、CDRH2为SEQ ID NO: 133、CDRH3为SEQ ID NO: 99及CDRL1为SEQ ID NO: 68、CDRL2为SEQ ID NO: 69和CDRL3为SEQ ID NO: 67的抗原结合蛋白；和
d)具有CDRH1为SEQ ID NO: 91、CDRH2为SEQ ID NO: 135、CDRH3为SEQ ID NO: 138及CDRL1为SEQ ID NO: 125、CDRL2为SEQ ID NO: 127和CDRL3为SEQ ID NO: 64的抗原结合蛋白。
5.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
选自以下的CDRH1：SEQ ID NO: 91、94、97、100和103；
选自以下的CDRH2：SEQ ID NO: 92、95、98、101、104、107和110；
选自以下的CDRH3：SEQ ID NO: 93、96、99、102和105；
选自以下的CDRL1：SEQ ID NO: 62、65、68、71和74；
选自以下的CDRL2：SEQ ID NO: 63、66、69、72、75和78；和
选自以下的CDRL3：SEQ ID NO: 64、67、70和73。
6.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含：
选自以下的CDRH1：SEQ ID NO: 91、106、109、112和115；
选自以下的CDRH2：SEQ ID NO: 113、116、118、120、121和122；
选自以下的CDRH3：SEQ ID NO: 108、111、114、117和119；
选自以下的CDRL1：SEQ ID NO: 77、80、83、85、86、87、88、89和90；
CDRL2为SEQ ID NO: 81；和
选自以下的CDRL3：SEQ ID NO: 76、79、82和84。
7.一种结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含选自以下的至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区：
a)包含SEQ ID NO: 31的31-35、50-65和99-113位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 1的23-36、52-58和91-101位氨基酸残基的轻链可变区；
b)包含SEQ ID NO: 34的31-35、50-65和99-110位氨基酸残基的重链可变区和包含SEQ ID NO: 36的31-35、50-66和99-110位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 4的23-36、52-62和97-105位氨基酸残基的轻链可变区；
c)包含SEQ ID NO: 38的31-35、50-66和99-114位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 7的23-34、50-61和94-106位氨基酸残基的轻链可变区；
d)包含SEQ ID NO: 40的31-35、50-66和99-114位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 9的24-34、50-56和94-106位氨基酸残基的轻链可变区；
e)包含SEQ ID NO: 42的31-35、50-66和99-114位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 11的23-34、50-61和94-106位氨基酸残基的轻链可变区；
f)包含SEQ ID NO: 44的31-35、50-65和98-107位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 13的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；
g)包含SEQ ID NO: 46或153的31-37、52-67和100-109位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO15的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；
h)包含SEQ ID NO: 48的31-37、52-67和100-109位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 17的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；
i)包含SEQ ID NO: 50的31-37、52-67和101-109位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 19的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；
j)包含SEQ ID NO: 52的31-35、50-65和98-107位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 21的24-34、50-56和98-107位氨基酸残基的轻链可变区；
k)包含SEQ ID NO: 54的31-37、52-67和100-109位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 23的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；
l)包含SEQ ID NO: 56的31-37、52-67和100-109位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 25的24-34、50-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区；和
m)包含SEQ ID NO: 58的31-37、52-57和100-109位氨基酸残基的重链可变区；和
包含SEQ ID NO: 27的24-34、500-56和89-97位氨基酸残基的轻链可变区。
8.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区。
9.权利要求1的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少两个重链可变区和至少两个轻链可变区。
10.一种结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区序列与表2中所示的重链可变区序列相差不超过13个氨基酸取代、添加和/或缺失；和其中所述轻链可变区序列与表1中所示的轻链可变区序列相差不超过13个氨基酸取代、添加和/或缺失。
11.权利要求10的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链可变区序列与表2中所示的重链可变区序列相差不超过11个氨基酸取代、插入和/或缺失。
12.权利要求10的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链可变区序列与表2中所示的重链可变区序列相差不超过5个氨基酸取代、插入和/或缺失。
13.权利要求10的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链可变区序列与表2中所示的重链可变区序列相差不超过2个氨基酸取代、插入和/或缺失。
14.权利要求10的分离的抗原结合蛋白，其中所述重链可变区序列与表2中所示的重链可变区序列相差不超过1个氨基酸取代、插入或缺失。
15.权利要求10的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区序列与表1中所示的轻链可变区序列相差不超过7个氨基酸取代、插入和/或缺失。
16.权利要求10的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区序列与表1中所示的轻链可变区序列相差不超过4个氨基酸取代、插入和/或缺失。
17.权利要求10的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区序列与表1中所示的轻链可变区序列相差不超过2个氨基酸取代、插入和/或缺失。
18.权利要求10的分离的抗原结合蛋白，其中所述轻链可变区序列与表1中所示的轻链可变区序列相差不超过1个氨基酸取代、插入和/或缺失。
19.一种选自以下的结合IL-23的分离的抗原结合蛋白：
a) SEQ ID NO: 140重链可变区和SEQ ID NO: 30轻链可变区；
b) SEQ ID NO: 141重链可变区和SEQ ID NO: 61轻链可变区；
c) SEQ ID NO: 142重链可变区和SEQ ID NO: 4轻链可变区；和
d) SEQ ID NO: 143重链可变区和SEQ ID NO: 139轻链可变区。
20.一种结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，其包含：
由与SEQ ID NO: 31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58具有至少90%序列同一性的氨基酸序列组成的重链可变区；和
包含与SEQ ID NO: 1、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
21.权利要求20的分离的抗原结合蛋白，
重链可变区由与SEQ ID NO: 31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58具有至少95%序列同一性的氨基酸序列组成；和
轻链可变区包含与SEQ ID NO: 1、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27具有至少95%序列同一性的氨基酸序列。
22.权利要求20的分离的抗原结合蛋白，其包含
由与SEQ ID NO: 31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58具有至少97%序列同一性的氨基酸序列组成的重链可变区；和
包含与SEQ ID NO: 1、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27具有至少97%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
23.权利要求20的分离的抗原结合蛋白，其包含
由与SEQ ID NO: 31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56和58具有至少98%序列同一性的氨基酸序列组成的重链可变区；和
包含与SEQ ID NO: 1、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27具有至少98%序列同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
24.权利要求20的分离的抗原结合蛋白，其包含
选自SEQ ID NO: 44、46、48、50、52、54、56、58和153的重链可变区和
选自SEQ ID NO: 13、15、17、19、21、23、25和27的轻链可变区。
25.权利要求20的分离的抗原结合蛋白，其包含
选自SEQ ID NO: 31、34、36、38、40和42的重链可变区和
选自SEQ ID NO: 1、4、7、9和11的轻链可变区。
26.一种结合IL-23的分离的抗原结合蛋白，包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：
a) SEQ ID NO: 31重链可变区和SEQ ID NO: 1轻链可变区；
b) SEQ ID NO: 34或36重链可变区和SEQ ID NO: 4轻链可变区；
c) SEQ ID NO: 38重链可变区和SEQ ID NO: 7轻链可变区；
d) SEQ ID NO: 40重链可变区和SEQ ID NO: 9轻链可变区；
e) SEQ ID NO: 42重链可变区和SEQ ID NO: 11轻链可变区；
f) SEQ ID NO: 44重链可变区和SEQ ID NO: 13轻链可变区；
g) SEQ ID NO: 46或153重链可变区和SEQ ID NO: 15轻链可变区；
h) SEQ ID NO: 48重链可变区和SEQ ID NO: 17轻链可变区；
i) SEQ ID NO: 50重链可变区和SEQ ID NO: 19轻链可变区；
j) SEQ ID NO: 52重链可变区和SEQ ID NO: 21轻链可变区；
k) SEQ ID NO: 54重链可变区和SEQ ID NO: 23轻链可变区；
l) SEQ ID NO: 56重链可变区和SEQ ID NO: 25轻链可变区；和
m) SEQ ID NO: 58重链可变区和SEQ ID NO: 27轻链可变区。
27.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含SEQ ID NO: 15的30、31、32、49、50、52、53、56、92和94位残基接触，其中所述残基接触具有大于或等于10 Å2的差值，其如通过溶剂暴露表面积所测定。
28.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含SEQ ID NO: 46的31-35、54、58-60、66和101-105位残基接触，其中所述残基接触具有大于或等于10 Å2的差值，其如通过溶剂暴露表面积所测定。
29.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含SEQ ID NO: 1的31-34、51、52、55、68、93和98位残基接触，其中所述残基接触具有大于或等于10 Å2的差值，其如通过溶剂暴露表面积所测定。
30.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁包含SEQ ID NO: 31的1、26、28、31、32、52、53、59、76、101、102和104-108位残基接触，其中所述残基接触具有大于或等于10 Å2的差值，其如通过溶剂暴露表面积所测定。
31.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 46的32-35、54、58-60、66和101-105位残基5 Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。
32.权利要求31的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 46的31-35、54、56、58-60、66和101-105位残基5 Å或更近。
33.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 15的30-32、49、52、53、91-94和96位残基5 Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。
34.权利要求33的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 15的30-32, 49、50、52、53、56、91-94和96位残基5 Å或更近。
35.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 31的26-28、31、53、59、102和104-108位残基5 Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。
36.权利要求35的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 31的1、26-28、30-32、52、53、59、100和102-108位残基5 Å或更近。
37.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 1的31-34、51、52、55、68和93位残基5 Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。
38.权利要求37的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离SEQ ID NO: 1的29、31-34、51、52、55、68、93和100位残基5 Å或更近。
39.权利要求1、4、7、10、19、20、26-31、33、35或37的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为抗体。
40.权利要求39的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体为单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。
41.权利要求40的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体片段为Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。
42.权利要求40的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为人抗体。
43.权利要求40的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为单克隆抗体。
44.权利要求39的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白属于IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。
45.权利要求44的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白属于IgG1型或IgG2型。
46.一种编码权利要求1、4、7、10、19、20或26的抗原结合蛋白的分离的核酸分子。
47.权利要求46的分离的核酸分子，其中至少一个重链可变区由选自以下的分离的核酸分子编码：SEQ ID NO: 32、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和152；和至少一个轻链可变区由选自以下的分离的核酸分子编码：SEQ ID NO: 2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28。
48.权利要求47的核酸分子，其中所述核酸分子与调控序列可操作地连接。
49.一种包含权利要求46的核酸分子的载体。
50.一种包含权利要求46的核酸分子的宿主细胞。
51.一种包含权利要求49的载体的宿主细胞。
52.一种足以用作杂交探针、PCR引物或测序引物的分离的多核苷酸，其为权利要求47的核酸分子的片段或其互补序列。
53.一种制备权利要求1、4、7、10、19、20或26的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括从分泌所述抗原结合蛋白的宿主细胞制备所述抗原结合蛋白的步骤。
54.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁，包含如SEQ ID NO: 145中所述的人IL-23p19亚基的46-58位残基内的残基接触、112-120位残基内的残基接触和155-163位残基内的残基接触，其中所述残基接触具有大于或等于10Å2的差值，其如通过溶剂暴露表面积所测定。
55.权利要求54的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时形成的覆盖补丁，进一步包含如SEQ ID NO: 147中所述的人IL-23p40亚基的121-125位残基内的残基接触，其中所述残基接触具有大于或等于10Å2的差值，其如通过溶剂暴露表面积所测定。
56.一种结合人IL-23的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离如SEQ ID NO: 145中所述的人IL-23p19亚基的以下残基5Å或更近：46-58位残基内的残基，112-123位残基内的残基，和155-163位残基内的残基；其如通过X射线晶体学所测定。
57.权利要求56的分离的抗原结合蛋白，其中当所述抗原结合蛋白与人IL-23结合时，所述抗原结合蛋白离如SEQ ID NO: 147中所述的人IL-23p40亚基的121-125位残基内的残基5Å或更近，其如通过X射线晶体学所测定。
58.权利要求1、4、7、10、19、20、26-31、33、35、37、54或56的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有选自以下的至少一种特性：
a)降低人IL-23活性；
b)降低促炎细胞因子的产生；
c)以≤ 5×10-8 M的KD与人IL-23结合；
d)具有≤ 5×10-6 1/s的Koff速率；和
e)具有≤ 400 pM的IC50。
59.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1、4、7、10、19、20或26的至少一种抗原结合蛋白和药学上可接受的赋形剂。
60.权利要求59的药物组合物，其进一步包含标记基团或效应基团。
61.权利要求60的药物组合物，其中所述标记基团选自：同位素标记、磁性标记、氧化还原活性部分、光学染料、生物素化基团和被第二报道分子识别的预定多肽表位。
62.权利要求60的药物组合物，其中所述效应基团选自：放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗基团和化疗基团。
63.权利要求60的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白与标记基团偶联。
64.一种用于治疗或预防患者中的与IL-23有关的病况的方法，所述方法包括给予有需要的患者有效量的权利要求1、4、7、10、19、20或26的至少一种分离的抗原结合蛋白。
65.权利要求64的方法，其中所述病况选自：炎性病症、风湿病、自身免疫性疾病、肿瘤病症和胃肠道病症。
66.权利要求65的方法，其中所述病况选自：多发性硬化症、类风湿性关节炎、癌症、银屑病、炎性肠病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、银屑病关节炎、自身免疫性心肌炎；1型糖尿病和强直性脊柱炎。
67.权利要求64的方法，其中所述分离的抗原结合蛋白质单独或作为联合疗法给予。
68.一种降低患者中的IL-23活性的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求1、4、7、10、19、20或26的至少一种抗原结合蛋白。
69.权利要求68的降低IL-23活性的方法，其中所述IL-23活性诱导产生促炎细胞因子。
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