CN104726446A - 一种通过超高压诱变提高啤酒酵母富锌能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过超高压诱变提高啤酒酵母富锌能力的方法，属于微生物育种技术领域。将啤酒酵母出发菌株经活化、菌悬液细胞超高压诱变处理、利用含锌选择性培养基对突变菌株筛选、驯化而提高啤酒酵母对锌的富集能力。采用超高压诱变获得高富锌啤酒酵母突变株，该方法相比较紫外线、化学诱变剂诱变更安全、操作简单、效果更明显。啤酒酵母突变菌株对锌的耐受浓度达到3.2mmol/L，含锌量达到2.75mg/g，比啤酒酵母出发菌含锌量高出6.55倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种通过超高压诱变提高啤酒酵母富锌能力的方法，属于微生物育种技术领域，特指一种将啤酒酵母细胞经超高压处理诱变后，再利用含锌选择性培养基对突变株筛选、驯化，提高啤酒酵母对锌的富集能力的方法。
背景技术
锌作为人体必需的微量元素之一越来越受到人们的关注。锌在人体内部主要是以有机态的形式被吸收、代谢，无机态的锌不但不能被人体消化吸收，且具有一定的毒性。利用微生物的方法富集人和动物必需的微量元素，制造成本低廉且安全的功能性食品，也日益受到人们的青睐。酵母菌对锌有一定的富集能力，可以将无机锌转化为有机锌。常见的紫外线和化学诱变剂等诱变方法由于具有辐射性或毒性，在很大程度上限制了它们的应用。随着高压理论和技术的发展，高压生物学的研究已经深入到生物学的多个领域，超高压诱变技术在工业微生物育种方面有了新的进展，但是利用超高压技术来进行富锌酵母选育的研究较少。利用超高压技术对啤酒酵母菌株进行诱变处理，可以获取富锌性能显著性提高的正突变菌株，因其简单实用、效果明显。
发明内容
针对目前筛选高效富锌微生物技术中存在的问题，本发明提供了一种通过超高压诱变提高啤酒酵母富锌能力的方法，从而获得高产锌的啤酒酵母以应用于食品、药品等行业。
本发明的一种通过超高压诱变提高啤酒酵母富锌能力的方法，其包括以下步骤：
⑴ 将斜面保存的啤酒酵母菌进行预培养，接种于YPD液体培养基上，经28℃、150rpm摇瓶培养10h达到对数生长期，取培养菌液于4℃、4000rpm离心10min，以无菌生理盐水制备细胞浓度为106～107个/mL的菌体悬液。
⑵ 将所制备的啤酒酵母菌悬液转入灭菌的聚丙烯塑料包装袋内并封口，置于超高压处理机内在250MPa条件下高压处理20min，进行超高压诱变。
⑶ 将诱变后的突变菌株涂布在啤酒酵母最大耐受锌浓度（0.8mmol/L）的Zn-YPD选择性培养基平板上，在28℃恒温箱中倒置培养72h。观察培养皿上长菌情况，挑取生长快、菌落较大的单菌落菌株。
⑷ 将初筛出的菌株接种于倍增的最大耐受锌浓度的Zn-YPD选择性培养基平板上，28℃恒温培养72h，连续驯化传代，得到稳定的抗性突变株，其对锌的耐受浓度为3.2mmol/L。
本发明通过超高压诱变、初筛和驯化，得到对高浓度锌充分耐受且富锌能力较高的啤酒酵母突变菌株，其对锌的耐受浓度达到3.2mmol/L，含锌量达到2.75mg/g，比啤酒酵母出发菌含锌量高出6.55倍。通过本方法大大地提高了啤酒酵母对锌的耐受性及富锌能力，相比较紫外线、化学诱变剂诱变更安全、操作简单、效果更明显。
具体实施方式
诱变流程：
啤酒酵母出发菌株活化→菌悬液超高压诱变→含锌选择性培养基初筛→耐锌性驯化→获得高富锌菌株。
从保藏试管的斜面里挑取啤酒酵母出发菌两环，至盛有50mL YPD液体培养基的250mL三角瓶中，在28℃、150rpm摇瓶培养10h，达到对数生长期。取培养后的啤酒酵母菌液l0mL，4℃、4000rpm离心10min后，以无菌生理盐水洗涤三次制得菌体悬液。使用前在摇床内轻微振荡30min，让菌体分散均匀。将制备好的菌悬液适当稀释，采用血球计数板调整细胞浓度为106个/mL，备用。
无菌操作条件下取啤酒酵母菌悬液5mL，转入经121℃、20min条件下灭菌的聚丙烯塑料包装袋内并封口，置于超高压处理机内在250MPa条件下高压处理20min，进行超高压诱变。
将诱变后的突变菌株涂布在0.8mmol/L（最大耐受锌浓度）的Zn-YPD选择性培养基平板上，在28℃恒温箱中倒置培养72h。挑取生长快、菌落较大的单菌落，依次涂布在两至四倍最大耐受锌浓度的Zn-YPD选择性培养基平板上驯化传代。在该平板上生长良好且稳定的菌落即为高效富锌突变菌株。
Claims (4)
1.一种通过超高压诱变提高啤酒酵母富锌能力的方法，其特征在于依次包括以下步骤：
⑴ 将斜面保存的啤酒酵母菌进行预培养，接种于YPD液体培养基上，经28℃、150rpm摇瓶培养10h达到对数生长期，取培养菌液于4℃、4000rpm离心10min，以无菌生理盐水制备细胞浓度为106～107个/mL的菌体悬液；
⑵ 将所制备的啤酒酵母菌悬液转入灭菌的聚丙烯塑料包装袋内并封口，置于超高压处理机内在250MPa条件下高压处理20min，进行超高压诱变；
⑶ 将诱变后的突变菌株涂布在啤酒酵母最大耐受锌浓度（0.8mmol/L）的Zn-YPD选择性培养基平板上，在28℃恒温箱中倒置培养72h；
观察培养皿上长菌情况，挑取生长快、菌落较大的单菌落菌株；
⑷ 将初筛出的菌株接种于倍增的最大耐受锌浓度的Zn-YPD选择性培养基平板上，28℃恒温培养72h，连续驯化传代，得到稳定的抗性突变株，其对锌的耐受浓度达到3.2mmol/L。
2.根据权利要求1所述的通过超高压诱变提高啤酒酵母富锌能力的方法，其特征在于：步骤⑵的在250MPa条件下高压处理20min。
3.根据权利要求1所述的通过超高压诱变提高啤酒酵母富锌能力的方法，其特征在于：步骤 ⑶的啤酒酵母最大耐受锌浓度0.8mmol/L。
4. 根据权利要求1所述的通过超高压诱变提高啤酒酵母富锌能力的方法，其特征在于：步骤 ⑷的啤酒酵母突变株对锌的耐受浓度为3.2mmol/L。
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Non-Patent Citations (4)
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