CN104725317B

CN104725317B - 一种具抗肿瘤活性的吡唑羧酸类化合物及其合成方法

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Publication number: CN104725317B
Application number: CN201510013956.XA
Authority: CN
Inventors: 梁承远; 宋慧慧; 张诗韵; 丁顺军
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2015-01-12
Filing date: 2015-01-12
Publication date: 2017-12-29
Anticipated expiration: 2035-01-12
Also published as: CN104725317A

Abstract

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的吡唑羧酸类化合物及其合成方法。该类化合物以苯基异氰酸酯、乙酰乙酸乙酯及其衍生物、苯肼为原料，在甲苯作为溶剂下反应合成吡唑羧酸类化合物。本发明方法操作安全性高，反应条件温和，适用于工业化生产。经初步生物活性测试表明该类型化合物有较好的抗肿瘤活性，具有重要的医药应用价值。

Description

一种具抗肿瘤活性的吡唑羧酸类化合物及其合成方法

技术领域

本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的吡唑羧酸类化合物及其合成方法，属于医药化学领域。

背景技术

肿瘤是一种严重威胁人类健康的疾病，寻找有效安全、毒副作用小的抗肿瘤药物一直是肿瘤药物研发工作者孜孜以求的目标。随着药物化学的发展，以吡唑羧酸为结构母核的化合物在肿瘤治疗中的作用引起广泛关注。

吡唑环是很多天然化合物和合成药物中的核心结构单元，作为杂环化合物中的一个重要分支，吡唑类化合物因其具有高效、低毒，以及其环上取代基可以多方位的变换而在药物领域中得到广泛应用。研究发现吡唑类化合物具有消炎、止痛、抑菌、杀菌、抗高血糖、抗癌、抗凝血剂等药理活性。将羧基引入吡唑的化学结构中，可以增强其生物活性，提高选择性，具有重要的理论价值和实际应用价值。近年来，对于有抗肿瘤活性的吡唑衍生物，药物化学家和生物学家进行了大量的研究，合成筛选出各种不同基因修饰的有抗肿瘤活性的吡唑衍生物，为进一步开发有效低毒的抗肿瘤药物打下了坚实基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的结构新颖的吡唑羧酸类化合物。

本发明的另一目的在于提供上述吡唑羧酸类化合物的合成方法。

本发明的实现过程如下：

结构通式（Ⅰ）所示化合物，

（Ⅰ）

其中，R₁、R₂独立地选自氢、硝基、烷氧基、卤素，苯基，取代苯基，低级烷基-环烷基，环烷基-低级烷基，取代或未取代的低级烷基或环烷基；

所述的低级烷烃为C1～C10的烷烃，所述取代的取代基为C1～C10的烷烃、烷氧基、硝基、卤素。

最优选的方式是，R₁、R₂独立地选自氢、甲基、硝基、卤素。

上述化合物（I）的合成方法，包括如下步骤：

（1）苯基异氰酸酯与乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯或乙酰乙酸异丙酯在80～120℃反应；

（2）向步骤（1）产物中加入苯肼，在80～120℃继续反应；

（3）将步骤（2）反应所得固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤得化合物（1）粗品。

上述苯基异氰酸酯：乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯或乙酰乙酸异丙酯：苯肼的摩尔比为1:1:1～1:2.5:2.5，或为1:1:1.5～1:1.5:2。

上述步骤（1）中的反应温度为105～115℃，反应时间为2～3小时。反应过程中使用薄层色谱追踪，及时监测反应的进行程度。

上述步骤（3）制备的化合物（1）粗品进一步用乙醇重结晶提纯。

上述化合物可用于制备抗肿瘤活性药物。

本发明的优点及积极效果：原料环保，生产成本低，操作安全性高，反应条件温和，反应原料利用充分，适用于工业化生产，解决了现有技术产率低的问题，同时将羧基引入到吡唑的化学结构中，对探究该类化合物的生物活性与总结构效关系具有重要的理论价值和应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。

本发明部分优选实施方案中的化合物结构式如下所示：

（1）（2）（3）

（4）（5）（6）

（7）（8）（9）

（10）（11）（12）

实施例1

5-甲基-1-苯基-3-(对-甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸（1）的制备。

在反应器中加入1.33g(10mmol) 4-甲基苯异氰酸酯和1.3g(10mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上用电热套加热到105℃搅拌，回流反应3小时。然后在该反应体系中加入1.1g(10mmol)苯肼继续回流反应4小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到5-甲基-1-苯基-3-(对-甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得淡黄色结晶性粉末（2.11克），总收率72.5%。淡黄色结晶粉末，M.P.185.5℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.20(1H,s), 9.45(1H,s),7.70-7.50(4H,q),7.46(1H,t),7.4-7.2(4H,q),2.53(3H,s),2.35(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSOd ₆)δ(ppm):169.6,158.5,139.8,139.2,137.7,131.4,130.0,129.5,126.5,120.3,107.7,21.5,11.4;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:307.1322,found 307.1325。

实施例2

3–((4-氯苯基)氨基)-5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸（2）的制备

在反应器中加入1.53g(10 mmol) 4-氯异氰酸酯和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.63g(15mmol)苯肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3–((4-氯苯基)氨基)-5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到浅黄色结晶性粉末（2.20克），总收率70.9%。浅黄色结晶粉末，M.P.192.7℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):11.20(1H,s), 9.55(1H,br),7.70-7.50(6H,m),7.46(1H,t),7.25(2H,d),2.53(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):169.6,158.5,139.8,139.0,129.9,129.3,127.9,126.4,124.9,121.3,107.7,11.4;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd:327.0775,found327.0779。

实施例3

5-甲基-1-苯基-3-(间-甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸（3）的制备

在反应器中加入1.33g(10 mmol) 间甲苯异氰酸酯和3.12g(24mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到115℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入2.72g(25mmol)苯肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到5-甲基-1-苯基-3-(间-甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得淡黄色结晶性粉末（2.03克），总收率69.5%。淡黄色结晶粉末，M.P.163.0℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):11.25(1H,s), 9.50(1H,br),7.7-7.5(4H,q),7.5-7.4(2H,d),7.10(1H,t),6.58(1H,d),2.56(3H,s),2.35(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):169.6,158.5,140.7,139.8,139.2,129.5,126.4,124.7,121.3,119.2,114.9,107.8,21.5,11.4;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd:307.1320,found 307.1324。

实施例4

3–((3-氯苯基)氨基)-5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.53g(10 mmol) 3-氯苯异氰酸酯和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到100℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.63g(15mmol)苯肼继续回流反应4小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3–((3-氯苯基)氨基)-5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得灰白色结晶性粉末（1.24克），总收率39.7%。灰白色结晶粉末，M.P.181.1℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):11.2(1H,s), 9.5(1H,br), 7.7-7.4(5H,m),7.16(1H,d),6.8-6.9(2H,m),2.53(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):169.6,158.5,142.7,139.8,139.2,135.3,130.9,129.3,126.4,124.7,122.3,116.9,115.8,107.7,11.4;HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:327.0776,found 327.0779。

实施例5

5-甲基-3- ((4-硝基苯基)氨基)-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.64g(10 mmol) 4-硝基苯异氰酸酯和1.3g(10mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.63g(15mmol)苯肼继续回流反应4小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到5-甲基-3- ( (4-硝基苯基)氨基)-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到棕黄色结晶性粉末（2.20克），总收率68.7%。棕黄色结晶粉末，M.P.193.0℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):11.2(1H,s), 9.5(1H,br), 8.01(2H,d),7.7-7.5(4H,q),7.46(1H,t),6.89(2H,d),2.55(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):169.6,158.5,147.2,139.8,139.2,137.8,129.5,126.3,124.8,124.6,119.3,107.8,11.5;HRMS(ESI)for(M+Na)⁺:calcd:361.1414,found 361.1409。

实施例6

3- (( 4-溴苯基)氨基)-5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸（6）的制备

在反应器中加入1.97g(10 mmol) 4-溴苯异氰酸酯和1.95g(15mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到120℃，回流反应1小时。然后在该反应体系中加入2.17g(20mmol)苯肼继续回流反应2小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3- (( 4-溴苯基)氨基)-5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得红褐色结晶性粉末（1.99克），总收率56.3%。红褐色结晶粉末，M.P.198.7℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.2(1H,s), 9.6(1H,br)，7.7-7.5(4H,q),7.46(1H,t),7.34(2H,d),7.03(2H,d),2.54(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):169.5,158.5,139.8,139.2,132.5,129.5,124.8,118.6,116.8,107.7,11.4;HRMS(ESI)for(M+Na)⁺:calcd:394.1368,found 394.1373。

实施例7

3-((4-氟苯基)氨基)-5-甲基-1-(4-硝基苯基)吡唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.37g(10 mmol) 4氟-苯异氰酸酯和1.95g(15mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入2.30g(15mmol)对硝基苯肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3-((4-氟苯基)氨基)-5-甲基-1-(4-硝基苯基)吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得红色粉末（2.23克），总收率65.5%。红色粉末，M.P.182.6℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.2(1H,s), 9.4(1H,s)，8.43(2H,d),8.13(2H,d),7.41(2H,t),7.33(2H,t),2.53(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):169.5,158.4,157.5,145.9,139.2,136.7,124.5,124.6,120.7,116.5,107.3,11.4;HRMS(ESI)for(M+Na)⁺:calcd:379.1020,found 379.1024。

实施例8

3- (( 3,5-二氯苯基)氨基)-5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.87g(10 mmol) 3,5-二氯苯异氰酸和1.56g(12mmol) 乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到80℃，回流反应3小时。然后在该反应体系中加入1.63g(15mmol)苯肼继续回流反应6小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3- (( 3,5-二氯苯基)氨基)-5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（1.87克），总收率51.0%。白色结晶粉末，M.P.209.1℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.2(1H,s), 9.5(1H,br)，7.7-7.5(4H,q),7.46(1H,t),7.07(1H,s),6.70(2H,s),2.53(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):169.5,158.4,145.4,140.1,129.9,129.5,126.3,124.8,119.4,114.9,107.5,11.4;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd:361.0383,found 361.0380。

实施例9

3- ((3-氯苯基)氨基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.53g(10 mmol) 3-氯苯异氰酸酯和1.3g(10mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.89g(15mmol) 4-氟苯肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到3- ((3-氯苯基)氨基)-1-(4-氟苯基)-5-甲基-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得桔红色结晶性粉末（1.42克），总收率43.6%。桔红色结晶粉末，M.P.203.5℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.2(1H,s),9.5(1H,br)，7.61(2H,d),7.53(1H,d),7.25(2H,t),7.15(1H,t),6.90-6.80(2H,t),2.55(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSOd ₆)δ(ppm):169.5,160.6,158.5,142.8,139.1,135.5,130.8,122.4,116.8,115.9,115.7,107.8,11.4;HRMS(ESI)for(M+Na)⁺:calcd:367.1681,found 367.1679.

实施例10

1-(4-氯苯基)-5-甲基-3(苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.19g(10 mmol) 苯基异氰酸酯和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入2.13g(15mmol) 4-氯苯肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到1-(4-氯苯基)-5-甲基-3(苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（1.61克），总收率51.9%。白色结晶粉末，M.P.206.6℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.2(1H,s),9.8(1H,br)，7.7-7.4(6H,m),7.21(2H,t),6.83(1H,s),2.56(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):169.5,158.4,140.8,139.1,137.9,131.9,129.7,129.3,122.5,119.7,117.9,107.7,11.4;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd:327.0774,found327.0778。

实施例11

5-甲基-1-(间甲苯基)-3-(间甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.33g(10 mmol) 间甲苯基异氰酸酯和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入1.83g(15mmol) 3-甲基苯肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到5-甲基-1-(间甲苯基)-3-(间-甲苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，然后加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得白色结晶性粉末（2.19克），总收率64.9%。白色结晶粉末，M.P.211.2℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.2(1H,s),9.7(1H,br)，7.56(1H,s),7.5-7.2(5H,m),7.10(1H,t),6.58(1H,t),2.53(3H,s),2.33(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm):169.5,158.4,140.8,139.7,139.4,138.9,129.5,129.3,126.6,121.1,119.2,116.8,114.9,107.5,21.5,11.4;HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd:321.1476,found 321.1479。

实施例12

5-甲基-1- (4-硝基苯基)-3-(苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸的制备

在反应器中加入1.19g(10 mmol)苯基异氰酸酯和1.56g(12mmol)乙酰乙酸乙酯，加50mL甲苯作反应溶剂，置于磁力搅拌器上搅拌，用电热套加热到110℃，回流反应2小时。然后在该反应体系中加入2.30g(15mmol)对硝基苯肼继续回流反应3小时。反应结束后，将上述反应体系的固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤，滤饼用温水洗涤，得到5-甲基-1- (4-硝基苯基)-3-(苯基氨基)-1H-吡唑-4-羧酸粗品。将该吡唑羧酸粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到得棕色结晶性粉末（1.32克），总收率38.5%。棕色结晶粉末，M.P.195.0℃。¹H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):11.2(1H,s),9.7(1H,br), 8.45(2H,d),8.13(2H,d),7.65(2H,d),7.21(2H,t),6.83(1H,t),2.53(3H,s);¹³C-NMR(75MHz,DMSO-d ₆)δ(ppm): 169.5,158.5,145.9,145.0,140.8,139.1,129.6,124.8,124.6,122.5,117.9,107.5,11.4;

HRMS(ESI)for(M+H)⁺:calcd:338.1016,found 338.1020。

实施例13

本发明化合物的抗肿瘤活性测试

对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用常规的MTT法。

细胞株选用：人肝癌细胞(HepG2)，人肺癌细胞(A-549)，人宫颈癌细胞(Hela)，人胃癌细胞(SGC-7901)，人结肠癌细胞(HCT-8)。培养液为DMEM+15%NBS+双抗。

样品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100 μmol/L的溶液或者均匀的混悬液，然后用DMSO的PBS(-)稀释，最终浓度分别为0.1，1，10，20，40，60，80，100 μmol/L。

将上市的抗肿瘤药物阿糖胞苷(Ara-C)以同样的条件配成对照品溶液。

细胞培养：贴壁生长肿瘤细胞细胞培养于含10% 灭活新生牛血清和青霉素、链霉素（各100万U/L）的1640培养液中，置于37℃，5% CO₂，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3 天传代1 次，传代时首先倒出培养液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量。取对数生长期细胞用于实验。

MTT法检测细胞活性及IC50的测定：

实验原理：活细胞线粒体中脱氢酶能将黄色的MTT还原成不溶于水的蓝紫色产物甲臜 (MTT formazan)，并沉积在细胞中，生成的量与活细胞数目成正比，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解蓝紫色结晶物，颜色深浅与所含的量成正比，因此用酶标仪测定的光吸收值可反映细胞存活率。

实验方法：取对数生长期细胞，消化、计数，以 2×104/mL 的密度接种于 96 孔培养板中，每孔100 μl。培养 24小时后，将待测化合物以0.1，1，10，20，40，60，80，100 μmol/L浓度处理细胞。实验组每个浓度设5个复孔，以含0.4% DMSO的培养液作对照。药物作用 48小时后，去上清，每孔加入100 μl MTT（2-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-3，5-二苯基-2H-四唑氢溴酸盐）(1mg/mL)，继续培养 4小时，弃上清，每孔加入100μl DMSO，振荡混匀，用酶标仪在570 nm处测定吸光度值，采用 IC₅₀计算软件求出半数抑制浓度(IC50)。

试验结果详见表1，其中，样品是指相应实施例中制备的吡唑羧酸类化合物，样品编号对应制备实施例中所得到的化合物的具体编号。化合物8在所测试的5种细胞株中均表现出了良好的抗肿瘤活性，化合物2、7和9次之，在不同的细胞株中也表现出了良好的抗肿瘤活性。以上实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，特别是部分吡唑羧酸类化合物的活性在特定细胞株中抗肿瘤活性优于或等同于阿糖胞苷。

Claims

1.结构通式（Ⅰ）所示化合物，

（Ⅰ）

其中，R₁、R₂独立地选自氢、硝基、卤素。

2.权利要求1所述化合物的合成方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）结构式（2）所示苯基异氰酸酯与乙酰乙酸乙酯在80～120℃反应；

（2）向步骤（1）产物中加入结构式（3）所示苯肼，在80～120℃继续反应；

（3）将步骤（2）反应所得固液混合物减压浓缩后，加水稀释，用稀盐酸酸化，调pH值至中性，冷却至室温，然后过滤得化合物（I）粗品。

3.根据权利要求2所述化合物的合成方法，其特征在于：步骤（1）中的反应温度为105～115℃，反应时间为2～3小时。

4.根据权利要求2所述化合物的合成方法，其特征在于：化合物（I）粗品用乙醇重结晶进一步提纯。

5.权利要求1所述化合物在制备抗肿瘤活性药物中的应用，所述肿瘤为肝癌、肺癌、宫颈癌、胃癌或结肠癌。