CN104721830A

CN104721830A - Top肽

Info

Publication number: CN104721830A
Application number: CN201310713278.9A
Authority: CN
Inventors: 温光辉; 宛六一; 王浩军
Original assignee: BEIJING LABWORLD BIO-MEDICINE TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING LABWORLD BIO-MEDICINE TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2013-12-20
Publication date: 2015-06-24

Abstract

本发明涉及拓扑替康聚天冬氨酸缀合物及其制备方法和应用。具体地说，本发明涉及一种生物可降解大分子前药，包括DNA拓扑异构酶抑制剂和大分子聚合物，它们通过化学键相结合。本发明还提供了制备所述前药的方法及其应用。

Description

TOP肽

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及喜树碱和生物活性喜树碱类似物的具有被动靶向作用的聚肽前药。本发明还涉及此种聚肽前药的制备方法。

背景技术

喜树碱(Camptothecin，CPT)，是一种细胞毒性喹啉类生物碱，是具有抑制DNA拓扑异构酶(TOPO I)的植物抗癌药。1966年由M.E.Wall和M.C.Wani通过有系统的筛选天然物质，进而发现的抗癌药物。喜树碱及其衍生物是由5个平面的环状结构构成，包括一个beta-3,4-喹啉吡咯(A、B和C环)，连接一个吡啶(D环)，最后在接上一个S-alpha-羟基内脂环(E环)，在第20个碳的位置含有一个掌性中心。此种平面结构，被认为是抑制拓扑异构酶最重要的因素。研究证明，拓扑异构酶I在DNA复制、重组、转录、切割和再连接，细胞染色质的组织化及有丝分裂中都起着重要作用，喜树碱不是通过抑制拓扑异构酶I的催化活性而起到杀死癌细胞的作用，而是通过与拓扑异构酶Ⅰ-DNA可络合中间体可逆结合，形成喜树碱-拓扑异构酶Ⅰ-DNA三元复合物，使DNA复制受阻而导致细胞死亡，由于癌细胞中拓扑异构酶I的含量远高于正常细胞，因此更易遭到喜树碱的攻击，从而达到杀死肿瘤细胞的作用。其结构通式如下：

其中n=0，1。

目前已有4个喜树碱类药物上市，并有30多个衍生物处于临床研究阶段。已经上市的喜树碱类药物包括10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin，HCPT）、伊立替康（lrinotecan，CPT-11）、拓扑替康（Topotecan，TPT）和贝洛替康（CKD-602）。伊立替康由日本第一制药公司研发，于1994年7月首次在日本上市；拓扑替康由美国食品药品监督管理局（FDA）于1996年批准在美国上市；贝洛替康（CKD-602）于2004年在韩国上市。目前处于临床试验阶段的喜树碱衍生物包括9-氨基喜树碱（9-aminocampt-othecin，9-AC）、9-硝基喜树碱（9-nitrocamptothecin，9-NC，Rubitecan，在体内转化成9-AC）、鲁托替康（GG-2ll，Lurtotecan）、DX-8951f（Exatecan）、Gimatecan（ST-1481）、Karenitecin（BNP-1350）、BN80915、BN-80927、BAY38-3441B、DB-67等。对Chimmitecan的药动学、毒理学等方面的临床前研究正在进行中。

尽管喜树碱及其衍生物具有显著的抗肿瘤活性，但因其药物本身的特性，其临床应用受到极大限制。首先，喜树碱水溶性和脂溶性都很差，疗效低，毒性大。其次，喜树碱类药物的内酯环（E环）很不稳定，在体内极易水解开环成羧酸形式，并与血浆中的白蛋白结合，进一步驱使水解平衡向开环方向移动，从而极大地降低活性喜树碱的生物利用度。已上市的以及在开发中的喜树碱衍生物也仍然未能完全克服上述问题困扰。因此，为进一步提高该类药物的临床治疗价值，围绕改善溶解性，稳定内酯环，提高靶向性提出了众多的解决方案。其中，具有可再生性、良好的生物相容性、生物可降解性和免疫惰性的生物大分子材料的出现，为这些药物的临床应用带来了新的契机。喜树碱类药物的纳米制剂国内报道以脂质体、胶束、纳米粒等多见，但是均存在载药量低、稳定性较差、在体内转运过程中药物容易氧化和渗漏等缺点。而另一种以聚合物-药物的缀合物也受到人们的极大关注。

聚合物前药是指具有药理活性的药物与聚合物通过化学键相连，形成聚合物－药物轭合物。这种新化学实体（前药）本身没有活性，进入人体后，经酶促或非酶促反应会释放出活性原药，从而产生药效。合理的前药可以增加活性药物在体内的水溶性和代谢的稳定性，酶促或非酶促反应需要时间，因此会延长药物的作用时间，同时可以借助于前药载体使药物在某些特定靶组织中定位，减少副作用，提高药物作用的选择性及疗效。

用于前药制备的高分子载体有白蛋白、聚乙二醇及其衍生物、Ｎ－丙烯酰吗啉低聚物、壳聚糖、葡聚糖、聚N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺（HPMA）等。LIN等通过磷酸酯键将壳聚糖与抗HIV药物司他夫定连接形成前药，使司他夫定的抗病毒活性获得明显提高，毒性降低。但由于壳聚糖的水溶性不佳，通常需要对壳聚糖修饰改性以改善其水溶性。

聚乙二醇（PEG）为线性结构，具有良好的水溶性和生物相溶性，无毒、无免疫性、无致畸性且无抗原性，是获得FDA批准的药用合成聚合物之一。但是，由于PEG是化学合成的聚合物，通常存在不均一的缺点；此外，由于PEG的体积及相对分子质量大，被修饰药物在所得到的产品中占的比例较小，不可避免地在一定程度上遮蔽或影响到药物的活性部位，有可能造成生物活性的降低。另外，PEG的两端只有2个活性羟基，造成了载药量低的缺点。虽然在理论上采用PEG树枝状或星状聚合物或使用有多个活性基团的连接臂可以有效改善载药量，但是在实际合成过程中，空间障碍对反应活性的限制明显抑制了PEG对药物的支载。

KRAKOVICOV等将载体HPMA与抗炎药地塞米松（DEX）通过对PH值敏感的腙键连接形成前药，达到缓控释的作用。另外有研究显示高分子量的HPMA-药物轭合物优先在实体瘤部位蓄积，在健康的器官中很少检测到。而游离的药物则在肝脏、心脏、肺、脾脏和肾脏中都能大量检测到。所以，和游离的药物相比，将抗肿瘤药物和HPMA轭合可以大大降低药物对健康器官的毒副作用。进入到肿瘤组织后，聚合物药物在整个肿瘤组织的分布比较均匀，而少量进入到肿瘤组织的游离药物主要蓄积在血管内皮通透性大的部位。HPMA轭合的抗肿瘤药物可以突破现有的肿瘤细胞质膜上的泵出机制，防止反复化疗中出现的多药耐药性（multi-drug resistance，MDR）。而游离的小分子药物可以活化现有的多药耐药性，在长期治疗中还会引入新的多药耐药性。聚合物药物通过胞吞作用穿过细胞膜进入肿瘤细胞，这可以保护药物不被细胞代谢解毒酶破坏，保存其抗肿瘤活性。HPMA药物轭合物可以抑制细胞解毒酶的活性。而游离的小分子药物在大多数情况下可以激活细胞解毒酶的活性和抗氧化防御体系以及其他的非特异性的细胞防御机制。聚合物药物可以激活细胞凋亡蛋白酶，它可以激活细胞死亡的信号通道，引起细胞的凋亡和死亡。同时，小分子药物可以激活细胞凋亡的防御机制，HPMA药物轭合物可以抑制这种机制。HPMA和小分子药物的轭合物可以明显增强其抗肿瘤效果。但是，HPMA作为高分子药物载体存在如下不足：载体HPMA生物可降解性差；无法经肾排除，会在体内细胞及组织中蓄积，引起毒副作用。

在众多高分子材料中聚天冬氨酸生物相容性好，可自行降解、代谢。（PASP）属于聚氨基酸中的一类，是一种带有羧酸侧链的聚合氨基酸，是天冬氨酸单体的氨基和羧基缩水而成的聚合物，有α，β两种构型。天然的聚氨基酸中聚天冬氨酸片段都是以α型形式存在的，而合成的聚天冬氨酸中大部分是α，β两种构型的混合物。聚天冬氨酸因其结构主链上的肽键易受微生物、真菌等作用而断裂，最终降解产物是对环境无害的水和二氧化碳。而其在体内会被酶降解为小分子量寡肽，天冬氨酸单体，被人体吸收或者直接排除体外。1985年Williams等首次报道聚天冬氨酸对氨基糖甙类抗生素肾毒性具有保护作用，而不减低其抗菌活性，此后科学家陆续从生物化学、病理形态、功能改变等方面研究支持并肯定了这一论点。聚天冬氨酸是一种新型水溶性高分子，具有无毒和类蛋白结构特点，在药物缓释、药物载体等多方面得到了广泛的应用。

聚天冬氨酸通常有三种生产方法：第一种是L-天冬氨酸法。由L-天冬氨酸在一定条件下缩聚、水解、中和而成。第二种是马来酸酐法。马来酸酐的铵盐经缩聚、水解、中和制得聚天冬氨酸。第三种是由天冬氨酸单体在光气等脱水剂作用下得到NCA，NCA在特定条件下开环聚合，水解，中和得到大分子量的聚天冬氨酸。聚天冬氨酸的制备工艺简单，产率高，成本低，可大规模生产。

因此，我们选用聚天冬氨酸作为药物偶联物合成聚天冬氨酸-喜树碱衍生物前药，试图获得一种具有优良水溶性，稳定性，缓释作用，且低毒的喜树碱类抗癌前药TOP肽。

本发明提供了聚天冬氨酸前药，其含有与母体药物部分的羟基和/或氨基连接的酯键和/或酰胺键的前药部分。应当理解，适宜的母体药物可含有羟基或氨基之一，或者可同时含有羟基和氨基中的一种或多种。这些前药在水解时可以生成聚肽，低聚肽，寡肽和氨基酸单体，并且释放出活性母体药物。聚肽，低聚肽，寡肽可以被直接排出体外或继续降解为氨基酸单体，或被人体吸收，或排出体外。这些副产物，包括聚肽，低聚肽，寡肽，氨基酸单体，是在体内可降解或可吸收利用，因此预期不会产生未知或不利的作用。另外采用大分子与母体药物缩合所制备得到的抗癌前药，能够产生基于EPR的肿瘤被动靶向性，在肿瘤组织有显著的蓄积作用，而且多次给药并不影响它的分布。

发明内容

本发明提供了一种治疗实体肿瘤的聚氨基酸前药。该前药是有喜树碱衍生物与聚肽聚天冬氨酸经化学结合而构成，它是将活性药物母体以共价键的形式连接在聚天冬氨酸的侧链羧基上的聚合物，即，本发明多聚结合物亦可称为化合物。一种提高活性药物母体在水或缓冲或渗水溶液中的浓度，稳定性的方法。一种提高活性药物母体在较长时间内可控释放的方法。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种治疗实体肿瘤的聚氨基酸前药，其成分为聚天冬氨酸喜树碱衍生物缀合物。该聚肽缀合物具有良好的水溶性。喜树碱衍生物在水中的溶解性普遍很低，如SN-38几乎不溶于水，而将其结合到聚肽链上后，其水中溶解度可达到5mg/mL以上。

喜树碱衍生物结合在大分子聚氨基酸上，被氨基酸包裹，降低了外界环境对其E环内酯的影响，从而增加喜树碱衍生物的稳定性，直至其被降解为游离的活性药物母体。

喜树碱衍生物结合在大分子聚氨基酸上，可控的，持续的释放出活性药物母体。通过控制喜树碱衍生物与聚氨基酸的结合率，调整聚氨基酸分子的大小，达到控制活性药物母体——喜树碱衍生物的释放速度，使其浓度长时间保持在治疗窗内。

本发明中所述聚天冬氨酸或聚天门冬氨酸，包括聚-L-天冬氨酸，聚-D-天冬氨酸，聚-DL-天冬氨酸，如式3所示：

式3中n+m的范围为20～10000，包含20，10000；m/(n+m)的范围为0～1，包含0，1；当m/(n+m)不为0或1时，α单元和β单元无规则存在，单元以无规则的存在。按本发明所描述，其特征在于n+m的范围在40～1000，m/(n+m)的范围为0～0.9；优选于n+m的范围在50～500，m/(n+m)的范围为0～0.75；更优选于n+m的范围在50～300，m/(n+m)的范围为0～0.01；最优选于n+m的范围在50～300；m=0，z的范围为1～0.25n。n、m值由凝胶渗透色谱法测定，本领域技术人员懂得，当采用其他如粘度，光散射，折光指数，核磁等方法测定时，该数值可能不同。

对于聚天冬氨酸，其制备方法有很多。其合成路径主要分为PSI（polysuccinimide）水解和NCAs开环聚合。PSI水解分为3个步骤：1）由原料合成中间体聚琥珀亚酰胺（PSI）；2）PSI水解制取聚天冬氨酸盐；3）聚天冬氨酸盐的分离与纯化。NCAs开环聚合可分为3个步骤：1）有原料4-天冬氨酸酯脱水生成4-天冬氨酸酯NCAs；2）NCAs开环聚合得到聚天冬氨酸酯；3）聚天冬氨酸酯水解，中和，纯化得到聚天冬氨酸。由P SI水解制备聚天冬氨酸的工艺以工业化生产，以NCAs开环制备的聚天冬氨酸也可从市场购得，如DESAI CHEMICAL公司和Sigma-Aldrich公司。在本发明中，如未另外说明，所用的聚氨基酸是从市场购得的。

本发明中的缀合物，其活性药物母体的结合率，即酰胺键和/或酯键连接到聚氨基酸的药物母体的结合率介于5%～60%，优选于10%～50%，更优选于15%～40%，更优选于20%～30%。

本发明任一实施方案的聚天冬氨酸缀合物，其中所述活性药物母体是选自下列喜树碱衍生物：伊立替康（lrinotecan，CPT-11）、拓扑替康（Topotecan，TPT）、SN-38、10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecin，HCPT）、喜树碱、贝洛替康（CKD-602）、9-氨基喜树碱（9-aminocamptothecin，9-AC）、9-硝基喜树碱（Rubitecan）、鲁托替康（GG-2ll，Lurtotecan）、DX-8951f（Exatecan）、Gimatecan（ST-1481）、Karenitecin（BNP-1350）、BN80915、BN-80927、DB-67。

众所周知，伊立替康已载入诸多国家的药品标准并且可以容易地从市场购得，其具有如下结构式、分子式和分子量：

例如在2010年版中国药典中记载其为（+）-4,11-二乙基-4-羟基-9[（4-哌啶基哌啶）羰基]-1H吡喃并[3，4，6，7]吲哚嗪[1,2b]喹啉-3,14-（4H-12H）-二酮盐酸盐三水合物。典型地，伊立替康20位羟基在缩合反应中与本发明中的大分子聚合物的羧基通过缩合剂脱水形成酯键而形成多聚缀合物。

另外，已知拓扑替康（托泊替康，Topotecan，Hycamtin）2005年版中国药典，并且其具有如下结构式：

典型地，拓扑替康包含有20位和10位羟基，这两类羟基均可在缩合反应中与本发明中的大分子聚合物的羧基通过缩合剂脱水形成酯键而形成多聚缀合物。且可通过本领域众所周知的方法得到单一的20位和/或10位键合的多聚缀合物。

另外，已知SN-38（CAS No.86639-52-3）作为伊立替康代谢的体内代谢产物已被广泛研究，其抗癌活性已众所周知，但其副作用太大而阻碍了其临床应用。其具有的结构是如下：

典型地，SN-38亦包括类似于拓扑替康特征的10位和20位羟基，这两类羟基均可在缩合反应中与本发明中的大分子聚合物的羧基通过缩合剂脱水形成酯键而形成多聚缀合物。且可通过本领域众所周知的方法得到单一的20位和/或10位键合的多聚缀合物。

另外，10-羟基喜树碱（CAS No.19685-09-7）其具有的结构是如下：

典型地，10-羟基喜树碱亦包括类似于拓扑替康特征的10位和20位羟基，这两类羟基均可在缩合反应中与本发明中的大分子聚合物的羧基通过缩合剂脱水形成酯键而形成多聚缀合物。且可通过本领域众所周知的方法得到单一的20位和/或10位键合的多聚缀合物。

另外，喜树碱（CAS No.7689-03-4）其具有的结构是如下：

典型地，喜树碱亦包括类似于伊立替康特征的20位羟基，20位羟基可在缩合反应中与本发明中的大分子聚合物的羧基通过缩合剂脱水形成酯键而形成多聚缀合物。

另外，9-氨基喜树碱（CAS No.91421-43-1）其具有的结构是如下：

典型地，9-氨基喜树碱包括20位羟基和9位的氨基，20位羟基和9位氨基均可在缩合反应中与本发明中的大分子聚合物的羧基通过缩合剂脱水分别形成酯键和酰胺键而形成多聚缀合物。且可通过本领域众所周知的方法得到单一的20位和/或9位键合的多聚缀合物。

另外，呃洛替康（BN-80927CAS No.220998-10-7）其具有的结构是如下：

典型地，呃洛替康包括20位羟基，20位羟基可在缩合反应中与本发明中的大分子聚合物的羧基通过缩合剂脱水分别形成酯键而形成多聚缀合物。

本发明任一实施方案中的缀合物，其活性药物母体是通过9位的氨基和/或10位的羟基和/或20位的羟基和或其它位置的活性基团通过共价键结合在聚天冬氨酸支链上。

本发明提供了制备本发明所述多聚结合物的方法，其中包括以下步骤：将带有羟基或氨基的活性药物母体与聚天冬氨酸溶解在DMSO或其他有机溶剂中，在恒温浴条件下加入缩合剂，适量的有机碱，搅拌并升温，直至反应进行完全，随后加入过量的弱碱液（碳酸氢钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾），优选10～30%的碳酸氢钠溶液，过滤，除去不溶于水的副产物以及未反应的活性药物母体，分别用稀的碳酸氢钠溶液，纯水透析纯化，冷冻干燥，得到固体结合物。

本发名提供的制备方法中所述的有机溶剂，例如但不限于二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）、N-甲基吡咯烷酮（NMP）。

本发名提供的制备方法中所述的缩合剂是二环己基碳二亚胺(DCC)，1，3-二异丙基碳二亚胺(DIPC)，N-乙基-N`-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDCI），2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）。缩合剂的量通常是活性药物母体摩尔量的1～4倍。

本发名提供的制备方法中所述的有机碱是4-(二甲氨基)吡啶(DMAP)，N,N二异丙基乙胺（DIEA），4-甲基吗啉（NMM），吡啶（Py）。有机碱的量通常是活性药物母体摩尔量的0.2～4倍。

本发明提供的制备方法中所述的反应温度在-25℃～80℃，优选于-5℃～50℃，更优选于5℃～35℃。所选用温度取决于反应底物的活性以及稳定性。

本领域技术人员已知的可以使本发明活性药物与所述大分子聚合物通过化学键结合的其它方法亦可用于本发明。

在制备本发明物质的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。本发明反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以作适当改变的。

本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

图1：两性霉素B紫外-可见光的光谱扫描图。

缀合物在PBS(pH=7.4)中的释药曲线。

具体实施方式

下面通过具体的制备实例和试验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些例子仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

测试活性药物母体与聚氨基酸结合率的方法：

采用紫外-可见分光光度法，通过紫外-可见分光光度计测定活性药物母体的紫外最大吸收波长，根据此数据确定出最佳波长，建立活性药物母体的标准曲线。通过测定活聚氨基酸活性药物母体缀合物的紫外吸收度，并从活性药物母体的标准曲线计算出活性药物母体的含量。典型的如SN-38，在381nm波长下进行测定。

聚氨基酸活性药物母体缀合物的制备例部分

制备例1.SN-38—聚天门冬氨酸缀合物（10位缀合物）的制备

合成步骤：在干燥的氮气保护条件下，将聚天门冬氨酸3.32g(分子量25000Da)，SN-380.98g(2.5mmol)加到30mL无水二甲基亚砜（DMSO）中，搅拌使之全部溶解。随后将0.62g（3mmol）的二环己基碳二亚胺（DCC）和0.31g（2.5mmol）的4-(二甲氨基)吡啶加入上述反应溶液中，在(25-35℃)条件下，搅拌17小时。将100ml的2N的碳酸氢钠溶液加入到上述反应溶液中，搅拌60分钟，过滤，滤液倒入透析袋中，用去离子水透析33小时后，将所得溶液冻干，得黄色絮状固体SN-38—聚天门冬氨酸缀合物（10位缀合物）3.12g，经测定，SN-38含量为17.5%。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ11.89（br，-COOH），δ8.62（br，-NH），δ6.64-7.89（m，SN-38的芳香氢），δ5.53（m），δ4.86-5.13（m，聚合物链上的-CH），δ2.62-2.91（聚合物支链上-CH₂），δ1.86-2.15（m），δ0.9-1.2（m）。

制备例2.拓扑替康—聚天门冬氨酸缀合物（10位缀合物）的制备

合成步骤：在干燥的氮气保护条件下，将聚天门冬氨酸3.35g(分子量25000Da)，拓扑替康1.6g(3.8mmol)加到35mL无水二甲基亚砜（DMSO）中，搅拌使之全部溶解。随后将0.94g（4.56mmol）的二环己基碳二亚胺（DCC）和0.56g（4.56mmol）的4-(二甲氨基)吡啶加入上述反应溶液中，在(30-35℃)条件下，搅拌19小时。将120ml的2N碳酸氢钠溶液加入到上述反应溶液中，搅拌60分钟，过滤，滤液倒入透析袋中，用去离子水透析33小时后，将所得溶液冻干，得黄色絮状固体拓扑替康—聚天门冬氨酸缀合物（10位缀合物）3.3g，经测定，拓扑替康含量为25.5%。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ12.1（br，-COOH），δ8.58（br，-NH），δ6.56-7.93（m，拓扑替康的芳香氢），δ5.52（m），δ4.81-5.15（m，聚合物链上的-CH），δ4.29-4.4（m），δ2.59-2.89（聚合物支链上-CH₂），δ1.89-2.11（m），δ0.93-1.2（m）。

制备例3.伊立替康—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）的制备

合成步骤：在干燥的氮气保护条件下，将聚天门冬氨酸3.34g(分子量25000Da)，盐酸伊立替康2.1g(3.6mmol)加到30mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌，加入三乙胺（TEA）使之全部溶解。随后将1.48g（7.16mmol）的二环己基碳二亚胺（DCC）和0.09g（0.7mmol）的4-(二甲氨基)吡啶加入上述反应溶液中，在(20-30℃)条件下，搅拌19小时。将100ml的2N碳酸氢钠溶液加入到上述反应溶液中，搅拌60分钟，过滤，滤液倒入透析袋中，用去离子水透析33小时后，将所得溶液冻干，得黄色絮状固体伊立替康—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）3.3g，经测定，伊立替康含量为22.5%。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ11.9（br，-COOH），δ8.55（br，-NH），δ6.52-7.89（m，伊立替康的芳香氢），δ4.02-5.15（m，聚合物链上的-CH），δ4.25-4.61（m），δ3.21-3.66（m），δ2.59-2.89（聚合物支链上-CH₂），δ1.87-2.12（m），δ0.91-1.22（m）。

制备例4.SN-38—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）的制备

制备10-O-Boc-SN-38：将5.9g（15mmol）SN-38悬浮于150mL1,2-二氯乙烷中，搅拌状态下加入4.9g（22.6mmol）二碳酸叔丁酯和3.6g（45mmol）吡啶。悬浮液在30-35℃搅拌21小时，过滤，滤液用80mL1N的盐酸溶液洗涤2次，用80mL饱和碳酸钠溶液洗涤1次，并用无水硫酸钠干燥，在30-35℃下，真空旋出1,2-二氯乙烷，真空干燥得黄色粉末状固体10-O-Boc-SN-385.8g。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ8.21（1H，d），δ7.83（1H，d），δ7.66（1H，S），δ7.61（1H，dd），δ5.71（1H，d），δ5.22（1H，d），δ5.19（2H，s），δ4.37（1H，s），δ3.10（2H，m），δ1.85（2H，m），δ1.59（9H，s），δ1.39（3H，t），δ0.98（3H，t）。

制备10-O-Boc-SN-38—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）：在干燥的氮气保护条件下，将聚天门冬氨酸3.35g(分子量25000Da)，10-O-Boc-SN-382.0g(4.1mmol)加到30mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌，使之全部溶解。随后将2.5g（12.2mmol）的二环己基碳二亚胺（DCC）和1.0g（8mmol）的4-(二甲氨基)吡啶加入上述反应溶液中，在（20～30℃）条件下，搅拌22小时。将100ml的2N碳酸氢钠溶液加入到上述反应溶液中，搅拌60分钟，过滤，滤液倒入透析袋中，用去离子水透析33小时后，将所得溶液冻干，得黄色絮状固体10-O-Boc-SN-38—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）3.5g。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ11.87（br，-COOH），δ8.65（br，-NH），δ6.64-7.91（m，Boc-SN-38的芳香氢），δ5.52（m），δ4.86-5.23（m，聚合物链上的-CH），δ2.63-3.09（聚合物支链上-CH₂），δ1.84-2.17（m），δ0.92-1.22（m）。

制备SN-38—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）：在干燥的氮气保护条件下，将3.3g10-O-Boc-SN-38—聚天门冬氨酸缀合物悬浮于150mL无水二氯甲烷中，在0～5℃加入无水三氟乙酸30mL，升高温度至20～30℃搅拌7小时，在低于35℃条件下真空旋出溶剂，剩余物溶解于25mL2N的碳酸钠溶液中，搅拌60分钟，过滤，滤液倒入透析袋中，用去离子水透析33小时，所得溶液经冷冻干燥机干燥的黄色絮状固体SN-38—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）2.5g，经检测SN-38含量为25%。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ11.87（br，-COOH），δ8.66（br，-NH），δ6.62-7.93（m，SN-38的芳香氢），4.32-5.25（m，聚合物链上的-CH），δ2.59-3.39（聚合物支链上-CH₂），δ1.81-2.23（m），δ0.89-1.23（m）。

制备例5.9-氨基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）的制备

制备N-Boc-9-氨基喜树碱：将5.5g（15mmol）9-氨基喜树碱悬浮于150mL二氯甲烷中，搅拌状态下加入5.0g（22.7mmol）二碳酸叔丁酯和3.6g（45mmol）吡啶。悬浮液在 30-35℃搅拌19小时，过滤，滤液用100mL1N的盐酸溶液洗涤2次，用100mL饱和碳酸钠溶液洗涤1次，并用无水硫酸钠干燥，在30-35℃下，真空旋出二氯甲烷，真空干燥得黄色粉末状固体N-Boc-9-氨基喜树碱4.9g。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ8.32（1H，d），δ7.83（1H，s），δ7.61（1H，m），δ7.49（1H，d），δ6.81（1H，s），δ6.71（1H，s），δ5.09（2H，s），δ4.74（2H，s），δ4.47（1H，s），δ1.85（2H，m），δ1.53（9H，s），δ0.98（3H，t）。

制备N-Boc-9-氨基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）：在干燥的氮气保护条件下，将聚天门冬氨酸3.35g(分子量25000Da)，N-Boc-9-氨基喜树碱2.3g(5.0mmol)加到30mL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，搅拌，使之全部溶解。随后将3.1g（15mmol）的二环己基碳二亚胺（DCC）和1.2g（10mmol）的4-(二甲氨基)吡啶加入上述反应溶液中，在（20～35℃）条件下，搅拌25小时。将100ml的2N碳酸氢钠溶液加入到上述反应溶液中，搅拌60分钟，过滤，滤液倒入透析袋中，用去离子水透析33小时后，将所得溶液用冷冻干燥机冻干，得黄色絮状固体N-Boc-9-氨基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物3.1g。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ11.86（br，-COOH），δ8.63（br，-NH），δ6.64-7.91（m，N-Boc-9-氨基喜树碱的芳香氢），δ5.52（m），δ4.83-5.21（m，聚合物链上的-CH），δ2.61-3.07（聚合物支链上-CH₂），δ1.74-2.11（m），δ0.92-1.39（m）。

制备9-氨基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）：在干燥的氮气保护条件下，将2.7g N-Boc-9-氨基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）悬浮于150mL无水二氯甲烷中，在0～5℃加入无水三氟乙酸30mL，升高温度至20～30℃搅拌7小时，在低于35℃条件下真空旋出溶剂，剩余物溶解于25mL2N的碳酸钠溶液中，搅拌60分钟，过滤，滤液倒入透析袋中，用去离子水透析35小时，所得溶液经冷冻干燥机干燥的黄色絮状固体9-氨基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）2.1g，经检测9-氨基喜树碱含量为24.6%。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ11.86（br，-COOH），δ8.62（br，-NH），δ6.65-7.89（m，9-氨基喜树碱的芳香氢），δ5.51（m），δ4.82-5.22（m，聚合物链上的-CH），δ2.63-3.05（聚合物支链上-CH₂），δ1.74-2.11（m），δ0.91-1.29（m）。

制备例6.喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）的制备

参考制备例1的方法，但是活性药物母体改用喜树碱进行，得黄色絮状固体喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）2.3g。所得产物经测定，活性药物母体喜树碱含量=21.3%(w/w)。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ12.03（br，-COOH），δ8.86（br，-NH），δ6.61-7.79（m，喜树碱的芳香氢），δ5.56（m），δ4.81-5.29（m，聚合物链上的-CH），δ2.59-3.01（聚合物支链上-CH₂），δ1.74-2.01（m），δ0.91-1.19（m）。

制备例7.（20S）-9-硝基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）的制备

参考制备例3的方法，但是活性药物母体改用9-硝基喜树碱进行，得黄色絮状固体9-硝基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）2.3g。所得产物经测定，活性药物母体喜树碱含量为22.7%(w/w)。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ12.01（br，-COOH），δ8.84（br，-NH），δ6.59-7.69（m，喜树碱的芳香氢），δ5.46（m），δ4.81-5.27（m，聚合物链上的-CH），δ2.59-3.01（聚合物支链上-CH₂），δ1.71-2.01（m），δ0.90-1.17（m）。

制备例8.（20S）-10-羟基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（10位缀合物）的制备

参考制备例1的方法，但是活性药物母体改用10-羟基喜树碱进行，得黄色絮状固体10-羟基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（10位缀合物）2.6g。所得产物经测定，活性药物母体喜树碱含量为27.1%(w/w)。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ11.98（br，-COOH），δ8.84（br，-NH），δ6.71-7.89（m，10-羟基喜树碱的芳香氢），δ5.51（m），δ4.83-5.29（m，聚合物链上的-CH），δ2.61-3.00（聚合物支链上-CH₂），δ1.74-2.03（m），δ0.90-1.15（m）。

制备例9.（20S）-9-氨基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（9位缀合物）的制备

参考制备例1的方法，但是活性药物母体改用9-氨基喜树碱进行，得黄色絮状固体9-氨基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（9位缀合物）1.9g。所得产物经测定，活性药物母体9-氨基喜树碱含量为24.5%(w/w)。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ11.92（br，-COOH），δ8.63（br，-NH），δ6.54-8.02（m，9-氨基喜树碱的芳香氢），δ5.57（m），δ4.81-5.26（m，聚合物链上的-CH），δ2.61-3.15（聚合物支链上-CH₂），δ1.69-2.12（m），δ0.90-1.29（m）。

制备例10.拓扑替康—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）的制备

参考制备例4的方法，但是活性药物母体改用拓扑替康进行，得黄色絮状固体拓扑替康—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）1.9g。所得产物经测定，活性药物母体拓扑替康含量为25.5%(w/w)。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ12.1（br，-COOH），δ8.57（br，-NH），δ6.54-7.91（m，拓扑替康的芳香氢），δ5.51（m），δ4.83-5.12（m，聚合物链上的-CH），δ4.27-4.4（m），δ2.58-2.91（聚合物支链上-CH₂），δ1.93-2.31（m），δ0.97-1.22（m）。

制备例11.（20S）-10-羟基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）的制备

参考制备例4的方法，但是活性药物母体改用10-羟基喜树碱进行，得黄色絮状固体10-羟基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）1.7g。所得产物经测定，活性药物母体喜树碱含量为25.7%(w/w)。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ12.02（br，-COOH），δ8.84（br，-NH），δ6.67-7.85（m，10-羟基喜树碱的芳香氢），δ5.51（m），δ4.79-5.25（m，聚合物链上的-CH），δ2.52-2.97（聚合物支链上-CH₂），δ1.80-2.03（m），δ0.91-1.17（m）。

制备例12.（20S）-7-（二甲基-叔丁基硅）-10-羟基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）的制备

参考制备例4的方法，但是活性药物母体改用（20S）-7-（二甲基-叔丁基硅）-10-羟基喜树碱进行，得黄色絮状固体（20S）-7-（二甲基-叔丁基硅）10-羟基喜树碱—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）1.7g。所得产物经测定，活性药物母体喜树碱含量为25.7%(w/w)。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ12.02（br，-COOH），δ8.81（br，-NH），δ6.64-7.75（m，芳香氢），δ5.53（m），δ4.77-5.25（m，聚合物链上的-CH），δ2.51-2.96（聚合物支链上-CH₂），δ1.81-2.02（m），0.91-1.17（m），δ0.32（s）。

制备例13.SN-38—聚天门冬氨酸缀合物（10位缀合物）的制备

参考制备例1的方法，但是聚天冬氨酸改为分子量为60000Da进行，得黄色絮状固体SN-38—聚天门冬氨酸缀合物（20位缀合物）1.9g。所得产物经测定，活性药物母体喜树碱含量为21.5%(w/w)。

¹HNMR（400MHz，DMSO-D6）δ11.88（br，-COOH），δ8.61（br，-NH），δ6.64-7.89（m，SN-38的芳香氢），δ5.51（m），δ4.85-5.13（m，聚合物链上的-CH），δ2.62-2.95（聚合物支链上-CH₂），δ1.85-2.15（m），δ0.9-1.2（m）。

试验部分

测试本发明缀合物的溶解性

以水为溶剂，在室温(22～25℃)下测定本发明所制备的缀合物溶解度。经测定，制备例1～12中所制备的化合物溶解度均大于5mg/mL，换算为活性药物母体，其溶解度均大于1mg/mL。而游离的药物母体在水中的溶解度均很小，如SN-38，其在水中溶解度位10ug/mL。制备例13中所制备化合物则在5mg/mL时称水凝胶状。

喜树碱类-聚天冬氨酸缀合物体外释放试验

精确称取三份10mg喜树碱类-聚天冬氨酸缀合物并装入三个透析袋内（MWCO8000），各加入10mL0.1M的磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4），夹紧后将其分别放置于200mL0.1M的PBS（pH=7.4）中，在37.0±0.5℃恒温，100rpm搅拌条件下，定时取样2mL，并立即补加相同体积的释药介质。样品在特定波长（如SN-38在381nm）处测定吸光度，根据标准曲线得到活性药物母体的浓度，计算释放量，取其平均值，实验结果见图1.

在喜树碱类-聚天冬氨酸缀合物体外试验中发现，除了9-氨基喜树碱9位天冬氨酸缀合物外，其余缀合物在PBS（pH=7.4）中均可释放出活性母体药物，在6-8小时时间内可以释放出50%以上的活性药物母体。而9-氨基喜树碱9位缀合物在释放体系中释放量基本为0，说明在该条件下，9-氨基喜树碱9位缀合物很稳定，其原因在于9-氨基喜树碱是通过酰胺键与聚天冬氨酸相结合的缀合物，酰胺键在PSB（pH=7.4）甚至更强的碱性条件下可以较稳定存在。而动物体内含有大量的酯水解酶以及肽水解酶，可以预见，通过控制活性药物母体与聚天冬氨酸的结合率以及给药量，可以较长时间的、智能的、有效的控制喜树碱—天冬氨酸缀合物在动物体内释放，使药物在动物体内的浓度能较长时间的平稳的保持治疗在治疗窗范围内。

Claims

1.通式的喜树碱衍生物的聚氨基酸缀合物的酸或其盐。

其中X为O或者N；R为喜树碱衍生物残基A、碱金属B、H，；其中喜树碱衍生物残基A的个数z的范围为1～n+m，z+（碱金属B的个数）+（H的个数）=n+m；n+m的范围为20～10000，包含20，10000；m/(n+m)的范围为0～1，包含0，1；当m/(n+m)不为0或1时，（NHCHCO）单元和（NHCHCH2CO）单元以无规则的存在。

2.根据权利要求1的多聚缀合物，其特征在于n+m的范围在40～1000；m/(n+m)的范围为0～0.9。

3.根据权利要求2的多聚缀合物，其特征在于n+m的范围在50～500；m/(n+m)的范围为0～0.75。

4.根据权利要求3的多聚缀合物，其特征在于n+m的范围在50～300；m/(n+m)的范围为0～0.01。

5.根据权利要求4的多聚缀合物，其特征在于n+m的范围在50～300；m=0，z的范围为1～0.25n。

6.根据权利要求5的多聚缀合物，喜树碱衍生物占结合物重量范围为5%～60%；喜树碱衍生物占结合物重量范围优选于10%～50%；喜树碱衍生物占结合物重量范围为15%～40%；喜树碱衍生物占结合物重量范围更优选于20%～30%。

7.根据权利要求1的多聚缀合物，其中所述聚氨基酸为聚天冬氨酸。

8.根据权利要求7的多聚结合物，其中所述聚天冬氨酸由单体D型天冬氨酸，L型天冬氨酸，DL型天冬氨酸或其他已知原料及方法聚合而成。

9.根据权利要求1的多聚缀合物，其中所述的喜树碱衍生物选自拓扑替康，伊立替康，10-羟基喜树碱，SN-38。

10.制备权利要求1-6任一项所述多聚缀合物的方法，其中包括以下步骤：

i)使聚天冬氨酸与喜树碱衍生物溶于反应溶剂，在缩合剂的作用下通过聚天冬氨酸的羧基与喜树碱衍生物的羟基或氨基形成酯键或酰胺键，将喜树碱衍生物结合到聚天冬氨酸上。

ii)将反应混合液转入二氯甲烷与饱和碳酸氢钠溶液的混合溶液中，除去未反应的小分子杂质。

iii)透析除去溶剂及小分子杂质，收集多聚缀合物。

iv)分离提取所得多聚缀合物。

11.一种药物组合物，它包含抗肿瘤和/或抗白血病有效量的权利要求1-6任一项多聚缀合物或其可药用盐以及任选的药学可接受的辅料和/或稀释剂。