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CN104717968A - 含铁的营养补充剂 - Google Patents

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CN104717968A
CN104717968A CN201380047237.9A CN201380047237A CN104717968A CN 104717968 A CN104717968 A CN 104717968A CN 201380047237 A CN201380047237 A CN 201380047237A CN 104717968 A CN104717968 A CN 104717968A
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fungal
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J·布鲁斯·威金
边依林
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Abstract

描述了一种含有具有至少100mg/kg铁的真菌生物质的营养补充剂和利用丝状真菌生产该营养补充剂的方法。

Description

含铁的营养补充剂
技术领域
本技术涉及含铁的营养补充剂和利用丝状真菌制备该补充剂的方法。
背景技术
基于世界卫生组织(WHO)关于全球贫血症的报告，“贫血症是一个影响贫富国家人口的公共卫生问题”，特别是对于孕妇、育龄非孕妇女和学龄前儿童。贫血症发作的最重要促成因素是缺铁性贫血(IDA)。据估计有超过10亿人(约占全球人口的15％)患有IDA。此外，还有10亿人患有铁缺乏症(ID)或铁耗尽症。
在全球范围内，近三十年来IDA的患病率保持不变或者略微增长。虽然其他营养不良病症的患病率逐渐下降，但是ID和IDA以及相关的不利作用持续存在。
铁对于大多数生命是必需的，因为它是构成维持良好健康的很多蛋白质和酶的不可缺少的一部分。在人体中，铁是参与氧运输、细胞生长和其他功能的红细胞的必要组分。一般地，ID限制对细胞的氧输送，导致疲劳、较差的工作表现和降低的疾病免疫力。但是对于0-5岁的儿童，ID损伤身体和认知发育，并可以持续到成年。在妊娠期，IDA可导致20-30％的孕产妇死亡、早产和新生儿夭折。
目前，WHO建议从四个主要方面去努力对抗ID/IDA：食品强化、补充、教育和新型植物育种方案。强化和补充策略通常对给定人群的ID/IDA问题有快速和直接的影响。
在人的营养应用中，有三种主要类型的铁，它们被列举在表1中。血红素铁和非血红素铁均来源于食物来源。然而，非血红素铁，大多来自谷类和豆类，因为肌醇六磷酸盐含量高而不易被吸收。除了改善总体营养，对抗ID/IDA的主要任务在于食品中铁的补充和强化，特别是对于血红素铁来源稀缺的发展中国家而言。
表1.人体营养应用中被视为重要的主要类型的铁
可溶性的铁盐化合物，如高度可吸收的硫酸亚铁，作为铁补充剂是期望的，但是由于感观问题不能用于多种强化食品中。其他形式如富马酸亚铁可以被微胶囊化并添加到半流质食品中，但是成本显著更高。食品的铁强化是向世界各地区提供铁的优选方法。有多种类型的铁产品被应用到强化食品中，成功的形式包括含抗坏血酸的硫酸亚铁或NAFeEDTA强化的鱼露和酱油。然而，强化对ID患病率在人口水平上的影响还未被成功证明。其中一个原因是食品载体(food delivery vehicles)例如谷类面粉中的铁增强剂与铁抑制剂的较量。与碘和维生素A相比，铁强化和补充需要不同的产品来适应多种食品体系。因此，需要更多的有机形式的非血红素铁产品来满足多种多样的饮食情况的需求。
在US 8,481,295(van Leeuwen)中，在玉米-乙醇干式碾磨生产工厂，将丝状真菌在醇发酵酒糟(stillage)上培养以除去有机废料，用于水循环，并得到真菌生物质用于动物饲料和其他用途。这些真菌生物质含铁量低，且不足以用作矿物质补充剂。因为现有的玉米-乙醇干式碾磨生产是工业生产方法而不是食品加工方法，真菌生物质未被美国食品及药物管理局(FDA)批准用于直接供人消耗(human consumption)。
本申请发明人现已发现可在农业副产品或食品加工副产品上培养丝状真菌，并采收(harvest)该丝状真菌以获得含铁量高的营养产品。
发明内容
公开了含铁的营养补充剂和形成含铁的营养补充剂的方法。
在一个实施方案中，提供了一种营养补剂，其包含：
含有至少约100mg/kg的铁的真菌生物质。
优选地，营养补充剂包含约200到40000mg/kg的铁。
含铁的营养补充剂可以包括稀释剂或其他共成分(co-ingredients)如硒和锌。例如，补充剂可以包含10到400mg/kg的硒；和20到20,000mg/kg的锌。
含铁的营养补充剂的形式可以被配制成粉剂、溶液、饮剂(drink)、胶囊、片剂、囊片。也可以将粉末形式的产品添加到食品中，并用作食品强化成分。食品的强化包括但不限于调味品、盐、婴幼儿配方、以及小麦粉、玉米粉和豆粉。
营养补充剂的一个优点是它含有来源于副产品的天然有机铁。营养补充剂可以被配制成进一步含有由丝状真菌天然产生的肌醇六磷酸酶和其他酶。
营养补充剂可以含有在丝状真菌的生长过程中添加的额外的无机铁盐或其他含铁量高的化合物。实例包括硫酸亚铁、富马酸亚铁、柠檬酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸亚铁和EDTA铁。
在一个实施方案中，提供一种形成含铁的营养补充剂的方法，该方法包括：
在农业副产品或食品加工副产品中培养丝状真菌，以在丝状真菌中聚积存在于农业副产品或食品加工副产品中的铁；和
采收丝状真菌，以得到含有具有至少100mg/kg铁的真菌生物质的营养补充剂。
优选地，丝状真菌选自米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillusniger)。
农业副产品可以来自来源于玉米、小麦、甜菜、蔗糖、大豆的废料，醇生产的酒糟和固体废料。这些产品的实例为甘蔗和甜菜浆、大豆皮、大豆加工乳清、麦壳、谷物渣(spent grain)和酒糟。优选地，农业副产品是浓缩玉米可溶物(condensed corn soluble)(糖浆(Syrup))，玉米、小麦和大豆的加工副产品。更优选地，农业副产品是糖浆。
优选地，食品加工副产品选自玉米浸出液、玉米酒糟、大豆乳清、甘蔗和甜菜糖蜜(molasses)、大豆皮、麦麸和麦壳。
可以向农业副产品或食品加工副产品提供额外的生长培养基，以在培养过程中辅助丝状真菌生长和聚积铁。
可以在丝状真菌的生长过程中添加额外的无机铁盐和其他高铁含量的化合物如硫酸铁、硫酸亚铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸亚铁，但不限于这些盐，以进一步增加营养补充剂中的铁含量。
营养补充剂可以进一步包含其他矿物质如硒和锌或其他矿物质如镁、钙和铬。为实现进一步的矿物质补充，可向培养物添加硒和锌化合物。适合的化合物包括亚硒酸钠、硫酸锌、硫酸钙、氯化铬和硫酸镁。
营养补充剂可以进一步包括硒和锌。优选地，营养补充剂包含10到400mg/kg的硒；和20到20,000mg/kg的锌。
可以提供额外的培养基或营养物来帮助丝状真菌的生长。实例包括酵母提取物、铵盐、尿素和钾磷(potassium phosphorus)。
可以在任何适宜的环境如固体和液体发酵都使用的发酵容器中培养丝状真菌。
丝状真菌的培养可以在室温或升高的温度如25到55℃下进行。
可以通过任何适宜的手段采收丝状真菌。实例包括过滤，如压滤机、压带机；离心，如滗析器；干燥，如旋转式干燥器、蒸汽干燥器。干燥温度通常低于约90℃，以避免产品受到任何不想要的高温破坏。
采收的丝状真菌可以经进一步加工以形成含铁的营养补充剂。进一步的加工包括分离、压碎、研磨、分馏、提取、冷热水洗涤以除去多余的盐或者用pH为2的弱酸或pH为9-10的碱洗涤以除去其他可溶性化合物。
营养补充剂包含至少约200mg/kg的铁。优选地，营养补充剂包含约200到40000mg/kg的铁。铁含量可以高于40000mg/kg，但是真菌生物质的产率可能会降低，并可能在实践中并不经济。
含铁的营养补充剂可以包括稀释剂或其他共成分如硒和锌。例如，补充剂可以包含10到400mg/kg的硒；和20到20,000mg/kg的锌。
营养补充剂可以含有在丝状真菌的生长过程中添加的额外的无机铁盐或其他高铁化合物。实例包括硫酸亚铁、富马酸亚铁、柠檬酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸亚铁和EDTA铁。
营养补充剂可以被配制成人用或动物用。
在另一实施方案中，该技术涉及通过所述的方法生产的含铁的营养补充剂。
在又一实施方案中，该技术涉及源于在农业副产品或食品加工副产品中培养的丝状真菌或由该丝状真菌得到的含铁的营养补充剂。
在整个说明书中，除非文中另有要求，词语“包括”，或变化形式如“包含”或者“含有”，应被理解为意指包含所述的要素、整体或步骤或者要素组、整体组或步骤组，但不排除任何其他要素、整体或步骤或者要素组、整体组或步骤组。
本说明书中包含的文献、动作、材料、器件、文章等的任何论述都仅用于为本发明提供上下文的目的。虽然其在本说明书的每项权利要求的优先权日期之前存在，但这并不是承认这些事项中的任何或全部事项形成现有技术基础的一部分或者是与本发明相关的领域中的公知常识。
为了可以更清楚地理解本发明的技术，将参照以下附图和实施例描述优选的实施方案。
附图说明
图1是本发明技术的一个优选方法的示意图。
图2是本发明技术的另一个优选方法的示意图。
图3显示添加无机铁盐对真菌生物质的铁含量的影响的结果。
图4显示Caco-2细胞铁蛋白形成按硫酸亚铁的百分数表示的结果。
具体实施方式
已报道酵母在含有FeSO4的酵母提取物蛋白胨葡萄糖(YEPD)板上聚积很多微量元素，包括铁。某些酵母菌株可以摄取每克细胞25mg的铁，且高达95％的这种铁被认为是细胞结构中的有机形式。富集铁的酵母生物质可被用作动物饲料补充剂，且被认为比铁盐毒性小。在其他非酵母菌丝体形成的真菌中，Fe3+、Fe2+、Mg2+和Zn2+可以刺激葡聚糖的形成。然而，利用丝状真菌生产富集铁的产品还尚未付诸实践。本申请发明人认识到现有技术和酵母的铁富集之间的根本差别在于：当天然来源如农业和食品加工废料和副产品用作生长培养基时，丝状真菌如米曲霉具有从这样的废料和副产品中聚积有机铁的能力，而无需采用铁强化。存在许多具有公认安全(GRAS)状态的丝状真菌，如米曲霉和黑曲霉，它们能用于富含铁和富集铁的产品的生产中。另一个优点是丝状真菌产品与酵母产品相比没有异味。
农业副产品的选择和预处理
农业和食品加工产生很多副产品，但是它们并不是全都天然地富含铁。表2列举了北美洲的一些富含铁的农业副产品，它们可以用于生产富含铁的真菌产品。其他副产品如麦麸和麦壳、米壳、高粱壳和土豆皮也具有潜力。
表2.各种农业加工副产品的铁含量
副产品 来源 铁含量，mg/kg或L
酒糟或糖浆 玉米-乙醇，干式碾磨 138(基于干重)
蔗糖蜜 甘蔗加工 249(平均值)
甜菜糖蜜 甜菜加工 117(平均值)
柑橘糖蜜 柑橘汁加工 400
大豆皮 大豆加工 180-390
尽管一些副产品被认为是富含铁的材料，很多并不适合直接供人消耗。谷物副产品中的大部分铁被肌醇六磷酸盐结合，因此，人类无法生物利用天然铁。可充分理解使用肌醇六磷酸酶来改进这些产品中的铁的生物利用度，但是基于改进人体中的铁状态直接使用的日需求量太大。本发明技术涉及使用所选的真菌种类作为将铁浓缩成适合供动物或人消耗的有机形式的手段。
在任何副产品可以用于铁-真菌产品的生产之前，优选地进行微生物腐败、霉菌毒素和重金属污染的检测。对于液体原材料，有必要进行稀释，因为用于真菌种类如米曲霉和黑曲霉的液体发酵的最佳总固体为约3-10％。可以对干的原材料进行研磨、浸泡或蒸煮(cooked)来释放天然铁和减少抗发酵因子。为了辅助天然铁从原材料中释放，可以在浸泡和蒸煮过程中使用酶，如纤维素酶、半纤维素酶和肌醇六磷酸酶。根据可用性和定价，可以同时使用多种原材料。
方法
利用农业副产品或食品加工副产品的优选方法的一般步骤在图1中阐述。
真菌菌株
使用的米曲霉菌株是与批准和商业应用于酱油和味噌生产的菌株相同的菌株，包括米曲霉2355和40151，来自中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；米曲霉22787，来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)；用于柠檬酸生产的黑曲霉变种(Aspergillus niger var.)2206和10557，来自CICC；以及用于肌醇六磷酸酶生产的黑曲霉66876，来自ATCC。
真菌培养
将米曲霉和黑曲霉菌株在由研碎的全玉米、麦麸、大豆皮、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜和果汁糖蜜的加工副产品，以及任何其他的由淀粉、糖和蛋白质组成的食品加工副产品组成的培养基中培养和保存。这些原材料可以经由酶预处理，所述酶包括淀粉酶、葡萄糖-淀粉酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶。将无机铁盐添加到真菌培养基，这样的无机铁盐包括硫酸亚铁、富马酸亚铁、柠檬酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸亚铁和乙二胺四乙酸(EDTA)铁，浓度为每升培养基含有300-2000mg的铁元素。
通过在40-70％的湿度下接种固体培养基如蒸煮过的米饭、大豆和高粱以及它们的组合，制备真菌孢子。在2-3周内，孢子发芽，并准备好进行收集。将真菌孢子收集到无菌蒸馏水中。采用1-10％体积的最终生产发酵菌(fermenters)来制备发酵菌的预培养物。预培养的培养基可以和上述的生产培养基相同。在孢子被引入到预培养培养基之后，孵育18-28小时的预培养发酵时间适合生成健康的预培养物。将预培养物添加到生产发酵菌，并允许真菌生长以生产期望的含铁真菌物质。
仪器设备
大规模发酵可以在任何适宜的发酵容器或者设备中进行。对于铁富集的生物质的生产，发酵优选地在有氧条件下进行48-72小时。在发酵周期的过程中可以将灭菌的或过滤的空气以0.5-1.0vvm泵入到发酵罐，以改进生长和产率。优选地，在发酵过程中搅动或搅拌培养物。对于商业微生物培养，空气、搅动和发酵容器的设计的组合是熟知的。
真菌发酵
发酵可在28-30℃的温度下进行48-72小时，或者直到开始细胞自溶。应该理解，培养时间和温度可以根据所用的真菌类型和菌株而变化。
根据原材料的营养组成，对于充气真菌发酵，可能需要其他营养物来补充生长培养基。这些营养物可以包括有机和无机氮源、磷源和微量矿物质。
作为补铁剂的富集铁的真菌产品的生产
真菌，包括丝状真菌，具有进一步摄取相对不易生物利用的和强毒性的铁的能力。应该注意，在人的饮食中直接补充可溶性无机铁盐可导致细胞毒反应。因此，利用真菌摄取无机铁盐并转化为有机形式，可以降低直接消耗铁盐的副作用。
无机盐可在发酵过程中加入。常见的铁盐选择包括硫酸铁、硫酸亚铁和柠檬酸铁。无机铁通过真菌转化成有机形式。为了使真菌产品中的铁水平最大化，可以在发酵过程中递增地供给给定的铁盐。铁盐的用量取决于所用盐的类型，但是用量水平不需要妥协于真菌生长。采收后，可以对真菌菌丝体进行彻底的清洗以除去多余的铁盐。在这方面，pH 2-3的弱酸能够是有效的。该方法的详细步骤在图2中描述。
真菌生物质采收
发酵后，含铁的真菌生物质可以用脱水机如离心机、压带机等进行采收。使用水和/或弱酸如0.01M的盐酸洗涤，可以除去无机铁残留物。然后可以使用加压空气、流化床干燥器等在60-80℃干燥富集铁的真菌产品。产品的最终湿度优选为小于约10％。
制剂
例如，化合物可以被配制成口服递送。特定的制剂类型的非限制性实例包括片剂、胶囊、囊片、粉剂、颗粒剂、安瓿剂、小瓶、即用型溶液或悬浮液、饮剂和冻干材料。固体制剂如片剂或胶囊剂可以含有任何数量的适宜的可接受的赋形剂或载体。
产品
营养补充剂包含具有至少约100mg/kg铁的真菌生物质。营养补充剂通常含有约100到40000mg/kg的铁。补充剂可以具有至少约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000或40000mg/kg的铁。
含铁的营养补充剂还可以包含稀释剂或其他共成分如硒和锌。例如，补充剂可以含有10到400mg/kg的硒；和20到20,000mg/kg的锌。补充剂可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400mg/kg的硒。补充剂还可以包含20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000mg/kg的锌。
含铁的营养补充剂可以被配制成粉剂、溶液、饮剂、胶囊、片剂、囊片。粉末形式的产品还可以被添加到食品中，并被用作食品强化成分。食品的强化包括但不限于调味品、盐、婴幼儿配方、以及小麦粉、玉米粉和豆粉。
营养补充剂的一个优点是它包含来源于副产物的天然有机铁。营养补充剂可以被配制成进一步包含由丝状真菌天然产生的肌醇六磷酸酶和其他酶。
营养补充剂可以包含在丝状真菌的生长过程中添加的额外的无机铁盐或其他含铁量高的化合物。实例包括硫酸亚铁、富马酸亚铁、柠檬酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸亚铁和EDTA铁。
营养补充剂可以被配制成人用或动物用。
结果
实施例1
主要的副产物浓缩的玉米蒸馏可溶物(糖浆)是在干式碾磨玉米以生产乙醇的过程中产生的。发酵工艺将玉米淀粉转化成乙醇但在原处留下作为酒糟的大部分的非淀粉营养物，包括玉米中的铁。然后将酒糟浓缩为糖浆并主要用于动物饲料。
现已发现糖浆含有用于生产真菌生物质的有活力的营养物，如米曲霉和黑曲霉。
当培养基由稀释糖浆(DS)做成时，分析真菌生物质和残留液(SL)的铁含量，结果显示糖浆中86.8％的天然铁被真菌集中(表3)。然而，相比于US 8,481,295(van Leeuwen)，利用糖浆相对于酒糟水的另一个优点是糖浆富含磷，当和其他成分如糖组合时，真菌生物质可以提高多达30％。
表3.米曲霉从玉米-乙醇酒糟水获得的铁余量(以1000mL计算)
因为玉米中的天然铁含量由地理位置和气候条件决定，铁含量为1-100mg/kg干玉米。因此糖浆中的残留铁会因玉米-乙醇工厂的不同而改变。因此，由不同乙醇工厂的DS生产的真菌生物质中的铁显示在180到320mg/kg的范围内。
为证明真菌菌丝体中的铁与细胞壁结合，对其进行热水洗涤和己烷提取。结果显示通过洗涤产物，由于除去了可溶物组分(表4)，最终干产物中的铁含量实际上提高。结果还表明真菌产物中的铁与细胞结构结合。由于大多数玉米-乙醇工厂正在实践从糖浆中进行玉米油的油分离，因此利用减脂糖浆相对初始糖浆来培养真菌以获得富含铁的产品更为优选。
表4.热水和己烷洗涤提高最终真菌产物中的铁含量
铁含量
初始DS 8mg/L
未经洗涤的 251mg/kg
热水洗涤2小时 274mg/kg
己烷提取6小时 303mg/kg
基于美国农业部(USDA)的食品营养数据(USDA国家营养物数据库，标准参照，发布17：每常用量度(common measure)中所选食品的铁Fe(mg)含量)，不包括富集铁的谷类和食物产品，由玉米-乙醇糖浆生产的真菌生物质中的铁含量高于相同使用重量基准的鸡肝，且只比铁含量最高的食品罐装蛤蜊低10.6％。在同等重量基准上，铁含量比所有非肉类食品都高(表5)。然而，在现行的商业玉米-乙醇运营中，糖浆不适合直接供人消耗。对于该行业来说，有必要在这些副产品可用于生产供人消耗的铁补充剂之前，将所使用的乙醇生产设施、化学品和酶升级到食品级质量。但是富含铁的产品可以喂养牲畜，并且特别适合青年猪(Kornievicz d，et.Al.2007Effect of dietaryyeast enriched with Cu，Fe and Mn on digestibility of main nutrients andabsorption of minerals by growing pigs.Am.J.Agril.Biol.Sci.2(4),267-275)。
表5.真菌产品中的铁含量(平均值为250mg/kg)和所选食品(不包括富集铁的谷类和食物产品)中的铁含量的比较
实施例2
尽管已报道多种酵母可以用来生成作为补充剂的富集铁的酵母产品，但是米曲霉变种尚未被用于生产富集铁的产品。
硫酸铁(Fe2(SO4)3·2H2O)，含25.69％的Fe3+，用作无机盐来强化玉米-乙醇糖浆。铁的用量按铁元素的浓度而不是按盐的浓度计算；为了能够与真菌生物质的铁含量进行比较。在采用ICP-OES方法测试之前，将所有真菌样品用去离子水彻底洗涤。结果(表6)显示真菌生物质中的铁含量随着Fe3+从1mg/L升高到200mg/L而显著升高。而且，有趣的是硫酸铁在给定用量下对米曲霉没有毒性，但在数字上提高了真菌产率。
表6.将硫酸铁加入到糖浆中对真菌铁含量和产率的影响
培养基 铁盐 mg/L 真菌产率，g/L 铁，(mg/kg)
TS 硫酸铁(Fe3+) 0 18.74 257
100 20.56 2456
200 20.18 4626
玉米面 硫酸亚铁(Fe2+) 1000 17.5 13,500
2000 14.8 20,500
除硫酸铁外，Fe2+含量为20.14％的硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)用作对照物。图3示出米曲霉能够利用Fe3+和Fe2+无机盐并摄取这两种铁盐，直至铁的用量达到超过1000mg(Fe)/L。这两种铁盐使得真菌生物质中的铁含量接近或超过20,000mg/kg。
尽管硫酸亚铁的水溶性更好，且通常被用作补铁剂，但是它和硫酸铁的结果没有表现出不同。米曲霉摄取铁的机制是能够将铁含量从257mg/kg增加到超过20,000mg/kg；增长40倍。当将这些铁水平和表6中包含的食品进行比较时，真菌产物能够提供富集非常大量的铁的产品。
实施例3
优选的是补铁剂具有高的铁含量，然而更重要的是这些铁能被人体吸收。使用成分玉米、麦麸和大豆皮，采用图2所示的方法生产富集铁的真菌产品(Ao-铁)。通过不同的原料成分和发酵优化的组合使得终产物中的铁含量为2-4％。将Ao-铁研磨成粉，并进行Glahn详述的体外消化/Caco-2细胞培养模型(细胞试验)(Glahn，R.P.et.al.1998.Caco-2cell ferritin formation predictsnonradiolabeled food iron availability in an In Vitro digestion/Caco-2cell culturemodel)。从ATCC获得第17传代的细胞培养物Caco-2细胞，并采用第25-33传代进行实验。将细胞以1.9x105的密度在胶原蛋白处理过的6孔板中接种。细胞在含有10％胎牛血清的Eagle培养基中生长，并保持在37℃、含5％CO2的环境中。每两天更换培养基。富集铁的真菌的体外消化也按照Glahn详述的步骤进行。细胞试验测量铁蛋白(一种含铁的蛋白质)在与经消化的铁产品一起孵育的细胞中的形成；因此已被用作人体内铁利用度的预测因子。细胞试验的基本步骤是酶消化(胃蛋白酶和胰酶-胆汁)样品，在Caco-2细胞层(来自人大肠)上培养，以及测量细胞内的铁蛋白(一种含铁蛋白质)形成。在酶消化之前，将Ao-铁用酸化水(pH＝2)和EDTA洗涤以除去细胞结构外部的任何无机盐残留物。
因为Ao-铁在水中具有有限的溶解度，且铁与真菌细胞结构结合，所以样品在酶消化过程中不能像无机盐一样被稀释。对于高铁含量的有机材料，开发了一种改良的样品制备方法以用于细胞试验中。注意到这种Ao-铁样品的重量在给定的消化液体积中保持在低水平，在这种情况下，该给定的消化液体积是22.5ml。表7显示消化过程中样品的过载导致低的铁溶解度。这种低溶解度归因于不完全消化。然而，当样品重量过低时，则可能因为称重天平的灵敏度而在称量过程中出现误差。经测定，对于20-25ml的消化液体积，0.005-0.01克样品是最佳的。可以应用更大的样品量，但是对消化过程中酶的用量也须进行调整。
表7.酶消化过程中的样品载量对铁的溶解度的影响
样品 样品重量，g 稀释系数，倍数 铁溶解度，％
硫酸亚铁 0.095 100 140
含铁真菌 0.0027 8 204
0.0056 8 99
0.014 8 46
0.027 8 28
0.056 8 20
将Ao-铁的铁蛋白响应与硫酸亚铁(使用最广泛的无机铁补充剂)进行比较。尽管硫酸亚铁非常易被人体吸收，但它也能引起人(特别是儿童)的严重副作用。因为它的反应性非常强，加入到食物中的硫酸亚铁能引起食物氧化，并因此使食物出现异味和较短的保存期限。一般地，已建议将硫酸亚铁补充剂与食物同食。相比之下，Ao-铁中的铁是有机形式，其可不和食物同食。利用硫酸亚铁的铁蛋白响应作为对照(100％)，并与硫酸亚铁和玉米面、Ao-铁、及Ao-铁和玉米面进行比较，结果显示Ao-铁与硫酸亚铁和玉米面相当(图5)。玉米面对铁蛋白响应的影响对于硫酸亚铁来说比对于Ao-铁更显著。而且，Ao-铁无味，并可以直接添加到食品中，但是硫酸亚铁大多采用丸剂或胶囊形式。尽管在Caco-2细胞中铁蛋白响应为硫酸亚铁的52％，但这好于牛肉和玉米中的铁，其分别为25％和少于20％。
实施例4
为生产食品级补铁剂，选择米曲霉ATCC 22787在由玉米粉、大豆皮和麦麸制成的培养基中生长。玉米粉和麦麸用酶淀粉酶、葡萄糖-淀粉酶、肌醇六磷酸酶处理。总的玉米粉和麦麸在培养基中的初始混合物为10-25％。在105-107℃的温度、约6的中性pH下，经由高压灭菌器或喷射蒸煮加入淀粉酶，然后保持95℃2个小时。下一步是施加葡萄糖-淀粉酶进行糖化。最后，可能需要或可能不需要肌醇六磷酸酶在酶生产商的说明书中要求的温度和pH值下处理玉米和麦麸的混合物。如果使用大豆皮，优选方案是在酶生产商要求的pH下在水中将蛋白酶施加于大豆皮。最佳pH在酸性范围内的蛋白酶是优选的。酶处理后，可以形成这些成分的混合物并将其用于真菌预培养物和产物培养基。在14-L搅拌发酵罐中，如图1所示，在pH 4-6、28℃下进行发酵反应48-72小时。在实验室中使用由双层尼龙布做成的过滤器来采收真菌生物质，产物在60℃烘箱中干燥过夜。最终富集铁的产物真菌的组成在表8中显示。
表8.富集铁的真菌产物的组成(基于干重)
试验 含量
水分 8.69％
粗蛋白质 29.8％
粗脂肪 9.2％
灰分 16.3％
硫 0.59％
磷 2.28％
钾 1.71％
镁 0.20％
钙 0.07％
铁 37886ppm或3.79％
另外，所用的米曲霉菌株是不产霉菌毒素的微生物。在商业实验室中采用LC/MS/MS方法的毒素测试，显示不存在可检测到的霉菌毒素(表9)。
表9.霉菌毒素测试结果显示富集铁的真菌产物中不含毒素。
分析 结果
黄曲霉毒素(Aflatoxin)B1 无，<10ppb水平
黄曲霉毒素B2 无，<10ppb水平
黄曲霉毒素G1 无，<10ppb水平
黄曲霉毒素G2 无，<10ppb水平
伏马菌素(Fumonisin)B1 无，<0.2ppm水平
伏马菌素B2 无，<0.2ppm水平
伏马菌素B3 无，<0.2ppm水平
瓜萎镰菌醇(Nivalenol) 无，<0.2ppm水平
赭曲霉毒素A(Ochratoxin A) 无，<0.2ppm水平
玉米赤霉烯醇(Zearalenol) 无，<0.2ppm水平
玉米赤霉烯酮(Zearalenone) 无，<0.2ppm水平
实施例5
其他无机矿物质如硒和锌，已经用于生产富集硒或锌的酵母，但是尚未报道使用丝状真菌。两种富集形式相比于无机等同物，均提供了更好的功能特性。利用相似的方法(图2)使经亚硒酸钠或硫酸锌强化的米曲霉生长。为了能够与真菌生物质中的矿物质含量进行对比，任一无机盐的用量均按元素的浓度而不是盐的浓度进行计算。真菌产物中的所选矿物质含量的增加在表10列出，并证明米曲霉可以用于生产富集有机硒或锌的产物。然而，当硒的用量升高至15mg/L时，真菌产率显著下降。而锌增加真菌产率，并且超过67％的添加的锌元素被转化为有机锌。
表10.在玉米-乙醇糖浆中富Se或Zn的米曲霉的生产
本领域技术人员应该理解，在不偏离按广义描述的技术的主旨或范围的情况下，可以对如具体实施方案中所示的技术进行多种变化和/或修改。因此，本发明实施方案在所有方面被视为是例证性的而不是限制性的。

Claims (23)

1.一种营养补充剂，包含：
含有至少100mg/kg的铁的真菌生物质。
2.根据权利要求1所述的营养补充剂，其中真菌生物质来自选自米曲霉(Aspergillus oryzae)或黑曲霉(Aspergillus niger)的丝状真菌。
3.根据权利要求1或2所述的营养补充剂，含有200到40000mg/kg的铁。
4.根据权利要求3所述的营养补充剂，含有200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000、20000、21000、22000、23000、24000、25000、26000、27000、28000、29000、30000、31000、32000、33000、34000、35000、36000、37000、38000、39000或40000mg/kg的铁。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的营养补充剂，含有硫酸亚铁、富马酸亚铁、柠檬酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁铵、柠檬酸亚铁或EDTA铁。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的营养补充剂，还含有稀释剂或共成分。
7.根据权利要求6所述的营养补充剂，其中共成分选自硒和锌。
8.根据权利要求7所述的营养补充剂，含有10到400mg/kg的硒；和20到20,000mg/kg的锌。
9.根据权利要求8所述的营养补充剂，含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400mg/kg的硒。
10.根据权利要求8所述的营养补充剂，含有20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000mg/kg的锌。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的营养补充剂，被配制成粉剂、溶液、饮剂、胶囊、片剂或囊片。
12.一种形成含铁的营养补充剂的方法，所述方法包括：
在农业副产品或食品加工副产品中培养丝状真菌，以在该丝状真菌中聚积存在于农业或食品加工副产品中的铁；以及
采收丝状真菌，以形成含有具有至少100mg/kg铁的真菌生物质的营养补充剂。
13.根据权利要求12所述的方法，其中丝状真菌选自米曲霉或黑曲霉。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中农业副产品为浓缩玉米可溶物(糖浆)，玉米、小麦和大豆的加工副产品。
15.根据权利要求14所述的方法，其中农业副产品为糖浆。
16.根据权利要求12或13所述的方法，其中食品加工副产品选自玉米浸出液、玉米酒糟、大豆乳清、甘蔗和甜菜糖蜜、大豆皮和麦麸或麦壳。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中在丝状真菌生长过程中添加额外的无机铁盐和其他含铁量高的化合物，以进一步增加营养补充剂中的铁含量。
18.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中营养补充剂含有200到40000mg/kg的铁。
19.根据权利要求12至19中任一项所述的方法，其中营养补充剂还含有稀释剂或共成分。
20.根据权利要求190所述的方法，其中共成分选自硒和锌。
21.根据权利要求20所述的方法，其中营养补充剂含有10到400mg/kg的硒；和20到20,000mg/kg的锌。
22.根据权利要求12至21中任一项所述的方法生产的含铁的营养补充剂。
23.根据权利要求22所述的营养补充剂，被配制成粉剂、溶液、浓缩物、饮剂、胶囊、片剂或囊片。
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