CN104704367A - 膜组件和包含这种膜组件的侧流免疫测定装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细长的膜组件，其具有长度、宽度和高度的，所述膜组件包括负载于液体不可渗透的负载层上的微孔膜层，并且所述组件适合液体在毛细管力的作用下侧向流过所述膜层，其中所述组件具有恒定的高度，并且至少部分所述膜层在所述组件的整个宽度上具有20至80μm的第一厚度。本发明还涉及一种包含所述膜组件的侧流免疫测定装置。

Description

膜组件和包含这种膜组件的侧流免疫测定装置

技术领域

本发明涉及一种细长膜组件，其包含负载于液体不可渗透的负载层上的微孔膜层，并涉及包含这种膜组件的侧流免疫测定装置。

背景技术

免疫测定经常用于检测生物体液(如血液、尿液或唾液)中各种物质——通常称为配体——的存在或浓度。在固相免疫测定中，受体——通常是待检测的配体的特异性抗体——被固定在固体负载上。使可能包含待检测配体的测试液与所述固体负载接触，若存在所述配体，则形成受体-配体对。为了使所述受体-配体对可见，可使用结合所述受体-配体对的标记抗体，然后目视检测和所述受体-配体对结合的所述标记抗体。

在所谓的夹心免疫测定中，将配体夹在标记抗体和固定在固体负载上的抗体之间。这种测定例如记载于US 5,591,645。

在固相免疫测定中，已将多孔材料如硝酸纤维素、尼龙、醋酸纤维素、玻璃纤维和其他多孔聚合物用作固体负载。在所谓的侧流测定中，将其中有待检测的配体的液体施加于多孔膜层的一端，并在毛细管力的作用下侧向流过该膜。这种膜包含能结合所述待检测的配体的固定化受体。所述固定化受体可均匀分布在整个膜上。然而，通常这种固定化受体位于膜上确定的测试区或检测区，通常位于狭窄的测试线上，所述测试线借助于喷墨印刷或其他气溶胶喷涂技术已得到应用。

在侧流免疫测定中，通常带有固定化受体的微孔材料薄层负载于液体不可渗透层，以给脆的膜层提供足够的硬度。通常厚度在100至200μm范围内的微孔材料层负载于负载层上，该负载层通常称为“膜背衬(membrane backing)”。

侧流免疫测定的普遍问题是测定灵敏度及其信号强度。例如与酶联免疫吸附试验(ELISA)相比，这类测定的灵敏度通常低五至十倍。已经提出了若干改进信号的措施，例如信号放大策略，如酶信号放大，但仍有改进的空间。

发明内容

现已发现，通过喷涂技术如喷墨印刷或其他气溶胶喷涂技术将受体固定在微孔膜如硝酸纤维素膜上，通常导致所述受体仅被固定在所述膜的较薄上层内。对借助氮气驱动的喷涂技术在其上固定抗体的硝酸纤维素膜进行的激光扫描共聚焦显微镜分析表明，所述抗体通常被固定在膜层的上部。通常在膜层的上部80μm处，或甚至只在膜层的上部60μm或30μm处。由于侧流测定中的微孔膜通常远厚于60或80μm，一般为100至200μm，经常为120至180μm，因此，仅有一小部分测试液会与固定化受体接触。

在免疫测定中，使用厚度不明显大于其中固定有抗体的层的厚度的侧流膜，会显著提高侧流免疫测定的灵敏度。

此外，已发现，即使受体更深地渗透到膜内并且也被固定在膜的下部，许多标记技术(例如使用特异性结合的有色或荧光纳米颗粒的那些)也只能使结合在膜表面或刚好在膜表面下一点的纳米颗粒具有可检测的信号。膜下方的特异性结合的纳米颗粒不会贡献信号，所述信号通常记录自膜上方。因此，如果结合了待检测的分析物的纳米颗粒在膜表面或膜表面附近被捕获(夹心型测定)或不被捕获(抑制型测定)，那么在那些情况下所述测定的灵敏度将明显提高。

因此，本发明涉及具有长度、宽度和高度的细长膜组件，所述组件包括负载于液体不可渗透的负载层上的微孔膜层，所述组件适用于液体在毛细管力的作用下侧向流过所述膜层，其中所述组件具有恒定的高度，并且至少部分膜层在所述组件的整个宽度上具有20至80μm的第一厚度。

所述膜组件可有利地应用于固相侧流免疫测定。所述膜组件还包含固定在所述膜层(优选在一个或多个检测区)上的配体结合分子。在这种固相侧流免疫测定中，所述膜层至少在所述一个或多个检测区中具有第一厚度，即20至80μm的厚度。

至少在检测区中具有厚度不明显大于其中固定有配体结合分子和/或其中可记录检测信号的层的深度的膜层，其重要优势在于，在检测区，待分析的液体被驱使流过如下的部分膜层：其包含固定化的配体结合分子和/或允许检测信号被记录。这将会导致与固定化的配体结合分子相互作用的配体数增加和/或可用于记录的信号实体数增加。于是，免疫测定的信号强度的灵敏度增强。

在本发明的一个实施方案中，所述膜层具有恒定的厚度，即在其整个长度和宽度上具有20至80μm的厚度。然而，优选地，所述膜层在检测区具有第一厚度，在检测区外具有第二且更大的厚度。在检测区外具有更大的厚度具有若干优点，包括膜层的脆性降低，从而使其操作性增强，对测试液的容量增加。

在另一方面，本发明涉及包含如上所定义的膜组件的侧流免疫测定装置。

附图说明

图1示出了本发明的膜组件的纵剖面。

图2示出了本发明的侧流免疫测定装置的纵剖面。

图3示出了激光扫描共聚焦显微镜实验的结果，其示出了在不同硝酸纤维素膜中抗体固定的深度。

具体实施方式

本发明的膜组件是细长的微孔膜层组件，所述微孔膜层负载于液体不可渗透的负载层上。所述组件适用于液体在毛细管力的作用下侧向流过所述膜层，并且通常用于在侧流免疫测定中检测侧向流过所述微孔膜层的测试液中的配体或分析物。所述细长组件具有长度、宽度和高度。所述组件的高度，即负载层加膜层，是恒定的。至少部分膜层在组件的整个宽度上具有20至80μm的第一厚度，优选为20至60μm，更优选为20至40μm，甚至更优选为20至30μm。

在本发明的组件中，整个膜层都可具有所述第一厚度。因此所述组件包含各自具有恒定厚度的负载层和膜层。然而，优选地，所述组件的膜层，在侧流方向上，在组件的整个宽度上，具有交替的第一厚度和第二且更大的厚度。第二厚度优选是已知的侧流免疫测定中微孔膜层所具有的厚度。更优选地，所述第二厚度为100至200μm，甚至更优选的为120至180μm。由于膜层和负载层的组件具有恒定的高度，因此所述膜层厚度增加时所述负载层的厚度会减小，反之亦然。

如果用于侧流免疫测定装置，本发明的膜组件优选是这样的，以使所述膜层在其中配体结合分子被固定在所述膜层的区域(检测区)以及(如果存在的话)还在包含配体结合分子和标记物的可移动缀合物(conjugate)的膜层的区域(结合区)具有第一厚度，而在这些区域的上游和下游以及这些区域之间具有第二厚度。

所述膜层的厚度可以任何合适的方式减小和增加，例如步进式或渐进式。优选地，所述膜层的厚度从第二厚度向第一厚度逐渐减小。本文提及的逐渐减小是梯度减小而非步进式减小，即具有有限切线的减小(每单位膜的长度的厚度减小)。更优选地，厚度最多减少300％(在1μm膜长度上厚度减少3μm)，甚至更优选地最多200％，甚至更优选地，减少30％至100％。

所述膜层可以是任何适合用于侧流膜的微孔材料。这些材料是本领域已知的，包括硝酸纤维素、尼龙、醋酸纤维素、玻璃纤维、交联葡聚糖和其他多孔聚合物。优选地，所述膜层是硝酸纤维素层。用于侧流测定的硝酸纤维素膜层是本领域公知的，并且由相互连接的硝化纤维组成。

所述负载层是液体不可渗透的负载层。这种负载层是本领域公知的，并且经常被称为“背衬”。合适的负载层包括聚合物材料，例如聚酯、聚丙烯、聚乙烯、丙烯酸(共)聚物、乙烯基丙烯酸聚合物和杂多糖。

本发明的膜组件优选应用于侧流免疫测定。在侧流免疫测定中，能够结合测试液中的待检测的配体或分析物的受体被固定在所述测试液流经的微孔膜层上。因此，所述膜组件优选包含固定在膜层上的配体结合分子。配体结合分子或受体是本领域已知的，并且包括例如抗体和适体。

通常在侧流免疫测定中，这种受体或配体结合分子以一个或多个测试线或点且经常是一个控制线或点的形式被固定，所述测试线或点和控制线或点通过喷涂技术如喷墨印刷或其他气溶胶喷涂技术施加在所述膜层上。于是所述膜层包含其中固定有配体结合分子的一个或多个检测区。每个检测区可包含一个或多个具有固定化的配体结合分子的线或点。因此，优选地，在本发明的膜组件中，所述配体结合分子被固定在所述膜层上的一个或多个检测区中，并且所述膜层至少在所述一个或多个检测区具有第一厚度。所述膜层可在其整个长度上具有第一厚度，但是优选地，所述膜层在所述检测区具有第一厚度，而在所述一个或多个检测区外——即在所述一个或多个检测区的上游、下游和其之间——具有如上所定义的第二厚度。

为了使在检测区形成的受体-配体对可视，通常使用标记物，如免疫标记物。非常普遍的是，待分析的液体首先流过所谓的结合垫(conjugatepad)，然后流过侧流膜。所述结合垫包含标记物和配体结合分子的可移动缀合物。如果待分析的液体流过所述结合垫，所述缀合物与配体结合，配体/缀合物的结合物随液体流过所述膜层。在所述膜层上，配体-缀合物的结合物结合到固定化的配体结合分子上。替代所述侧流膜上游的结合垫，所述侧流膜可包含含有标记物和配体结合分子的可移动缀合物的一个或多个结合区。这类结合区优选位于检测区的上游。如果所述膜层包含一个或多个结合区，优选所述膜层在一个或多个结合区具有第一厚度。更优选地，所述膜层在一个或多个检测区和一个或多个结合区具有第一厚度，而在这些区域外具有第二厚度。所述膜层可在一个或多个检测区具有第一厚度，在这些区域外(包括任何结合区)具有第二厚度。

为了使得在检测区，以及(如果存在的话)在结合区配体与配体结合分子的结合增强，优选在所述检测区和所述结合区具有相对较低流速的待分析的液体。因此，在检测区和/或结合区——其中所述膜层具有第一厚度，即20至80μm的厚度——中的膜组件的宽度优选大于在其中所述膜层具有更大的第二厚度的区域中的组件的宽度。更优选地，具有第一厚度的检测区和/或结合区中的组件的宽度是这样的，以使这些区域中的流速等于或低于(优选低于)这些区域外的流速。优选地，这些区域中的流速是这些区域外流速的25至100％，更优选为50至95％。因此，具有第一厚度的区域中的组件宽度和膜层厚度的乘积优选不小于具有第二厚度的区域的此乘积。

本发明还涉及包含本发明膜组件的侧流免疫测定装置。侧流免疫测定装置是本领域公知的，并且例如记载于US2006/0205059、US 5,252,496和US 5,591,645。所述膜组件可用于任何合适的本领域已知的侧流免疫测定装置中。

通常，侧流免疫测定装置包含反应区、所述反应区上游的样品添加区和所述反应区下游的吸收区，所述反应区包含负载于液体不可渗透的负载层上的具有固定化配体结合分子的侧流膜。本文提及的上游或下游是相对于侧向液体流动的方向而言。将测试液加入样品添加区，所述样品添加区通常包含吸收液体的过滤垫。在毛细管力的作用下，所述液体从所述样品添加区流过所述反应区到达吸收区。所述装置可在所述样品添加区和所述反应区之间包含所谓的结合区——所述结合区包含结合测试液中待检测的配体的可移动免疫标记物或其他标记物，以使测试液被驱使流过所述结合区。所述标记物随后结合到测试液中的配体上，被标记的配体流过测试区并被结合在所述反应区中的固定化配体结合分子上，在所述反应区中被标记的配体视觉可见。或者，所述膜层包含一个或多个如上文所述的结合区。

本发明的侧流免疫测定装置优选是包含含有配体结合分子的微孔膜层的侧流免疫测定装置，该配体结合分子借助喷墨印刷或其他喷涂技术而被施加在所述膜层上。

优选如下制造本发明的膜组件：首先提供一个液体不可渗透的负载层，然后将溶于适当溶剂的组成膜层的材料的溶液施加在所述负载层上。然后使所述溶剂蒸发，获得负载于所述负载层上的膜层的膜组件。通过提供具有待获得的细长突出物的液体不可渗透的负载层获得在其整个宽度上具有交替的第一和第二厚度的膜层，所述细长突出物的高度与所述膜层的第一和第二厚度间的厚度差类似，即优选为20至180μm，优选为80至120μm。实际上，所述负载层充当待获得的膜层的模具。通过将膜材料作为液体溶液来施加，得到恒定高度的膜组件，即膜层加负载层。适用于侧流免疫测定装置的本发明的细长膜组件可从如此获得的所述负载层和膜层的组件中切割下来。

通过以下非限制性的附图对本发明进行进一步说明。

附图详述

图1示意性地示出了本发明膜组件1的纵剖面，所述膜组件1包含微孔膜层2和负载层3。负载层3在其整个宽度上具有突出物4。膜层2包括检测区5，所述检测区5包含固定于测试线6上的抗体。每个检测区5包含3条测试线6。膜层2在检测区5具有第一厚度7，在所述检测区外具有第二厚度8。在每个检测区5的上游，膜层2的厚度由第二厚度8逐渐减小为第一厚度7。膜组件1具有高度9，所述高度9在膜组件1的整个长度上都是恒定的。本文提及的上游以侧流方向为参照。箭头“a”指示流动方向。

图2示出了本发明侧流免疫测定装置10的纵剖面。装置10包括壳体50中的样品添加区20、反应区30和吸收区40。在本装置的正常操作过程中，通过应用窗口21将测试液施加在样品垫22上。在毛细管力的作用下，测试液从样品垫22流经结合垫23到达反应区30中的膜组件31。结合垫23包含与测试液中待检测的配体结合并随测试液流入反应区30的可移动免疫标记物。膜组件31包括膜层32和负载层33。负载层具有突出物34，使得膜层32在检测区35具有较小的厚度。吸收区40包括吸收垫41。

图3示出了激光扫描共聚焦显微镜实验的结果，如以下实施例中进一步详细描述的，其示出了在不同硝酸纤维素膜层上抗体固定的深度。

实施例

以下实施例表明，通过喷涂技术如喷墨印刷被固定在微孔侧流膜上的配体结合分子主要是固定在所述膜的上部。

AlexaFluor647标记的IgG分子(分子探针A21235；200μg/mL)在下列膜上被喷涂成线：

-四张试验性的硝酸纤维素微孔膜，它们的标称孔径是0.8μm(NC膜1)、1.2μm(NC膜2)、3.0μm(NC膜3)和5.0μm(NC膜4)；

-三张市售膜，每张膜由背衬层负载(Sartorius Unisart CN95、Sartorius Unisart CN140和Millipore HF135，标称孔径分别是15.0、8.0和8.0μm)；和

-一张没有背衬层的Unisart CN140膜(标称孔径是8.0μm)。

所述膜各自具有0.5cm的宽度，IgG-AlexaFluor647的线由CAMAGLinomat IV TLC喷涂器以1μL/0.5cm的量喷涂，即每条线和每个条带为200ng。在将所述膜进行干燥(在37℃下过夜)以后，通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)以Z-叠加(Z-stacking)模式对从所述膜顶部测量的固定化荧光抗体分子的位置进行评估。此时，从所述膜的顶部开始，检测具有3μm高度的膜切片的荧光。所测试的每张膜的总共21个切片的荧光如图3所示。

在图3中，示出了荧光的相对强度。通常，标称孔径越小，已固定有抗体分子的区域的深度越小。抗体分子被固定在从膜顶部起12μm(Unisart CN140)至51μm(Unisart CN95)的深度内。下表中给出了每张膜的膜层深度，在所述膜层深度处相对荧光强度低于5个相对荧光单位。

表-荧光小于5个相对荧光单位的深度

膜	深度(μm)
		NC膜1	27
NC膜2	27
		NC膜3	24
NC膜4	27
		Unisart CN140,无背衬	12
Unisart CN140,有背衬	12
		Unisart CN95,有背衬	51
Millipore HF135,有背衬	27

Claims (14)

1.一种细长的膜组件，其具有长度、宽度和高度，所述组件包括负载于液体不可渗透的负载层上的微孔膜层，且所述组件适合液体在毛细管力的作用下侧向流过所述膜层，其中所述组件具有恒定的高度，并且至少部分所述膜层在所述组件的整个宽度上具有20至80μm的第一厚度。

2.权利要求1的膜组件，其中所述微孔膜是硝酸纤维素膜。

3.权利要求1或2的膜组件，其中所述第一厚度为20至60μm。

4.前述权利要求中任一项的膜组件，其中整个膜层具有第一厚度。

5.权利要求1至3中任一项的膜组件，其中所述膜层在所述组件的整个宽度上具有在侧向上交替的第一厚度和至少为100μm的第二厚度。

6.权利要求5的膜组件，其中所述第二厚度最多为200μm。

7.权利要求5或6的膜组件，其中所述膜层的厚度在侧向上从第二厚度向第一厚度逐渐减小。

8.前述权利要求中任一项的膜组件，其还包括固定在所述膜层上的配体结合分子。

9.权利要求8的膜组件，其中所述配体结合分子固定在所述膜层的一个或多个检测区内，并且其中所述膜层至少在一个或多个检测区内具有第一厚度。

10.权利要求9的膜组件，其中所述膜层还包含含有配体结合分子和标记物的可移动缀合物的一个或多个结合区，其中所述膜层在一个或多个结合区内具有第一厚度。

11.权利要求9或10和权利要求5至7中任一项的膜组件，其中所述膜层在一个或多个检测区外和一个或多个结合区外具有第二厚度。

12.权利要求11的膜组件，其中所述膜组件在一个或多个检测区内和一个或多个结合区内的宽度比在检测区外和结合区外的大。

13.权利要求12的膜组件，其中任一检测区内和结合区内的所述组件的宽度和所述膜层的厚度的乘积都不小于检测区外和结合区外的所述组件的宽度和所述膜层的厚度的乘积。

14.一种侧流免疫测定装置，其包含前述项权利要求中任一项的膜组件。