CN104693137A

CN104693137A - 一种莫沙必利活性代谢物

Info

Publication number: CN104693137A
Application number: CN201310666229.4A
Authority: CN
Inventors: 赵龙山; 秦峰; 孙晓红; 李发美
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2015-06-10

Abstract

本发明提供了一种低毒、高效的莫沙必利的活性代谢物，从而为以后临床上成为莫沙必利的替代物。本发明提供的代谢物如下所示：

Description

一种莫沙必利活性代谢物

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及莫沙必利的活性代谢物的制备方法及其应用。

背景技术

莫沙必利(mosapride)，(±)-4-氨基-5-氯-2-乙氧基-N-[[4-(4-氟苄基)-2-吗啉基]甲基]苯甲酰胺，是一强效、选择性苯甲酰胺类5-HT4受体激动剂，作为新型胃动力药，其越来越多地用于日本和其它一些亚洲国家。莫沙必利具有以下的化学结构：

莫沙必利与大脑神经细胞突触膜上的多巴胺D2受体、肾上腺素α1受体、5-HT1及5-HT2受体无亲和力，故不会引起锥体外系综合征及心血管不良反应。不良反应的发生率约为4%。主要表现为腹泻、腹痛、口干、皮疹、倦怠、头晕、不适、心悸等。另有约3.8%的病人出现检验指标异常变化，表现为嗜酸性粒细胞增多、甘油三酯升高，ALT升高等。基于以上不良反应，因此寻找可能具有相等或更高促胃动力作用的相关结构的化合物的研究就有重要的价值。

发明内容

本专利旨在提供一种低毒、高效的莫沙必利的活性代谢物，从而为以后临床上成为莫沙必利的替代物。本发明提供的活性代谢物如下所述：

该代谢物的制备方法包括：

（1）代谢物制备的前期准备：将培养好的雅致小克银汉霉AS3.156(从市场上购得)预培养24h后，加入莫沙必利DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液（80mg/ml），使底物浓度达到200mg/L，转化120h，转化培养物于4000rpm离心20min，收集上清转化液约3L，置-20℃冷冻，用于制备莫沙必利代谢物。同时，将离心后的菌丝体沉淀收集在一起，以2倍体积量的乙酸乙酯超声20min，于4000rpm离心20min，收集上清液，重复以上步骤两次，合并洗菌丝体的乙酸乙酯，置-20℃冷冻，用于制备莫沙必利代谢物。

（2）代谢物的分离纯化：将转化液用饱和Na₂CO₃碱化至pH＝9，以2倍体积量乙酸乙酯萃取2次，合并有机层，与洗菌丝体的乙酸乙酯层合并，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，残渣用约8.0mL甲醇-水(7:3,v/v)复溶，上样至填充有Sephadex G10填料的内径约5cm的凝胶柱，以甲醇为洗脱溶剂，每8mL收集一瓶。洗脱流份经UPLC-MS检测，将含有代谢物的流份合并，减压蒸干，用甲醇溶解，运用ODS开放柱色谱法，以甲醇-水混合溶剂系统进行梯度洗脱(10:90，30:70，50:50，70:30，90:10)，每50mL收集一瓶。洗脱流份经UPLC-MS检测，合并含代谢物的流份，减压蒸干；用甲醇复溶，用于进一步制备液相色谱分离纯化。

本发明的实施方案将在下面的说明中阐述，下列提供的实施例不意味以任何方法限定发明,并仅仅是说明性目的。

具体实施方式

实施例1代谢物的制备方法

（1）代谢物制备的前期准备：将培养好的雅致小克银汉霉AS3.156（市场上购得）预培养24h后，加入莫沙必利DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液(80mg/ml），使底物浓度达到200mg/L，转化120h，转化培养物于4000rpm离心20min，收集上清转化液约3L，置-20℃冷冻，用于制备莫沙必利代谢物。同时，将离心后的菌丝体沉淀收集在一起，以2倍量的乙酸乙酯超声20min，于4000rpm离心20min，收集上清液，重复以上步骤两次，合并洗菌丝体的乙酸乙酯，置-20℃冷冻，用于制备莫沙必利代谢物。

（2）代谢物的分离纯化：将转化液用饱和Na₂CO₃碱化至pH＝9，以2倍体积极量乙酸乙酯萃取2次，合并有机层，与洗菌丝体的乙酸乙酯层合并，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，残渣用约8.0mL甲醇-水(7:3,v/v)复溶，上样至填充有Sephadex G10填料的内径约5cm的凝胶柱，以甲醇为洗脱溶剂，每8mL收集一瓶。洗脱流份经UPLC-MS检测，将含有代谢物的流份合并，减压蒸干，用甲醇溶解，运用ODS开放柱色谱法，以甲醇-水混合溶剂系统进行梯度洗脱(10:90，30:70，50:50，70:30，90:10)，每50mL收集一瓶。洗脱流份经UPLC-MS检测，合并含代谢物的流份，减压蒸干；用甲醇复溶，用于进一步制备液相色谱分离纯化。将含有代谢物的甲醇溶液重复进入制备液相色谱多次，分别收集不同保留时间的色谱流出物，将保留时间相同的流份合并，减压蒸干有机溶剂，剩下的部分冷冻干燥，得到该代谢物的纯品。所采用的制备液相色谱条件为色谱柱：ZorbaxC18柱（10.7×250mm I.D.，7μm，美国安捷伦公司）；流动相：甲醇-10mmol/L醋酸铵水溶液(45:55,v：v)，等度洗脱；流速：20.0mL/min；检测波长274nm；柱温：室温。

实施例2代谢物的结构确认

综合利用NMR、TOF-MS、UPLC-MS/MS及UV对实施例2制得的莫沙必利活性代谢物进行结构确证。

熔点：141-143℃。保留时间为2.81min，UV最大吸收波长为217、273和308nm。TOF-MS分析表明，准分子离子峰[M+H]⁺的m/z438.1592(计算值为438.1590)，表明分子式为C₂₁H₂₅ClF N₃O₄，与原形药相比，多了一个O原子，说明是原形药的一羟基化物或N-氧化物代谢物。MS/MS结果表明，其碎片离子m/z为420、329、280、215、198、170、159和109。m/z198、170和109碎片离子的存在表明苯甲酰和对氟苄基部分没有发生氧化。m/z420的碎片离子由原形药脱去一分子水生成，且二级质谱图中的相对丰度仅为2%，提示MSP437是N-氧化物，而非羟基化代谢物，因为在ESI-MS/MS分析中，羟基化代谢物比N-氧化代谢物容易脱水，生成的碎片离子的相对丰度较大。MSP437的准分子离子[M+H]⁺脱去对氟苄基部分生成m/z329的碎片离子，它继而发生C1-C7键断裂，丢掉4-氨基-5-氯-2-乙氧基部分(m/z170)，生成m/z159的碎片离子。m/z215的碎片离子则是C7’-N键断裂后的苯甲酰胺部分。

与原形药莫沙必利的¹H和13C-NMR数据相比，3’、5’、7’’、2’’和6’’位的C和H信号均向低场发生不同程度的位移，而6’和1’’的信号则向高场移动。H-2’从3.5向低场移至4.2ppm，相应的C信号则由73.9向高场移至69.6ppm。由于吗啉环的N原子发生氧化亲电性增强，而导致M4发生这些变化。其它的信号与原形药相比，基本没有变化。此外，在碳氢远程相关谱(HMBC)中，3.4ppm处的H-6’与69.6ppm处的C-2’远程相关，4.10ppm处的H-5’与64.7ppm处的C-3’相关；氢-氢化学位移相关谱(1H-1H COSY)中，H-5’和H-6’相关；无畸变极化转移增强谱(DEPT135)显示，只有C-2’(CH)为正信号，而其它C-3’,5’和6’(CH2)均为负信号，表明氧化不是发生在吗啉环的四个C原子上。碳氢相关谱(HSQC)进一步证实了上述结构。

综合ESI-MS、一维(1D)和二维(2D)-NMR数据，确定其为莫沙必利-4’-N-氧化物。

实施例3代谢物的活性研究

豚鼠12只，随机分为2组，实验时将豚鼠致昏，迅速剖腹取近盲肠端10cm处的回肠段，放入台式液的培养皿中。除去附着的肠粘膜及脂肪，冲净肠内容物，剪成2-3cm肠段备用，一端固定于通气钩上，另一端连接固定于肌肉张力换能器并引至RM6240电导生理仪接口。待标本稳定肠管正常蠕动后描记正常收缩曲线，肠管的自发收缩活动可通过张力换能器输入生理记录仪。运用累积给药法，莫沙必利和实施例1制得的莫沙必利代谢物I的给药间隔分别是15s，20s，20s和15s。每一项实验完毕后，用37±0.5℃预热的台式液冲洗标本，冲洗3-4次，当给予同一种药物重复实验时均需先让肠管恢复正常蠕动平衡，用药间隔15min。每个待测物的结果来自6只豚鼠。以加入每个浓度后出现最大效应（收缩）的一段时间内的收缩强度作为效应值。

表1莫沙必利和代谢物对离体豚鼠回肠的收缩增强百分比

结果表明，代谢物III在各累积浓度下均具有活性，但对离体豚鼠回肠的收缩增强百分比均小于原形药莫沙必利。

Claims

1.一种莫沙必利的活性代谢物，其结构如下：

。

2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，步骤如下：

1）代谢物制备的前期准备：将培养好的雅致小克银汉霉AS3.156(从市场上购得)预培养24h后，加入莫沙必利DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶液（80mg/ml），使底物浓度达到200mg/L，转化120h，转化培养物于4000rpm离心20min，收集上清转化液约3L，置-20℃冷冻，用于制备莫沙必利代谢物。同时，将离心后的菌丝体沉淀收集在一起，以2倍体积量的乙酸乙酯超声20min，于4000rpm离心20min，收集上清液，重复以上步骤两次，合并洗菌丝体的乙酸乙酯，置-20℃冷冻，用于制备莫沙必利代谢物。

（2）代谢物的分离纯化：将转化液用饱和Na₂CO₃碱化至pH＝9，以2倍体积量乙酸乙酯萃取2次，合并有机层，与洗菌丝体的乙酸乙酯层合并，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，残渣用约8.0mL甲醇-水(7:3,v/v)复溶，上样至填充有Sephadex G10填料的内径约5cm的凝胶柱，以甲醇为洗脱溶剂，每8mL收集一瓶。洗脱流份经UPLC-MS检测，将含有代谢物的流份合并，减压蒸干，用甲醇溶解，运用ODS开放柱色谱法，以甲醇-水混合溶剂系统进行梯度洗脱(10:90，30:70，50:50，70:30，90:10)，每50mL收集一瓶。洗脱流份经UPLC-MS检测，合并含代谢物的流份，减压蒸干；用甲醇复溶，用于制备液相色谱分离纯化,即得。

3.如权利要求1所述的化合物在制备胃动力药的应用。