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CN104685072A - 用于确定抵抗雄激素受体疗法的方法和组合物 - Google Patents

用于确定抵抗雄激素受体疗法的方法和组合物 Download PDF

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CN104685072A CN201380050780.4A CN201380050780A CN104685072A CN 104685072 A CN104685072 A CN 104685072A CN 201380050780 A CN201380050780 A CN 201380050780A CN 104685072 A CN104685072 A CN 104685072A
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polypeptide
amino acid
nucleic acid
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subject
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CN201380050780.4A
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J.D.约瑟夫斯
J.H.哈格
J.L.森辛塔法
N.卢
J.钱
N.D.史密斯
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My Tribute Drug Co
Aragon Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
My Tribute Drug Co
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Abstract

本文描述了经修饰的雄激素受体多肽，其对雄激素受体抑制剂的抑制作用具有抵抗性。本文描述了含有所述经修饰的雄激素受体多肽的组合物、组合和试剂盒，以及使用所述经修饰的雄激素受体多肽的方法。本文还描述了使用所述经修饰的雄激素受体多肽作为筛选剂来鉴定和设计第三代雄激素受体调节剂的方法。本文还描述了抑制所述经修饰的雄激素受体多肽的活性的第三代雄激素受体调节剂。还描述了包含本文描述的化合物的药物组合物和药剂，以及单独使用或与其他化合物组合地使用此类雄激素受体调节剂来治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症包括由雄激素受体介导或依赖于雄激素受体的癌症，诸如去势抵抗性前列腺癌。

Description

用于确定抵抗雄激素受体疗法的方法和组合物
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本申请包含序列表，所述序列表已通过EFS-Web提交为ASCII格式的计算机可读文本文件并且该序列表的全文据此以引用方式并入本文。该文本文件的创建日期是2013年7月16日，名称是38937-725-601_SEQ.txt，并且大小是132KB。
背景技术
雄激素受体(“AR”)是一种配体激活的转录调节蛋白，该转录调节蛋白通过与内源性雄激素相互作用来介导多种生物效应的诱导。内源性雄激素包括类固醇，诸如睾酮和双氢睾酮。在多种组织中利用5α还原酶将睾酮转化成双氢睾酮。
雄激素与雄激素受体的作用与许多疾病或病症有关，诸如雄激素依赖性癌症、女性男性化以及痤疮等。减少雄激素经由雄激素受体的信号转导效应和/或降低雄激素受体浓度的化合物用于治疗其中雄激素受体发挥作用的疾病或病症。
发明内容
本文描述了赋予患者抵抗用第一代或第二代雄激素受体(AR)拮抗剂治疗的雄激素受体中修饰的鉴定。在一些实施例中，该修饰为在AR多肽的位置876处的苯丙氨酸的替换。在一些实施例中，该修饰为F876L。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽对用第二代雄激素受体拮抗剂的抑制作用具有抵抗性，该第二代雄激素受体拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽对用第一代雄激素受体拮抗剂的抑制作用具有抵抗性，该第一代雄激素受体拮抗剂选自比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺或尼鲁米特。在一些实施例中，该患者患有癌症。在一些实施例中，该癌症为前列腺癌、乳腺癌、肝(即，肝细胞)癌或膀胱癌。在一些实施例中，该癌症为去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽表现出野生型AR受体的一种或多种活性，所述活性包括但不限于：共激活因子结合、DNA结合、配体结合、或核转运。在一些实施例中，该第一代或第二代拮抗剂对经修饰的AR多肽表现出与野生型AR多肽相比降低的拮抗活性。
在本文的某些实施例中描述了用于确定受检者是否对或将变得对用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂的疗法具有抵抗性的方法，所述方法包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：(a)测试来自受检者的含有编码雄激素受体多肽的核酸分子的样本以确定所编码的雄激素受体多肽是否在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为对用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂的疗法具有抵抗性或将变得对用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂的疗法具有抵抗性。在一些实施例中，所述方法还包括从受检者获取样本的步骤。在一些实施例中，该受检者已被施用第一代或第二代AR拮抗剂来治疗癌症。在一些实施例中，该癌症为前列腺癌、乳腺癌、肝(即，肝细胞)癌或膀胱癌。在一些实施例中，该癌症为前列腺癌。在一些实施例中，该癌症为去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则停止用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处不具有该修饰，则继续用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则施用抑制经修饰的AR的第三代雄激素受体拮抗剂。在一些实施例中，该第二代雄激素受体拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162。在一些实施例中，该第一代雄激素受体拮抗剂选自比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺或尼鲁米特。
在本文的某些实施例中描述了用于选择用第三代雄激素受体拮抗剂的疗法的受检者的方法，所述方法包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：(a)测试来自受检者的含有编码雄激素受体多肽的核酸分子的样本以确定所编码的雄激素受体多肽是否在SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为用第三代雄激素受体拮抗剂的疗法的候选者。在一些实施例中，所述方法还包括从受检者获取样本的步骤。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则停止用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处不具有该修饰，则继续用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则施用抑制经修饰的AR的第三代雄激素受体拮抗剂。在一些实施例中，该第二代雄激素受体拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162。在一些实施例中，该第一代雄激素受体拮抗剂选自比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺或尼鲁米特。
在本文的某些实施例中描述了用于表征受检者的雄激素受体以确定此受检者是否可对用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂的抑制作用具有抵抗性的方法，所述方法包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：(a)测试来自受检者的含有编码雄激素受体多肽的核酸分子的样本以确定所编码的雄激素受体多肽是否在SEQ ID NO：1的氨基酸位置876处被修饰；以及(b)如果受检者在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则将该受检者的雄激素受体表征为对用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂的抑制作用具有抵抗性。在一些实施例中，所述方法还包括从受检者获取样本的步骤。在一些实施例中，该第一代或第二代拮抗剂对经修饰的AR多肽表现出与野生型AR多肽相比降低的拮抗活性。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则停止用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处不具有该修饰，则继续用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则施用抑制经修饰的AR的第三代雄激素受体拮抗剂。在一些实施例中，该第二代雄激素受体拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162。在一些实施例中，该第一代雄激素受体拮抗剂选自比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺或尼鲁米特。
在本文的某些实施例中描述了用于监测正接受第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗癌症的受检者是否已发展出或将发展出对该疗法的抵抗的方法，所述方法包括：(a)测试来自受检者的含有编码雄激素受体多肽的核酸分子的样本以确定所编码的雄激素受体多肽是否在SEQ ID NO：1的氨基酸位置876处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为对用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂的疗法具有抵抗性或将变得对用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂的疗法具有抵抗性。在一些实施例中，所述方法还包括从受检者获取样本的步骤。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则停止用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处不具有该修饰，则继续用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则施用抑制经修饰的AR的第三代雄激素受体拮抗剂。在一些实施例中，该第二代雄激素受体拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162。在一些实施例中，该第一代雄激素受体拮抗剂选自比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺或尼鲁米特。
在本文的某些实施例中描述了用于优化正接受第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗癌症的受检者的疗法的方法，所述方法包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：(a)测试来自受检者的含有编码雄激素受体多肽的核酸分子的样本以确定所编码的雄激素受体多肽是否在SEQ ID NO：1的氨基酸位置876处被修饰；以及(c)(i)如果该样本具有该修饰，则停止用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗该受检者，或(ii)如果该样本不具有该修饰，则继续用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗该受检者。在一些实施例中，所述方法还包括从受检者获取样本的步骤。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ IDNO：1的位置876处具有该修饰，则停止用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处不具有该修饰，则继续用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：如果来自受检者的样本在SEQ ID NO：1的位置876处具有该修饰，则施用抑制经修饰的AR的第三代雄激素受体拮抗剂。在一些实施例中，该第二代雄激素受体拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162。在一些实施例中，该第一代雄激素受体拮抗剂选自比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺或尼鲁米特。
在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含在SEQ ID NO：1的位置876处的氨基酸的替换或缺失，由其组成，和/或基本上由其组成。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含在SEQ ID NO：1的位置876处的苯丙氨酸至选自下列的氨基酸的替换：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸，由其组成，和/或基本上由其组成。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含在SEQ ID NO：1的位置876处的苯丙氨酸至选自下列的氨基酸的替换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，由其组成，和/或基本上由其组成。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含在SEQ ID NO：1的位置876处的苯丙氨酸至亮氨酸的替换，由其组成，和/或基本上由其组成。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含编码SEQ ID NO：1的氨基酸位置876的核酸的缺失，由其组成，和/或基本上由其组成。
在一些实施例中，编码该经修饰的AR多肽的核酸具有(i)在对应于SEQ ID NO：18中所示的核苷酸序列中的核酸位置2626的核酸位置处的胸腺嘧啶(t)至胞嘧啶(c)的突变；(ii)在对应于SEQ ID NO：18中所示的核苷酸序列中的核酸位置2628的核酸位置处的胞嘧啶(c)至腺嘌呤(a)的突变；或(ii)在对应于SEQ ID NO：18中所示的核苷酸序列中的核酸位置2628的核酸位置处的胞嘧啶(c)至鸟嘌呤(g)的突变。
在所述方法的一些实施例中，该核酸样本为RNA或DNA。在所述方法的一些实施例中，该核酸样本为基因组DNA。在一些实施例中，所述方法还包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：从RNA样本中分离mRNA。在一些实施例中，从自受检者获取的肿瘤细胞样本中分离核酸。在一些实施例中，该样本为自受检者获取的肿瘤活检样本、血液样本、血清样本、淋巴液样本、或骨髓穿刺液。在一些实施例中，该样本含有循环肿瘤细胞。在一些实施例中，该样本含有播散肿瘤细胞。在一些实施例中，在测试前从样本中纯化核酸。在一些实施例中，在测试前使核酸扩增。
在所述方法的一些实施例中，测试包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：执行对编码SEQ ID NO：1的位置876的核酸样本的聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实施例中，PCR扩增包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：使用一对寡核苷酸引物，该对寡核苷酸引物位于编码SEQ ID NO：1的氨基酸位置876的区域两侧。在一些实施例中，所述方法还包括使用本领域的技术人员已知的技术对PCR扩增后的核酸进行测序。
在一些实施例中，测试包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：使核酸与序列特异性核酸探针接触，其中该序列特异性核酸探针：(a)结合至编码经修饰的受体的核酸，该经修饰的受体在氨基酸位置876处被修饰；并且(b)不结合至编码野生型受体的核酸，该野生型受体在SEQ ID NO：1的位置876处具有苯丙氨酸。
在一些实施例中，该第一代或第二代雄激素受体拮抗剂通过竞争性拮抗来抑制野生型雄激素受体多肽。在一些实施例中，该第二代雄激素受体拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)或RD162。
在一些实施例中，该受检者患有选自下列的疾病或病症：癌症、炎性病症或增殖性病症。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有AR介导的癌症。在一些实施例中，所述癌症选自：前列腺癌、乳腺癌、肝(即，肝细胞)癌或膀胱癌。在一些实施例中，该癌症为前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有实体瘤。
在一些实施例中，在从受检者获取样本之前用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂来治疗该受检者。在一些实施例中，当第一次施用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂时，该受检者对用第一代或第二代雄激素受体拮抗剂的治疗具有响应性。在一些实施例中，在所述方法中使用的样本为在第一次施用第一代或第二代AR拮抗剂之后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月或24个月时获取的样本。在一些实施例中，在用第一代或第二代AR拮抗剂的治疗的过程中获取1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次该样本。在一些实施例中，当第一次施用第一代或第二代AR拮抗剂时，该受检者对用第一代或第二代AR拮抗剂的治疗具有响应性。
在本文的一些实施例中描述了用于筛选拮抗经修饰的雄激素受体的化合物的方法，所述方法包括以下步骤，由以下步骤组成，和/或基本上由以下步骤组成：(a)在细胞中表达经修饰的雄激素受体，其中该经修饰的雄激素受体在对应于SEQ ID NO：1的位置876的氨基酸位置处被修饰；(b)使细胞与测试化合物接触；以及(c)检测细胞中的雄激素受体活性水平，其中所表达的活性降低指示该化合物拮抗该经修饰的AR。在一些实施例中，该测试化合物表现出对该经修饰的AR的完全拮抗剂活性。在一些实施例中，该测试化合物未表现出对该经修饰的AR的激动剂活性。在本文的某些实施例中描述了由本文所述的方法鉴定的第三代雄激素受体抑制剂。在一些实施例中，对所述方法中使用的AR多肽的修饰为在雄激素受体多肽的位置876处的氨基酸的替换或缺失。在一些实施例中，对所述方法中使用的AR多肽的修饰为在雄激素受体多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸至选自下列的氨基酸的替换：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，对所述方法中使用的AR多肽的修饰为在雄激素受体多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸至选自下列的氨基酸的替换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。在一些实施例中，对所述方法中使用的AR多肽的修饰为在雄激素受体多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸至亮氨酸的替换。
在一些实施例中，所述方法中采用的细胞缺乏野生型雄激素受体的表达、表达低水平的野生型雄激素受体、或表达经修饰的AR受体。在一些实施例中，该细胞选自HeLa、CV1、COS7、HepG2、HEK-293、DU145、PC3、TSY-PR1、LNCaP、CWR、VCaP和LAPC4。在一些实施例中，该细胞包含可操作地连接至雄激素响应性启动子的报告基因。在一些实施例中，AR多肽的活性是通过分析报告基因的表达来确定的。在一些实施例中，该启动子包含雄激素响应元件。在一些实施例中，该雄激素响应元件为4XARE或腺血管舒缓素(probasin)元件。在一些实施例中，该启动子为腺血管舒缓素、前列腺特异性抗原、MMTV LTR、FASN、STEAP4、TMPRSS2、ORM1或NKX3.1启动子。在一些实施例中，该报告基因编码选自下列的蛋白：荧光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、或酶。
在本文的某些实施例中描述了具有雄激素受体活性的分离的雄激素受体多肽或其变体，所述分离的雄激素受体多肽或其变体在对应于SEQ IDNO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处包含修饰，其中该修饰赋予经修饰的雄激素受体多肽或变体对雄激素受体拮抗剂的抵抗。在一些实施例中，该修饰包括与SEQ ID NO：1中所示的野生型雄激素受体相比在位置876处的氨基酸的替换。在一些实施例中，该替换为F876L。在一些实施例中，该修饰包括氨基酸位置876的缺失。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽具有SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽为重组多肽。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含与SEQ ID NO：1中所示的野生型雄激素受体相比在位置876处的氨基酸的替换以及一个或多个另外的氨基酸替换。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含在位置876处为F876L的氨基酸的替换。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含选自与去势抵抗性前列腺癌相关联的一个或多个氨基酸替换的一个或多个另外的氨基酸替换。在一些实施例中，该一个或多个另外的氨基酸替换选自与SEQ ID NO：1中所示的野生型雄激素受体相比，在氨基酸位置701、741、874和877处的一个或多个替换。在一些实施例中，该一个或多个另外的氨基酸替换选自T877A、W741C、W741L、W741R、L701H和H874Y。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽为重组多肽。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含SEQID NO：5中所示的氨基酸序列或变体，所述变体与具有SEQ ID NO：5中所示的序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性，其中在位置876处的氨基酸不是苯丙氨酸。
在本文的某些实施例中描述了分离的核酸分子，该核酸分子编码本文提供的经修饰的雄激素受体多肽。在一些实施例中，该核酸为DNA或RNA分子。在一些实施例中，该核酸为cDNA分子。在一些实施例中，该核酸为PCR扩增产物。在一些实施例中，该核酸为重组分子。在一些实施例中，该核酸为合成分子。在一些实施例中，该核酸包含SEQ ID NO：19中所示的核酸序列或变体，所述变体与具有SEQ ID NO：19中所示的序列的多肽具有至少或至少约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性，其中编码在位置876处的氨基酸的核酸密码子不编码苯丙氨酸。
在本文的某些实施例中描述了载体，该载体包含编码本文提供的经修饰的雄激素受体多肽的核酸分子。在一些实施例中，该载体为病毒或质粒载体。在一些实施例中，该核酸可操作地连接至启动子。在一些实施例中，该启动子为组成型启动子或诱导型启动子。在本文的某些实施例中描述了包含该载体的宿主细胞。在一些实施例中，该细胞为原核细胞或真核细胞。在本文的某些实施例中描述了由该宿主细胞表达的突变体AR多肽。
在本文的某些实施例中描述了药物组合物，该药物组合物包含由本文提供的方法鉴定的第三代雄激素受体抑制剂以及药学上可接受的赋形剂。在本文的某些实施例中描述了由本文提供的方法鉴定的第三代雄激素受体抑制剂在药物制造方面的用途。在本文的某些实施例中描述了治疗的方法，所述方法包括向对其有需要的受检者施用治疗有效量的药物组合物，其中该组合物包含合适的药用载体。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有AR介导的癌症。在一些实施例中，该癌症为前列腺癌、乳腺癌、肝(即，肝细胞)癌或膀胱癌。在一些实施例中，该癌症为去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该受检者表达突变体AR。在一些实施例中，该突变体AR包含在雄激素受体多肽中的氨基酸位置876处的氨基酸的替换或缺失。在一些实施例中，该替换为F876L。在一些实施例中，该第三代AR拮抗剂与另外的治疗剂一起施用。在一些实施例中，该第三代AR拮抗剂和该另外的治疗剂顺序地、同时地或间歇地施用。在一些实施例中，该另外的治疗剂选自激素、激素受体激动剂或拮抗剂、皮质类固醇、止吐剂、止痛药、抗癌剂、抗炎剂、激酶抑制剂、HSP90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。在一些实施例中，该另外的治疗剂为促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，该GnRH激动剂为亮丙瑞林、布舍瑞林或戈舍瑞林。
在本文的某些实施例中描述了微芯片，该微芯片包含本文提供的突变体AR多肽或编码本文提供的经修饰的AR多肽的核酸。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含在氨基酸位置876处的修饰。在一些实施例中，该修饰为F876L氨基酸替换。
在本文的某些实施例中描述了包含本文提供的突变体AR多肽的试剂盒。在本文的某些实施例中描述了包含分离的核酸的试剂盒，所述分离的核酸编码本文提供的突变体AR多肽。在本文的某些实施例中描述了包含一种或多种试剂的试剂盒，该一种或多种试剂用于检测在氨基酸位置876处包含修饰的突变体AR多肽。在本文的某些实施例中描述了包含一种或多种试剂的试剂盒，该一种或多种试剂用于检测编码在氨基酸位置876处包含修饰的突变体AR多肽的核酸。在一些实施例中，该修饰为F876L氨基酸替换。在一些实施例中，该试剂盒包含一对寡核苷酸引物，该对寡核苷酸引物位于编码AR多肽的氨基酸位置876的核酸区域两侧。在一些实施例中，该试剂盒包含寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物：(a)结合至编码经修饰的AR的核酸，该经修饰的AR在氨基酸位置876处被修饰；并且(b)不结合至编码野生型AR的核酸，该野生型AR在氨基酸位置876处具有苯丙氨酸。在一些实施例中，该试剂盒包含微芯片，该微芯片包含：(a)具有为F876S的修饰的经修饰的AR多肽，或包含为F876S的修饰的经修饰的AR多肽的一部分；或(b)核酸分子，该核酸分子编码具有为F876S的修饰的突变体AR多肽或包含为F876S的修饰的突变体AR多肽的一部分。
在本文的某些实施例中描述了用于检测经修饰的AR的体系，该经修饰的AR对在受检者中用第一代或第二代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性，所述体系包括：(a)来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本；以及(b)微阵列，该微阵列包含编码突变体AR多肽或突变体AR多肽的一部分的核酸，所述突变体AR多肽或所述突变体AR多肽的一部分在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰。在一些实施例中，该微阵列包含于微芯片上。在本文的某些实施例中描述了用于检测经修饰的AR的体系，该经修饰的AR对在受检者中用第一代或第二代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性，所述体系包括：(a)来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本；以及(b)序列特异性核酸探针，其中该序列特异性核酸探针：(i)结合至编码经修饰的AR的核酸，该经修饰的AR在氨基酸位置876处被修饰；并且(ii)不结合至编码野生型AR的核酸，该野生型AR在氨基酸位置876处具有苯丙氨酸。在本文的某些实施例中描述了用于检测经修饰的AR的体系，该经修饰的AR对在受检者中用第一代或第二代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性，所述体系包括：(a)来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本；以及(b)一对寡核苷酸引物，该对寡核苷酸引物位于编码AR多肽的氨基酸位置876的核酸区域两侧。
在本文的某些实施例中描述了分离的抗体，所述分离的抗体结合至本文提供的经修饰的雄激素受体多肽，其中该抗体不结合至或以较低亲和力结合至具有SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的野生型AR多肽。在一些实施例中，该经修饰的AR多肽包含在氨基酸位置876处的修饰。在一些实施例中，该修饰为F876L氨基酸替换。
在本文的某些实施例中描述了用于在患有癌症的患者中维持疗法的方法，所述方法包括：(a)向患者施用维持疗法方案，该维持疗法方案包括施用治疗有效剂量的第一代或第二代AR拮抗剂；以及(b)在维持疗法方案的过程中以预先确定的时间间隔监测患者以确定受检者是否具有编码AR的内源性基因的突变，该突变导致在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处的修饰。在一些实施例中，所述监测包括：测试来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰。在一些实施例中，所述方法还包括：如果受检者具有该突变，则停止维持疗法方案；或如果受检者不具有该突变，则继续维持疗法方案。在一些实施例中，所述方法还包括：如果受检者具有该突变，则施用抑制经修饰的AR的第三代AR拮抗剂。在一些实施例中，在该AR多肽中的修饰为F876L。在一些实施例中，该第一代或第二代AR拮抗剂通过竞争性拮抗来抑制野生型AR多肽。在一些实施例中，该第二代AR拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162。在一些实施例中，该癌症为前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、或肝细胞癌。在一些实施例中，该癌症为前列腺癌。在一些实施例中，该癌症为去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，所述预先确定的时间间隔为每周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月、或每年。
本文所述的多肽、核酸、化合物、方法和组合物的其他目的、特征和优点通过以下详细说明将变得显而易见。然而应当理解的是，虽然详细说明和具体实例指明具体实施例，但是仅以举例说明的方式给出，因为对本领域的技术人员来说，在本发明的实质与范围内对该详细说明的各种变化和更改都将是显而易见的。
附图说明
图1示出对ARN-509和恩杂鲁胺的抵抗性。(A)LNCaP和LNCaPARN-509r1细胞增殖。在去激素培养基的存在下培养LNCaP和LNCaPARN-509r1细胞2天，之后添加配体。经过7天的化合物处理后，用CellTiter-(Promega Corp.)的基于发光的细胞活力测定来定量增殖。(B)LNCaP/AR-Luc、LNCaP/AR-Luc ENZr2和LNCaP ARN-509r2细胞系的激动剂增殖测定。在去激素培养基的存在下培养细胞2天，之后用配体处理7天。用CellTiter-的基于发光的细胞活力测定来定量增殖。(C)亲本和第2代抗雄激素抵抗性细胞系的拮抗剂增殖测定。在去激素培养基的存在下培养细胞2天，之后在R1881的存在下用配体处理(最终浓度＝100pM)。用CellTiter-Glo的基于发光的细胞活力测定来定量增殖。(D)AR域结构的示意图，该示意图示出当在CRPC中突变时表现出改变的配体活性的氨基酸。
图2示出亲本和第2代抗雄激素抵抗性细胞系中的AR水平。从在去激素培养基中培养3天的细胞中产生蛋白提取物。通过蛋白印迹分析AR蛋白水平。将AR水平定量并且根据α微管蛋白(α-tubulin)归一化，然后相对于LNCaP细胞表达该AR水平。
图3示出ARN-509和恩杂鲁胺是AR F876L的部分激动剂。(A)ARN-509和恩杂鲁胺对野生型或F876L AR的转录激活剂和拮抗剂活性。在存在不断增长的化合物浓度的情况下，测量不存在或存在1nM R1881(对于野生型AR而言)或5nM R1881(对于F876L AR而言)时4X ARE-荧光素酶报告基因的转录激活。(B)在瞬时转染的HepG2细胞中测量第1代和第2代抗雄激素和泼尼松对于4X ARE-荧光素酶报告基因的野生型、F876L、T877A、F876L/T877A、L701H、H874Y和W741C AR依赖性激活的转录激活剂活性。
图4示出VP16-AR(A)和F876L VP16-AR(B)的激动剂活性，以及ARN-509和恩杂鲁胺的拮抗剂活性。在存在不断增长的化合物浓度的情况下，监测不存在或存在90pM R1881(对于野生型VP16-AR而言)或1nM R1881(对于F876L VP16-AR而言)时4X ARE-荧光素酶报告基因的活性。
图5示出野生型AR(A)和F876L AR(B)的竞争性结合测定。3H-R1881结合是在表达野生型或F876L AR的PC3细胞提取物中进行的。数据是3个独立实验的代表。误差线，SEM；n＝2。
图6示出AR过度表达的细胞系中的AR水平。从已在去激素培养基中培养3天的LNCaP、LNCap/AR(cs)、LNCaP/SRαF876L和LNCaP/pCDNAF876L细胞中产生蛋白提取物。通过蛋白印迹分析AR蛋白水平。将AR水平定量并且根据肌动蛋白归一化，然后相对于LNCaP细胞表达该AR水平。
图7示出F876L AR突变赋予对ARN-509和恩杂鲁胺的部分激动剂活性。(A)LNCaP/AR(cs)和LNCaP/SRαF876L细胞增殖。在去激素培养基的存在下培养细胞2天，之后用配体处理7天。用CellTiter-Glo的基于发光的细胞活力测定来定量增殖。(B)LNCaP/AR(cs)、LNCaP/SRαF876L和LNCaP/pCDNAF876L细胞增殖。在去激素培养基中培养细胞2天，之后用配体处理7天。对于拮抗剂测定而言，在200pMR1881的存在下添加化合物(100pM的最终浓度)。使用基于荧光的CellTiter-测定定量增殖。
图8示出AR N/C相互作用测定。通过HepG2细胞中的哺乳动物双杂交测定来监测配体诱导的N/C相互作用。测定8μM的拮抗剂，以及测定1nM的R1881。
图9示出AR靶基因的AR ChIP分析。对已在去激素培养基中孵育3天，之后用配体处理4小时的LNCaP/AR(cs)和LNCaP/SRαF876L细胞进行ChIP测定。在存在或不存在1nM R1881的情况下，用10μM的拮抗剂处理细胞。AR和非特异性的IgG对照的数据表示为百分比输入。
图10示出AR F876L突变使体内具有对ARN-509和恩杂鲁胺的抵抗性。LNCaP/AR(cs)和LNCaP/SRαF876L肿瘤异种移植物。每日用载体或30mg/kg/天的化合物处理荷瘤的去势雄性小鼠。每一组的肿瘤生长表示为平均肿瘤体积±SEM。
图11示出对于在患有进展性、晚期、转移性的去势抵抗性前列腺癌的患者中进行ARN-509的有关安全性、药动学和概念验证的开放式1期/2期研究的给药方案。
图12示出经ARN-509治疗的患者的AR-F876L鉴定。(A)分析29名患者对于F876L突变的PSA响应。PSA响应线的末端是使用BEAMing分析筛选患者血浆中的F876L突变的时刻。本研究中使用的血浆最初是收集以用于确定ARN-509的药动学，因此无需使用最大化ctDNA与淋巴细胞DNA的比率的方法来制备样本。(B)患者对F876L的PSA响应是阳性的。在所指示的治疗周期处患者7的PSA响应。在用箭头指示的时刻处分析循环血浆中的F876L。未检测到突变的血浆样本被标记为“w.t.”，存在F876L突变用“m”表示。如果突变微珠(mutant bead)的百分比高于截止值(0.02％)，并且估计突变拷贝的数量≥0.5(血浆样本中基因组当量的数量×突变微珠分数＝≥0.5)，则血浆样本被称为对该突变为阳性。
图13示出在对AR中具有可检测的体细胞F876L突变的三名患者(7、10、和13)中的每一者进行阶段1/2 ARN-509临床研究过程中检测到的前列腺特异性抗原(PSA)的相对量。箭头指示其中检测到一个或多个突变的样本。
具体实施方式
一些术语
除非另有规定，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有受权利要求保护的主题的所属技术领域的技术人员公知的相同含义。除非另外指明，否则本文全部公开内容通篇提及的所有专利、专利申请、已公开申请和公布、GENBANK序列、网站和其他已公开的材料全文以引用方式并入。在本文中存在对术语的多个定义的情况下，此部分中的定义优先。在参考URL或其他此类标识符或位址的情况下，应理解此类标识符可改变并且因特网上的具体信息可不断变化，但是等效的信息是已知的并且可诸如通过搜索因特网和/或适当的数据库容易地获取。对此类标识符的参考证明此类信息的可获得性和公众传播性。一般来讲，用于细胞培养、细胞感染、抗体产生的程序和分子生物学方法是本领域中常用的方法。此类标准技术可在例如参考手册中找到，所述参考手册诸如Sambrook等人(2000)和Ausubel等人(1994)。
如本文所用，除非上下文另行明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。在本申请中，除非另外明确指明，否则单数的使用包括复数。如本文所用，除非另外指明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及该术语的其他形式(例如，“包括(include/includes/included)”)的使用不是限制性的。
如本文所用，范围和量可表述为“约”具体值或范围。约也包括确定的量。因此“约5μg”既意指“约5μg”也意指“5μg”。一般来讲，术语“约”包括预计将在实验误差内的量。
如本文所用，雄激素受体(AR)多肽指代任意的雄激素受体蛋白或多肽，该雄激素受体蛋白或多肽包括但不限于：重组产生的蛋白、合成产生的蛋白、天然雄激素受体蛋白、以及从细胞或组织中提取的雄激素受体蛋白。AR多肽包括来自不同物种的相关多肽，所述物种包括但不限于人源和非人源的动物。非人源的AR多肽包括但不限于非人灵长类动物(例如，黑猩猩和猿)、鼠科动物(例如，小鼠和大鼠)、犬科动物(狗)、猫科动物(猫)、兔属动物(兔子)、禽类(鸟)、牛科动物(奶牛)、绵羊科动物(绵羊)、猪科动物(猪)、马科动物(马)、鱼科动物(鱼)、蛙科动物(青蛙)和其他哺乳动物或非哺乳动物的AR多肽。示例性的AR多肽包括例如SEQ ID NO：1-17。雄激素受体多肽包括野生型雄激素受体、等位变体同种型、体细胞突变(包括在肿瘤中发现的体细胞突变)、来自核酸的合成分子、从人组织和细胞分离的蛋白、以及所述蛋白的经修饰形式。本文提供的雄激素受体多肽可通过对主氨基酸序列的修饰、通过一个或多个氨基酸的缺失、添加或替换而进一步被修饰。雄激素受体多肽包括具有AR活性的任意AR多肽或其一部分，该多肽包括例如AR配体结合域至异源DNA结合域的融合多肽。
如本文所用，突变体雄激素受体(AR)多肽、突变体AR蛋白、经修饰的AR多肽或经修饰的AR蛋白在本文中可互换使用，并且是指在一个或多个氨基酸位置处被修饰的雄激素受体多肽。示例性的修饰包括但不限于：氨基酸的替换、缺失或添加。
如本文所用，术语“抗雄激素”指代一组激素受体拮抗剂化合物，该组化合物能够防止或抑制雄激素对体内正常响应组织的生物效应。
如本文所用，术语“AR抑制剂”或“AR拮抗剂”在本文中可互换使用，并且是指抑制或减少AR多肽的至少一种活性的试剂。示例性的AR活性包括但不限于共激活因子结合、DNA结合、配体结合或核转运。
如本文所用，“完全拮抗剂”是指在有效浓度下基本上完全抑制AR多肽的活性的拮抗剂。如本文所用，“部分拮抗剂”是指能够部分抑制AR多肽活性的拮抗剂，但是该种拮抗剂即使在最高浓度时也不是完全拮抗剂。“基本上完全”意指对AR多肽活性的至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或更大的抑制作用。
如本文所用，术语“第三代AR抑制剂”或“第三代AR拮抗剂”在本文中可互换使用，并且是指抑制含有赋予对第二代AR拮抗剂的抑制作用的抵抗的一个或多个氨基酸修饰的AR多肽的至少一种活性的试剂，所述第二代AR拮抗剂诸如ARN-509(CAS No.956104-40-8)、恩杂鲁胺(也已知为MDV3100；CAS No：915087-33-1)、或RD162(CAS No.915087-27-3)。在一些实施例中，第三代AR抑制剂抑制野生型AR多肽的至少一种活性，诸如但不限于共激活因子结合、DNA结合、配体结合或核转运。在一些实施例中，第三代AR抑制剂抑制突变体AR多肽的活性，该AR多肽的活性也受第一代或第二代AR抑制剂抑制。
如本文所用，短语“对抑制作用具有抵抗性”是指与对野生型AR多肽活性的抑制能力相比，AR拮抗剂对经修饰的AR多肽的一种或多种活性的抑制(即，拮抗)能力下降。例如，与对野生型AR多肽的抑制相比，该AR拮抗剂对经修饰的AR多肽的抑制有效性降低。在一些实施例中，与对野生型AR多肽的拮抗活性相比，对经修饰的AR多肽的降低的拮抗活性为约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或100％。示例性的AR活性包括但不限于共激活因子结合、DNA结合、配体结合或核转运。在一些实施例中，该AR拮抗剂不能够结合至或以降低的亲和力结合至经修饰的AR多肽。
如本文所用，术语“第二代AR抑制剂”或“第二代AR拮抗剂”在本文中可互换使用并且是指表现出对野生型AR多肽的完全拮抗剂活性，但是不表现出对含有赋予对抑制作用的抵抗的一个或多个氨基酸修饰的AR多肽的完全拮抗剂活性的试剂，该一个或多个氨基酸修饰诸如AR多肽中氨基酸位置876处的修饰。在一些实施例中，该第二代AR抑制剂不表现出对具有F876L氨基酸替换的AR多肽的完全拮抗剂活性。在一些实施例中，该第二代AR抑制剂在具有等于或高于抑制野生型AR所需浓度的浓度时诱导AR的活性(即，为AR激动剂)。第二代AR抑制剂不同于第一代AR抑制剂诸如比卡鲁胺和氟他胺，不同之处在于在表达升高水平的AR的细胞中，例如在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)中，第二代AR抑制剂用作完全拮抗剂。第一代AR抑制剂，诸如比卡鲁胺和氟他胺，用作CRPC中的激动剂。示例性的第二代AR抑制剂包括ARN-509、恩杂鲁胺和RD162。在一些实施例中，第二代AR抑制剂是本文提供的突变体AR多肽的激动剂。在一些实施例中，第二代AR抑制剂在或接近于AR多肽的配体结合位点处结合至AR多肽。
术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸，以及其单链或双链形式的聚合物。除非有明确限制，否则该术语涵盖包含天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸类似的结合特性并且被以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有明确限制，否则该术语也指寡核苷酸类似物，所述寡核苷酸类似物包括PNA(肽基核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(例如，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯)。除非另外指明，否则特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子替换)和互补序列，以及明确指示的序列。特别地，简并密码子替换是通过产生其中一个或多个选定的(或所有的)密码子的第三位被混合基和/或脱氧肌苷残基替换的序列而实现(Batzer等人(1991)Nucleic Acid Res.19：5081；Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；和Cassol等人(1992)Mol.Cell.Probes 6，327-331；和Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes 8：91-98)。
术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，所述氨基酸类似物和氨基酸模拟物以和天然存在的氨基酸类似的方式作用。天然编码氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)，以及焦赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即，键合至氢、羧基、氨基和R基的α碳)的试剂，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此种类似物具有经修饰的R基(诸如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但是保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。
在本文中用氨基酸的常用已知三字母符号或用IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来表示氨基酸。同样，用核苷酸的已被普遍认可的单字母代码来表示核苷酸。
在本文中可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如，氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。所述术语涵盖任意长度的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文所用，修饰是指对多肽的氨基酸序列的修饰或对核酸分子中的核苷酸序列的修饰，并且所述修饰分别包括氨基酸和核苷酸的缺失、插入和替换。
为了确定两个氨基酸序列或两条核酸的同源百分比，出于最优比较目的可将所述序列进行比对(例如，将空位引入第一氨基酸序列或第一核酸序列中以用于与第二氨基酸序列或第二核酸序列的最优比对)。之后可比较在对应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的一位置被与第二序列中对应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则在该位置处的分子是相同的。两个序列之间的同源百分比是序列共有的相同位置的数量的函数(即，％同一性＝相同位置数/位置总数(例如，重叠位置)×100)。在一些实施例中所述两个序列的长度相同。
为了确定两个序列之间的同源百分比，使用Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268提出的，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877修改的算法。这种算法被并入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST程序中。用NBLAST程序，评分＝100，字长＝12来执行BLAST核苷酸搜索，以获得与本文描述或公开的核酸分子同源的核苷酸序列。用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3来执行BLAST蛋白搜索。为了获得出于比较目的的带空位的比对，如在Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402中所述使用Gapped BLAST。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。更多详情请见美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的网站(在万维网上的ncbi.nlm.nih.gov处)。适用于本文所述的方法中的蛋白还包括与本文所述任何蛋白的氨基酸序列相比具有1至15个氨基酸改变的蛋白，所述氨基酸改变例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸替换、缺失或添加。在其他实施例中，改变的氨基酸序列与本文所述任何蛋白的氨基酸序列具有至少75％同一性，例如77％、80％、82％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。只要所述改变的氨基酸序列保持足够的生物活性以在本文所述的组合物和方法中起作用，这种序列变体蛋白就适用于本文所述的方法。在进行氨基酸替换的情况下，所述替换应为保守氨基酸替换。在常见的氨基酸中，例如“保守氨基酸替换”是通过以下各组中氨基酸间的替换来说明的：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。本领域内的技术人员认识到，一般来说，在多肽的非必需区域中进行的单氨基酸替换基本上不会改变生物活性(参见，例如，Watson等人Molecular Biology of the Gene，第4版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.co.，p.224)。该BLOSUM62表是来源于蛋白序列片段的约2,000局部多重比对的氨基酸替换矩阵，代表大于500组相关蛋白的高度保守区(Henikoff等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919)。因此，该BLOSUM62替换频率被用于定义保守氨基酸替换，所述保守氨基酸替换在一些实施例中被引入本文所描述或公开的氨基酸序列中。虽然可仅基于化学性质来设计氨基酸替换(如上文所讨论的)，但是术语“保守氨基酸替换”优选地指用大于-1的BLOSUM62值表示的替换。例如，如果替换的特征是BLOSUM62值为0、1、2或3，则氨基酸替换是保守的。根据该体系，优选的保守氨基酸替换的特征是BLOSUM62值为至少1(例如，1、2或3)，而更优选的保守氨基酸替换的特征是BLOSUM62值为至少2(例如，2或3)。
如本文所用，相应的残基是指出现在比对基因座处的残基。用本领域的技术人员已知的任意方法来比对相关多肽或变体多肽。此类方法一般最大化匹配，并且包括诸如使用人工比对的方法和使用多种可用的比对程序(例如，BLASTP)的方法，以及本领域的技术人员已知的其他方法。通过比对多肽序列，本领域的技术人员可使用保守的和相同的氨基酸残基作为向导来鉴定对应的残基。对应的位置也可以基于结构比对，例如通过使用计算机模拟的蛋白结构比对。在其他情况中，可以鉴定对应的区域。
如本文所用，等位变体或等位变异指代由与基因的参考形式不同的基因编码的多肽(即，由等位基因编码)。通常，参考形式的基因编码来自物种的群体或单个参考成员的野生型形式和/或主要形式的多肽。通常，包含物种之间或物种内的变体的等位变体与来自相同物种的野生型和/或主要形式的多肽具有至少80％、90％或更大的氨基酸同一性；同一性程度取决于基因以及比较是种间的还是种内的。一般来讲，种内的等位变体与野生型和/或主要形式的多肽具有至少约80％、85％、90％或95％或更大的同一性，包括与野生型和/或主要形式的多肽96％、97％、98％、99％或更大的同一性。
如本文所用，物种变体是指物种之间或物种内的同一多肽的变体。一般来讲，种间的变体与来自另一物种的野生型和/或主要形式的多肽具有至少约60％、70％、80％、85％、90％或95％或更大的同一性，包括与野生型和/或主要形式的多肽96％、97％、98％、99％或更大的同一性。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”以及其他语法上的等效形式包括减轻、除掉或改善疾病或病症的一个或多个症状，改善、预防或减少疾病或病症的一个或多个其他症状的发生、严重程度或发病频率，改善或预防疾病或病症的一个或多个症状的基础代谢原因，抑制疾病或病症，诸如遏止疾病或病症的发展、减轻疾病或病症、使疾病或病症消退、减轻由疾病或病症引起的病况、或预防性和/或治疗性地抑制疾病或病症的症状。在非限制性实例中，为了预防性益处，向有患特定疾病风险的个体、易患特定疾病的个体，或报告有疾病的一种或多种生理症状的个体施用本文公开的第三代AR抑制剂化合物。在一些实施例中，在用一种或多种治疗剂进行治疗之后，向受检者施用本文公开的第三代AR抑制剂化合物。在一些实施例中，与用一种或多种治疗剂的治疗结合，向受检者施用本文公开的第三代AR抑制剂化合物。
如本文所用，预防或预防法是指减少患疾病或病症的风险。
如本文所用的术语“有效量”、“治疗有效量”或“药用有效量”是指AR抑制剂化合物的足以治疗疾病的量。在一些实施例中，结果是疾病的征象、症状或病因的减少和/或减轻，或任何其他所需的生物体系变化。例如，用于治疗用途的“有效量”是提供疾病临床上显著减少所需的组合物的量，该组合物包含本文公开的AR抑制剂化合物。在任何个体病例中的适当“有效”量是使用任何合适的技术(例如，剂量递增研究)来确定的。
如本文所用的术语“药学上可接受的”是指不消除本文所述的AR抑制剂化合物的生物活性或性质，并且是相对无毒(即，该材料施用于个体时不会引起不期望的生物效应或与含有该材料的组合物中的任意组分以有害的方式相互作用)的材料(例如载体或稀释剂)。
如本文所用，对照是指基本上与测试样本相同的样本，不同的是该样本未用测试参数处理，或如果该样本是血浆样本，则该样本可以是来自未受所关注的病症影响的正常志愿者。对照也可以是内对照。
如本文所用，术语“受检者”、“个体”和“患者”可互换使用。所述术语中的任意一者都不应解读为需要医疗专业人员(例如，医生、护士、助理医师、医院病房杂工、临终关怀工作者)的指导。如本文所用，受检者可以为任意动物，包括哺乳类动物(例如，人或非人动物)和非哺乳类动物。在本文提供的方法和组合物的一个实施例中，所述哺乳类动物是人。
如本文所用，“接触”是指触摸、相接触或使物体紧邻的动作。“接触”可以通过在流体或半流体混合物中混合组分来实现。
综述：癌症中AR的功能和抗药性
雄激素受体(AR)是类固醇和核受体超家族的一个成员。在这个蛋白大家族中，只有五种脊椎动物类固醇受体是已知的，所述五种受体包括雄激素受体、雌激素受体、孕酮受体、糖皮质激素受体和盐皮质激素受体。AR是用作细胞内转录因子的可溶性蛋白。AR功能是通过雄激素的结合来调节的，雄激素的结合启动受体的序列构象变化，所述序列构象变化影响受体-蛋白的相互作用和受体-DNA的相互作用。
AR主要在雄激素靶组织中表达，所述靶组织诸如前列腺、骨骼肌、肝脏和中枢神经系统(CNS)，其中在前列腺、肾上腺和附睾中观察到最高的AR表达水平。在某些情况下AR通过内源性雄激素的结合而激活，所述内源性雄激素包括睾酮和5α-双氢睾酮(5α-DHT)。
AR是110kD核受体，其在由雄激素激活时，介导调节前列腺上皮细胞的生长和分化的靶基因的转录。AR是由位于X染色体上Xq11-12处的AR基因编码的。所述AR基因包含编码全长雄激素受体的8个外显子。与其他类固醇受体类似，未结合的AR主要位于细胞质中，并且通过与配体结合域的相互作用而与热休克蛋白(HSP)复合物缔合。在激动剂结合时，AR经历一系列的构象变化：所述热休克蛋白从AR解离，并且所述转化的AR经历二聚化、磷酸化，并且易位到细胞核，所述易位是由核定位信号介导的。所述易位的受体接着结合至雄激素响应元件(ARE)，该雄激素响应元件的特征是被三个随机核苷酸隔开的两条排列成反向重复序列的六聚六核苷酸半位点共有序列5′-TGTTCT-3′，并且位于AR基因靶的启动子或增强子区域中。其他转录辅助调节因子(包括共激活因子和共抑制因子)和转录机制的募集还确保对AR调控的基因表达的适当调节。这些过程是通过在配体结合域中配体诱导的构象变化启动的。
AR信号转导对于包括前列腺在内的雄性生殖器官的发育和维持至关重要，因为具有功能丧失型AR突变的基因型雄性和被工程改造为具有AR缺陷的小鼠不发育前列腺。前列腺细胞对AR信号转导的这种依赖性甚至在致瘤性转化时仍然继续。雄激素枯竭(例如，使用促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂)仍然是前列腺癌治疗的主要方法。然而，雄激素枯竭通常在有限持续时间内有效，并且前列腺癌进化成即使在低水平循环雄激素下也恢复生长能力。
前列腺癌是男性最常见的癌症。前列腺癌占诊断的所有新癌症病例的大约29％，并且占男性癌症死亡的10％。另外，美国男性在其一生中有大约17％的可能性会患侵入性前列腺癌。在最初诊断时，大部分的前列腺癌具有低风险至中等风险，意味着在几乎没有干预的情况下，10年死亡风险是相对较低的(最高24％)。然而，晚期和转移性前列腺癌具有2.5-3年的平均存活时间，并且接受包括外科手术和化学去势疗法的积极治疗。
假定大部分的前列腺癌细胞依靠AR来进行增殖和存活，则治疗大体由单独施用或与抗雄激素(例如，比卡鲁胺)组合施用阻断睾酮产生的药剂(例如，GnRH激动剂)构成，所述治疗拮抗任何残余睾酮的效应。不幸的是，虽然所述治疗最初通常是成功的，如前列腺特异性抗原(PSA)的减少和可见肿瘤(如果存在的话)的消退所证实的，但是转移性肿瘤不可避免地变得对激素治疗具有抵抗性，在激素疗法阶段不存在治愈性治疗。
对激素治疗具有抵抗性的前列腺癌目前被称为“去势抵抗性的”，意味着所述前列腺癌已发展到超出以雄激素轴上的任意点为靶的药物本应具有任意临床效用的点。临床前和临床证据表明即使在去势抵抗性癌症中，AR仍然是可行的治疗靶。AR突变据报道在高达33％的前列腺癌病例中出现，并且是在AR依赖性去势抵抗性期(castration resistant state)的治疗之后最常观察到的。已发现突变改变配体特异性和效力，并且产生与配体无关的受体活性。特异性突变各不相同，但是都表现为取决于治疗方案。另外，在患者和动物模型中，AR自身的上调已与去势抵抗性期的进展相关联。
两种试剂，醋酸阿比特龙(Zytiga；CAS No.154229-19-3)和MDV3100(恩杂鲁胺；CAS No.915087-33-7)，近来已用于治疗男性去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的后期临床试验。醋酸阿比特龙以7-α-羟化酶/17，20-裂解酶(CYP17A)为靶，从而抑制残余雄激素的生物合成。MDV3100是在AR过度表达的情况下对缺乏激动剂活性的有效抗雄激素的筛选过程中发现的一种抗雄激素。MDV3100和醋酸阿比特龙的临床疗效支持AR持续促进去势抵抗性前列腺癌的生长与存活的假说。不幸的是，类似于第一代雄激素阻断治疗，用醋酸阿比特龙或第二代AR拮抗剂的长效治疗最终导致抵抗性。
已经在前列腺癌的两种模型中以及在患者中观察到对醋酸阿比特龙和MDV3100的抵抗。原始数据表明，类似于去势抵抗性前列腺癌，对第二代抗雄激素的抵抗性通过多种机制发展，并且仍然认为AR在这种情况中保持为治疗靶。在异种移植模型和在患者中，已经在具抵抗性的群体中注意到CYP17A上调和皮克水平的雄激素的存在。推测CYP17A上调通过由瘤内雄激素合成导致的AR激活来促进抵抗性。在其他情况下，抵抗性与升高的AR水平以及核定位相关。另外，在不存在内源性配体的情况下，已知用于激活AR的众多细胞信号转导通路可促进对第二代疗法的抵抗性。观察到具有高水平激活的Src的肿瘤对MDV3100和醋酸阿比特龙治疗几乎没有响应支持该假说。迄今为止，尚无AR突变被描述为赋予对MDV3100、ARN-509或阿比特龙的抵抗。
ARN-509是使用构效关系(SAR)-导向的药物化学发现的合成硫代乙内酰脲化合物，以鉴定在AR表达增加的情况中保持完全拮抗剂活性的非甾体抗雄激素。ARN-509在前列腺癌的去势敏感模型和去势抵抗性异种移植模型中表现出抗肿瘤活性，并且在表型模拟去势的狗中表现出抗雄激素效应。
耐AR抑制剂的细胞系和突变体AR多肽的鉴定
本文描述了说明抗药性细胞系的产生的操作实例。在一些实施例中，所提供的方法用于产生对第二代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性的细胞系，所述第二代AR拮抗剂诸如但不限于ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)或RD162。在一些实施例中，所提供的方法用于产生对AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性的细胞系，所述AR拮抗剂抑制雄激素产生并且表现为结合至AR受体。在一些实施例中，抑制雄激素产生的AR拮抗剂是CYP17A抑制剂，并且表现为结合至AR。在一些实施例中，抑制雄激素产生并且表现出AR结合性的AR拮抗剂是galeterone(TOK001)或醋酸阿比特龙。在一些实施例中，抑制雄激素产生并且表现出AR结合性的AR拮抗剂是TAK-700。
如本文所述，通过暴露于不断增加浓度的抗雄激素类药ARN-509或MDV3100，在去势抵抗性前列腺癌(CRPC)细胞异种移植中在体内产生抵抗性细胞系，以及在雄激素响应性前列腺癌细胞系中在体外产生抵抗性细胞系。在细胞增殖和转录分析中，所述细胞系被分成两个不同的类别。
第1类细胞系与其亲本细胞系相比表达更高水平的AR，并且在不添加雄激素的情况下增殖。在ARN-509、MDV3100或比卡鲁胺的存在下，第1类细胞与配体无关的生长不发生改变。合成的雄激素R1881抑制第1类细胞的增殖，并且被MDV3100或ARN-509所拮抗，这表明这些细胞系中的AR仍然结合至MDV3100和ARN-509。
第2类抵抗性细胞系与其亲本细胞系类似，保持生长的雄激素依赖性。虽然ARN-509和MDV3100抑制亲本细胞系的增殖，但是这两种化合物都表现出激动剂活性并且促进第2类细胞系的增殖。对第2类细胞系中编码AR的核酸的分析显示该细胞系表达在配体结合域具有突变的突变体AR。所述突变是胸腺嘧啶(T)至胞嘧啶(C)的错义突变，所述错义突变导致在野生型AR的位置876处的苯丙氨酸至亮氨酸的氨基酸替换(F876L)。
如本文所述，在所述实例中，已鉴定了来自经历ARN-509 1/2阶段临床研究的前列腺癌患者的血浆样本中的AR基因突变。所鉴定的突变包括在野生型AR的位置876处的苯丙氨酸至亮氨酸的氨基酸替换(F876L)中，在位置2988(编码苯丙氨酸的密码子的第一位置，所述密码子在AR基因的外显子8中编码)处胸腺嘧啶(T)至胞嘧啶(C)的错义突变，以及在位置2990(编码苯丙氨酸的密码子的第三位置)处的胞嘧啶(C)至丙氨酸(A)的错义突变。在研究过程中，被鉴定为具有这些突变的患者还表现出升高的前列腺特异性抗原(PSA)水平，这指示对治疗的抵抗增加。
本文描述了含有在野生型AR的位置876处的苯丙氨酸至亮氨酸的氨基酸替换(F876L)的突变体AR多肽，以及编码所述多肽的核酸。本文还描述了制备本文所述的突变体AR核酸和多肽的方法。本文还描述了含有本文所述的突变体AR核酸和多肽的组合物、组合和试剂盒。本文还描述了使用该突变体AR多肽来鉴定突变体AR相互作用分子的方法，所述突变体AR相互作用分子包括雄激素抑制剂，包括第三代AR抑制剂化合物。还提供了含有该突变体AR相互作用分子的组合物，包括所述分子的药物组合物。还提供了使用该经鉴定的突变体AR相互作用分子进行治疗的方法。本文还描述了为合成核酸的突变体AR核酸。本文还描述了为cDNA分子的突变体AR核酸。本文还描述了由突变体AR核酸产生的突变体AR多肽，所述突变体AR核酸是合成核酸。本文还描述了由突变体AR核酸产生的突变体AR多肽，所述突变体AR核酸是cDNA分子。本文还描述了不含有AR基因组DNA的突变体AR核酸。本文还描述了未甲基化的突变体AR核酸。本文还描述了不含有AR内含子序列的突变体AR核酸。本文还描述了包含来自AR基因组序列的两个或更多个外显子的核苷酸序列的突变体AR核酸。在一些实施例中，该突变体AR核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码在对应于野生型AR多肽的位置876的位置处的苯丙氨酸。
如本文所述，AR中位置876处的突变(例如，F876L)的鉴定允许设计及筛选有效抑制具有一个或多个抵抗突变的突变体AR的抑制剂。此类抑制剂可用于临床和治疗应用。在一些实施例中，所述抑制剂可用于治疗癌症，例如AR介导的癌症，诸如前列腺癌、乳腺癌、肝(即，肝细胞)癌或膀胱癌，例如抗药性的前列腺癌、乳腺癌、肝(即，肝细胞)癌或膀胱癌。
如本文所述，在一些实施例中，筛选受检者以鉴定AR中位置876处的突变，例如F876L。在一些实施例中，此突变的鉴定允许为癌症治疗开处方或修改癌症治疗。在一些实施例中，此突变的鉴定被用于针对特定疗法对受检者分类，所述特定疗法是例如用抑制突变体AR的活性的抑制剂(即，第三代AR抑制剂)的疗法。在一些实施例中，此突变的鉴定被用于表征具有高的疾病或病症复发风险的受检者，所述疾病或病症诸如前列腺癌、乳腺癌、肝(即，肝细胞)癌或膀胱癌。在一些实施例中，此突变的鉴定被用于表征对特定AR抑制剂缺乏响应性的受检者，所述特定AR抑制剂诸如ARN-509、MDV3100或RD162。在一些实施例中，此突变的鉴定被用于表征对为CYP17A抑制剂的AR抑制剂缺乏响应性的受检者，所述抑制剂诸如galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙。
突变体AR多肽
本文提供突变体AR多肽。在一些实施例中，分离的突变体AR多肽是分离的突变体AR多肽。在一些实施例中，分离的突变体AR多肽是非天然的突变体AR多肽。在一些实施例中，分离的突变体AR多肽是重组的突变体AR多肽。在一些实施例中，本文提供的该突变体AR多肽表现出雄激素受体活性。例如，该突变体AR多肽结合至雄激素响应元件并促进AR响应性基因的表达。在一些实施例中，该突变体AR多肽含有赋予对抗雄激素的完全拮抗作用的抵抗的一个或多个氨基酸替换。在一些实施例中，该突变体AR多肽含有赋予对第二代AR抑制剂的完全拮抗作用的抵抗的一个或多个氨基酸替换，所述第二代AR抑制剂诸如但不限于ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)或RD162。在一些实施例中，该突变体AR多肽含有赋予对ARN-509的抑制作用的抵抗的一个或多个氨基酸替换。在一些实施例中，该突变体AR多肽含有赋予对恩杂鲁胺(MDV3100)的抑制作用的抵抗的一个或多个氨基酸替换。在一些实施例中，该突变体AR多肽含有赋予对RD162的抑制作用的抵抗的一个或多个氨基酸替换。
在一些实施例中，用第二代AR抑制剂处理本文提供的突变体AR多肽以诱导AR活性。例如，该第二代AR抑制剂用作该突变体AR多肽的激动剂。在一些实施例中，用ARN-509处理本文提供的突变体AR多肽以诱导AR活性。在一些实施例中，用恩杂鲁胺(MDV3100)处理本文提供的突变体AR多肽以诱导AR活性。在一些实施例中，用RD162处理本文提供的突变体AR多肽以诱导AR活性。
在一些实施例中，该突变体AR多肽在对应于SEQ ID NO：1(登录号P10275)中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876或SEQ ID NO：2(登录号NP_000035.2)中所示的野生型AR多肽的对应位置的位置处包含修饰。在一些实施例中，该修饰是在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处的苯丙氨酸的氨基酸替换。在一些实施例中，该突变体雄激素受体(AR)多肽在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处不包含苯丙氨酸。
在一些实施例中，该修饰是在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处的苯丙氨酸的氨基酸替换，并且替换后的氨基酸选自：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，该突变体雄激素受体(AR)多肽在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处包含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施例中，该修饰是在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处的苯丙氨酸的氨基酸替换，并且替换后的氨基酸选自：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。在一些实施例中，该突变体雄激素受体(AR)多肽在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处包含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或色氨酸。在一些实施例中，该修饰是在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处苯丙氨酸至亮氨酸的氨基酸替换。在一些实施例中，该突变体AR多肽在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处包含亮氨酸。
在一些实施例中，该修饰在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处包含苯丙氨酸的氨基酸缺失。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在对应于氨基酸位置876的位置处具有亮氨酸并且与具有SEQ ID NO：5中所示的序列的多肽具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的多肽。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在对应于氨基酸位置876的位置处不具有苯丙氨酸并且与具有SEQ ID NO：5中所示的序列的多肽具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性的多肽。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在氨基酸位置876处的修饰以及在一个或多个另外的氨基酸位置处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在氨基酸位置876处的修饰以及在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸位置处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰以及在一个另外的氨基酸位置处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在氨基酸位置876处的亮氨酸以及在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸位置处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸以及在一个另外的氨基酸位置处的修饰。在一些实施例中，在氨基酸位置876处的修饰是F876L替换。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰以及在另外的氨基酸位置处的修饰，所述另外的氨基酸位置处的修饰赋予对第一代或第二代AR拮抗剂或对抑制雄激素产生的AR拮抗剂的抵抗。在一些实施例中，与仅包含在氨基酸位置876处的修饰的AR多肽相比，除氨基酸位置876处的修饰以外的氨基酸位置修饰增加AR多肽对第一代或第二代AR拮抗剂或对抑制雄激素产生的AR拮抗剂的抵抗性。在一些实施例中，在氨基酸位置876处的修饰是F876L替换。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰以及选自在例如以下文献中描述的AR修饰的修饰：Grasso等人(2012)Nature487(7406)：239-43；Ning等人(2012)Urology 80(1)：216-8；Cong等人(2012)Gene 500(2)：220-3；Hay等人(2012)PLoS One 2012；7(3)：e32514；Koochekpour(2010)Asian J Androl.12(5)：639-57；Waltering等人(2012)Mol Cell Endocrinol.360：38-43；Robbins(2012)Mol Cell Endocrinol.352(1-2)：26-33；或Gottlieb等人(2012)Hum Mutat.33(5)：887-94。在一些实施例中，在氨基酸位置876处的修饰是F876L替换。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰，以及选自与去势抵抗性前列腺癌相关联的AR修饰的修饰。在一些实施例中，该与去势抵抗性前列腺癌相关联的修饰是氨基酸替换，该氨基酸替换诸如T877A、W741C、W741L、W741R、L701H或H874Y。在一些实施例中，在氨基酸位置876处的修饰是F876L替换。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在氨基酸位置876处的修饰和在氨基酸位置877处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置877处的修饰。在一些实施例中，在氨基酸位置877处的修饰是苏氨酸的氨基酸替换。在一些实施例中，在氨基酸位置877处的替换后氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，在氨基酸位置877处的替换后氨基酸是丙氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰和在氨基酸位置877处的丙氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置877处的丙氨酸。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰和在氨基酸位置741处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置741处的修饰。在一些实施例中，在氨基酸位置741处的修饰是色氨酸的氨基酸替换。在一些实施例中，在氨基酸位置741处的替换后氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，在氨基酸位置741处的替换后氨基酸是亮氨酸、半胱氨酸或精氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰和在氨基酸位置741处的亮氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰和在氨基酸位置741处的半胱氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰和在氨基酸位置741处的精氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置741处的亮氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置741处的半胱氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置741处的精氨酸。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰和在氨基酸位置701处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置701处的修饰。在一些实施例中，在氨基酸位置701处的修饰是亮氨酸的氨基酸替换。在一些实施例中，在氨基酸位置701处的替换后氨基酸选自异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，在氨基酸位置701处的替换后氨基酸是组氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰和在氨基酸位置701处的组氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置701处的组氨酸。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰和在氨基酸位置874处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置874处的修饰。在一些实施例中，在氨基酸位置874处的修饰是组氨酸的氨基酸替换。在一些实施例中，在氨基酸位置874处的替换后氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。在一些实施例中，在氨基酸位置874处的替换后氨基酸是酪氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的修饰和在氨基酸位置874处的酪氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在位置876处的亮氨酸和在氨基酸位置874处的酪氨酸。
在一些实施例中，该突变体AR多肽是AR多肽变体，相对于SEQ IDNO：1中所示的野生型AR多肽，该变体包含在位置876和一个或多个另外的氨基酸位置处的修饰。示例性的变体包括例如物种变体、等位变体、RNA剪接变体，以及含有保守和非保守氨基酸突变的变体。在一些实施例中，该AR多肽变体包含约6个连续的谷氨酰胺残基至约39个连续的谷氨酰胺残基的多聚谷氨酰胺尾巴。在一些实施例中，该AR多肽变体包含约16个连续的谷氨酰胺残基至约29个连续的谷氨酰胺残基的多聚谷氨酰胺尾巴。在一些实施例中，该AR多肽变体包含约21个连续的谷氨酰胺残基的多聚谷氨酰胺尾巴。在一些实施例中，该AR多肽变体包含约22个连续的谷氨酰胺残基的多聚谷氨酰胺尾巴。在一些实施例中，该AR多肽变体包含约23个连续的谷氨酰胺残基的多聚谷氨酰胺尾巴。在一些实施例中，该AR多肽变体包含约10个连续的甘氨酸残基至约27个连续的甘氨酸残基的聚甘氨酸尾巴。在一些实施例中，该AR多肽变体包含约23个连续的甘氨酸残基的聚甘氨酸尾巴。在一些实施例中，该AR多肽变体包含约24个连续的甘氨酸残基的聚甘氨酸尾巴。
在一些实施例中，该突变体AR多肽包含SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的一部分。在一些实施例中，该部分表现出AR多肽的活性。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含AR多肽的DNA结合域和该AR多肽的配体结合域，该配体结合域包含SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的氨基酸位置876处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽基本上由AR多肽的DNA结合域和该AR多肽的配体结合域组成，该配体结合域包含SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的氨基酸位置876处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含从SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的大约氨基酸位置554至大约氨基酸位置919的氨基酸序列。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含所述突变体AR多肽的配体结合域。在一些实施例中，该突变体AR多肽基本上由所述突变体AR多肽的配体结合域组成。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含从大约氨基酸位置554至大约氨基酸位置919的氨基酸序列。
在一些实施例中，AR多肽是包含所述AR多肽的配体结合域的融合蛋白，该配体结合域包含在SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876处的修饰，所述修饰连接至异源多肽。在一些实施例中，该修饰是F876L氨基酸替换。用于产生融合蛋白的方法是本领域已知的，并且所述方法包括标准重组DNA技术。例如，在一些实施例中，根据常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段框内连接在一起，例如通过使用平头(blunt-ended)或交错(stagger-ended)的末端来连接，限制性酶切以提供适当的末端，视需要补平粘性末端，进行碱性磷酸酶处理以避免不期望的接合，以及酶促连接。在一些实施例中，可通过包括自动DNA合成仪的常规技术来合成融合基因。在一些实施例中，可使用锚定引物来进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物导致两个连续的基因片段之间的互补突出端，该两个连续基因片段随后可退火和再扩增以产生嵌合基因序列(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑，JohnWiley&Sons：1992)。在一些实施例中，编码融合部分(例如，GST多肽)的表达载体是可商购获得的。可将编码经修饰AR多肽的核酸克隆进此类表达载体，使得融合部分可以框内连接至该经修饰AR多肽。
在一些实施例中，AR多肽是包含AR多肽的配体结合域的融合蛋白，该配体结合域包含在SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876处的修饰，该修饰连接至异源的DNA结合域。在一些实施例中，AR多肽是融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的配体结合域，该配体结合域连接至异源的DNA结合域。在一些实施例中，所述异源DNA结合域是GAL4 DNA结合域。在一些实施例中，所述异源DNA结合域是LexA DNA结合域。在一些实施例中，AR多肽的该配体结合域包含在SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876处的修饰，该修饰通过肽接头连接至异源的DNA结合域。在一些实施例中，AR多肽是融合蛋白，所述融合蛋白包含在SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的配体结合域，该配体结合域通过肽接头连接至异源的DNA结合域。
在一些实施例中，AR多肽是包含AR多肽的配体结合域的融合蛋白，该配体结合域包含在SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876处的修饰，该修饰连接至异源多肽以用于蛋白相互作用测定，所述测定诸如但不限于酵母双杂交测定、基于哺乳动物细胞的双杂交(M2H)系统、福斯特(荧光)共振能量转移(FRET)测定、生物发光共振能量转移(BRET)、或均相时间分辨荧光测定。在一些实施例中，AR多肽是融合蛋白，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的配体结合域，该配体结合域连接至异源肽以用于蛋白相互作用测定，所述测定诸如但不限于酵母双杂交测定、基于哺乳动物细胞的双杂交(M2H)系统、福斯特(荧光)共振能量转移(FRET)测定、生物发光共振能量转移(BRET)、或均相时间分辨荧光测定。
在一些实施例中，AR多肽的该配体结合域包含在SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876处的修饰，该修饰连接至可检测的多肽。在一些实施例中，SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的配体结合域连接至可检测的多肽。在一些实施例中，AR多肽的该配体结合域包含在SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876处的修饰，该修饰连接至荧光蛋白，所述荧光蛋白诸如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、或蓝色荧光蛋白(BFP)。在一些实施例中，SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的配体结合域连接至荧光蛋白，所述荧光蛋白诸如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、或蓝色荧光蛋白(BFP)。在一些实施例中，AR多肽的该配体结合域包含在SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876处的修饰，该修饰连接至生物发光蛋白。在一些实施例中，SEQID NO：5中所示的突变体AR多肽的配体结合域连接至生物发光蛋白。在一些实施例中，AR多肽的该配体结合域包含在SEQ lD NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876处的修饰，该修饰连接至肽标签。在一些实施例中，SEQ ID NO：5中所示的突变体AR多肽的配体结合域连接至肽标签。在一些实施例中，该肽标签是由标签特异性抗体识别的表位标签。在一些实施例中，该标签是表位标签，诸如但不限于c-myc、V-5、血细胞凝集素(HA)、FLAG。在一些实施例中该标签是亲和标签，诸如但不限于生物素、strep标签、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、或多聚组氨酸标签。
在一些实施例中，本文提供包含本文提供的突变体AR多肽的阵列。在一些实施例中，该突变体AR多肽结合至微芯片。在一些实施例中，该突变体AR多肽直接结合至微芯片。在一些实施例中，该突变体AR多肽通过接头间接地结合至微芯片。在一些实施例中，本文提供包含本文提供的突变体AR多肽的微芯片阵列。
核酸
本文提供编码突变体AR多肽的核酸。本文提供编码本文所述的任意突变体AR多肽的核酸。用于推导出编码特定多肽的核酸的方法是本领域已知的，并且涉及标准分子生物学技术。提供编码本文提供的突变体AR多肽的示例性核酸。应理解，由于遗传密码的简并性，存在编码相同多肽的多种变体核酸。编码本文提供的突变体AR多肽的核酸涵盖此类变体。在一些实施例中，该突变体AR核酸是合成的核酸。在一些实施例中，该突变体AR核酸是cDNA分子。在一些实施例中，该突变体AR核酸不含基因组DNA。在一些实施例中，该突变体AR核酸是未甲基化的。在一些实施例中，该突变体AR核酸不含AR基因组内含子序列。在一些实施例中，该突变体AR核酸包含来自AR基因组序列的两个或更多个外显子的核苷酸序列，该核苷酸序列包括外显子8或外显子8的一部分，所述外显子8或外显子8的一部分包含编码AR多肽的位置876的核酸序列。在一些实施例中，该突变体AR核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码在对应于野生型AR多肽的位置876的位置处的苯丙氨酸。
在一些实施例中，相对于编码野生型AR多肽的核酸，编码突变体AR多肽的核酸包含修饰。在一些实施例中，编码突变体AR多肽的核酸包含修饰，其中所编码的多肽包含在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处的苯丙氨酸的氨基酸替换。在一些实施例中，编码突变体AR多肽的核酸包含修饰，其中所编码的多肽在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处不包含苯丙氨酸。
在一些实施例中，该核酸修饰是编码多肽的一个或多个密码子的错义突变或缺失。在一些实施例中，该修饰为错义突变，所述错义突变改变编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子。在一些实施例中，编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子是TTC或TTT。在一些实施例中，编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子是TTC。在一些实施例中，编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子是TTT。在一些实施例中，该修饰将编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子从TTC改变成编码亮氨酸的核酸密码子。在一些实施例中，该修饰将编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子从TTT改变成编码亮氨酸的核酸密码子。在一些实施例中，编码亮氨酸的核酸密码子选自TTA、TTG、CTT、CTC、CTA或CTG。
在一些实施例中，该修饰是错义突变，该错义突变包含将胸腺嘧啶替换为胞嘧啶(C)。在一些实施例中，该修饰将编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子从TTC改变成CTC。在一些实施例中，该修饰是错义突变，该错义突变包含在SEQ ID NO：18中所示的AR核酸序列的核酸位置2626处将胸腺嘧啶(T)替换为胞嘧啶(C)。
在一些实施例中，该修饰是错义突变，该错义突变包含将胸腺嘧啶(T)替换为腺嘌呤(A)。在一些实施例中，该修饰将编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子从TTT改变成TTA。在一些实施例中，该修饰是错义突变，该错义突变包含在SEQ ID NO：18中所示的AR核酸序列的核酸位置2628处将胸腺嘧啶(T)替换为腺嘌呤(A)。
在一些实施例中，该修饰是错义突变，该错义突变包含将胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)。在一些实施例中，该修饰将编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子从TTT改变成TTG。在一些实施例中，该修饰是错义突变，该错义突变包含在SEQ ID NO：18中所示的AR核酸序列的核酸位置2628处将胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)。
在一些实施例中，该修饰包括错义突变，该错义突变包含在编码AR多肽的F876的密码子的第一位置处将胸腺嘧啶(T)替换为胞嘧啶(C)，以及第二错义突变，该第二错义突变包含在编码AR多肽的F876的密码子的第三位置处将胸腺嘧啶(T)替换为腺嘌呤(A)。在一些实施例中，该修饰将编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子从TTT改变成CTA。在一些实施例中，该修饰是错义突变，该错义突变包含在核酸位置2626处将胸腺嘧啶(T)替换为胞嘧啶(C)，以及第二错义突变，该第二错义突变包含在SEQ ID NO：18中所示的AR核酸序列的核酸位置2628处将胸腺嘧啶(T)替换为腺嘌呤(A)。
在一些实施例中，该修饰包括错义突变，该错义突变包含在编码AR多肽的F876的密码子的第一位置处将胸腺嘧啶(T)替换为胞嘧啶(C)，以及第二错义突变，该第二错义突变包含在编码AR多肽的F876的密码子的第三位置处将胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)。在一些实施例中，该修饰将编码AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸的核酸密码子从TTT改变成CTG。在一些实施例中，该修饰是错义突变，该错义突变包含在核酸位置2626处将胸腺嘧啶(T)替换为胞嘧啶(C)，以及第二错义突变，该第二错义突变包含在SEQ ID NO：18中所示的AR核酸序列的核酸位置2628处将胸腺嘧啶(T)替换为鸟嘌呤(G)。
在一些实施例中，编码该突变体AR多肽的核酸包含SEQ ID NO：19中所示的核苷酸序列。在一些实施例中，编码该突变体AR多肽的核酸包含与具有SEQ ID NO：19中所示的核苷酸序列的核酸具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性的核酸，其中相对于野生型AR多肽，所编码的突变体AR在对应于氨基酸位置876的位置处包含修饰。在一些实施例中，编码该突变体AR多肽的核酸包含与具有SEQ ID NO：19中所示的核苷酸序列的核酸具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性的核酸，其中所编码的突变体AR在对应于氨基酸位置876的位置处不包含苯丙氨酸。在一些实施例中，编码该突变体AR多肽的核酸包含与具有SEQ ID NO：19中提及的核苷酸序列的核酸具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的核酸序列同一性的核酸，其中所编码的突变体AR在对应于氨基酸位置876的位置处包含亮氨酸。
在一些实施例中，本文提供的编码突变体AR多肽的核酸是分离的核酸。在一些实施例中，本文提供的编码突变体AR多肽的核酸是DNA分子。在一些实施例中，本文提供的编码突变体AR多肽的核酸是cDNA分子。在一些实施例中，本文提供的编码突变体AR多肽的核酸是RNA分子。在一些实施例中，本文提供的编码突变体AR多肽的核酸是抑制性RNA分子(即，RNAi)。在一些实施例中，本文提供的核酸是核酸分子，该核酸分子与编码突变体AR多肽的核酸互补或结合至该编码突变体AR多肽的核酸。
在一些实施例中，本文提供的编码突变体AR多肽或突变体AR多肽的一部分的核酸包含编码不是苯丙氨酸的位置876处的氨基酸的核酸。在一些实施例中，本文提供的编码突变体AR多肽或突变体AR多肽的一部分的核酸包含编码氨基酸位置876处的亮氨酸的核酸。
在一些实施例中，本文提供的核酸是编码突变体AR多肽的一部分的寡核苷酸。在一些实施例中，本文提供的核酸是编码突变体AR多肽的一部分的寡核苷酸，该寡核苷酸含有编码对应于氨基酸位置876的氨基酸的核苷酸密码子。在一些实施例中，该密码子编码不是苯丙氨酸的氨基酸。在一些实施例中，该密码子编码为亮氨酸的氨基酸。
在一些实施例中，本文提供的核酸是载体，该载体包含编码本文提供的任意突变体AR多肽的核酸。在一些实施例中，本文提供的核酸是载体，该载体包含编码本文提供的任意突变体AR多肽的核酸，该载体是表达载体。在一些实施例中，本文提供的核酸是载体，该载体包含编码本文提供的任意突变体AR多肽的核酸，该载体可操作地连接至启动子以用于该突变体AR多肽的表达。
在一些实施例中，该载体是质粒载体。在一些实施例中，该载体是病毒载体。在一些实施例中，该病毒载体是DNA或RNA病毒载体。示例性的病毒载体包括但不限于牛痘、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、逆转录病毒、或疱疹病毒载体。
在一些实施例中，本文提供了包含编码本文提供的任意突变体AR多肽的核酸的阵列。在一些实施例中，该突变体AR核酸结合至微芯片。在一些实施例中，该突变体AR核酸直接结合至微芯片。在一些实施例中，该突变体AR核酸通过连接基间接地结合至微芯片。在一些实施例中，本文提供了包含编码本文提供的任意突变体AR多肽的核酸的微芯片阵列。
核酸和多肽的制备
在一些实施例中，编码本文提供的突变体AR多肽的分离的核酸分子是通过标准重组方法产生的。在一些实施例中，编码本文提供的突变体AR多肽的分离的核酸分子是通过来自基因组DNA的突变体AR序列的扩增产生的。在一些实施例中，编码本文提供的突变体AR多肽的分离的核酸分子是通过使用AR序列特异性引物的聚合酶链反应产生的。在一些实施例中，编码本文提供的突变体AR多肽的分离的核酸分子是通过编码突变体AR多肽的mRNA的逆转录产生的。
在一些实施例中，将编码本文提供的突变体AR多肽的分离的核酸分子插入表达载体并且在宿主细胞或非细胞提取物中表达。在一些实施例中，将编码本文提供的突变体AR多肽的分离的核酸分子可操作地连接至启动子以用于在细胞或非细胞提取物中表达所编码的多肽。在一些实施例中，该启动子是组成型启动子。在一些实施例中，该启动子是诱导型启动子。
在一些实施例中，编码本文提供的突变体AR多肽的核酸分子对于细胞来说是“外源的”，这意味着对于载体待引入的细胞来说该核酸分子是外来的，或意味着该序列与细胞中的序列同源，但是处在宿主细胞核酸之内该序列通常不存在的位置中。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)以及人工染色体(例如，YAC)。通过标准重组技术，本领域技术人员将很好地准备来构建载体，所述技术在Sambrook等人，1989和Ausubel等人，1996中有所描述，两者均以引用方式并入本文。
用于细胞中蛋白的表达的方法在本领域中是已知的，并且包括例如细胞中的表达，该细胞诸如动物和植物细胞。用于表达本文提供的突变体AR多肽的示例性动物细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞例如人细胞、灵长类动物细胞、啮齿动物细胞、牛科动物细胞和绵羊科动物细胞。在一些实施例中，编码该突变体AR的核酸被整合至宿主细胞的基因组中。
在一些实施例中，用于表达本文提供的突变体AR多肽的方法包括：培养含有编码突变体AR多肽的表达载体的宿主细胞，使得由细胞产生该突变体AR多肽。在一些方法中，将编码该突变多肽的核酸连接至编码信号序列的核酸，使得该信号序列被表达为具有该突变体AR多肽的融合肽。在一些实施例中，该信号序列使得宿主细胞能分泌该突变体AR多肽。
在一些实施例中，从表达突变多肽的宿主细胞分离该突变体AR多肽。在一些实施例中，从该宿主细胞制备提取物并且通过纯化方法分离该突变体AR多肽，所述纯化方法诸如但不限于色谱法或用对于AR多肽具有特异性或尤其对于突变体AR多肽具有特异性的抗体的免疫亲和法。
抗体
在一些实施例中，该抗体结合至本文提供的突变体AR多肽，并且以较低的亲和性结合至或不结合至野生型AR多肽。在一些实施例中，在第二代抑制剂的存在下，该抗体结合至突变体AR多肽，所述第二代抑制剂诸如但不限于ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)或RD162。
在一些实施例中，使用特异性地识别突变体AR多肽而不识别野生型AR多肽的抗体来检测本文提供的突变体AR多肽。在一些实施例中，使用特异性地识别在氨基酸位置876处具有亮氨酸的突变体AR多肽而不识别野生型AR多肽的抗体来检测本文提供的突变体AR多肽。在一些实施例中，抗体是针对本文提供的一个或多个等位型突变体AR多肽而产生的。使用特异性蛋白或寡肽作为抗原来诱导特异性地识别肽或蛋白上的表位的抗体的技术是众所周知的。在一个实施例中，所需等位型靶基因的DNA序列通过以下方式被拷贝：插入至适当的表达载体中并且在原核或真核宿主细胞中翻译成蛋白。该蛋白可被回收并且用作抗原来诱导特异性抗体的产生。在另一个实施例中，所需等位型靶基因的DNA通过PCR技术扩增，并且随后在体外被翻译成蛋白，以用作抗原来诱导特异性抗体的产生。在另一个实施例中，该交互等位基因的DNA序列用作生成合成肽的基础，该合成肽代表等位基因的氨基酸序列，该合成肽用作抗原以诱导特异性抗体的产生。
在一些实施例中，抗体是利用标准单克隆抗体技术产生的，或是通过基于重组的表达体系产生的。一般来讲参见Abbas、Lichtman和Pober，Cellular and Molecular Immunology，W.B.Saunders Co.(1991)。术语“抗体”意指包括完整的抗体分子以及抗体片段或衍生物，诸如Fab和F(ab′)2，其能够特异性地结合至抗原。这样产生的抗体优选地仅结合至以等位型产生的突变蛋白，所述突变蛋白用作抗原以产生抗体。在美国专利6,200,754和美国专利6,054,273中也描述了产生等位基因特异性抗体的方法，所述专利的全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施例中，本文提供的抗体是人源化抗体。“人源化抗体”是指一种基因工程抗体，该抗体具有衍生自非人供体免疫球蛋白的CDR，该分子的剩余免疫球蛋白衍生部分衍生自一个或多个人免疫球蛋白。在一些实施例中，改变框架支持残基以保留结合亲和性(参见例如，Queen等人，Proc.Natl.Acad Sci USA，86：10029-10032(1989)，Hodgson等人，Bio/Technology，9：421(1991))。在一些实施例中，适当的人受体抗体是选自传统数据库并且与供体抗体的核酸和氨基酸序列同源的一种抗体，所述数据库是例如数据库、Los Alamos数据库和Swiss蛋白数据库。在一些实施例中，以与供体抗体的框架区同源(在氨基酸基础上)为特征的人抗体适用于提供重链恒定区和/或重链可变框架区以用于供体CDR的插入。在一些实施例中，能够提供轻链恒定或可变框架区的适当受体抗体以类似方式选择。在一些实施例中，所述受体抗体重链和轻链源自相同的受体抗体。在一些实施例中，所述受体抗体重链和轻链源自不同的受体抗体。现有技术描述了产生这种人源化抗体的若干方法-参见例如，EP-A-0239400和EP-A-054951。
在一些实施例中，对于本文提供的突变体AR多肽具有特异性的抗体可用于使用本领域中已知的技术来检测样本中本文提供的突变体AR多肽的存在，所述样本是例如测定样本、细胞样本、细胞提取物、生物样本或患者样本。这些技术包括例如蛋白印迹法、免疫组织化学法、间接免疫荧光法以及抗体微阵列法。在一些实施例中，特异性识别突变体AR多肽的抗体是第三代AR抑制剂。在一些实施例中，可使用本文描述的鉴定第三代AR抑制剂的方法来确定特异性识别突变体AR多肽的抗体抑制突变体AR多肽的生物活性的能力。
用于检测突变体AR多肽和编码突变体AR多肽的核酸的诊断分析法
本文提供的诊断方法涉及对受检者中的突变体AR多肽进行检测或对编码受检者中的突变体AR多肽的核酸进行检测。在一些实施例中，受检者患有AR介导的疾病或病症。在一些实施例中，诊断方法用于筛选对用抗雄激素类药(诸如，第一代或第二代AR拮抗剂)的疗法具有抵抗性的癌症患者，鉴定用于用抗雄激素类药(诸如，第一代或第二代AR拮抗剂)治疗的受检者，监测对正接受抗雄激素类药(诸如，第一代或第二代AR拮抗剂)疗法的受检者的疗法，优化正接受抗雄激素类药(诸如，第一代或第二代AR拮抗剂)疗法的受检者的疗法，以及它们的组合。在一些实施例中，该方法包括选择用第三代AR拮抗剂的疗法的受检者。在一些实施例中，该方法还包括向受检者施用如本文所描述的第三代AR拮抗剂。在一些实施例中，该检测到的突变体AR多肽在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处包含修饰。在一些实施例中，该检测到的突变体AR多肽包含在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处苯丙氨酸至亮氨酸的氨基酸替换。在一些实施例中，具有包含在氨基酸位置876处的修饰的突变体AR多肽的受检者具有对第一代或第二代拮抗剂的抑制作用的抵抗性。
在一些实施例中，具有包含在氨基酸位置876处的修饰的突变体AR多肽的受检者具有对第一代或第二代拮抗剂的抑制作用的抵抗性。在一些实施例中，具有包含在氨基酸位置876处的修饰的突变体AR多肽的受检者具有对第一代和第二代拮抗剂的抑制作用的抵抗性。在一些实施例中，具有包含在氨基酸位置876处的亮氨酸的突变体AR多肽的受检者具有对第一代或第二代拮抗剂的抑制作用的抵抗性。在一些实施例中，具有包含在氨基酸位置876处的亮氨酸的突变体AR多肽的受检者具有对第一代和第二代拮抗剂的抑制作用的抵抗性。在一些实施例中，具有包含在氨基酸位置876处的修饰的突变体AR多肽的受检者具有对CYP17A抑制剂的抑制作用的抵抗性，该CYP17A抑制剂结合至AR，该CYP17A抑制剂为例如galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙。在一些实施例中，具有包含在氨基酸位置876处的修饰的突变体AR多肽的受检者具有对CYP17A抑制剂的抑制作用的抵抗性，该CYP17A抑制剂结合至AR，该CYP17A抑制剂为例如galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙。
在一些实施例中，提供表征受检者中对第二代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性的AR多肽的方法，该方法包括：(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将所述AR表征为对第二代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该方法还包括不施用第二代AR拮抗剂。在一些实施例中，该方法还包括如果受检者不具有该修饰，则施用第二代AR拮抗剂。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供表征受检者中对第一代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性的AR的方法，该方法包括：(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ IDNO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将所述AR表征为对第一代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该方法还包括不施用第二代AR拮抗剂。在一些实施例中，该方法还包括如果受检者不具有该修饰，则施用第二代AR拮抗剂。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本。
在一些实施例中，提供表征受检者中对AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性的AR的方法，其中该AR拮抗剂是CYP17A抑制剂，该方法包括：(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将所述AR表征为对是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该方法还包括不施用第二代AR拮抗剂。在一些实施例中，该方法还包括如果受检者不具有该修饰，则施用第二代AR拮抗剂。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该CYP17A抑制剂是galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本。
在一些实施例中，提供用于选择用第二代AR拮抗剂的疗法的受检者的方法，该方法包括(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者不具有该修饰，则将该受检者表征为用第二代AR拮抗剂的疗法的候选者。在一些实施例中，该方法还包括：如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为不是用第二代AR拮抗剂的疗法的候选者。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于选择用第一代AR拮抗剂的疗法的受检者的方法，该方法包括(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者不具有该修饰，则将该受检者表征为用第一代AR拮抗剂的疗法的候选者。在一些实施例中，该方法还包括：如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为不是用第一代AR拮抗剂的疗法的候选者。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于选择用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的疗法的受检者的方法，该方法包括(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰，以及(b)如果受检者不具有该修饰，则将该受检者表征为用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的疗法的候选者。在一些实施例中，该方法还包括：如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为不是用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的疗法的候选者。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该CYP17A抑制剂是galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于选择用第三代AR拮抗剂的疗法的受检者的方法，该方法包括(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为用第三代AR拮抗剂的疗法的候选者。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于确定受检者是否对用第二代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或可能变得对用第二代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性的方法，该方法包括：(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为对用第二代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或可能变得对用第二代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR抑制剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于确定受检者是否对用第一代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或可能变得对用第一代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性的方法，该方法包括：(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为对用第一代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或可能变得对用第一代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR抑制剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于确定受检者是否对用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或可能变得对用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的疗法具有抵抗性的方法，该方法包括：(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为对用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或可能变得对用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的疗法具有抵抗性。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR抑制剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该CYP17A抑制剂是galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于监测正接受第二代AR拮抗剂来治疗癌症的受检者是否已发展出或将发展出对该疗法的抵抗的方法，该方法包括(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为对用第二代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或将变得对用第二代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于监测正接受第一代AR拮抗剂来治疗癌症的受检者是否已发展出或将发展出对该疗法的抵抗的方法，该方法包括(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为对用第一代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或将变得对用第一代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于监测正接受是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂来治疗癌症的受检者是否已发展出或将发展出对该疗法的抵抗的方法，该方法包括(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则将该受检者表征为对用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或将变得对用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的疗法具有抵抗性。在一些实施例中，该方法还包括施用本文提供的第三代AR拮抗剂来抑制突变体AR。在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有前列腺癌。在一些实施例中，该受检者患有去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该CYP17A抑制剂是galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于优化正接受第二代AR拮抗剂来治疗癌症的受检者的疗法的方法，该方法包括：(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ IDNO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受检者具有该修饰，则停止用第二代AR拮抗剂来治疗，或如果受检者不具有该修饰，则继续用第二代AR拮抗剂来治疗。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于优化正接受第一代AR拮抗剂来治疗癌症的受检者的疗法的方法，该方法包括：(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ IDNO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果该受检者具有该修饰，则停止用第一代AR拮抗剂来治疗，或如果受检者不具有该修饰，则继续用第一代AR拮抗剂来治疗。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，提供用于优化正接受是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂来治疗癌症的受检者的疗法的方法，该方法包括：(a)分析来自受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及(b)如果受检者具有该修饰，则停止用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂来治疗，或如果受检者不具有该修饰，则继续用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂来治疗。在一些实施例中，该CYP17A抑制剂是galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙。在一些实施例中，该方法还包括从受检者获取核酸样本的步骤。
在一些实施例中，该经修饰的AR对用第二代AR拮抗剂的完全拮抗作用具有抵抗性，所述第二代AR拮抗剂是诸如ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)或RD162。在一些实施例中，第二代AR拮抗剂，诸如ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)或RD162，表现出对经修饰的AR的激动剂活性。在一些实施例中，该经修饰的AR对用第一代AR拮抗剂的完全拮抗作用具有抵抗性。在一些实施例中，该经修饰的AR对用是CYP17A抑制剂的AR拮抗剂的完全拮抗作用具有抵抗性。
在一些实施例中，受检者具有AR依赖性或AR介导的疾病或病症。在一些实施例中，AR依赖性或AR介导的疾病或病症是良性前列腺增生症，多毛症，痤疮，腺瘤以及前列腺肿瘤，含有AR的良性或恶性肿瘤细胞，超多毛症，脂溢性皮炎，子宫内膜异位症，多囊卵巢综合征，雄激素性脱发，性腺机能减退，骨质疏松症，对精子生成、性欲的抑制，恶病体质，厌食，对年龄相关的睾酮水平降低的雄激素补充，前列腺癌，乳腺癌，膀胱癌，肝癌，子宫内膜癌，子宫癌，脸潮红，肯尼迪病，肌肉萎缩和无力，皮肤萎缩，骨质疏松，贫血，动脉硬化，心血管疾病、能量流失，幸福感丧失，2型糖尿病或腹内脂肪堆积。
在一些实施例中，该受检者患有癌症。在一些实施例中，该受检者患有实体瘤。在一些实施例中，该癌症是前列腺癌、乳腺癌、肝癌或膀胱癌。在一些实施例中，该癌症是前列腺癌。
在一些实施例中，该样本源于生物体的任意组织或流体。样本包括但不限于全血、分离的骨髓、骨髓穿刺液、胸膜液、腹膜液、中枢脊髓液、腹腔液、胰液、脑脊液、脑液、腹水、心包液、尿液、唾液、支气管灌洗液、汗液、泪液、耳朵流出物、痰、鞘膜积液、精液、阴道流出物、乳汁、羊水，以及呼吸道、肠道或泌尿生殖道的分泌物。在特定实施例中，该样本是肿瘤活检样本。在特定实施例中，该样本来自是淋巴系统或循环系统的一部分，或与该淋巴系统或循环系统相关联的流体或组织。在一些实施例中，该样本是血液样本，该血液样本是静脉血样本、动脉血样本、外周血样本、组织血样本、脐带血样本。在特定实施例中，该样本是血清样本。在一些实施例中，该样本包含一个或多个循环肿瘤细胞(CTC)。在一些实施例中，该样本包含一个或多个播散肿瘤细胞(DTC，例如在骨髓穿刺液样本中)。
用于从组织和流体样本所含的细胞中分离核酸和蛋白的方法在本领域中是熟知的。在特定实施例中，从受检者肿瘤活检所含的细胞中分离从受检者获取的核酸样本。在特定实施例中，从骨髓穿刺液中的细胞分离从受检者获取的核酸样本。在特定实施例中，从含细胞的血清样本中分离从受检者获取的核酸样本。在特定实施例中，从含细胞的淋巴液样本中分离从受检者获取的核酸样本。
在一些实施例中，通过使用熟知和常规临床方法获取样本的任何合适方法来从受检者获取样本。从受检者获取流体样本的程序是熟知的。例如，用于抽取和处理全血和淋巴液的程序是熟知的，并且可用于获取用于所提供的方法的样本。通常，为采集血液样本，可以将抗凝血剂(例如，EDTA，或柠檬酸盐和肝素或CPD(柠檬酸盐、磷酸盐、葡萄糖)或类似的物质)添加至样本以防止血液的凝结。在一些例子中，将血液样本采集在含有一定量的EDTA的采集管中以防止血液样本的凝结。
在一些实施例中，该样本是组织活检，并且例如通过针吸活检、CT引导的针吸活检、穿刺活检、内窥镜活检、支气管镜活检、支气管灌洗、切取活检、切除活检、钻取活检、刮取活检、皮肤活检、骨髓活检、以及环形电外科切除术(LEEP)获取。通常所获得的无坏死、无菌的活检或样品大于100mg，但是该活检或样品也可以更小，诸如小于100mg、50mg或更小、10mg或更小，或5mg或更小；或更大，诸如大于100mg、200mg或更大、或500mg或更大、1gm或更大、2gm或更大、3gm或更大、4gm或更大、或5gm或更大。待提取以用于测定的样本大小取决于许多因素，所述因素包括但不限于待执行的测定次数、组织样本的完好程度、癌症类型、以及患者的病症。在一些实施例中，所述组织被置放于无菌容器中并且被任选地浸入适当的培养基中，所述无菌容器为诸如无菌管或无菌培养板。通常，通过机械装置和/或本领域中熟知的酶处理将所述细胞分离成细胞悬液。通常，采集所述细胞并随后使其经受核酸分离的标准程序以用于测定。
在一些实施例中，以规律的时间间隔从受检者获取样本，所述时间间隔为诸如一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、每日、每周、每月、每季度、每半年或每年。在一些实施例中，以与用一种或更多种抗癌药治疗相关的预先确定的时间或规律的时间间隔来执行样本采集。在一些实施例中，以与用AR拮抗剂(诸如，第一代或第二代AR拮抗剂)治疗相关的预先确定的时间或规律的时间间隔来执行样本采集。例如，在治疗之前、在治疗期间、在治疗之后或在连续治疗之间以预先确定的时间或规律的时间间隔来采集样本。在特定例子中，在施用抗癌疗法之前从受检者获取样本，并且随后在治疗已经起效之后以规律的时间间隔再次从受检者获取样本。在特定例子中，在施用AR拮抗剂(诸如，第一代或第二代AR拮抗剂)疗法之前从受检者获取样本，并且随后在治疗已经起效之后以规律的时间间隔再次从受检者获取样本。在一些实施例中，该AR拮抗剂选自：比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺、尼鲁米特、ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162。在一些实施例中，该AR拮抗剂是CYP17A抑制剂。在一些实施例中，该CYP17A抑制剂选自galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙。
流体样本的体积可以为适用于在所提供的方法中检测AR突变的任何体积。在一些例子中，流体样本的体积取决于所使用的具体测定方法。例如，具体的测定方法可取决于各种因素而需要较大或较小的流体样本体积，所述因素诸如但不限于所使用的设备或方法的容量，以及所述测定方法的通量水平。在一些例子中，在应用所述测定方法之前，在适当的培养基中稀释流体样本。在一些例子中，从受检者获取流体样本，并且在所述测定方法中使用该样本的一部分或等分试样。在应用所述测定方法之前，可以在适当的培养基中稀释所述部分或等分试样。
在一些实施例中，该样本是从哺乳动物受检者获取的。示例性哺乳动物受检者包括但不限于灵长类，诸如人、猿和猴子；啮齿类，诸如小鼠、大鼠、兔子和白鼬；反刍动物，诸如山羊、奶牛、鹿和绵羊；马、猪、狗、猫和其他动物。在一些实施例中，该样本是从患者获取的。在一些例子中，患者是人患者。
在一些实施例中，从受检者获得的核酸样本是基因组核酸样本。在一些实施例中，从受检者获得的核酸样本是RNA样本。在一些实施例中，从RNA样本中的总RNA中分离mRNA。在一些实施例中，RNA样本被逆转录成cDNA。在一些实施例中，通过核酸扩增方法来扩增基因组核酸样本。在一些实施例中，核酸扩增方法是聚合酶链反应(PCR)。在一些实施例中，使用一组对于AR基因具有特异性的核苷酸引物扩增基因组核酸样本。在一些实施例中，该组核苷酸引物位于编码AR多肽的氨基酸位置876的核酸序列的两侧。在一些实施例中，扩增产物是编码AR多肽的氨基酸位置876的核酸。在一些实施例中，序列特异性引物缀合至可检测的分子，所述分子为诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射标记、酶标记、可检测的底物，或结合到第二可检测分子的肽或分子。
在一些实施例中，测定包括对核酸样本测序。在一些实施例中，首先通过方法(诸如，使用序列特异性引物的聚合酶链反应(PCR))扩增核酸样本中编码AR的核酸，并且随后对经扩增的PCR片段进行测序。用于本文提供的方法中的示例性测序方法在本领域中是熟知的，并且包括但不限于双脱氧法或链终止方法、马克萨姆-吉尔伯特测序法(Maxam-Gilbertsequencing)、大规模平行测序技术(或MPSS)、聚合酶克隆测序、焦磷酸测序、Illumina染色测序、SOLiD测序(或以接合法测序)、离子半导体测序、DNA纳米球测序、heliscope测序、以及单分子实时(SMRT)测序。
在一些实施例中，所述样本是含有循环肿瘤DNA(ctDNA)、RNA(ctRNA)或微RNA的血浆或血清样本(参见例如，Chan等人(2007)BrJ Cancer.96(5)：681-5)。在一些实施例中，编码突变体AR的DNA通过BEAMing(微珠、扩增、乳液、磁学)PCR测序方法(参见例如，Li等人(2006)Nat Methods.3(2)：95-7；Li等人(2006)Nat Methods.3(7)：551-9；以及Diehl等人(2008)Nat Med.14(9)：985-990)进行评估。BEAMing是一种其中将单个DNA分子附接到油包水乳液中的磁珠并且随后经受区室化PCR扩增的技术。结合至微珠的DNA的突变状态随后通过杂交至用于突变体或野生型AR的荧光等位基因特异性探针来确定。随后使用流式细胞技术量化血浆或血清中存在的突变DNA的水平(参见例如，Higgins等人(2012)Clin Cancer Res 18：3462-3469)。
在一些实施例中，测定样本以用于检测编码突变体AR的DNA的存在包括：用对于编码突变体AR而非野生型AR的核酸具有特异性的序列特异性寡核苷酸探针检测突变。在一些实施例中，测定包括：(a)使样本与突变体AR核酸序列特异性寡核苷酸探针接触，从而如果在所述样本中存在所述突变核酸序列，则将形成探针-DNA复合物，以及(b)检测该探针-DNA复合物。在一些实施例中，该寡核苷酸探针对于编码在对应于AR多肽的氨基酸位置876的位置处的亮氨酸的核酸具有特异性。在一些实施例中，该序列特异性探针缀合至可检测的分子，所述分子为诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射标记、酶标记、可检测的底物，或结合到第二可检测分子的肽或分子。
在一些实施例中，单核苷酸改变可通过使用基于PCR的酶切扩增多态性序列(CAPS)标志物的PCR来检测，所述标志物使突变序列中产生限制性位点(Michaels等人(1998)Plant J.14(3)：381-5)，或通过附接至可检测部分的序列特异性发夹探针来检测，所述可检测部分诸如但不限于荧光团(Mhlanga和Malmberg(2001)Methods 25：463-471)。在一些实施例中，该序列特异性探针缀合至可检测的分子，所述分子为诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射标记、酶标记、可检测的底物，或结合到第二可检测分子的肽或分子。在一些实施例中，该寡核苷酸探针对于编码在对应于AR多肽的氨基酸位置876的位置处的亮氨酸的核酸具有特异性。
在一些实施例中，测定样本以用于检测编码突变体AR的DNA的存在是使用寡核苷酸阵列来执行的(参见例如，Hastia等人(1999)J MedGenet.36(10)：730-6)。在一些实施例中，将来自受检者的含核酸的样本直接杂交至芯片。在一些实施例中，使用扩增方法扩增来自受检者的含核酸的样本，该扩增方法为诸如但不限于聚合酶链反应(PCR)，并且将该经扩增的核酸杂交至芯片。在一些实施例中，寡核苷酸阵列被包含在微芯片上。在一些实施例中，单核苷酸变化可使用微芯片检测。
在一些实施例中，测定样本包括：用对于突变体AR多肽具有特异性的抗体检测突变。在一些实施例中，检测突变体AR多肽的方法包括从受检者获取样本，其中该样本包含AR多肽；以及通过使该样本与抗体接触来测试该样本中突变体AR多肽的存在，所述抗体对于结合至该突变体AR多肽具有特异性并且不结合至或以降低的亲和性结合至野生型AR多肽，其中该突变体AR多肽的存在会产生抗体-突变体AR多肽复合物。在一些实施例中，所述方法还包括检测抗体-突变体AR多肽复合物。在一些实施例中，所述方法还包括用检测试剂检测抗体-突变体AR多肽复合物。在一些实施例中，该突变体AR特异性抗体缀合至可检测的分子，所述分子为诸如荧光标记、生物发光标记、化学发光标记、放射标记、酶标记、可检测的底物，或结合到第二可检测蛋白(例如，第二抗体)的肽或分子。在一些实施例中，通过测定所述可检测的分子来检测该突变体AR特异性抗体的结合。在一些实施例中，通过使用第二(例如，抗IgG)抗体来检测该突变体AR特异性抗体的结合。在一些实施例中，该样本是肿瘤活检样本、骨髓穿刺液、血液样本、血清样本、或淋巴液样本。
与突变体雄激素受体相互作用的分子的鉴定
本文提供了使用该突变体AR多肽筛选抑制所述突变受体(即，第三代AR抑制剂化合物)的化合物的方法。在一些实施例中，所述方法用于鉴定用于癌症治疗的第三代AR抑制剂化合物。在一些实施例中，所述方法用于鉴定用于抵抗性癌症治疗的第三代AR抑制剂化合物，所述抵抗性癌症为诸如对用第二代AR拮抗剂治疗具有抵抗性的前列腺癌，所述第二代AR拮抗剂为诸如ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)或RD162。
在一些实施例中，用于鉴定第三代AR抑制剂化合物的方法包括(a)在细胞中表达本文提供的突变体AR多肽，(b)使该细胞与测试化合物接触，以及(c)检测该细胞中的AR活性水平。在一些实施例中，在使细胞与测试化合物接触之前或同时，使该细胞与AR激动剂接触。在一些实施例中，在使细胞与测试化合物接触之前，使该细胞与AR激动剂接触约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时或更长时间。在一些实施例中，在使细胞与测试化合物接触的同时使该细胞与AR激动剂接触。在一些实施例中，所述AR激动剂选自美曲勃龙(R1881)、DHT、米勃酮(Mb)和睾酮。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处的氨基酸替换。在一些实施例中，该突变体AR多肽在多肽中的氨基酸位置876处不含有苯丙氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽在多肽中的氨基酸位置876处含有亮氨酸。
在一些实施例中，使用可以用编码该突变体AR多肽的核酸转染并且可监测其中的AR活性的细胞系。在一些实施例中，该细胞不表达野生型AR。在一些实施例中，该细胞表达低水平的野生型AR。在一些实施例中，该细胞表达内源性的突变体AR多肽。在一些实施例中，该内源性的突变体AR多肽包含在对应于野生型AR多肽的氨基酸877的氨基酸处的修饰。在一些实施例中，该内源性的突变体AR多肽包含在氨基酸位置877处将苏氨酸替换成丙氨酸(T877A)的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在对应于野生型AR多肽的氨基酸874的氨基酸处的修饰。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在氨基酸位置874处将组氨酸替换成酪氨酸(H874Y)的修饰。在一些实施例中，该细胞选自HeLa、CV1、COS7、HepG2、HEK-293、DU145、PC3和TSY-PR1。在一些实施例中，该细胞系是前列腺癌细胞系。在一些实施例中，该细胞系选自CWR、LNCaP、VCaP和LAPC4。
在一些实施例中，该细胞稳定地表达该突变体AR多肽。在一些实施例中，编码该突变体AR的核酸被整合至该细胞的基因组中。
在一些实施例中，使用可操作地连接至AR响应性启动子的报告基因来检测AR活性水平。在一些实施例中，AR响应性启动子包括突变体AR多肽所结合至的一个或多个雄激素响应元件(ARE)。在一些实施例中，启动子选自腺血管舒缓素启动子(probasin，Pb)、前列腺特异性抗原(PSA)、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(MMTV LTR)、脂肪酸合酶(FASN)、前列腺的六跨膜上皮抗原4(STEAP4)、跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)、α-1-酸性糖蛋白1(ORM1)、或人同源盒基因NKX3.1启动子。在一些实施例中，该启动子是含有一个或多个ARE的合成启动子。
在一些实施例中，该AR响应性启动子可操作地连接至编码可检测蛋白的合适的报告基因。示例性的可检测蛋白包括但不限于荧光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、以及氯霉素乙酰转移酶。在一些实施例中，相比于合适的对照，在暴露于测试化合物之后报告基因表达的减少指示测试化合物有效抑制该突变体AR多肽。在一些实施例中，所述对照是在使细胞暴露于所述测试化合物之前报告基因的基础表达。在一些实施例中，使用从测试细胞制备的细胞提取物测定所述报告基因的表达。
在一些实施例中，通过测量细胞中一个或多个内源性的雄激素响应性基因的表达来检测AR活性水平。在一些实施例中，响应于雄激素治疗，该雄激素响应性基因上调(即，被诱导)。在一些实施例中，响应于雄激素治疗，该雄激素响应性基因下调(即，被抑制)。示例性的雄激素响应性基因包括但不限于前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺蛋白、蜗牛同源物2(SLUG)、跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)、前列腺家族成员的六跨膜上皮抗原4(STEAP4)、FK506结合蛋白5(FKBP5)、血清粘蛋白1/α-1-酸性糖蛋白1(ORM1)、溶质载体家族35(SLC35F2/NOV)、胰岛素样生长因子I(IGF-1)、IGF结合蛋白-3和IGF结合蛋白-5、CCAAT-增强子结合蛋白-δ、第10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)、FASN、NKX3.1、AMIGO2、BDNF、CAMK2N1、HPGD、NCAPD3、PLD1、IL-15、IL-18、以及ERBB2/HER2。
在一些实施例中，通过测量一个或多个内源性基因的表达来检测AR活性水平，所述内源性基因通过暴露于雄激素或AR激动剂而被诱导。在一些实施例中，相比于合适的对照，在暴露于测试化合物之后一个或多个雄激素诱导基因表达的减少指示测试化合物有效抑制该突变体AR多肽。示例性的雄激素诱导基因包括但不限于前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺蛋白、蜗牛同源物2(SLUG)、跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)、前列腺家族成员的六跨膜上皮抗原4(STEAP4)、FK506结合蛋白5(FKBP5)、以及血清粘蛋白1/α-1-酸性糖蛋白1(ORM1)。在一些实施例中，在AR激动剂的存在下评估所述诱导基因的表达。在一些实施例中，在使细胞与测试化合物接触之前或同时，使该细胞与雄激素激动剂接触。
在一些实施例中，通过测量一个或多个内源性基因的表达来检测AR活性水平，所述内源性基因通过暴露于雄激素或AR激动剂而被抑制。在一些实施例中，相比于合适的对照，在暴露于测试化合物之后一个或多个雄激素抑制基因表达的增加或未能抑制该表达指示测试化合物有效抑制该突变体AR多肽。在一些实施例中，所述对照是在使细胞暴露于所述测试化合物之前基因的基础表达。示例性的雄激素抑制基因包括但不限于前列腺特异性膜抗原(PSMA)、溶质载体家族35(SLC35F2/NOV)、IGF结合蛋白-3和IGF结合蛋白-5、CCAAT-增强子结合蛋白-δ、第10号染色体上缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)、IL-15、IL-18、以及ERBB2/HER2。在一些实施例中，在AR激动剂的存在下评估所述可抑制基因的表达。在一些实施例中，在使细胞与测试化合物接触之前或同时，使该细胞与雄激素激动剂接触。
测量内源性基因表达的方法在本领域中是熟知的。示例性的用于基因表达的测量的方法包括但不限于蛋白分析方法，诸如免疫组织化学法；免疫印迹法(例如，Western分析)；色谱法；以及核酸分析方法，诸如聚合酶链反应(PCR)、定量PCR(qPCR)、实时PCR(RT-PCR)、Northern分析。
在一些实施例中，使用以下测定法测量突变体AR多肽的活性，所述测定法为诸如但不限于AR共激活因子结合测定(例如，免疫沉淀测定法、双杂交测定、福斯特(荧光)共振能量转移测定，例如LanthaScreenTMTR-FRET雄激素受体共激活因子测定)、AR构象图谱测定(参见例如，Joseph等人(2009)PNAS 106(29)：12178-12183)、AR DNA结合测定(参见例如，Roche等人(1992)Mol.Endocrinol.6(12)：2229-35)、染色质免疫沉淀、N/C末端相互作用测定(参见例如，Hsu等人(2005)Mol.Endocrinology 19(2)350-361和Ghali等人(2003)J Clin EndocrinolMetab.88(5)：2185-93)。
在一些实施例中，鉴定第三代AR抑制剂化合物的方法包括：使用计算机辅助建模来选择具有本文提供的突变体AR多肽的三维晶体结构或溶液结构的可能的第三代AR抑制剂化合物。在一些实施例中，该突变体AR多肽包含在对应于SEQ ID NO：1中所示的野生型AR多肽的氨基酸位置876的位置处的氨基酸替换。在一些实施例中，该突变体AR多肽在多肽中的氨基酸位置876处不含有苯丙氨酸。在一些实施例中，该突变体AR多肽在多肽中的氨基酸位置876处含有亮氨酸。在一些实施例中，所述方法包括使该突变体AR多肽与测试化合物接触，以及检测该测试化合物与该突变体AR多肽的相互作用。在一些实施例中，与该突变体AR多肽相互作用的测试化合物被鉴定为候选的第三代AR抑制剂化合物。
在一些实施例中，用于所提供的方法中的测试化合物是化合物文库的成员。在一些实施例中，测试化合物文库是通过用于化学化合物制备的任意合适的方法建立的。“测试化合物文库”是指包含许多测试化合物的对象组(panel)。已经描述了用于合成有机小分子的分子文库的示例性途径(Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061)。在一些实施例中，使用在本领域中已知的组合文库方法中的多种方法中的任一种而获得本文提供的测试化合物，其包括：生物文库；空间可寻址的平行固相或液相文库、需要去卷积的合成文库方法、“一个微珠一个化合物”的文库方法，以及使用亲和色谱选择的合成文库方法。生物文库途径被限制为肽文库，而其他四种方法适用于化合物的肽、非肽寡聚物或小分子文库(Lam，K.S.(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。在本领域内已发现用于合成分子文库的其他示例性方法，例如在以下文献中：Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Horwell等人(1996)Immunopharmacology 33：68-；以及Gallop等人(1994)J.Med.Chem.37：1233-。在一些实施例中，化合物文库可呈现在溶液中(例如，Houghten(1992)Biotechniques 13：412-421)，或在微珠(Lam(1991)Nature 354：82-84)、芯片(Fodor(1993)Nature364：555-556)、细菌(Ladner，美国专利5,223,409)、孢子(Ladner USP′409)、质粒(Cull等人(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869)或噬菌体(Scott和Smith(1990)Science 249：386-390)；(Devlin(1990)Science 249：404-406)；(Cwirla等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-310)上。在一些实施例中，组合多肽是从cDNA文库制得的。可经活性筛选的示例性化合物包括但不限于肽、核酸、碳水化合物、有机小分子、以及天然产物提取物文库。
通过筛选方法鉴定AR抑制剂
使用本文提供的筛选方法鉴定的第三代AR抑制剂是AR调节剂。在一些实施例中，第三代AR抑制剂抑制或降低AR多肽的至少一种活性。示例性的AR活性包括但不限于共激活因子结合、DNA结合、配体结合或核转运。在一些实施例中，相比于不存在所述第三代AR抑制剂时AR多肽的活性，该抑制剂抑制约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的AR多肽活性。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是AR反向激动剂、AR拮抗剂、AR降解剂、AR运输调节剂和/或AR DNA结合抑制剂。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是AR反向激动剂。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是AR拮抗剂。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是AR降解剂。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是AR运输调节剂。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是AR DNA-结合抑制剂。在一些实施例中，所述AR抑制剂抑制野生型AR多肽的至少一种活性。在一些实施例中，所述AR抑制剂抑制突变体AR多肽的至少一种活性。
在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物具有最小的促惊厥活性和/或对癫痫发作阈值具有最小的影响。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物显示出对GABA门控氯离子通道最小的调节。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物显示出至GABA门控氯离子通道的最小结合。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物具有对GABA门控氯离子通道的最小拮抗作用。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是与GABA门控氯离子通道具有最小相互作用的AR调节剂。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是与GABAA门控氯离子通道具有最小相互作用的AR调节剂。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是与GABAA门控氯离子通道具有最小相互作用和/或最小血脑屏障渗透的AR调节剂。GABA测定法是已知的并且包括但不限于在Ashok K.Mehta和Maharaj K.Ticku o“Characterization of the PicrotoxinSite of GABAA Receptors”Current Protocols in Pharmacology(2000)1.18.1-1.18.17(John Wiley&Sons有限公司2000年版权所有)中描述的那些，所述文献以引用方式并入本文。
在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制AR核转运。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制至雄激素响应元件的AR DNA结合。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制共激活因子在AR响应性启动子处的募集。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物表现为在AR过度表达的前列腺癌细胞中无激动剂活性。
在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制去势敏感和去势抵抗性前列腺癌异种移植模型的生长。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制表达野生型AR的去势敏感和去势抵抗性前列腺癌异种移植模型的生长。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制表达具有F876L突变的突变体AR的去势敏感和去势抵抗性前列腺癌异种移植模型的生长。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制表达野生型AR和具有F876L突变的突变体AR的去势敏感和去势抵抗性前列腺癌异种移植模型的生长。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制表达具有T877A突变的突变体AR的去势敏感和去势抵抗性前列腺癌异种移植模型(例如，由LNCaP细胞形成的移植瘤)的生长。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制表达野生型AR和具有T877A突变的突变体AR的去势敏感和去势抵抗性前列腺癌异种移植模型(例如，由LNCaP/AR细胞形成的移植瘤)的生长。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物抑制表达具有T877A突变的突变体AR和具有F876L突变的突变体AR的去势敏感和去势抵抗性前列腺癌异种移植模型的生长。
药物组合物
在一些实施例中，提供了包含治疗有效量的第三代AR抑制剂的药物组合物，使用本文提供的筛选方法鉴定所述第三代AR抑制剂。在一些实施例中，提供了将使用本文提供的筛选方法鉴定的第三代AR抑制剂用于药物的制备。
在一些实施例中，包含第三代AR抑制剂的药物组合物还含有至少一种药学上可接受的非活性成分。在一些实施例中，包含第三代AR抑制剂的药物组合物被配制用于静脉注射、皮下注射、口服、或局部施用。在一些实施例中，包含第三代AR抑制剂的药物组合物是片剂、丸剂、胶囊、液体、悬浮液、凝胶、胶质、分散剂、悬浮液、溶液、乳液、油膏、或洗剂。
使用一种或多种药学上可接受的非活性成分以传统方式配制药物组合物，所述非活性成分有助于将活性化合物处理成可以在药学上使用的制剂。恰当的配制取决于所选的施用途径。本文描述的药物组合物的概述可以发现于，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第十九版(Easton，Pa.：Mack Publishing Company，1995)；Hoover，John E.，Remington”s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania 1975；Liberman，H.A.和Lachman，L.编辑，PharmaceuticalDosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)，所述文献以引用方式并入本文以用于本公开内容。
本文提供第三代AR抑制剂或该抑制剂的药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的非活性成分的药物组合物。在一些实施例中，本文描述的第三代AR抑制剂作为药物组合物施用，在所述药物组合物中该第三代AR抑制剂与其他活性成分混合，如在组合疗法中一样。在其他实施例中，所述药物组合物包含其他药用或药物试剂、载体、佐剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压力的盐和/或缓冲液。在其他实施例中，所述药物组合物包含其他有治疗价值的物质。
如本文所用的药物组合物是指第三代AR抑制剂或该抑制剂的药学上可接受的盐与其他化学组分(即，药学上可接受的非活性成分)的混合物，其他化学组分为诸如载体、赋形剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、矫味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂、塑化剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或它们的一种或多种组合。所述药物组合物有助于将化合物施用于受检者，所述受检者为诸如哺乳动物。
治疗有效量可根据疾病的严重程度、受检者的年龄和相关健康程度、所使用的化合物的效力以及其他因素而广泛地变化。所述化合物可以单独使用或与一种或多种治疗剂组合用作混合物的组分。
通过适当的施用途径将本文描述的药物制剂施用至受检者，所述施用途径包括但不限于口服、肠胃外施用(例如，静脉注射、皮下注射、肌内注射)、鼻内施用、口腔含化施用、局部施用、直肠施用、或经皮施用途径。本文描述的药物制剂包括但不限于水性液体分散剂、自乳化分散剂、固溶体、脂质体分散剂、气雾剂、固体剂型、散剂、速释型制剂、控释型制剂、速溶型制剂、片剂、胶囊、丸剂、迟释制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂、以及混合的速释型和控释型制剂。
在一些实施例中，药物组合物还包含一种或多种另外的治疗活性剂，所述治疗活性剂包括但不限于皮质类固醇、止吐剂、止痛药、抗癌剂、抗炎剂、激酶抑制剂、HSP90抑制剂、以及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。
在一些实施例中，提供包含治疗有效量的本文提供的突变体AR多肽的药物组合物。在一些实施例中，提供包含治疗有效量的编码本文提供的突变体AR多肽的核酸的药物组合物。
治疗方法
在一些实施例中，施用使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物以用于治疗疾病或病症。在一些实施例中，本文描述了治疗哺乳动物的AR依赖性或AR介导的疾病或病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物或该化合物的药学上可接受的盐施用至哺乳动物。
在一些实施例中，提供的方法包括：将使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物施用至患有AR介导的或AR依赖性疾病或病症的受检者(例如，人)。在一些实施例中，提供了将使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗AR介导的或AR依赖性疾病或病症的药物的制备。在一些实施例中，提供了用于治疗AR介导的或AR依赖性疾病或病症的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂。在一些实施例中，受检者(例如，人)目前正接受除第三代AR抑制剂化合物以外的一种或多种另外的治疗活性剂。
在一些实施例中，所述方法还包括施用除使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物以外的一种或多种另外的治疗活性剂。在一些实施例中，除使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物以外的一种或多种另外的治疗活性剂选自：激素、激素受体激动剂或拮抗剂、皮质类固醇、止吐剂、止痛药、抗癌剂、抗炎剂、激酶抑制剂，HSP90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。在一些实施例中，在施用除第三代AR抑制剂化合物以外的一种或多种另外的治疗活性剂之前、同时、之后或间歇地施用第三代AR抑制剂化合物。
在一些实施例中，将促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂或拮抗剂与本文提供的第三代AR抑制剂化合物组合施用至受检者。在一些实施例中，将诸如亮丙瑞林、布舍瑞林和戈舍瑞林的GnRH受体激动剂与本文提供的第三代AR抑制剂化合物组合施用至受检者。GnRH受体激动剂造成激素产生的初始激增(即，“临床上的潮红”)，之后抑制黄体化激素的产生，其继而造成对睾酮和双氢睾酮的抑制，而前列腺癌细胞的继续生长取决于睾酮和双氢睾酮。在一些实施例中，将促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂或拮抗剂与本文提供的第三代AR抑制剂化合物组合施用至受检者以用于治疗AR依赖性或AR介导的疾病或病症，所述疾病或病症为诸如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌或肝细胞癌。在一些实施例中，将促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂或拮抗剂与本文提供的第三代AR抑制剂化合物组合施用至受检者以用于治疗去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。在一些实施例中，将本文提供的第三代AR抑制剂化合物施用至受检者以减少或抑制由用GnRH受体激动剂治疗造成的激素产生的初始激增。在一些实施例中，在施用GnRH受体激动剂或拮抗剂之前、同时、之后或间隔地施用第三代AR抑制剂化合物。
在一些实施例中，AR依赖性或AR介导的疾病或病症是良性前列腺增生症，多毛症，痤疮，腺瘤以及前列腺肿瘤，含有雄激素受体的良性或恶性肿瘤细胞，超多毛症，脂溢性皮炎，子宫内膜异位症，多囊卵巢综合征，雄激素性脱发，性腺机能减退，骨质疏松症，对精子生成、性欲的抑制，恶病体质，厌食，对年龄相关的睾酮水平降低的雄激素补充，前列腺癌，乳腺癌，子宫内膜癌，子宫癌，膀胱癌，肝细胞癌，脸潮红，以及肯尼迪病，肌肉萎缩和无力，皮肤萎缩，骨质疏松，贫血，动脉硬化，心血管疾病、能量流失，幸福感丧失，2型糖尿病或腹内脂肪堆积。在一些实施例中，AR依赖性或AR介导的疾病或病症是AR依赖性或AR介导的癌症，诸如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌或肝(即，肝细胞)癌。
在一些实施例中，本文描述了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物或该化合物的药学上可接受的盐施用至哺乳动物。在一些实施例中，该癌症是激素依赖性癌症。在一些实施例中，该激素依赖性癌症是AR依赖性癌症。在一些实施例中，该癌症是前列腺癌。在一些实施例中，该癌症是去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该治疗癌症的方法还包括将至少一种另外的抗癌剂施用至该哺乳动物。
在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗哺乳动物的前列腺癌，其中该哺乳动物尚未接受用抗癌剂治疗。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗哺乳动物的前列腺癌，其中该哺乳动物尚未接受用化疗化合物治疗。
在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗哺乳动物的前列腺癌，其中已向该哺乳动物施用一种或多种抗癌剂。示例性的抗癌剂包括但不限于激素治疗剂，所述激素治疗剂包括但不限于第一代和第二代AR拮抗剂(例如，比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺、尼鲁米特、ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162)；以及抑制激素(例如雄激素)产生的化合物，诸如galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙；化疗化合物；抗代谢药；抗癌抗体；外科手术；辐射疗法以及超高温疗法。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗哺乳动物的前列腺癌，其中已向该哺乳动物施用一种或多种化疗化合物。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗哺乳动物的前列腺癌，其中已通过外科手术来治疗该哺乳动物。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗哺乳动物的前列腺癌，其中已用辐射疗法来治疗该哺乳动物。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗哺乳动物的前列腺癌，其中已用超高温疗法来治疗该哺乳动物。
在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗哺乳动物的前列腺癌，其中该哺乳动物已被施用一个或多个用抗癌剂治疗的周期。
在一些实施例中，本文描述了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物或该化合物的药学上可接受的盐施用至哺乳动物，其中该化合物是AR反向激动剂、AR拮抗剂、AR降解剂、AR运输调节剂、AR DNA结合抑制剂或它们的组合。
在一些实施例中，本文描述了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物或该化合物的药学上可接受的盐施用至哺乳动物，其中该化合物是AR反向激动剂。
在一些实施例中，本文描述了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物或该化合物的药学上可接受的盐施用至哺乳动物，其中该化合物是AR拮抗剂。
在一些实施例中，本文描述了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物或该化合物的药学上可接受的盐施用至哺乳动物，其中该化合物是AR降解剂。
在一些实施例中，本文描述了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物或该化合物的药学上可接受的盐施用至哺乳动物，其中该化合物是AR运输调节剂。
在一些实施例中，本文描述了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物或该化合物的药学上可接受的盐施用至哺乳动物，其中该化合物是ARDNA结合抑制剂。
在一些实施例中，本文描述了治疗哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括将治疗有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物或该化合物的药学上可接受的盐施用至哺乳动物，其中该化合物是AR蛋白合成抑制剂。
在一些实施例中，该癌症是前列腺癌。在一些实施例中，该癌症是去势抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该前列腺癌是ARN-509抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该前列腺癌是恩杂鲁胺(MDV3100)抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该前列腺癌是RD162抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该前列腺癌是醋酸阿比特龙抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该前列腺癌是galeterone(TOK001)抵抗性前列腺癌。在一些实施例中，该前列腺癌是TAK-700抵抗性前列腺癌。
通过多种施用途径以各种方式将本文描述的药物制剂施用至受检者，所述施用途径包括但不限于口服、肠胃外施用(例如，静脉注射、皮下注射、肌内注射)、口腔含化施用、局部施用或经皮施用途径。本文描述的药物制剂包括但不限于水性液体分散剂、自乳化分散剂、固溶体、脂质体分散剂、固体剂型、散剂、速释型制剂、控释型制剂、速溶型制剂、片剂、胶囊、丸剂、迟释制剂、缓释制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂、以及混合的速释型和控释型制剂。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是口服施用的。在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是静脉注射施用的。
在一些实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是局部施用的。在此类实施例中，使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物被配制成各种局部施用组合物，诸如溶剂、悬浮液、洗剂、凝胶、糊剂、洗发剂、擦洗剂、涂搓剂、涂抹剂、医用棒剂、医用绷带、香膏、乳膏或油膏。此类药物化合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液以及防腐剂。在一个方面，使用本文提供的方法鉴定的抗雄激素化合物局部施用至皮肤。
在另一方面，将使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于药物制造中，所述药物用于治疗其中AR活性导致疾病或病症的病变和/或症状的疾病、障碍或病症。在一个方面，所述疾病或病症是本文指明的疾病或病症中的任一种。
在上述任一方面中的其他实施例，其中：(a)将有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物全身施用至哺乳动物；和/或(b)将有效量的第三代AR抑制剂化合物口服施用至哺乳动物；和/或(c)将有效量的第三代AR抑制剂化合物静脉注射施用至哺乳动物；和/或(d)将有效量的第三代AR抑制剂化合物通过注射施用至哺乳动物；和/或(e)将有效量的第三代AR抑制剂化合物局部施用至哺乳动物；和/或(f)将有效量的第三代AR抑制剂化合物非全身地或局部施用至哺乳动物。
在上述任一方面中的其他实施例包括有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物的单次施用，包括其中(i)第三代AR抑制剂化合物施用一次；(ii)该第三代AR抑制剂化合物在一天的期间内多次施用至哺乳动物；(iii)频繁施用；或(iv)连续施用的其他实施例。
在上述任一方面中的其他实施例包括有效量的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物的多次施用，包括其中(i)第三代AR抑制剂化合物是连续或间歇施用的：如单剂量施用一样；(ii)多次施用之间的时间是每6小时；(iii)每8小时将第三代AR抑制剂化合物施用至哺乳动物；(iv)每12小时将第三代AR抑制剂化合物施用至哺乳动物；(v)每24小时将第三代AR抑制剂化合物施用至哺乳动物的其他实施例。在其他或另选实施例中，所述方法包括休药期，其中暂停第三代AR抑制剂化合物的施用，或暂时减少施用的化合物的剂量；在休药期结束时，恢复该化合物的剂量。在一些实施例中，休药期的时长从2天到1年不等。
还提供了减少哺乳动物的AR激活的方法，所述方法包括将使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物施用至该哺乳动物。在一些实施例中，所述方法包括减少哺乳动物前列腺细胞中的AR激活。在一些实施例中，所述方法包括减少非前列腺细胞中的AR激活。在一些实施例中，减少AR激活的方法包括减少雄激素至雄激素受体的结合。在一些实施例中，减少AR激活的方法包括减少细胞中的AR浓度。
在一些情况下，本文公开了将使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于药物制造中，所述药物用于治疗AR依赖性或AR介导的疾病或病症。在一些实施例中，所述疾病或病症是前列腺癌。在一些实施例中，所述AR依赖性或AR介导的疾病或病症如本文所述。
在一些情况下，本文公开了将使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物用于治疗或预防AR依赖性或AR介导的疾病或病症中。在一些实施例中，所述AR依赖性或AR介导的疾病或病症如本文所述。
在本文公开的任一实施例中，所述哺乳动物是人。在一些实施例中，将本文提供的第三代AR抑制剂化合物施用至人。
在一些实施例中，本文提供的第三代AR抑制剂化合物用于减少、降低或消除AR活性。
在一些实施例中，由本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物是选择性的AR调节剂。在一些实施例中，由本文公开的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物具有对AR的高度特异性，并且具有所需的组织选择性的药理活性。所需的组织选择性的药理活性包括但不限于前列腺细胞中的AR拮抗剂活性以及在非前列腺细胞中无AR拮抗剂活性。在一些实施例中，本文公开的第三代AR抑制剂化合物是表现出可忽略的AR激动剂活性或未表现出AR激动剂活性的抗雄激素。
在一些实施例中，本文提供的由本文公开的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物选自使用本文提供的方法鉴定的AR抑制剂化合物的活性代谢物、互变异构体、药学上可接受的溶剂、药学上可接受的盐或前体药物。
在一些实施例中，将包含第三代AR抑制剂化合物的药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用，所述治疗剂包括但不限于皮质类固醇、止吐剂、止痛药、抗癌剂、抗炎剂、激酶抑制剂、HSP90抑制剂、以及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。在一些实施例中，将包含第三代AR抑制剂化合物的药物组合物与抗癌剂组合施用，所述抗癌剂包括但不限于激素治疗剂，所述激素治疗剂包括但不限于第一代和第二代AR拮抗剂(例如，比卡鲁胺、氟他胺、羟基氟他胺、尼鲁米特、ARN-509、恩杂鲁胺(MDV3100)和RD162)；抑制激素(例如雄激素)产生的化合物，诸如CYP17A抑制剂，包括例如galeterone(TOK001)、TAK-700或醋酸阿比特龙；化疗化合物；抗代谢药；抗癌抗体；外科手术；辐射疗法以及超高温疗法。在一些实施例中，将第三代AR抑制剂化合物与另外的治疗剂以同一组合物施用。在一些实施例中，将第三代AR抑制剂化合物与另外的治疗剂作为不同的组合物施用。在一些实施例中，将第三代AR抑制剂化合物与另外的治疗剂同时地、顺序地或间歇地施用。在一些实施例中，将第三代AR抑制剂化合物与另外的治疗剂以相同的施用途径施用。在一些实施例中，将第三代AR抑制剂化合物与另外的治疗剂以不同的施用途径施用。
试剂盒/制品
为了在本文描述的诊断和治疗应用中使用，本文还描述了试剂盒和制品。此类试剂盒可包含载体、包装或容器，所述容器经区室化以容纳一个或多个诸如小瓶、管等的容器，所述容器中的每一个包括待在本文描述的方法中使用的单独元件中的一个。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器以及试管。所述容器由任何可接受的材料形成，所述材料包括例如玻璃或塑料。
在一些实施例中，本文提供的试剂盒用于检测编码受检者的突变体AR多肽的核酸，或用于检测受检者的突变体AR多肽(即，诊断试剂盒)。在一些实施例中，所述试剂盒用于选择用第三代AR拮抗剂治疗的患者，用于鉴定对第一代或第二代AR拮抗剂具有抵抗性或可能会变得对第一代或第二代AR拮抗剂具有抵抗性的受检者，用于监测对第一代或第二代AR拮抗剂疗法的抵抗的发展，或它们的组合。本文提供的试剂盒含有一种或多种试剂以用于检测编码突变体AR多肽的核酸，用于检测突变体AR多肽，用于检测受检者细胞中的AR活性，或它们的组合。示例性的试剂包括但不限于缓冲液、PCR试剂、抗体、用于酶染色的底物、色原体或其他材料，诸如载玻片、容器、微量滴定板，以及任选地用于执行所述方法的说明。本领域内的那些技术人员将认识到许多其他可能的容器和板以及可用于接触各种材料的试剂。试剂盒还可含有对照样本，例如核酸或蛋白，例如本文提供的突变体AR多肽或编码本文提供的突变体AR多肽的核酸。在一些实施例中，试剂盒含有用于检测内源性雄激素基因表达的一组或多组寡核苷酸引物。
在一些实施例中，所述容器可包含一种或多种第一代或第二代AR拮抗剂或由本文所述的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物，所述化合物任选地为组合物形式或与另一种如本文公开的试剂组合。所述容器任选地具有无菌入口(例如容器可以为具有被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶)。这种试剂盒任选地包含一种化合物，所述化合物具有与该化合物在本文描述的方法中的使用有关的鉴定说明或标签或说明书。
试剂盒将通常包含一个或多个另外的容器，每个容器具有用于使用本文所描述的化合物、从商业或使用者角度期望的各种材料(诸如试剂，任选地为浓缩形式，和/或设备)中的一种或多种。此类材料的非限制性例子包括但不限于缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器；载体、包装、容器、小瓶和/或管标签列表内容和/或使用说明以及具有使用说明的包装说明书。通常还将包括一组说明。
标签可在所述容器上或与所述容器相关联。当形成标签的字母、数字或其他字符附接到、模制成或蚀刻到容器本身中时，该标签可以在所述容器上；当标签存在于也保持容器的插座或载体内时(例如，作为包装说明书)，该标签可以与所述容器相关联。标签可用于指示待用于特定治疗应用中的内容物。标签也可指示用于指示诸如在本文描述的方法中使用的内容物的用法说明。
包含包装材料、在包装材料内的使用本文提供的方法鉴定的第三代AR抑制剂化合物以及标签的制品用于降低、减少或消除雄激素受体的效应，或用于治疗、预防或改善将受益于雄激素受体活性的降低或消除的疾病或病症的一个或多个症状，所述标签指示化合物或组合物、或该化合物或组合物的药学上可接受的盐、互变异构体、药学上可接受的N-氧化物、药学上的活性代谢物、药学上可接受的前体药物、或药学上可接受的溶剂。
抗雄激素抵抗性细胞系的制备
本文提供了制备对用AR拮抗剂的治疗具有抵抗性的前列腺癌细胞系的方法。在一些实施例中，所述前列腺癌细胞系对用ARN-509的治疗有抵抗性。在一些实施例中，所述前列腺癌细胞系对用恩杂鲁胺(MDV3100)的治疗有抵抗性。在一些实施例中，相比于用于产生抵抗性细胞系的亲本细胞系，通过本文提供的方法产生的抵抗性细胞系表达更高水平的AR。在一些实施例中，相比于亲本细胞系，通过所述方法产生的抵抗性细胞系表达约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10倍或更大的AR量。在一些实施例中，所述抵抗性细胞系表达突变体AR蛋白。
在一些实施例中，所述方法包括使前列腺癌细胞系(即，亲本细胞系)与AR拮抗剂接触，以及培养所述细胞达预先确定的时间周期。在一些实施例中，所述方法包括以渐增的AR拮抗剂浓度培养所述细胞达预先确定的时间周期。在一些实施例中，AR拮抗剂的浓度在约0.1μM至约100μM，诸如1μM至约10μM的范围内。在一些实施例中，以0.8μM、1.5μM、3μM和6μM的AR拮抗剂培养所述细胞。在一些实施例中，AR拮抗剂的浓度增大2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍。在一些实施例中，AR拮抗剂的浓度增大3倍。在一些实施例中，在AR拮抗剂的存在下培养所述细胞1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、4周、1个月、1.5个月、2个月、2.5个月、3个月或更长时间。在一些实施例中，每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周或更长时间来分裂并重新平板接种细胞。在一些实施例中，每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每周或更长时间更换含有AR拮抗剂的培养基。在一些实施例中，AR拮抗剂是第二代拮抗剂。在一些实施例中，AR拮抗剂是ARN-509。在一些实施例中，AR拮抗剂是恩杂鲁胺(MDV3100)。
在一些实施例中，所述前列腺癌细胞系是人前列腺癌细胞系。在一些实施例中，所述前列腺癌细胞系是LNCaP细胞系。在一些实施例中，所述前列腺癌细胞系过度表达雄激素受体。在一些实施例中，所述前列腺癌细胞系是LNCaP/AR(cs)或LNCaP/AR(cs)-Luc。
实例
提供的这些实例仅出于示例性目的且不限制本文提供的权利要求的范围。
实例1：抗药性细胞系的体内
产生对周抗AR化合物ARN-509的治疗具有抵抗性的细胞系在具有去势抵抗性人前列腺癌(LNCaP/AR(cs))移植瘤的小鼠体内产生。相比于亲本LNCaP细胞系，LNCaP/AR(cs)细胞系过度表达雄激素受体(AR)3-5倍，以模拟去势抵抗性前列腺癌(Chen等人(2004)Nature Medicine10：33-39)。
LNCap-AR(cs)移植瘤在经去势的六周龄的雄性SCID无毛杂交小鼠(SHO，Charles Rivers Laboratories)中生长。将50％无血清RPMI和50％MatrigelTM中的1×106LNCaP-ARcs细胞皮下注射(100μl/动物)到去势3-5天后的10只小鼠的右侧侧腹。每日监测肿瘤大小。当肿瘤达到约200mm3的平均体积时(大约在注射60天后)，开始按照QD给药方案(即，口服含15％维生素E-TPGS和65％的0.5％w/v羧甲基纤维素(CMC)溶液的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0))仅用载体(n＝1)或30mg/kg ARN-509(n＝9)来治疗所述动物。初始时，用ARN-509的治疗引起肿瘤消退。在给药大约75天之后，单个肿瘤恢复生长并且发展成比治疗初期更大的大小。一旦抵抗性肿瘤达到约800mm3，对小鼠实施安乐死并获得肿瘤。肿瘤细胞通过用3mL注射器均化而手动分散。在添加有10％FBS和10μMARN-509的RPMI中培养肿瘤细胞。通过该方法产生一种抵抗性细胞系。
实例2：抗药性细胞系的体外
产生对用抗AR化合物ARN-509和MDV3100的治疗具有抵抗性的细胞系在体外使用LNCaP人前列腺癌细胞系产生。
在补充有10％FBS(Hyclone)的RPMI 1640中保持LNCaP(ATCC)、LNCaP/AR(cs)(Guo等人(2006)Cancer Cell 0：309-19)和LNCaP/AR-Luc(Tran等人Science(2009)324(5928)：787-90；Ellwood-Yen等人(2006)Cancer Res.66：10513-6)。在6个月的时间内以渐增的ARN-509或MDV3100浓度培养LNCaP(ATCC)、LNCaP/AR(cs)或LNCaP/AR(cs)-Luc细胞。初始时，将50mL细胞接种到225cm2的细胞培养瓶中，浓度为大约80,000细胞/mL，并且在800nM ARN-509或MDV3100的存在下，在添加有10％FBS的RPMI中生长。每半周更换一次培养基和药物，并且根据需要使细胞在75cm2的细胞培养瓶中传代。随着经药物处理的细胞的生长速率增大到未处理的对照细胞的生长速率，每个化合物的浓度在约1.5μM至约6μM的范围内增大数倍。在大约6个月的药物选择之后，将细胞保持在添加有10％FBS和6μM ARN-509或MDV3100的RPMI中。在选择之后，获得10个单独的ARN-509和MDV3100抵抗性细胞系。两个细胞系得自在ARN-509的存在下选择的LNCaP(ATCC)细胞。四个细胞系得自LNCaP/AR(cs)，其中两个是在用ARN-509治疗后获得的，并且两个是在用MDV3100治疗后获得的。LNCaP/AR(cs)-Luc细胞用于获得4个抵抗性细胞系，其中两个来自ARN-509治疗，并且两个来自MDV3100治疗。
实例3：增殖测定以测试抗药性
执行细胞增殖测定以测试细胞系对ARN-509和MDV3100治疗的抵抗性。
对所有ARN-509和MDV3100抵抗性细胞系执行增殖测定，方法是在无酚红RPMI 1640(含有5％CSS)中以50,000个细胞每毫升的密度将16μL/孔的细胞接种于384孔细胞培养板(平坦透明底黑色聚苯乙烯经TC处理的384孔板(Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated 384 Wellplates，Corning))中并且在37℃温育2天。对于激动剂测定而言，在培养基中制备每个化合物的11个点的半对数稀释液并且将16μL每种稀释液添加到所述细胞中。ARN-509、MDV3100和比卡鲁胺以3.16×10-5M至3.18×10-10M范围内的最终浓度运行，而合成的雄激素美曲勃龙(R1881)以3.16×10-8M至3.18×10-13M范围内的最终浓度运行。对于拮抗剂模式测定而言，将化合物在还含有200pM R1881(PerkinElmer，Waltham，MA)的培养基中稀释(最终[R1881]＝100pM)并且随后添加到所述细胞中(16μL)。7天之后，将16μL CellTiter-发光法细胞活力检测试剂盒(CellTiter-Luminescent Cell Viability Assay)(Promega，Madison，WI)直接添加至细胞培养物，并且根据制造商说明书测量相对发光单位(RLU)。
在激动剂模式测定中，样本的活力百分比被计算为：活力％＝100×([RLU样本-RLU不含细胞的培养基]/[RLU经R1881处理的细胞-RLU不含细胞的培养基])(表1A)。在拮抗剂模式测定中，样本的活力百分比被计算为：活力％＝100×([RLU样本-RLU第0天]/[RLU经R1881处理的细胞-RLU第0天])(表1B)。
表1A.激动剂增殖测定(活力％)
“+”＝＜30，“++”＝＞30
[R1881]＝0.1nM，[拮抗剂]＝10μM
表1B.拮抗剂增殖测定(活力％)
“+”＝＜30，“++”＝＞30
[R1881]＝0.1nM，[拮抗剂]＝10μM
在增殖测定中，ARN-509和恩杂鲁胺两者是所有三个LNCaP亲本细胞系中的完全增殖拮抗剂(表1A，图1A)。所述抵抗性细胞系被分成两个不同的类别。不同于其亲本细胞系，第一类ARN-509-和MDV3100抵抗性细胞(第1类)在不存在添加的雄激素时增殖。在ARN-509、MDV3100或比卡鲁胺的存在下，细胞的配体依赖性生长不发生变化。合成的雄激素R1881在高浓度下抑制第1类细胞的增殖。R1881的这种生长抑制活性被MDV3100或ARN-509所拮抗，这指示AR仍能够结合这些细胞系中的MDV3100和ARN-509。
第1类抵抗性细胞系包括得自LNCaP-AR(cs)移植瘤的一个细胞系、得自在ARN-509的存在下选择的LNCaP/AR(cs)细胞的2个细胞系、得自在MDV3100的存在下选择的LNCaP/AR(cs)细胞的2个细胞系、得自在ARN-509的存在下选择的LNCaP/AR(cs)-Luc细胞的2个细胞系、以及得自在MDV3100的存在下选择的LNCaP/AR(cs)-Luc细胞的细胞系中的一个。
第二类MDV3100-和ARN-509抵抗性细胞系(第2类)与其亲本细胞系类似，保持生长方面的雄激素依赖性。然而，不同于ARN-509-和MDV3100对亲本细胞系的活性，ARN-509和MDV3100可促进第2类细胞系的增殖。然而，比卡鲁胺不能促进第2类细胞系的增殖。第2类抵抗性细胞系包括得自在ARN-509的存在下选择的LNCaP细胞的两个细胞系(LNCaP ARN-509r1和LNCaP ARN-509r2)以及得自在MDV3100的存在下选择的LNCaP/AR(cs)-Luc细胞的细胞系中的一个(LNCaPENZr2)。
部分激动剂活性与用于选择的化合物无关；ARN-509和恩杂鲁胺显示出对所有三个细胞系的部分激动剂活性，而不考虑用于获得抵抗性变体的化合物。与增殖活性一致，ARN-509或恩杂鲁胺仅部分地使这些抵抗性细胞系的雄激素依赖性生长拮抗化(表1B，图1B、图1C)。
实例4：转录报告基因测定以测试抗药性
执行使用可操作地连接至报告基因的ARE响应元件的转录报告基因测定以测试细胞对ARN-509、MDV3100和比卡鲁胺治疗的抵抗性。
对所有抵抗性细胞系执行转录报告基因测定，方法是在补充有5％活性炭吸附血清的RPMI 1640中以250,000细胞/mL的密度将100μL细胞接种到96孔细胞培养板中并使其在37℃下贴壁过夜。
除了含有整合的雄激素响应性报告基因的LNCaP/AR(cs)-Luc细胞以外，根据制造商的规程使用(Life Technologies)使细胞瞬时转染。对于LNCaP和LNCaP/AR(cs)细胞，使用428ng报告基因载体(pGL4Pb-荧光素酶(pGL4中的大鼠腺血管舒缓素启动子(Promega，Madison，WI)))、50ng pRL-CMV(标准化载体，Promega，Madison，WI)和0.7μL来执行三次重复转染。在转染之后，将所述细胞温育4小时。
然后用测试化合物ARN-509、MDV3100和比卡鲁胺处理细胞。对于激动剂测定，将所述化合物连续稀释，并且将添加有RPMI 1640的50μL化合物添加至所述细胞，所述RPMI 1640添加有5％活性炭吸附FBS。对于拮抗剂测定，将所述化合物连续稀释，并且将具有RPMI的50μL化合物添加至所述细胞，所述RPMI添加有3nM补充有5％活性炭吸附血清的R1881。在温育48小时之后移除培养基并且在40μL裂解缓冲液(25mM三磷酸酯、2mM CDTA、10％甘油、0.5％Triton X-100、2mM DTT)中裂解所述细胞。在添加40μL荧光素酶缓冲液(20mM麦黄酮、0.1mM EDTA，1.07mM(MgCo3)4Mg(OH)2·5H2O、2.67mM MgSO4、33.3mM DTT、270μM辅酶A、470μM虫荧光素、530μM ATP)之后立即测量荧火虫荧光素酶活性。在添加40μL腔肠素缓冲液(1.1M NaCl、2.2mM Na2EDTA、0.22M KxPO4(pH 5.1)、0.44mg/mL BSA、1.3mM NaN3、1.43μM腔肠素，最终pH调节至5.0)之后测量海肾荧光素酶。
在增殖测定中鉴定的两种类型的ARN-509-和MDV3100抵抗性细胞系在转录测定中也表现出不同的性质。在使用pGL4 Pb-荧光素酶报告基因的瞬时转染测定中或在使用整合的腺血管舒缓素-荧光素酶报告基因(即，LNCaP/AR(cs)-Luc-衍生的细胞)的测定中，ARN-509和MDV3100在雄激素依赖性第1类抵抗性细胞中是有效拮抗剂，如相对于未经处理的对照的荧光素酶活性降低所证明的(表2)。然而，相比于亲本细胞，比卡鲁胺对第1类抵抗性细胞表现出增强的激动剂活性。在第2类抵抗性细胞中，在腺血管舒缓素-荧光素酶报告基因测定中，MDV3100是弱部分激动剂，而比卡鲁胺和ARN-509表现为无激动剂活性。
表2A.激动剂转录报告基因测定(最大活性％)
“+”＝＜5，“++”＝＞5
[R1881]＝10nM，[拮抗剂]＝50μM
表2B.拮抗剂转录报告基因测定(最大活性％)
“+”＝＜5，“++”＝＞5
[R1881]＝10nM，[拮抗剂]＝50μM
实例5：内源性基因转录测定
检测R1881、MDV3100和比卡鲁胺治疗对内源性基因转录的影响。
对所有抵抗性系执行内源性基因转录测定，方法是在含有5％活性炭吸附FBS的RPMI中(经去激素化)以500,000细胞/mL的密度将0.5mL细胞平板接种于24孔板中，并且使所述细胞在37℃下生长3天。然后用10nM的R1881、30μM MDV3100或30μM比卡鲁胺将细胞处理24小时。
使用AurumTM总RNA分离试剂盒(BIO-RAD，Hercules，CA)分离总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(BIO-RAD，Hercules，CA)逆转录RNA(1μg)以产生cDNA。使用Applied Biosystems 7900HT仪和SYBRGreen PCR预混液(SYBR Green PCR Master Mix)(Applied Biosystems，Foster City，CA)来执行实时PCR。根据制造商规程和热循环规程来执行6μL RCR反应，所述热循环规程为95℃持续10分钟，然后40个循环的95℃持续15秒和58℃持续1分钟。雄激素响应性基因(PSA、SLUG、TMPRSS2、STEAP4、FKBP5、ORM1、NOV、FASN、NKX3.1、AMIGO2、BDNF、CAMK2N1、HPGD、NCAPD3、PLD1)的表达被归一化为GAPDH表达，并且相对于用载体处理亲本细胞系进行表达。相对表达结果在表3A中提供。用于PCR的引物在表3B中列出。
已在内源性雄激素响应性基因上观察到类似的化合物和类似类型的选择性激动剂活性，但是在内源性基因的情况下，MDV3100的转录活性更明显(表3)。在第1类抵抗性细胞中，比卡鲁胺显示出强有力的转录活性，而MDV3100则是弱转录激动剂。相反，在第2类抵抗性细胞系中，比卡鲁胺是弱转录激动剂，而MDV3100则显示出对所测试基因的强有力的转录活性。
表3A.内源性基因转录活性(载体倍数)
[R1881]＝10nM，[拮抗剂]＝30μM
--＜0.1，-＝0.1-1，+＝1-10，++＝10-50，+++50-500，++++＞500
在单独的试验中，分析以下基因在LNCaP、LNCaP/AR(cs)、LNCaP/AR-Luc、LNCaP ARN-509r1、LNCaP ARN-509r2和LNCaP/AR-LucENZr2细胞中的基因表达：PLD、CAM2KN、NOV、BDNF、AMIGO2、FASN、TMPRSS2、NKX3.1、PSA、FKBP5、HPGD、NCAPD3、SLUG、STEAP4和ORM。将细胞在去激素化的培养基中培养3天，之后用载体、1nM R1881或30μM化合物处理。基因表达被归一化成GAPDH，如上文所述。结果在表4A和表4B中给出。
表4A.LNCaP、LNCaP/AR(cs)和抵抗性系转录
表4B.LNCaP/AR-Luc和LNCaP/AR-Luc ENZr2转录
实例6：抵抗性机制的测定
微阵列比较基因组杂交技术(Array CGH)、mRNA表达图谱以及对源自患者的前列腺癌肿瘤以及许多动物和体外模型的序列分析在至去势抵抗性期的进展中具有相关联的多个通路。在去势抵抗性前列腺癌中鉴定的最常见激活通路中的三个是PI3K、Raf和AR通路。在该实例中，用蛋白印迹法评估Akt和Erk磷酸化以分别评估PI3K和Raf途径的激活状态。
为了评估第1类和第2类细胞系的抗药性，执行Western分析以评估AR蛋白水平和已知用于调节AR活性并且在去势抵抗性前列腺癌中通常被激活的若干细胞信号通路的激活状态。测定AR、Akt、磷酰化的Akt(Ser473)、p44/42 MAPK(Erk1/2)、磷酰化的p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)、微管蛋白和肌动蛋白的相对表达。
对于Western分析，使细胞在补充有5％活性炭吸附血清的RPMI 1640中生长3天。在改性的放射免疫沉淀缓冲液(mRIPA；10mM Tris、150mMNaCl、1％(v/v)NP-40、0.5％脱氧胆酸盐、0.1％SDS、5mM EDTA，pH7.4)中裂解细胞，所述缓冲液含有HaltTM蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(HaltTM Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail)(Thermo Scientific)。通过Lowry测定(Biorad DC蛋白测定)定量澄清溶解物的总蛋白。将LDS样本缓冲液和样本还原剂添加至溶解物并加热至70℃持续10分钟。将20μg总细胞蛋白在NuPAGE 4-12％Bis Tris丙烯酰胺凝胶上分离并使用Xcell IITM印迹模块(Xcell IITM blot module)(Invitrogen)转移到硝酸纤维膜上。将膜在封闭缓冲液(LI-COR，Lincoln，NE)中在室温下温育30分钟，之后与抗雄激素受体的第一抗体(Santa Cruz Biotechnology，目录号SC-816)、Akt和磷酸化-Akt(Ser473)(Cell Signaling，目录号分别为9272和4058)、p44/42MAPK(Erk1/2)和磷酸化-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(Cell Signaling，目录号分别为4695和4376)以及微管蛋白或肌动蛋白(Sigma，目录号分别为T6199和A4700)一起温育60分钟。在与缀合的山羊抗小鼠或兔子IgG(LI-COR)一起温育后，使用红外成像系统(Infrared ImagingSystem)定量蛋白条带。
通过蛋白印迹法，第1类抵抗性细胞系中的AR水平比在LNCaP/AR(cs)细胞系中观察到的AR水平高大约2至4倍(图2)。与AR水平的大约3倍增长足以支持LNCaP细胞在去势环境中在体内生长类似，AR水平另外提高2至4倍可足以促进在不存在雄激素时在体外增殖。相反，第2类抵抗性系中的AR水平与在亲本细胞系中观察到的AR水平类似。因此，恩杂鲁胺和ARN-509转化成第2类细胞系的部分激动剂并非是由于AR的过度表达。已观察到总Akt和Erk以及磷酰化的Akt和Erk的微小差异，未在任一类细胞系中发现一致的变化。
实例7：突变体AR序列的测定
MDV3100和ARN-509是第2类抵抗性细胞系的转录和增殖激动剂，而比卡鲁胺仍为拮抗剂。第2类抵抗性细胞中的AR表达类似于亲本细胞系(实例6)。因此，测定第2类抵抗性细胞中的AR序列以探知AR配体结合域的突变是否促进功能活性的增益。
将通过从第1类和第2类细胞分离的RNA的逆转录产生的cDNA(参见实例5)用作对AR进行测序的模板。使用一系列寡核苷酸，按照制造商的规程通过使用聚合酶(New England Biolabs)的PCR产生包含AR配体结合域的重叠片段(c.2013-2757)。PCR产物经凝胶纯化以移除非特异性条带以及未引入的寡核苷酸。使用内部寡核苷酸对纯化的PCR产物测序。
在三个独立获得的细胞系的核酸位置2626处的AR配体结合域内鉴定到单个核酸突变。在所有系中鉴定到的错义突变是胸腺嘧啶(T)突变成胞嘧啶(C)，其使所编码的多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸(F)转变为亮氨酸(L)(SEQ ID NO：19)。另外，对来自LNCaP/AR-Luc ENZr2细胞系的单个亚克隆PCR产物的测序表明在所有细胞系中，F876L突变出现在内源性AR等位基因中。
F876存在于AR配体结合袋的区域的螺旋11中，所述区域为CRPCAR突变的热点(图1D)。然而，不同于以配位氢键结合至双氢睾酮的17α-OH基团的T877和L701，F876造成由螺旋11中的残基(F786，L880)、螺旋11和12之间的环(F891)以及螺旋3(F697，L701)形成的小型疏水核心。虽然类似的残基和疏水性配体相互作用保存在雌激素和黄体酮受体中，但F876尚未涉及高亲和性结合或类固醇选择性。与预计F876将在类固醇结合中起到的相对次要作用一致，尚无在前列腺癌或雄激素不敏感型种群中发现AR-F876L突变的报导。
实例8：突变体AR在AR缺乏型细胞中的表达
为了确认F876L突变造成对ARN-509和MDV3100的激动剂活性，在全长野生型AR和LNCaP T877A突变受体的情况下产生点突变。所述F876L和F876L/T877A突变是根据制造商的规程使用QuickChange II定点突变试剂盒(QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit)(AgilentTechnologies，Santa Clara，CA)在质粒pcDNA3-AR中产生的。
执行使用可操作地连接至报告基因的ARE响应元件的转录报告基因测定以测试该突变体AR响应于ARN-509、MDV3100和比卡鲁胺治疗的转录活性。
转录报告基因测定是通过以下执行的：在补充有10％活性炭吸附血清的MEM中以250,000细胞/mL的密度将100μL HEPG2细胞接种到96孔细胞培养板中并使其在37℃下贴壁过夜。
根据制造商的规程使用(Life Technologies)使细胞瞬时转染。使用378ng报告基因载体(4X ARE-荧光素酶或pGL4 Pb-荧光素酶(pGL4中的大鼠腺血管舒缓素启动子(Promega，Madison，WI))、50ngpcDNA-AR(野生型或突变体)、50ng pRL-CMV(标准化载体)和0.7μL来执行三次重复转染。在转染之后，将所述细胞温育4小时。
在温育之后，用测试化合物ARN-509、MDV3100和比卡鲁胺处理细胞。对于激动剂测定，将化合物按1：6稀释，并且将用添加有5％活性炭吸附FBS的MEM配制的50μL化合物添加至所述细胞，所获得的最终浓度范围是30μM至0.64nM。对于拮抗剂测定，用1nM R1881(对于野生型AR来说)或5nM R1881(对于F876L AR来说)连续稀释所述化合物。
在温育48小时之后移除培养基并且在40μL裂解缓冲液(25mM三磷酸酯、2mM CDTA、10％甘油、0.5％Triton X-100、2mM DTT)中裂解所述细胞。在添加40μL荧光素酶缓冲液(20mM麦黄酮、0.1mM EDTA，1.07mM(MgCo3)4Mg(OH)2·5H2O、2.67mM MgSO4、33.3mM DTT、270μM辅酶A、470μM虫荧光素、530μM ATP)之后立即测量荧火虫荧光素酶活性。在添加40μL腔肠素缓冲液(1.1M NaCl、2.2mM Na2EDTA、0.22M KxPO4(pH 5.1)、0.44mg/mL BSA、1.3mM NaN3、1.43μM腔肠素，最终pH调节至5.0)之后测量海肾荧光素酶。
在瞬时转录测定中，第二代AR拮抗剂ARN-509和MDV3100在F876L或F876L/T877A突变体AR的情况下诱导AR依赖性转录活性，而来自比卡鲁胺的诱导是极小的(表5)。例如，在使用4XARE-荧光素酶或Pb-荧光素酶报告基因的HepG2细胞中，ARN-509和MDV3100，而非比卡鲁胺，在F876L或F876L/T877A突变体AR的情况下诱导AR依赖性转录活性。这指示第2类细胞系的抵抗性机制是AR F876L突变。
表5.AR转录活性(DMSO倍数)
+＝＜20，++＝10-200，+++＞200
[R1881]＝100nM，[拮抗剂]＝6.3μM
执行使用4X-ARE-荧光素酶报告基因的第二个实验以确认上述结果。在该实验中，第一代抗雄激素尼鲁米特和羟基氟他胺也与比卡鲁胺、ARN-509和恩杂鲁胺一起进行比较。以最小的修饰，基本上如上文所描述地执行所述AR转录报告基因测定。使用50ng pCDNA3-AR或pCDNA3-AR突变、65ng 4X ARE-荧光素酶、20ng pRL(Promega)、以及25ng pCMX执行三次重复转染。对于激动剂测定，将所述化合物连续稀释，并且将添加有RPMI 1640的50μL化合物添加至所述细胞，所述RPMI 1640补充有活性炭吸附血清。对于拮抗剂测定，将所述化合物连续稀释，并且将含有RPMI的50μL化合物添加至所述细胞，所述RPMI补充有活性炭吸附血清和美曲勃龙(R1881)。在拮抗剂测定中使用的最终R1881浓度是1nM，除了使用5nM R1881的F876L之外。
如图4所示，在野生型AR的情况下，ARN-509和恩杂鲁胺是完全拮抗剂，并且在4X-ARE雄激素响应性转录报告基因测定中具有最小的激动剂活性。然而，在表达AR-F876L或AR F876L/T877A的细胞中，恩杂鲁胺和ARN-509是转录的部分激动剂(图4A)。相反，第一代抗雄激素比卡鲁胺、尼鲁米特和羟基氟他胺表现出对F876L突变最小的激动剂活性(表6，图4)(E最大＝最大R1881响应的百分比)。恩杂鲁胺和ARN-509是AR突变T877A、L701H、H874Y和W741C的完全拮抗剂，所述突变赋予对第一代AR拮抗剂的抵抗或扩大CRPC患者中的类固醇配体特异性。
表6.
为了测试F876L突变的DNA结合能力，产生VP16-AR融合构造。pVP16-AR是通过将全长人AR亚克隆成pVP16(Clontech)产生的。AR点突变是根据制造商的规程使用QuickChange II定点突变试剂盒(QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit)(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)在VP16-AR中产生的。
基本上如上文所述地执行转录测定。使用35ng pVP16-AR或pVP16-F876L、70ng 4X ARE-荧光素酶、20ng pRL(Promega)、以及35ng pCMX来执行三次重复转染。在渐增的化合物浓度的存在下，监测不存在或存在90pM R1881(对于野生型VP16-AR而言)或1nM R1881(对于F876LVP16-AR而言)时4X ARE-荧光素酶报告基因的活性。如上文所述地测量荧光素酶活性。
作为对转录报告基因测定的反映，在监测受体的DNA结合能力的野生型VP16-AR测定中，恩杂鲁胺和ARN-509是完全拮抗剂(表7，图4)(E最大＝最大R1881响应的百分比)。然而，在VP16-AR-F876L的情况下，ARN-509和恩杂鲁胺促进AR DNA结合。因此，AR F876至L的突变足以将第二代抗雄激素恩杂鲁胺和ARN-509转变成部分激动剂。
表7.
实例9：稳定细胞系的产生
在该实例中，细胞系在AR F876L突变的稳定表达下产生。首先根据制造商的规程通过用pVSV-G(Clontech)共转染GP2-293细胞来产生pSRαF876L、pQCXIN-AR和pQCXIN-F876L逆转录病毒。
稳定地表达野生型或AR-F876L的PC3细胞是通过用pQXIN-AR或pQXIN-F876L逆转录病毒转导PC3细胞以及在含有500μg/mL庆大霉素的RPMI 1640培养基中进行选择而产生的。
稳定地表达AR-F876L的LNCaP细胞是通过用pCDNA-F876L转染LNCaP细胞或用SRαF876L逆转录病毒转导LNCaP细胞产生的。在400μg/mL庆大霉素中选择之后，分离LNCaP/pCDNA-F876L的单个克隆。LNCaP/SRαF876L细胞池是所选择的400mg/mL庆大霉素。
通过使用AR N-20抗体(Santa Cruz Biotechnology)的Western分析确认所有细胞系的AR蛋白表达。
实例10：平衡AR结合测定
野生型AR与F876L AR的竞争性结合测定如在Clegg等人(2012)Cancer Research 72：1494-503中所描述的，使用如上所述稳定地表达野生型人AR或AR-F876L的PC3细胞来执行。Ki被计算为Ki＝IC50/(1+([3H-R1881]/Kd))，[3H-R1881]＝0.6nM。
在平衡AR结合测定中，ARN-509和恩杂鲁胺分别以30倍与48倍的高亲和性结合所述突变(表8，图5)(R1881的Kd：AR＝0.5nM；AR-F877L＝0.64nM)。因此，对AR的激动剂活性升高与对野生型与F876L受体两者的结合亲和性增大相关联，表明证实激动剂能够通过降低解离常数来增大亲和性。
表8.
实例11：稳定的F876L前列腺癌细胞系中AR靶基因的表达以及稳定 的F876L前列腺癌细胞系的增殖
如上文所示，AR-F876L的表达足以造成基于瞬时报告基因的测定中的对恩杂鲁胺和ARN-509的抵抗性。在这个实例中，检测F876L对内源性AR靶基因的影响，以及稳定地表达所述突变的前列腺癌细胞中的增殖。如在实例9中所述工程构建两个LNCaP细胞系(LNCaP/SRαF876L和LNCaP/pCDNAF876L)，从而以与LNCaP/AR(cs)模型相当的水平过度表达AR-F876L。
为了测量细胞中的AR水平，从已在去激素培养基中培养3天的LNCaP、LNCap/AR(cs)、LNCaP/SRαF876L和LNCaP/pCDNAF876L细胞中获得蛋白提取物。通过蛋白印迹法分析AR蛋白水平。所述AR水平经量化并归一化成肌动蛋白水平，并且相对于LNCaP细胞中的AR表达而表达(图6)。
对于内源性的靶基因分析，将LNCaP/AR(cs)、LNCaP SRαF876L、以及LNCaP/pCDNAF876L细胞在去激素培养基中培养3天，之后用载体、1nM R1881或在存在或不存在1nM R1881的情况下用1μM、3μM、10μM和30μM ARN-509或恩杂鲁胺处理所述细胞。
对于增殖测定，将LNCaP/AR(cs)、LNCaP SRαF876L、以及LNCaP/pCDNAF876L细胞在去激素培养基的存在下培养2天，之后用配体处理7天，如上文所述。对于拮抗剂测定，在200pM R1881的存在下添加ARN-509或恩杂鲁胺(最终浓度为100pM)。用CellTiter-Glo的基于发光的细胞活力测定来定量增殖，如上文所述。
在LNCaP/AR(cs)细胞中，ARN-509和恩杂鲁胺对AR靶基因的诱导或增殖活性几乎没有影响(图7A，表9A)。这两种拮抗剂将R1881诱导的转录和增殖阻遏至与其较高浓度时的激动剂活性相符的水平(图7B，表9B)。相反，在表达F876L-AR的细胞中，恩杂鲁胺和ARN-509两者都显示出强有力的转录和增殖激动剂活性(图7A和图7B，表9C至表9F)。
表9A.LNCaP/AR(cs)激动剂转录
表9B.LNCaP/AR(cs)拮抗剂转录
表9C.LNCaP/SRαF876L激动剂转录
表9D.LNCaP/SRαF876L拮抗剂转录
表9E.LNCaP/pCDNAF876L激动剂转录
表9F.LNCaP/pCDNAF876L拮抗剂转录
实例12：稳定的F876L前列腺癌细胞系中AR靶基因的N端表达与C 端表达的相互作用，以及稳定的F876L前列腺癌细胞系的增殖
对于完全AR转录激活能力来说，AR氨基末端与AR羰基末端的相互作用是重要的。许多AR完全激动剂和AR部分激动剂促进AF2依赖性的N-C相互作用。执行N-C双杂交相互作用测定以评估在ARN-509和恩杂鲁胺的存在下F87L突变中AR的N末端与C末端的相互作用。
pM-AR1-660、pVP16-AR507-919和pVP16-F876L507-919通过将pCDNA3-AR和pCDNA3-F876L的适当PCR产物亚克隆至pM和pVP16(Clontech)中而产生。对于N-C末端相互作用测定，使用50ng pM-AR1-660、75ng pVP16-AR507-919或pVP16-F876L507-919、25ng pMH100-Luc和10ng pRL(Promega)执行三次重复转染。将经转染的细胞温育4小时，随后用配体处理。ARN-509和恩杂鲁胺是以8μM的量测定的，而R1881是以1nM的量测定的。
与其转录活性相符，恩杂鲁胺和ARN-509促进AR-F876L而非野生型AR的N-C末端相互作用(图8)。因此，ARN-509和恩杂鲁胺对AF-F876L的激动剂活性与激动剂样的AF-2构造相关联。
实例13：AR的染色质免疫沉淀测定
雄激素调节的AR靶基因的转录激活需要激动剂诱导的DNA结合和随后转录辅助调节因子的募集。为了确认指示ARN-509和恩杂鲁胺促进AR-F876L DNA结合的VP16-AR报告基因结果，我们执行对6个AR靶基因的染色质免疫沉淀(ChIP)分析，所述AR靶基因来自已用R1881和/或每一拮抗剂处理的细胞。
如在Joseph等人(2009)PNAS USA 106：12178-83]中所述执行ChIP测定。简单地说，将LNCaP/AR(cs)和LNCaP SRαF876L细胞在补充有10％CSS的RPMI 1640中平板接种在150mm的培养皿中(20mL中7×106个细胞)培养3天。在存在或不存在1nM R1881的情况下，用10μM的拮抗剂处理细胞4小时。在配体处理之后，将甲醛添加至培养基至1％的最终浓度，将所述细胞温育10分钟，并且用甘氨酸淬火(125mM最终浓度)5分钟。用含有1X HaltTM蛋白酶和磷酸酶一次性抑制剂混合物(1X HaltTMProtease&Phosphatase Single-Use Inhibitor Cocktail)(1X PI，ThermoScientific)的PBS洗涤细胞3次，使细胞沉淀、在1mL RIPA缓冲液(50mM Tris pH7.5、0.15M NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.05％SDS、1mM EDTA，1X PI)中裂解，并且经超声处理直至平均DNA片段大小为约等于500bp。将经超声处理的交联染色质稀释到3.3mL RIPA中，并且用100mL 50％蛋白A/G琼脂糖浆(SC-2003，Santa CruzBiotechnology)预清除所述染色质，所述琼脂糖浆含有200mg/mL经超声处理的鲑鱼精DNA和500mg/mL BSA。随后将1mL经预清除的染色质用15μg抗AR(SC-816，Santa Cruz Biotechnology)或正常的兔IgG(SC-2027，Santa Cruz Biotechnology)在4℃免疫沉淀2小时，并且添加100mL 50％蛋白A/G琼脂糖微珠并在4℃温育过夜。按顺序在低盐缓冲液(50mMHEPES pH 7.8、140mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100、0.1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS)、高盐缓冲液(与低盐缓冲液成分相同，但是含有500mM NaCl)、LiCl缓冲液(20mM Tris pH 8.0、1mM EDTA、250mMLiCl、0.5％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠)、以及TE缓冲液(50mM Tris pH8.0、1mM EDTA)中将琼脂糖微珠洗涤2遍。所有的洗涤步骤均在1X PI的存在下执行。蛋白-DNA复合物在225mL洗脱缓冲液(50mM Tris pH8.0、1mM EDTA、1％SDS)中在65℃洗脱两次共15分钟。在NaCl存在下经洗脱的蛋白-DNA复合物在65℃逆向交联过夜并且在42℃用EDTA和蛋白酶K进一步处理1小时。所述DNA片段在10mM Tris pH 8.5中使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAquick PCR purification kit)(Qiagen)纯化，稀释，并且通过使用iTaq SYBR Green ROX超混合液(iTaq SYBRGreen Supermix with ROX)(Bio-Rad)的实时PCR进行分析。所述样本在ABI 7900HT仪器上扩增。寡核苷酸引物的序列在表8中列出。
在LNCaP/AR(cs)细胞中，R1881促进AR DNA(图9)。与VP16-AR报告基因数据相符，ARN-509和恩杂鲁胺两者都促进AR DNA结合LNCaP/SRαF876L细胞。在R1881的存在下，所有拮抗剂将经R1881促进的AR DNA结合抑制到与其在两个细胞系中的部分激动剂或拮抗剂活性相符的水平(补充图S9)。
实例14：AR F876L的体内效应
为了确定F876L变化是否在体内造成对恩杂鲁胺和ARN-509的抵抗，将稳定地表达F876L AR的LNCaP细胞系注射(皮下注射)到经去势的免疫缺陷小鼠中，并且形成肿瘤。
所有动物研究都是按照实验动物使用与管理委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committees)批准的协定执行的，以及遵循了在研究中适当、人道地使用动物的指导方针。在SCID无毛远交(SHO)雄性小鼠(Charles River Laboratories)中执行体内异种移植实验。所述小鼠在用异氟醚麻醉的情况下去睾丸，并且给予其7-10天时间恢复。将LNCaP/AR(cs)或LNCaP/SRαF876L细胞(如上文所述)悬浮在50％RPMI、50％基质胶(BD Biosciences)中，以及按100μL体积注射3×106个细胞/异种移植物。每周观察所述动物直到肿瘤生长明显可见。在注射40-60天后，所述动物被随机分配成具有相等的肿瘤负荷均值(150-250mm3)和范围的多个群组。所有的化合物都以口服管饲法按照30mg/kg/天的化合物剂量每日给药。对于所有LNCaP/AR(cs)异种移植研究，ARN-509和恩杂鲁胺药物原种是以18％PEG-400、1％Tween-80和1％聚维酮制备的，并且以含15％维生素E-TPGS和65％0.5％w/v的CMC溶液的20mM柠檬酸盐缓冲液(pH 4.0)进行配置以用于给药。在研究的最后评估ARN-509和恩杂鲁胺的药代动力学，如先前所描述的(Clegg等人(2012)Cancer Research72：1494-503)。
与体外数据相符，30mg/kg/天的ARN-509或恩杂鲁胺都不影响LNCaP/AR/SRαF876肿瘤的生长(图10)。这种活性缺乏并非取决于极低的化合物暴露，因为第28天的血浆药物水平被定量并且与先前的LNCaP/AR异种移植研究相符(表9)。此外，在平行实验中，30mg/kg/天的ARN-509在LNCaP/AR(cs)模型中表现出强有力的抗肿瘤活性，与先前的结果相符(图10)。
表9.LNCaP/SRαF876L异种移植药代动力学
实例15：在患有进展性晚期去势抵抗性前列腺癌(CRPC)的患者中 进行ARN-509的安全性、药动学和概念验证的开放式1期/2期研究
在这项研究中，从参与用ARN-509治疗前列腺癌的1期/2期临床研究的患者的29份患者血浆样本中分离DNA。使用基于乳化PCR的BEAMing技术方法(Dressman等人(2003)PNAS USA100：8817-22)对此进行分析。BEAMing已经成功地用于检测驱动癌基因中的各种致瘤性突变，所述驱动癌基因为诸如从人血浆获得的PIKC3a和K-ras(Diehl等人(2008)Nature Medicine 14：985-90)。在所测试的29份患者样本中的3份中鉴定到了AR F876L突变。
所执行的临床研究是对9种剂量水平进行的多中心合作的、首次用于人的、1期/2期的、剂量递增和概念验证研究，其中符合条件的进展性晚期CRPC患者接受门诊病人基数的ARN-509口服剂量，以确定ARN-509的安全性、药代动力学(PK)和抗肿瘤疗效的初步证据。
使用标准的3x3剂量递增标准将mCRPC患者按照剂量水平依次分配成群组，每一剂量水平3到6名患者。
目标为测定ARN-509的最大耐受剂量(MTD)和/或2期推荐剂量(RP2D)，其导致对最多30％的患者的剂量限制毒性(DLT)。DLT一般定义为任意的1级或更高级癫痫，任意的3-4级非血液毒性(虽然最大药物疗法，但GI毒性必须维持在3-4级)和/或持续时间大于5天的4级血液毒性，所述DLT是按照CTCAE V4.0定义的并且与ARN-509治疗相关联进行评估。所述研究设计的示意图在图11中提供。
已签写知情同意书的符合条件的患者被优先选择到剂量递增群组中，在所述群组中患者将接受单次口服剂量的ARN-509，之后是一周的观察时期(PK周)。连续给药开始于周期1的第1天，假设未观察到不可接受的毒性。
在周期1的第28天中监测每个剂量水平的最少3名受检者的DLT。如果在每个剂量水平的前3名患者中未检测到DLT，则随后的入组以下一剂量水平进行。如果在给定剂量水平的2名或更多名患者经历DLT或在给定剂量水平观察到任意等级癫痫的单次发作，则停止剂量递增并且将MTD定义为先前的剂量水平。如果未观测到DLT，则RP2D是基于ARN-509的完整药代动力学和安全特性，并且最佳生物剂量是从临床前数据确定的，而不必从MTD确定。
起始剂量为30mg/天，逐步递增到每天60mg、90mg、120mg、180mg、240mg、300mg、390mg、以及480mg。预计这些剂量水平跨越了所预期的药理学活性剂量范围并且在临床前毒性结果所指示的安全裕度内。
在选择240mg作为RP2D之后，另外的符合条件患者被选入所述研究的2期部分，其由处于MTD和/或RP2D的3个一致的扩展群组组成，以收集另外的安全信息并且提供抗肿瘤活性的起始信号。所述三个扩展群组包括：
1.未治疗的非转移性CRPC人群(未用化学疗法和阿比特龙治疗的50名非转移性CRPC患者)；
2.未治疗的转移性CRPC人群(未用化学疗法和阿比特龙治疗的20名mCRPC患者)；以及
3.已用阿比特龙治疗的转移性CRPC人群(10-20名患者)。
希望每名mCRPC患者会接受至少3个周期(12周)的连续治疗，并且每名非转移性CRPC患者将接受至少4个周期(16周)的连续治疗。在规程规定的疾病进展或不可接受的毒性的任意时刻停止治疗。每3个周期(12周)执行对mCRPC患者的肿瘤评估，以及每4个周期(16周)执行对非转移性CRPC患者的肿瘤评估。评估从第一剂量到最终剂量之后的至少四周内，或直到药物相关毒性分解，或当毒性被视为不可逆时的安全性，无论哪个时间更长。在所选临床站点的2期扩展阶段，评估食物对ARN-509吸收的影响以及ARN-509对心室复极的影响。
使用BEAMing技术的样本分析在当前的ARN-509临床研究中是用Inostics GMBH执行的。将血液收集于K2-EDTA真空管中并且通过缓慢地倒转数次来进行彻底的混合。在收集之后的30分钟内，将管以2000xg离心15分钟。血浆经滗出并转移到冻存管中。在滗出之后的90分钟内，将血浆存储在-70℃或更低的温度直至分析。将DNA从300-500μl的血浆等分试样中纯化并提取，如在Diehl等人(2008)Nature medicine 14：985-90中描述的。突变检测是根据如在Diehl等人中描述的BEAMing技术执行的。简单地说，在起始PCR步骤中，使用具有标记序列的基因特异性引物扩增靶区域(～100bp)，并且所述靶区域经受含有引物覆盖磁珠的乳化PCR。在乳化PCR之后，通过等位基因特异性杂交执行野生型和突变体微珠的区分，之后进行流式细胞计数。使用FCS Express(De Novo Software，LosAngeles，CA)分析流式细胞计数结果，从而导致突变体等位基因比野生型等位基因的比率的定量化。
分析样本中野生型AR或3个单点突变体等位基因的存在，相对于编码SEQ ID NO：18中所示的序列的AR核酸，所述3个单点突变体等位基因可生成F876L(分别为t2988c、c2990a和c2990g，或t2626c、c2628a以及c2928g)。经分析的突变和BEAMing方法的技术灵敏度展示于表10中。为了进行检测，所述频率必须高于每次测定中所使用的基因组当量的总量。例如，如果在样本中存在1,000基因组当量，虽然突变体DNA分子的经计算的分数是0.02％(5,000个野生型等位基因中存在1个突变体等位基因)，但是所述样本仍计为野生型。
表10.通过BEAMing测定监测的AR核苷酸变化
核苷酸位置 核苷酸变化 氨基酸位置 氨基酸变化
c.2626 t＞c 876 F＞L
c.2628 c＞a 876 F＞L
c.2628 c＞g 876 F＞L
结果
所有剂量分组中的患者子集表现出PSA响应，其中14/30的患者表现出相比于基线的12周≥50％的PSA下降。经筛选的29名患者的PSA响应示于图12中。分析治疗前和治疗期间的血浆样本。BEAMing分析的时间由PSA响应线的末端指示。所述29名患者中的十八名患者在分析时具有高于基线的PSA，这指示对ARN-509的内在或获得性抵抗。
设计三个探针以监测3个核苷酸变化，所述核苷酸变化可编码用于F876L氨基酸替换。突变序列和野生型DNA的稀释混合实验指示0.02％的技术灵敏度(可以检测5000个野生型中的1个突变序列)。在29名经ARN-509治疗的患者的血浆样本的初试筛选中，在3名患者中检测到了突变的证据(表11和表12)。在BEAMing分析时，患者7和患者10具有高于基线的PSA水平，而患者13证实具有高于治疗最低点的不断升高的PSA(图13)。在所有3名患者中都检测到了核苷酸变化c2628a。在这3名患者中的一位(患者10)还检测到了t2626c突变，所述突变表征多克隆疾病。编码F876L的突变未在任一治疗前的样本中检测到(0/29)，这表明若在ARN-509治疗之前存在突变，则所述突变低于检测极限，或所述突变是在ARN-509治疗期间重新产生的。在任一情形中，所述数据支持以下假说：具有突变等位基因的消融灶到足以用于检测ctDNA的水平的选择性生长取决于长期暴露于ARN-509，并且与不断升高的PSA有关。为了进一步建立F876L与进展性疾病之间的联系，我们分析了在其他时间点从在初始筛选中计为阳性的3名患者获得的血浆样本(表12)。在患者10中，在分析的另一时间点处未检测到突变(第4周期；T0时的PSA为102％)。在患者13中，在第4周期(PSA为基线的16.2％)时或第12周期(患者在第11周期被计为阳性)时未检测到突变。第11周期时的突变序列在检测极限处，并且预计通过单个突变分子的扩增而产生。虽然患者13的PSA在第11周期和第12周期时从治疗最低点缓慢地上升，但是在这两个时间点处PSA仍然比研究开始时低60％以上，并且因此并未出现真实抵抗性。检测极限处的突变序列的鉴定可能反映出相对稀少的突变克隆的存在，所述突变克隆可能在持续的选择压力下扩展并且最终导致进展性疾病。
对患者7给定相对较长的治疗持续时间，其他时间点的血浆发生明显的PSA下降；(从基线下降90％以上；第4周期、第8周期和第10周期)，并且分析初始时从其最低点上升的PSA(第15周期和第19周期)(图13)。有趣的是，在来自第4治疗周期、第8治疗周期和第10治疗周期的3个样本中未检测到突变，但是在从初始PSA上升分析的2个样本中检测到了c2628a突变(第15周期和第19周期)。这些临床数据与临床前的数据相符，这指示F876L氨基酸改变足以造成对ARN-509的抵抗。
表11.F876L阳性患者的BEAMing结果
*治疗周期为4周；第0周期是治疗前的时间点。
表12.ARN-509-001患者的初步F876L BEAMing
实例16：产生用于药物筛选的细胞系的方法
为了鉴定在雄激素受体发生F876L突变的情况下保持AR拮抗剂活性的化合物，改编如上文所述的多个体外和体内测定。
在体外环境中，使用类似于实例8中所描述的测定的瞬时转染转录测定来鉴定缺乏激动剂活性并且对野生型和F876L突变体AR转录活性完全拮抗的化合物。HEPG2细胞或其中的AR转录活性可被监测的任意真核细胞被用于这种筛选。
作为瞬时转染的替代方案，转录报告基因和F876L AR被稳定地整合于大量细胞系中并且用于筛选化合物。通过使用基于质粒(即，pCDNA3.1)或病毒的整合将突变体F876L AR稳定地整合到雄激素敏感型前列腺癌细胞系(诸如，LNCaP、LaPC4或VCaP)中允许在转录、增殖和异种移植环境中筛选和评估所述化合物。简单地说，F876L AR被克隆到逆转录病毒表达载体中，所述逆转录病毒表达载体为诸如pQCXIP(Clontech，Mountain View，CA)。所得的质粒随后被用于产生高滴度的病毒原种以用于根据制造商的规程产生稳定转导的细胞系。所得的细胞系被用于如在实例4中所描述的瞬时转染转录测定、如在实例5中所描述的内源性基因转录测定、如在实例3中所描述的增殖测定或如在实例1中所描述的异种移植研究。
另选地，通过AR响应性报告基因的稳定整合来进一步修饰细胞，所述AR响应性报告基因为诸如Cignal Lenti AR报告基因(Cignal Lenti ARReporter)(Qiagen，Valencia，CA)，以允许基于报告基因的化合物筛选，而无需瞬时转染。
本文描述的实例和实施例仅用于示例性目的，并且对本领域中的技术人员建议的各种修改或改变包含在本申请的实质和范围内，并且在所附权利要求的范围内。

Claims (114)

1. 一种用于确定受检者是否对或将变得对用第一代或第二代雄激素受体（AR）拮抗剂的疗法具有较差响应性的方法，所述方法包括：
(a) 测试来自所述受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及
(b) 如果所述受检者具有所述修饰，则将所述受检者表征为对用第一代或第二代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性或将变得对用第一代或第二代AR拮抗剂的疗法具有抵抗性。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述受检者已被施用第一代或第二代AR拮抗剂来治疗癌症。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌。
4. 一种用于优化正接受第一代或第二代AR拮抗剂来治疗癌症的受检者的疗法的方法，所述方法包括：
(a) 测试来自所述受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及
(b) 如果所述受检者具有所述修饰，则停止用所述第一代或第二代AR拮抗剂来治疗，或如果所述受检者不具有所述修饰，则继续用第一代或第二代AR拮抗剂来治疗。
5. 一种用于选择用第三代AR拮抗剂的疗法的受检者的方法，所述方法包括：
(a) 测试来自所述受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；以及
(b) 如果所述受检者具有所述修饰，则将所述受检者表征为用第三代AR拮抗剂的疗法的候选者。
6. 根据权利要求2或3所述的方法，所述方法还包括如果所述受检者具有所述修饰，则停止用第一代或第二代AR拮抗剂来治疗，或如果所述受检者不具有所述修饰，则继续用第一代或第二代AR拮抗剂来治疗。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括如果所述受检者具有所述修饰，则施用抑制所述经修饰的受体的第三代AR拮抗剂。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述修饰包括在所述AR多肽的氨基酸位置876处的氨基酸的替换或缺失。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述修饰为在所述AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸至选自下列的氨基酸的替换：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。
10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述修饰为在所述AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸至选自下列的氨基酸的替换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中所述修饰为在所述AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸至亮氨酸的替换。
12. 根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述修饰包括编码所述AR多肽的氨基酸位置876的核酸的缺失。
13. 根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中编码所述经修饰的AR多肽的核酸具有（i）在对应于SEQ ID NO: 18中所示的核苷酸序列中的核酸位置2626的核酸位置处的胸腺嘧啶（t）至胞嘧啶（c）的突变；（ii）在对应于SEQ ID NO: 18中所示的核苷酸序列中的核酸位置2628的核酸位置处的胞嘧啶（c）至腺嘌呤（a）的突变；或（ii）在对应于SEQ ID NO: 18中所示的核苷酸序列中的核酸位置2628的核酸位置处的胞嘧啶（c）至鸟嘌呤（g）的突变。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述核酸编码在所述AR多肽的氨基酸位置876处的亮氨酸。
15. 根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述核酸分子为RNA或DNA。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中所述DNA为基因组DNA。
17. 根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述方法还包括从所述RNA样本中分离mRNA。
18. 根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中测试包括使编码所述AR多肽的氨基酸位置876的核酸扩增。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中扩增是通过聚合酶链反应（PCR）进行的。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中PCR扩增包括使用一对寡核苷酸引物，所述一对寡核苷酸引物位于编码所述AR多肽的氨基酸位置876的区域两侧。
21. 根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述方法包括对所扩增的核酸进行测序。
22. 根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中测试包括使所述核酸与序列特异性核酸探针接触，其中所述序列特异性核酸探针：
(a) 结合至编码经修饰的受体的核酸，所述经修饰的受体在氨基酸位置876处被修饰；并且
(b) 不结合至编码野生型受体的核酸，所述野生型受体在氨基酸位置876处具有苯丙氨酸。
23. 根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述样本来自所述受检者的肿瘤细胞样本。
24. 根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中样本来自肿瘤活检样本、血液样本、血清样本、淋巴液样本、或骨髓穿刺液。
25. 根据权利要求23或24所述的方法，其中所述样本含有循环肿瘤细胞（CTC）或播散肿瘤细胞（DTC）。
26. 根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述第一代或第二代AR拮抗剂通过竞争性拮抗作用来抑制野生型AR多肽。
27. 根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述第二代AR拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺（MDV3100）和RD162。
28. 根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述受检者患有选自下列的疾病或病症：癌症、炎性病症或增殖性病症。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述受检者患有癌症。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、或肝细胞癌。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述受检者患有去势抵抗性前列腺癌。
33. 根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述受检者患有实体瘤。
34. 根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中在获取所述样本之前用所述第一代或第二代AR拮抗剂来治疗所述受检者。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述样本为在第一次施用所述第一代或第二代AR拮抗剂之后1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、14个月、16个月、18个月、20个月、22个月或24个月时获取的样本。
36. 根据权利要求34或35所述的方法，其中在用所述第一代或第二代AR拮抗剂的治疗的过程中获取1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次所述样本。
37. 根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中当第一次施用所述第一代或第二代AR拮抗剂时，所述受检者对用所述第一代或第二代AR拮抗剂的治疗具有响应性。
38. 一种用于筛选拮抗经修饰的AR的化合物的方法，所述方法包括：
(a) 在细胞中表达经修饰的AR，其中所述经修饰的AR在对应于SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰；
(b) 使所述细胞与测试化合物接触；以及
(c) 检测所述细胞中的AR活性水平，其中活性降低指示所述化合物拮抗所述经修饰的AR受体。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中所述测试化合物表现出对所述经修饰的AR受体的完全拮抗剂活性。
40. 根据权利要求38或39所述的方法，其中所述测试化合物未表现出对所述经修饰的AR受体的激动剂活性。
41. 根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中所述修饰为在所述AR多肽的位置876处的氨基酸的替换或缺失。
42. 根据权利要求39所述的方法，其中所述修饰为在所述AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸至选自下列的氨基酸的替换：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中所述修饰为在所述AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸至选自下列的氨基酸的替换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
44. 根据权利要求43所述的方法，其中所述修饰为在所述AR多肽的氨基酸位置876处的苯丙氨酸至亮氨酸的替换。
45. 根据权利要求38-44中任一项所述的方法，其中所述细胞缺乏野生型AR的表达、表达低水平的野生型AR、或表达经修饰的AR受体。
46. 根据权利要求38-45中任一项所述的方法，其中所述细胞选自HeLa、CV1、COS7、HepG2、HEK-293、DU145、PC3、TSY-PR1、LNCaP、CWR、VCaP和LAPC4。
47. 根据权利要求38-46中任一项所述的方法，其中所述细胞包含可操作地连接至雄激素响应性启动子的报告基因。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中活性是通过分析所述报告基因的表达来确定的。
49. 根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述启动子包含雄激素响应元件。
50. 根据权利要求49所述的方法，其中所述雄激素响应元件为4xARE或腺血管舒缓素元件。
51. 根据权利要求38-50中任一项所述的方法，其中所述启动子为腺血管舒缓素、前列腺特异性抗原、MMTV LTR、FASN、STEAP4、TMPRSS2、ORM1、或NKX3.1启动子。
52. 根据权利要求38-51中任一项所述的方法，其中所述报告基因编码选自下列的蛋白：荧光素酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、或酶。
53. 一种具有AR活性的分离的AR多肽或其变体，所述分离的AR多肽或其变体在对应于SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处包含修饰，其中所述修饰赋予所述经修饰的AR多肽或变体对AR拮抗剂的抵抗。
54. 根据权利要求53所述的分离的AR多肽，其中所述修饰包括与SEQ ID NO: 1中所示的野生型AR相比在位置876处的氨基酸的替换。
55. 根据权利要求53或权利要求54所述的分离的AR多肽，其中所述替换为F876L。
56. 根据权利要求55所述的分离的AR多肽，所述分离的AR多肽具有SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列。
57. 根据权利要求53所述的分离的AR多肽，其中所述修饰包括氨基酸位置876的缺失。
58. 根据权利要求53-57中任一项所述的分离的AR多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO: 1中所示的野生型AR相比在位置876处的氨基酸的替换以及一个或多个另外的氨基酸替换。
59. 根据权利要求58所述的分离的AR多肽，其中在位置876处的氨基酸的替换为F876L。
60. 根据权利要求58-59中任一项所述的分离的AR多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸替换选自与去势抵抗性前列腺癌相关联的一个或多个氨基酸替换。
61. 根据权利要求58-60中任一项所述的分离的AR多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸替换选自T877A、W741C、W741L、W741R、L701H和H874Y。
62. 根据权利要求53-61中任一项所述的分离的AR多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO: 5中所示的氨基酸序列或变体，所述变体与所述具有SEQ ID NO: 5中所示的序列的多肽具有至少或至少约60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性，其中在位置876处的氨基酸不是苯丙氨酸。
63. 根据权利要求53-62中任一项所述的分离的AR多肽，所述分离的AR多肽为重组蛋白。
64. 一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码权利要求53-62中任一项所述的经修饰的AR多肽。
65. 根据权利要求64所述的分离的核酸，其中所述核酸为DNA或RNA分子。
66. 根据权利要求64所述的分离的核酸，其中所述核酸为cDNA分子。
67. 根据权利要求64或权利要求65所述的分离的核酸，其中所述核酸包含SEQ ID NO: 19中所示的核酸序列或变体，所述变体与所述具有SEQ ID NO: 19中所示的序列的多肽具有至少或至少约60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同一性，其中编码在位置876处的氨基酸的核酸密码子不编码苯丙氨酸。
68. 根据权利要求67所述的分离的核酸，其中所述核酸分子编码在所述AR多肽的位置876处的亮氨酸。
69. 一种载体，所述载体包含权利要求64-68中任一项所述的核酸分子。
70. 根据权利要求69所述的载体，其中所述载体为病毒或质粒载体。
71. 根据权利要求69或权利要求70所述的载体，其中所述核酸可操作地连接至启动子。
72. 根据权利要求71所述的载体，其中所述启动子为组成型启动子或诱导型启动子。
73. 一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求69-72中任一项所述的载体。
74. 根据权利要求73所述的宿主细胞，其中所述细胞为原核细胞或真核细胞。
75. 根据权利要求74所述的宿主细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、或两栖动物细胞。
76. 一种由权利要求73-75中任一项所述的宿主细胞表达的突变体AR多肽。
77. 一种由权利要求38-52中任一项所述的方法鉴定的第三代AR拮抗剂。
78. 一种药物组合物，所述药物组合物包含由权利要求38-52中任一项所述的方法鉴定的第三代AR拮抗剂以及药学上可接受的赋形剂。
79. 一种治疗的方法，所述方法包括向对其有需要的受检者施用治疗有效量的权利要求77或权利要求78所述的药物组合物，其中所述组合物包含合适的药用载体。
80. 根据权利要求79所述的方法，其中所述受检者患有癌症。
81. 根据权利要求80所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、或肝细胞癌。
82. 根据权利要求81所述的方法，其中所述癌症为去势抵抗性前列腺癌。
83. 根据权利要求79-82中任一项所述的方法，其中所述受检者表达突变体AR。
84. 根据权利要求83所述的方法，其中所述突变体AR包含在所述AR多肽的氨基酸位置876处的氨基酸的替换或缺失。
85. 根据权利要求84所述的方法，其中所述替换为F876L。
86. 根据权利要求71-85中任一项所述的方法，其中所述第三代AR拮抗剂与另外的治疗剂一起施用。
87. 根据权利要求86所述的方法，其中所述第三代AR拮抗剂和所述另外的治疗剂顺序地、同时地或间歇地施用。
88. 根据权利要求86或权利要求87所述的方法，其中所述另外的治疗剂选自激素、激素受体激动剂或拮抗剂、皮质类固醇、止吐剂、止痛药、抗癌剂、抗炎剂、激酶抑制剂、HSP90抑制剂、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂。
89. 根据权利要求86或权利要求87所述的方法，其中所述另外的治疗剂为促性腺激素释放激素（GnRH）激动剂或拮抗剂。
90. 根据权利要求89所述的方法，其中所述GnRH激动剂为亮丙瑞林、布舍瑞林或戈舍瑞林。
91. 一种微芯片，所述微芯片包含权利要求53-62中任一项所述的经修饰的AR多肽或权利要求64-68中任一项所述的核酸。
92. 根据权利要求91所述的微芯片，其中所述经修饰的AR多肽包含为F876L的氨基酸替换，或所述核酸编码具有为F876L的氨基酸替换的经修饰的AR多肽。
93. 一种试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种用于检测核酸或在氨基酸位置876处包含修饰的经修饰的AR多肽的试剂，所述核酸编码在氨基酸位置876处包含修饰的经修饰的AR多肽。
94. 根据权利要求93所述的试剂盒，其中所述经修饰的AR多肽包含为F876L的氨基酸替换。
95. 根据权利要求93或94所述的试剂盒，所述试剂盒包含一对寡核苷酸引物，所述一对寡核苷酸引物位于编码AR多肽的氨基酸876的核酸区域两侧。
96. 根据权利要求93或94所述的试剂盒，所述试剂盒包含寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物：
(a) 结合至编码经修饰的AR的核酸，所述经修饰的AR在氨基酸位置876处被修饰；并且
(b) 不结合至编码野生型AR的核酸，所述野生型AR在氨基酸位置876处具有苯丙氨酸。
97. 根据权利要求93或94所述的试剂盒，所述试剂盒包含微芯片，所述微芯片包含：
(a) 具有为F876S的修饰的经修饰的AR多肽，或包含为F876S的修饰的经修饰的AR多肽的一部分；或
(b) 核酸分子，所述核酸分子编码具有为F876S的修饰的突变体AR多肽或包含为F876S的修饰的突变体AR多肽的一部分。
98. 一种用于检测经修饰的AR的体系，所述经修饰的AR对在受检者中用第一代或第二代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性，所述体系包括：
(a) 来自所述受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本；以及
(b) 微阵列，所述微阵列包含编码突变体AR多肽或所述突变体AR多肽的一部分的核酸，所述突变体AR多肽或所述突变体AR多肽的一部分在对应于SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰。
99. 根据权利要求98所述的体系，其中所述微阵列包含于微芯片上。
100. 一种用于检测经修饰的AR的体系，所述经修饰的AR对在受检者中用第一代或第二代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性，所述体系包括：
(a) 来自所述受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本；以及
(b) 序列特异性核酸探针，其中所述序列特异性核酸探针：
(i) 结合至编码经修饰的AR的核酸，所述经修饰的AR在氨基酸位置876处被修饰；并且
(ii) 不结合至编码野生型AR的核酸，所述野生型AR在氨基酸位置876处具有苯丙氨酸。
101. 一种用于检测经修饰的AR的体系，所述经修饰的AR对在受检者中用第一代或第二代AR拮抗剂的抑制作用具有抵抗性，所述体系包括：
(a) 来自所述受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本；以及
(b) 一对寡核苷酸引物，所述一对寡核苷酸引物位于编码AR多肽的氨基酸876的核酸区域两侧。
102. 一种分离的抗体，所述分离的抗体结合至权利要求53-62中任一项所述的经修饰的AR多肽，其中所述抗体不结合至或以较低亲和力结合至具有SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的野生型AR多肽。
103. 根据权利要求102所述的抗体，其中所述经修饰的AR多肽包含为F876L的氨基酸替换。
104. 一种在患有癌症的患者中维持疗法的方法，所述方法包括：
(a) 向所述患者施用维持疗法方案，所述维持疗法方案包括施用治疗有效剂量的第一代或第二代AR拮抗剂；以及
(b) 在所述维持疗法方案的过程中以预先确定的时间间隔监测所述患者以确定所述受检者是否具有编码AR的内源性基因的突变，所述突变导致在对应于SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处的修饰。
105. 根据权利要求104所述的方法，其中监测包括：
测试来自所述受检者的含有编码AR多肽的核酸分子的样本以确定所编码的AR多肽是否在对应于SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列的氨基酸位置876的氨基酸位置处被修饰。
106. 根据权利要求104或105所述的方法，其中所述方法还包括如果所述受检者具有所述突变，则停止维持疗法方案，或如果所述受检者不具有所述修饰，则继续维持疗法方案。
107. 根据权利要求104或105所述的方法，其中所述方法还包括如果所述受检者具有所述修饰，则施用抑制所述经修饰的AR的第三代AR拮抗剂。
108. 根据权利要求104-107中任一项所述的方法，其中在所述AR多肽中的修饰为F876L。
109. 根据权利要求104-108中任一项所述的方法，其中所述第一代或第二代AR拮抗剂通过竞争性拮抗作用来抑制野生型AR多肽。
110. 根据权利要求104-109中任一项所述的方法，其中所述第二代AR拮抗剂选自ARN-509、恩杂鲁胺（MDV3100）和RD162。
111. 根据权利要求104-110中任一项所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、或肝细胞癌。
112. 根据权利要求111所述的方法，其中所述癌症为前列腺癌。
113. 根据权利要求112中任一项所述的方法，其中所述癌症为去势抵抗性前列腺癌。
114. 根据权利要求104-113中任一项所述的方法，其中所述预先确定的时间间隔为每周、每月、每2个月、每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月、或每年。
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