CN104678069B

CN104678069B - 卡那霉素、红霉素、林可霉素三合一金标微孔试纸条

Info

Publication number: CN104678069B
Application number: CN201310616277.2A
Authority: CN
Inventors: 沈建忠; 江海洋; 王战辉; 丁双阳; 张素霞; 温凯; 夏曦; 吴聪明
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2016-08-10
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN104678069A

Abstract

本发明公开了一种卡那霉素、红霉素、林可霉素三合一金标微孔试纸条。本发明提供的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；样品槽的底部附着有卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、红霉素特异性抗体的胶体金标记物和林可霉素特异性抗体的胶体金标记物；试纸条包括底板（1）、反应膜（2）、样品吸收垫（3）和吸水垫（4）；样品吸收垫、反应膜和吸水垫依次附着于底板上；反应膜上由始端至末端依次具有T₃线、T₂线、T₁线和C线，T₃线、T₂线和T₁线上分别包被如下三种偶联物：林可霉素‑载体蛋白偶联物、红霉素‑载体蛋白偶联物、卡那霉素‑载体蛋白偶联物；C线上包被抗抗体。本发明提供的试剂盒具有广阔的市场前景。

Description

卡那霉素、红霉素、林可霉素三合一金标微孔试纸条

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种同时检测动物源性食品（如牛奶等）中卡那霉素、红霉素、林可霉素含量的卡那霉素、红霉素、林可霉素三合一金标微孔试纸条。

背景技术

卡那霉素（Kanamycin）属于氨基糖甙类抗生素，对各种革兰氏阴性细菌及革兰氏阳性细菌均有良好的抗菌作用，适用于治疗细菌性痢疾或其他细菌性肠道感染，是我国畜牧业和水产业中常用的兽药之一，也常被添加到饲料中促进动物的生长发育。虽然卡那霉素具有良好的药理作用，但是其耳毒性和肾毒性作用也较为严重，因此其在动物性产品中的残留问题也日益引起人们的关注。为严格控制卡那霉素在动物源食品中的残留，保证人类的身体健康，欧盟和日本均对牛奶中卡那霉素的最高残留限量进行了规定，分别为150μg/kg和400μg/kg。

红霉素（Erythromycin）属于大环内酯类抗生素，抗菌谱与青霉素近似，临床上主要用于耐青霉素及对青霉素过敏的金黄色葡萄球菌感染，也用于溶血性链球菌及肺炎球菌所致的呼吸道肺炎、军团菌肺炎、支原体肺炎、皮肤软组织感染等，此外红霉素与白喉抗毒素联用对白喉疗效显著。红霉素临床滥用可导致胃肠道反应、肝脏损害、过敏反应、心血管反应等副作用，并可导致细菌产生耐药性，其在动物性食品中的残留会严重影响人类健康。欧盟和我国对红霉素的残留限量均有规定，其中我国农业部235号公告中规定红霉素在奶中最大残留限量为40μg/kg。

林可霉素（Lincomycin）为一般系抑菌剂，在高浓度下对高度敏感细菌具有杀菌作用。林可霉素口服适用于葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎球菌及厌氧菌所致的呼吸道感染、皮肤软组织感染和厌氧菌所致的腹腔感染等。临床广泛应用可导致细菌产生耐药性。因此有必要对动物性食品中的林可霉素的残留进行检测。欧盟和我国均规定林可霉素在牛奶中的最大残留限量为150μg/kg。

现有的卡那霉素、红霉素和林可霉素检测方法多为仪器方法，如HPLC、HPLC-MS/MS、GC-MS/MS等，这些仪器方法灵敏度高，可以提供定量及确证分析，但是前处理复杂，需要昂贵的仪器，且对操作人员有专业的要求，不适合基层检测分析。此外，在实际养殖过程中，动物可能同时使用了多种抗生素，现有检测技术一般仅能检测一种或一类药物，目前尚无可同时检测卡那霉素、红霉素和林可霉素残留量的产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种卡那霉素、红霉素、林可霉素三合一金标微孔试纸条。

本发明提供了一种用于检测卡那霉素、红霉素和林可霉素的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；

所述样品槽的底部附着有卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、红霉素特异性抗体的胶体金标记物和林可霉素特异性抗体的胶体金标记物；

所述试纸条包括底板1、反应膜2、样品吸收垫3和吸水垫4；所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；所述反应膜上由始端至末端依次具有T₃线、T₂线、T₁线和C线，所述T₃线、T₂线、T₁线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T₃线、T₂线和T₁线上分别包被如下三种偶联物（三种偶联物可任意排序）：林可霉素-载体蛋白偶联物、红霉素-载体蛋白偶联物、卡那霉素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与卡那霉素特异性抗体和/或红霉素特异性抗体和/或林可霉素特异性抗体结合的抗抗体。

所述卡那霉素特异性抗体可为卡那霉素单克隆抗体或卡那霉素多克隆抗体。所述红霉素特异性抗体可为红霉素单克隆抗体或红霉素多克隆抗体。所述林可霉素特异性抗体可为林可霉素单克隆抗体或林可霉素多克隆抗体。所述卡那霉素单克隆抗体具体可为卡那霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株KANA-2B11CGMCC No.8403分泌的单克隆抗体。所述红霉素单克隆抗体具体可为红霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株ERM-3F1CGMCCNo.8402分泌的单克隆抗体。所述林可霉素单克隆抗体具体可为林可霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株LIN-6D2CGMCC No.8405分泌的单克隆抗体。

任一所述的载体蛋白可为牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白。

所述卡那霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为BSA，卡那霉素与BSA的摩尔结合比具体可为9:1。所述红霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为OVA，红霉素与OVA的摩尔结合比具体可为8:1。所述林可霉素-载体蛋白偶联物中，所述载体蛋白具体可为OVA，林可霉素与OVA的摩尔结合比具体可为10:1。

所述卡那霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：

（1）称取50mg卡那霉素原料药，溶于4.1ml碳酸盐缓冲液（pH9.5、0.1M)；

（2）称取70mg BSA，溶于5ml碳酸盐缓冲液（pH9.5、0.1M)；

（3）将步骤（1）得到的卡那霉素溶液加到步骤（2）得到的BSA溶液中并混匀，然后加入0.9ml1%（体积比）戊二醛水溶液并搅拌1.5h，然后滴加NaBH₄溶液（6mg NaBH₄用1ml纯水溶解）并反应2h，然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析，然后4500rpm离心6min并取上清液（卡那霉素-载体蛋白偶联物溶液）。

所述红霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：

（1）称取100mg红霉素原料药，溶于6ml无水乙醇，称为A液；

（2）称取羧甲基羟胺半盐酸盐44mg，溶于2ml水，用1M碳酸氢钠水溶液调pH=5-6，称为B液；

（3）将B液加到A液中，然后50℃恒温水浴中搅拌反应5h，冷却到室温，然后加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取2次，合并2次萃取的二氯甲烷层，加入无水硫酸钠振摇后静置过夜，然后过滤并收集滤液，减压旋蒸，得到干物质；

（4）取88mg步骤（3）得到的干物质，溶于6ml DMF中，然后在冰水浴下加入24μL三正丁胺，混匀后再加入24μL氯甲酸异丁酯，冰浴下搅拌反应3h；

（5）称取30mg OVA，溶于3ml0.1M的碳酸钠水溶液；

（6）取步骤（4）得到的溶液，在冰水浴环境下加到步骤（5）得到的OVA溶液中，然后4℃搅拌3h，然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析，然后4500rpm离心6min并取上清液（红霉素-载体蛋白偶联物溶液）。

所述林可霉素-载体蛋白偶联物的制备方法具体如下：

（1）取126mg盐酸林可霉素原料药，溶于1.5ml蒸馏水；

（2）取53mg高碘酸钠，溶于0.5ml蒸馏水；

（3）将步骤（2）得到的高碘酸钠溶液加到步骤（1）得到的溶液中并反应20min，然后加入17μl乙二胺并反应2h，然后滴加NaBH₄溶液（2mg NaBH₄用1ml纯水溶解）并反应10h；

（4）称取60mg OVA，溶于6ml的蒸馏水；

（5）取580μl步骤（3）得到的溶液，加入步骤（4）得到的OVA溶液，然后加入500μl2.5%（体积比）的戊二醛水溶液并搅拌3.5h，然后加入NaBH₄溶液（4mg NaBH₄用2ml纯水溶解）并搅拌24h，然后用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析，然后4500rpm离心5min并取上清液（林可霉素-载体蛋白偶联物溶液）。

卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、红霉素特异性抗体的胶体金标记物和林可霉素特异性抗体的胶体金标记物的制备方法均如下：

（1）在沸腾的100mL的0.01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1%柠檬酸三钠水溶液，获得终浓度为0.01%的胶体金溶液（胶体金的直径为15-20nm）；

（2）用0.1mol/L的K₂CO₃水溶液调胶体金溶液的pH至8.5；

（3）将1μL10mg/mL的特异性抗体溶液（所述卡那霉素特异性抗体溶液、所述红霉素特异抗体溶液或所述林可霉素特异抗体溶液）加入1mL步骤（2）得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10μL20g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10μL10g/100ml的PEG₈₀₀₀水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000g离心15min取上清液，然后4℃、12000g离心20分钟取沉淀；

（4）用PBS缓冲液（pH7.2、2mM）溶解步骤（3）得到的沉淀，4℃、12000g离心20分钟取沉淀，然后用200μL含1g/100ml BSA的PBS缓冲液（pH7.2、20mM）重悬沉淀，得到特异性抗体的胶体金标记物。

所述卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、所述红霉素特异性抗体的胶体金标记物和所述林可霉素特异性抗体的胶体金标记物均可以冻干品的形式附着于于所述样品槽底部。这样做的优势是简化样品前处理过程，提高产品的检测的灵敏度。所述样品板的制备方法具体如下：取微孔反应板（如8联ELISA微孔反应板），向每个样品槽中加入卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、红霉素特异性抗体的胶体金标记物和林可霉素特异性抗体的胶体金标记物各25μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到样品槽底部附着有三种特异性抗体的胶体金标记物的样品板。

所述试纸条还可包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜5。所述固定膜可以促进试纸条中各组件的稳固性，优选为防水材质。所述固定膜还具有避免样品或试剂与外界环境中的物质发生反应的作用。

所述样品吸收垫和所述反应膜具有2mm的重叠区；所述吸水垫和所述反应膜具有2mm的重叠区。重叠区保证了样品液流动的连续性，使反应能够充分发生，有效地降低了实验误差。

所述T₃线、T₂线和T₁线上依次包被如下三种偶联物：林可霉素-载体蛋白偶联物、红霉素-载体蛋白偶联物和卡那霉素-载体蛋白偶联物。

所述试纸条中，所述样品吸收垫的始端与所述底板的始端对齐，所述吸水垫的末端与所述底板的末端对齐。

所述试纸条的始端为检测端，末端为手柄端。

所述样品吸收垫的长度（自始端至末端）可为18mm，所述反应膜的长度（自始端至末端）可为25mm，所述吸水垫的长度（自始端至末端）可为20mm。所述T₃线距离所述样品吸收垫的垂直距离可为6mm，所述T₂线距离所述T₃线的垂直距离可为4mm，所述T₁线距离所述T₂线的垂直距离可为4mm；所述C线距离所述吸水垫的垂直距离可为7mm。

所述卡那霉素-载体蛋白偶联物的包被浓度可为1mg/mL、包被宽度可为1mm、包被量可为0.8μL/cm。所述红霉素-载体蛋白偶联物的包被浓度可为1mg/mL、包被宽度可为1mm、包被量可为0.8μL/cm。所述林可霉素-载体蛋白偶联物的包被浓度可为1mg/mL、包被宽度可为1mm、包被量可为0.8μL/cm。

所述抗抗体具体可为羊抗鼠二抗。所述抗抗体的包被浓度可为0.2mg/mL、包被宽度可为1mm，包被量可为1μL/cm。

所述底板可为PVC板。所述样品吸收垫可为玻璃纤维棉。所述反应膜可为硝酸纤维素膜。所述吸水垫可为吸水纸。所述保护膜可为PE保护膜。所述样品板可为塑料材质。

所述试剂盒还可包括铝箔袋，所述样品板和所述试纸条封装于所述铝箔袋中。

每个试剂盒具体可包括具有8个样品槽的样品板和8个试纸条。

本发明提供的试剂盒中，特异性抗体与胶体金颗粒之间无价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此具有较高的特异性和灵敏度。

卡那霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株KANA-2B11简称杂交瘤细胞KANA-2B11。杂交瘤细胞KANA-2B11已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8403。

红霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株ERM-3F1简称杂交瘤细胞ERM-3F1。杂交瘤细胞ERM-3F1已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8402。

本发明还保护林可霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株LIN-6D2（简称杂交瘤细胞LIN-6D2）。杂交瘤细胞LIN-6D2已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8405。

本发明还保护杂交瘤细胞LIN-6D2分泌的单克隆抗体。

本发明提供的试剂盒的检测原理基于免疫分析法，能同时待测样本中是否含有卡那霉素、红霉素和林可霉素，具有前处理简单、不需任何仪器、灵敏度高、特异性强、适用范围广、操作简便（对操作人员没有专业要求）、快捷（可在5-10min内获取结果）、成本低廉、仅通过T线和C线的显色即可读取结果及现场适应能力强等优点，非常适合现场大批量样本的筛选，可用于专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为试纸条的结构示意图。

图2为试剂盒的使用状态示意图。

图3为试剂盒的结果判读示意图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

卡那霉素原料药：Sigma-Aldrich，货号46356。红霉素原料药：Sigma-Aldrich，E6376。盐酸林可霉素原料药：Sigma-Aldrich，31727。牛血清白蛋白(BSA)：Sigma-Aldrich，A2058。鸡卵白蛋白（OVA）：Sigma-Aldrich，A5503。

卡那霉素的结构式如下：

红霉素的结构式如下：

林可霉素的结构式如下：

实施例1、偶联物、特异性抗体和特异性抗体的的胶体金标记物的制备

一、偶联物的制备

1、卡那霉素-载体蛋白偶联物的制备

（1）称取50mg卡那霉素原料药，溶于4.1ml碳酸盐缓冲液（pH9.5、0.1M)中，搅拌至溶解完全。

（2）称取70mg BSA，溶于5ml碳酸盐缓冲液（pH9.5、0.1M)中，400rpm搅拌10min，充分溶解。

（3）将步骤（1）得到的卡那霉素溶液逐滴加入到步骤（2）得到的BSA溶液中并充分混匀，然后缓慢加入0.9ml1%（体积比）戊二醛水溶液并室温搅拌1.5h，然后逐滴加入NaBH₄溶液（6mg NaBH₄用1ml纯水溶解，新制）并室温反应2h，然后置于透析袋中用PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）进行透析（透析过程参数：室温、100rpm搅拌、3天、每天换液2次)，然后4500rpm离心6min并取上清液（卡那霉素-载体蛋白偶联物溶液），1ml/管分装，-20℃保存。

（4）采用紫外分光光度法测定卡那霉素-载体蛋白偶联物溶液中卡那霉素与载体蛋白的摩尔结合比（方法参考文献：罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳；氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备；食品科学；2010,Vol.31,No.10，91-94），卡那霉素与BSA的摩尔结合比为9:1。

2、红霉素-载体蛋白偶联物的制备

（1）称取100mg红霉素原料药，溶于6ml无水乙醇中，充分溶解，称为A液。

（2）称取羧甲基羟胺半盐酸盐44mg，溶于2ml水中，用1M碳酸氢钠水溶液调pH=5-6，称为B液。

（3）将B液逐滴加入到A液中，然后50℃恒温水浴中磁力搅拌反应5h，自然冷却到室温，然后加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取2次（25ml/次），合并2次萃取的二氯甲烷层，加入无水硫酸钠振摇后静置过夜，然后过滤并收集滤液，40℃减压旋蒸，得到干物质。

（4）取88mg步骤（3）得到的干物质，溶于6ml DMF中，磁力搅拌使其溶解，然后在冰水浴下加入24μL三正丁胺，混匀后再加入24μL氯甲酸异丁酯，冰浴下磁力搅拌反应3h。

（5）称取30mg OVA，溶于3ml0.1M的碳酸钠水溶液中，400rpm搅拌10min，充分溶解。

（6）取步骤（4）得到的溶液，在冰水浴环境下逐滴加入到步骤（5）得到的OVA溶液中，然后4℃、400rpm搅拌3h，然后置于透析袋中用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析（透析过程参数：室温、100rpm搅拌、4天、每天换液2次)，然后4500rpm离心6min并取上清液（红霉素-载体蛋白偶联物溶液），0.5ml/管分装，-20℃保存。

（7）采用紫外分光光度法测定红霉素-载体蛋白偶联物溶液中红霉素与载体蛋白的结合比（方法参考文献：罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳；氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备；食品科学；2010,Vol.31,No.10，91-94），红霉素与OVA的摩尔结合比为8:1。

3、林可霉素-载体蛋白偶联物的制备

（1）取126mg盐酸林可霉素原料药，溶于1.5ml蒸馏水中，500rpm搅拌5min以促进溶解。

（2）取53mg高碘酸钠，溶于0.5ml蒸馏水中。

（3）将步骤（2）得到的高碘酸钠溶液逐滴加入到步骤（1）得到的林可霉素溶液中并反应20min，然后加入17μl乙二胺并反应2h，然后滴加NaBH₄溶液（2mg NaBH₄用1ml纯水溶解，新制）并反应10h；本步骤持续进行室温、500rpm磁力搅拌。

（4）称取60mg OVA，溶于6ml的蒸馏水中，500rpm搅拌10min，充分溶解。

（5）取580μl步骤（3）得到的溶液，边搅拌边逐滴加入步骤（4）得到的OVA溶液中，然后加入500μl2.5%（体积比）的戊二醛水溶液并室温500rpm搅拌3.5h，然后加入NaBH₄溶液（4mg NaBH₄用2ml纯水溶解，新制）并室温500rpm磁力搅拌24h，然后置于透析袋中用PBS缓冲液（pH7.2、0.01M）进行透析（透析过程参数：室温、100rpm搅拌、3天、每天换液3次)，然后4500rpm离心5min并取上清液（林可霉素-载体蛋白偶联物溶液），0.5ml/管分装，-20℃保存。

（6）采用紫外分光光度法测定林可霉素-载体蛋白偶联物溶液中林可霉素与载体蛋白的结合比（方法参考文献：罗舜菁，钟寒燕，刘成梅，陈婷婷，陈发荣，严杰琳；氯霉素免疫抗原及包被抗原的制备；食品科学；2010,Vol.31,No.10，91-94），林可霉素与OVA的摩尔结合比为10:1。

二、特异性抗体的制备

1、卡那霉素鼠单克隆抗体的制备

（1）动物免疫程序

采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以卡那霉素-载体蛋白偶联物为免疫原，单次免疫剂量为50-100μg/只（以载体蛋白计）。首次免疫时将免疫原溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射。首次免疫后，每间隔2周将免疫原溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，进行加强免疫，颈背部皮下多点注射。第三次加强免疫2周后将免疫原剂量减半用0.5ml灭菌生理盐水稀释后，采用腹腔注射的方法加强免疫一次，3天后取脾细胞。

（2）细胞融合与克隆化

步骤（1）得到的脾细胞，按（4-8）：1的比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

（3）杂交瘤细胞株的保藏

将一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为卡那霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株KANA-2B11（简称杂交瘤细胞KANA-2B11）。杂交瘤细胞KANA-2B11已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8403。

（4）细胞冻存和复苏

用冻存液将杂交瘤细胞KANA-2B11制成细胞浓度为（1-5）×10⁶个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时，取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后移入培养瓶内培养。

（5）单克隆抗体的制备与纯化

细胞培养基（7.4）的制备方法：向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20%（质量百分含量），碳酸氢钠的终浓度为0.2%（质量百分含量）。

将杂交瘤细胞KANA-2B11置于细胞培养基中，37℃培养2天，采用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的细胞培养上清液进行纯化，得到卡那霉素单克隆抗体溶液（-20℃保存）。

单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度（mg/ml）=1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀。

卡那霉素单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度=0.6mg/ml。

2、红霉素鼠单克隆抗体的制备

用红霉素-载体蛋白偶联物代替卡那霉素-载体蛋白偶联物，其他同步骤1。

将一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为红霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株ERM-3F1（简称杂交瘤细胞ERM-3F1）。杂交瘤细胞ERM-3F1已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8402。

红霉素单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度=0.8mg/ml。

3、林可霉素单克隆抗体的制备

用林可霉素-载体蛋白偶联物代替卡那霉素-载体蛋白偶联物，其他同步骤1。

将一株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞命名为林可霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株LIN-6D2（简称杂交瘤细胞LIN-6D2）。杂交瘤细胞LIN-6D2已于2013年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.8405。

林可霉素单克隆抗体溶液中的蛋白质浓度=0.5mg/ml。

4、卡那霉素兔多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以卡那霉素-载体蛋白偶联物为免疫原，单次免疫剂量为1mg/kg·b.w.。首次免疫时将免疫原溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射。首次免疫后，每间隔3-4周将免疫原溶液与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化，进行加强免疫，颈背部皮下多点注射，加强免疫4次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫7-10d后采血，测定血清抗体效价。颈动脉放血，经硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

5、红霉素兔多克隆抗体的制备

用红霉素-载体蛋白偶联物代替卡那霉素-载体蛋白偶联物，其他同步骤4。

6、林可霉素兔多克隆抗体的制备

用林可霉素-载体蛋白偶联物代替卡那霉素-载体蛋白偶联物，其他同步骤4。

三、特异性抗体的胶体金标记物的制备

1、在沸腾的100mL的0.01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1%柠檬酸三钠水溶液，获得终浓度为0.01%的胶体金溶液（胶体金的直径为15-20nm）。

2、用0.1mol/L的K₂CO₃水溶液调胶体金溶液的pH至8.5。

3、将1μL10mg/mL的单克隆抗体溶液（步骤二制备的卡那霉素单克隆抗体溶液、红霉素单克隆抗体溶液或林可霉素单克隆抗体溶液；预实验已得到最佳标记浓度）加入1mL步骤2得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10μL20g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10μL10g/100ml的PEG₈₀₀₀水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000g离心15min取上清液，然后4℃、12000g离心20分钟取沉淀。

4、用PBS缓冲液（pH7.2、2mM）溶解步骤3得到的沉淀，4℃、12000g离心20分钟取沉淀，然后用200μL含1g/100ml BSA的PBS缓冲液（pH7.2、20mM）重悬沉淀，得到单克隆抗体的胶体金标记物。

5、取8联ELISA微孔反应板，向每个样品槽中加入卡那霉素单克隆抗体的胶体金标记物、红霉素单克隆抗体的胶体金标记物和林可霉素单克隆抗体的胶体金标记物各25μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到样品槽底部附着有三种单克隆抗体的胶体金标记物的样品板。

实施例2、试剂盒的组装

图1为试纸条的结构示意图。图2为试剂盒的使用状态示意图。图3为试剂盒的结果判读示意图。

本发明提供的用于检测卡那霉素、红霉素和林可霉素的试剂盒，包括实施例1的步骤三制备的样品板和8个完全相同的试纸条。所述试剂盒还包括铝箔袋，所述样品板和所述试纸条封装于所述铝箔袋中。每个试纸条包括底板1、反应膜2、样品吸收垫3和吸水垫4。所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连。所述试纸条的始端为检测端，末端为手柄端。所述样品吸收垫和所述反应膜具有2mm的重叠区，所述吸水垫和所述反应膜具有2mm的重叠区。所述样品吸收垫的始端与所述底板的始端对齐，所述吸水垫的末端与所述底板的末端对齐。所述试纸条还包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜5。所述反应膜上由始端至末端依次具有T₃线、T₂线、T₁线和C线，所述T₃线、T₂线、T₁线和C线均与所述反应膜的轴线（即自始端至末端的中轴线）垂直。所述T₃线、T₂线和T₁线上依次包被如下三种偶联物：实施例1的步骤一中制备的林可霉素-载体蛋白偶联物（包被浓度为1mg/mL,包被宽度为1mm，包被量为0.8μL/cm）、实施例1的步骤一中制备的红霉素-载体蛋白偶联物（包被浓度为1mg/mL，包被宽度为1mm，包被量为0.8μL/cm）和实施例1的步骤一中制备的卡那霉素-载体蛋白偶联物（包被浓度为1mg/mL,包被宽度为1mm，包被量为0.8μL/cm）。所述C线上包被抗抗体（羊抗鼠二抗，杭州格朗瑞生物科技有限公司，产品型号：GRBT-044；包被浓度为0.2mg/mL,包被宽度为1mm，包被量为1μL/cm）。

所述样品吸收垫的长度（自始端至末端）为18mm，所述反应膜的长度（自始端至末端）为25mm，所述吸水垫的长度（自始端至末端）为20mm。所述T₃线距离所述样品吸收垫的垂直距离为6mm，所述T₂线距离所述T₃线的垂直距离为4mm，所述T₁线距离所述T₂线的垂直距离可为4mm，所述C线距离所述吸水垫的垂直距离为7mm。

所述底板为PVC板。所述样品吸收垫为玻璃纤维棉。所述反应膜为硝酸纤维素膜。所述吸水垫为吸水纸。所述保护膜为PE保护膜。

所述试剂盒的应用方法如下：

将待检样品溶液200μ1滴加到样品板的一个样品槽中，反复吹打至孔底的紫红色颗粒完全溶解，室温孵育3min，然后将试纸条的样品吸收垫端插入该样品槽中，反应5-8min，按照如下标准判断结果：

阴性：C线、T₁线、T₂线和T₃线均显红色；待检样品中不含卡那霉素、红霉素和林可霉素；

阳性：C线显红色、T₂线和T₃线均显红色、T₁线不显色，待检样品中含卡那霉素，不含红霉素和林可霉素；C线显红色、T₁线和T₃线均显红色、T₂线不显色，待检样品中含红霉素，不含卡那霉素和林可霉素；C线显红色、T₁线和T₂线均显红色、T₃线不显色，待检样品中含林可霉素，不含卡那霉素和红霉素；C线显红色、T₁线显红色、T₂线和T₃线均不显色，待检样品中含红霉素和林可霉素，不含卡那霉素；C线显红色、T₂线显红色、T₁线和T₃线均不显色，待检样品中含卡那霉素和林可霉素，不含红霉素；C线显红色、T₃线显红色、T₁线和T₂线均不显色，待检样品中含卡那霉素和红霉素，不含林可霉素；C线显红色、T₁线、T₂线和T₃线均不显色，待检样品中含卡那霉素、红霉素和林可霉素；

无效：C线不显色。

所述不含卡那霉素包括如下两种含义：第一种，不含有；第二种，含有，但含量低于检测限。所述不含红霉素包括如下两种含义：第一种，不含有；第二种，含有，但含量低于检测限。所述不含林可霉素包括如下两种含义：第一种，不含有；第二种，含有，但含量低于检测限。

所述试剂盒的检测原理如下：

待检样品中卡那霉素、红霉素和林可霉素的含量高于或等于检测限时，微孔中的卡那霉素单克隆抗体的胶体金标记物和/或红霉素单克隆抗体的胶体金标记物和/或林可霉素单克隆抗体的胶体金标记物均与待测样品中的抗原结合，结合有待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物无法与反应膜上的卡那霉素-载体蛋白偶联物和/或红霉素-载体蛋白偶联物和/或林可霉素-载体蛋白偶联物结合，T₁线和/或T₂线和/或T₃线不显红色，结合有待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物可以与抗抗体结合，C线显红色；

待检样品中卡那霉素、红霉素和林可霉素的含量低于检测限时，微孔中的卡那霉素单克隆抗体的胶体金标记物和/或红霉素单克隆抗体的胶体金标记物和/或林可霉素单克隆抗体的胶体金标记物并不全与待测样品中的抗原结合，未结合待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物可以与反应膜上的卡那霉素-载体蛋白偶联物和/或红霉素-载体蛋白偶联物和/或林可霉素-载体蛋白偶联物结合，T₁线和/或T₂线和/或T₃线显红色，结合有待测样品中的抗原的单克隆抗体的胶体金标记物或未结合待测样品中的抗原的的单克隆抗体的胶体金标记物均可以与抗抗体结合，C线显红色。

用卡那霉素原料药、红霉素原料药和盐酸林可霉素原料药分别制备梯度稀释液，作为待检样品溶液，应用上述试剂盒进行检测。各个稀释液采用的溶剂均为PB缓冲液（pH7.2、0.02M）。

本发明提供的试剂盒对卡那霉素、红霉素和林可霉素的检测限见表1。

表1检测限

药物名称	检测限μg/L(kg)
		卡那霉素	50
红霉素	10
		林可霉素	20

Claims

1.一种用于检测卡那霉素、红霉素和林可霉素的试剂盒，包括至少具有一个样品槽的样品板和至少一个试纸条；

所述样品板的制备方法如下：取微孔反应板，向每个样品槽中加入卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、红霉素特异性抗体的胶体金标记物和林可霉素特异性抗体的胶体金标记物各25μl，然后将样品板放入冷冻干燥机中，预冻4h后冻干14h，得到样品槽底部附着有三种特异性抗体的胶体金标记物的样品板；卡那霉素特异性抗体的胶体金标记物、红霉素特异性抗体的胶体金标记物和林可霉素特异性抗体的胶体金标记物的制备方法均如下：

(1)在沸腾的100mL的0.01g/100ml氯金酸水溶液中加入2-4mL的1％柠檬酸三钠水溶液，获得终浓度为0.01％的胶体金溶液；

(2)用0.1mol/L的K₂CO₃水溶液调胶体金溶液的pH至8.5；

(3)将1μL 10mg/mL的特异性抗体溶液加入1mL步骤(2)得到的胶体金溶液中并搅拌30分钟，然后加入10μL 20g/100ml的BSA水溶液并搅拌15min，然后加入10μL10g/100ml的PEG₈₀₀₀水溶液并搅拌15分钟，然后4℃、4000g离心15min取上清液，然后4℃、12000g离心20分钟取沉淀；

(4)用pH7.2、2mM的PBS缓冲液溶解步骤(3)得到的沉淀，4℃、12000g离心20分钟取沉淀，然后用200μL含1g/100ml BSA的pH7.2、20mM的PBS缓冲液重悬沉淀，得到特异性抗体的胶体金标记物；所述特异性抗体溶液为卡那霉素特异性抗体溶液、红霉素特异抗体溶液或林可霉素特异抗体溶液；

所述试纸条包括底板(1)、反应膜(2)、样品吸收垫(3)和吸水垫(4)；所述样品吸收垫、所述反应膜和所述吸水垫依次附着于所述底板上，所述样品吸收垫的末端与所述反应膜的始端相连，所述反应膜的末端与所述吸水垫的始端相连；所述反应膜上由始端至末端依次具有T₃线、T₂线、T₁线和C线，所述T₃线、T₂线、T₁线和C线均与所述反应膜的轴线垂直；所述T₃线、T₂线和T₁线上分别包被如下三种偶联物：林可霉素-载体蛋白偶联物、红霉素-载体蛋白偶联物、卡那霉素-载体蛋白偶联物；所述C线上包被可与卡那霉素特异性抗体和/或红霉素特异性抗体和/或林可霉素特异性抗体结合的抗抗体；

所述卡那霉素-载体蛋白偶联物的包被浓度为1mg/mL、包被宽度为1mm、包被量为0.8μL/cm；

所述红霉素-载体蛋白偶联物的包被浓度为1mg/mL、包被宽度为1mm、包被量为0.8μL/cm；

所述林可霉素-载体蛋白偶联物的包被浓度为1mg/mL、包被宽度为1mm、包被量为0.8μL/cm。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述卡那霉素特异性抗体为卡那霉素单克隆抗体或卡那霉素多克隆抗体；所述红霉素特异性抗体为红霉素单克隆抗体或红霉素多克隆抗体；所述林可霉素特异性抗体为林可霉素单克隆抗体或林可霉素多克隆抗体。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述卡那霉素单克隆抗体为卡那霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株KANA-2B11 CGMCC No.8403分泌的单克隆抗体；所述红霉素单克隆抗体为红霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株ERM-3F1 CGMCC No.8402分泌的单克隆抗体；所述林可霉素单克隆抗体为林可霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株LIN-6D2 CGMCCNo.8405分泌的单克隆抗体。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：任一所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白或人血清白蛋白。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试纸条还包括覆盖于所述样品吸收垫上和覆盖于所述吸水垫上的固定膜(5)。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述样品吸收垫和所述反应膜具有2mm的重叠区；所述吸水垫和所述反应膜具有2mm的重叠区。

7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述T₃线、T₂线和T₁线上依次包被如下三种偶联物：林可霉素-载体蛋白偶联物、红霉素-载体蛋白偶联物、卡那霉素-载体蛋白偶联物。

8.林可霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株LIN-6D2，它的保藏编号为CGMCC No.8405。

9.权利要求8所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。