CN104673728B - 一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法 - Google Patents
一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物菌剂发酵技术领域，具体涉及一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法。本发明的发酵方法包括下述的步骤：在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料；将芽孢杆菌菌种接种到装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；将发酵物料在40‑60℃下烘干至其含水量低于35%。本发明采用旋转式杀菌机进行原位发酵，相对于传统的发酵方式，发酵原料成本低，发酵工艺简单且易于控制，节省了人工成本；整个生产过程占地面积小，单位体积产量较传统发酵方式高且能耗极低；发酵完成后整个基质可作为复配肥原料使用，不需要更一步的回收及纯化，无废弃物的问题。本发明制备菌剂的成本仅为液体发酵的40—70%。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌剂发酵技术领域，具体涉及一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法。
背景技术
芽孢杆菌是一类好氧和兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的革兰氏阳性杆状细菌。该菌在自然界中分布广泛，分离培养简单，对人畜无害，对环境友好。芽孢杆菌生长快、营养简单，能产生耐热、抗逆的芽孢，其芽孢抗逆性强、利于保藏，具有较强的抵抗外界环境压力的能力，能够抵抗所生存的环境中由于干燥、高温、紫外线等所造成的伤害，这种生物学特征使其成为一种理想的农用微生物。芽孢杆菌菌剂施用于农田后，可充分分解土壤中难溶的大分子成分，转化为利于植物吸收的小分子水溶成分，并且还可产生多糖与其它胶体结合，能有效改善土壤的团粒结构，增加土壤的生理性能和保护作物根系免受病原微生物的侵入，起到减轻作物病害的作用。很多生物农药就是利用芽孢杆菌做成的，它可通过生物间的竞争作用、抗生作用、寄生作用、溶菌作用及诱导植物抗性等来抑制特定农作物病原体的生存和活动，具有显著的抗菌防病作用，比如苏云金芽孢杆菌及其伴胞晶体是农业上良好的杀虫剂，已成为世界上产量最大的生物农药。
目前关于芽孢杆菌工业化的生产方式主要分为液体深层发酵和固体发酵。和液层发酵相比固体发酵原料要求简单，设备要求较低，生产成本远低于液体深层发酵。虽然近年来各生产厂家都在积极探索芽孢杆菌的固体发酵技术，但目前为止，对于在细菌发酵过程中出现的代谢热移除、质量传递、参数精确控制等问题，传统的固体发酵方法仍未有成熟的解决方法及产品面市。基于此我们开发了一种利用旋转式杀菌机进行的芽孢杆菌原位固体发酵新方法，采用常规营养源，或更为低廉的营养源，比如农副加工的副产物、工业生产废弃物等对芽孢杆菌进行固体发酵，并由此建立了一套成熟的芽孢杆菌菌剂制备新工艺，不仅可实现芽孢杆菌菌剂的高密度发酵，还极大降低了其成产成本，具有广阔的应用前景。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种工艺简单、易于控制、能有效节省人工成本且能耗极低的农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，该方法采用旋转式杀菌机进行原位发酵，有效节省了占地面积；并且发酵工艺简单，制备菌剂的成本低。
本发明是通过下述的技术方案来实现的：
一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌2-6h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源1-5份 长效碳源1-10份
氮源1-5份 磷酸氢二钾0.2-0.8%
磷酸二氢钾0.1-0.5% 硫酸镁0.05-0.15％
硫酸锰0.006-0.012% 水40-65%
上述的速效碳源为豆面、玉米面、淀粉、葡萄糖、氨基酸液、功能性废糖液、豆粕、花生粕中的的至少一种；
上述的长效碳源为各种工业、发酵废弃物：糠醛渣、柠檬酸渣、酒糟、油渣、糖渣、酵母泥、木薯渣、食品厂废弃物、果渣、药渣等；畜禽养殖废弃物：如鸡粪、羊粪、牛粪、猪粪等；农作物废弃物：如秸秆、棉柴、稻壳、蘑菇渣、甜菜渣等中的至少一种或多种；
上述的氮源为玉米浆、酵母粉、鱼粉、蛋白胨、花生饼粉、酒糟、尿素、硫酸铵、硝酸钾的至少一种；
调节物料的pH6.8-7.2；
灭菌完成后，物料置于杀菌机中不动，降温至30-45℃。
（2）将芽孢杆菌菌种接种到步骤（1）中装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；
上述的芽孢杆菌指枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的至少两种；
发酵条件：培养温度30-45℃， 通气量50-300升/小时，杀菌机旋转转数10-40转/小时， pH值不低于6.5，旋转培养12-48个小时；活菌含量可达到50-300亿；
（3）将发酵物料40-60℃烘干至含水量低于35%。
优选的，上述的的灭菌时间为3.5h；
速效碳源为2.5份的葡萄糖；
长效碳源为糠醛渣和棉柴，糠醛渣：棉柴的重量比为2：1；
氮源为玉米浆和硫酸铵，玉米浆：硫酸铵的重量比为1：1；
水的含量为55%。
芽孢杆菌菌种为纳豆芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌时，纳豆芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的种子液体积比为1:1；
芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌时，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：3：1：4：3；
芽孢杆菌菌种为纳豆芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌时，纳豆芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的种子液的体积比为3：2：5。
上述步骤（2）中的发酵条件：培养温度35℃； 通气量200升/小时； 杀菌机旋转转数25转/小时，pH值不低于6.5，旋转培养12-48个小时。
本发明的有益效果在于，采用了旋转式杀菌机进行原位发酵，相对于液体发酵，本发明的培养基原料简单，选择余地大，成本低；占地面积小，设备要求低，不需要特殊机具，能耗低，单位体积产量较液体为高，因此生产成本远低于液体发酵，只有其40—70%；与渥堆、浅盘发酵相比，本发明的发酵全程置于杀菌机中进行，有效避免了上述的两种发酵方式中杂菌污染的问题，并且，在发酵过程中通过杀菌机的匀速翻转及通气控制，有效解决了细菌在固体发酵过程中的代谢热移除、质量传递、参数精确控制等问题，通过本方法得到的菌剂活菌含量高，芽孢生成率高；发酵工艺简单，整个过程可实现全自动化，有效节省了人工成本。
本发明固体发酵完成后，所有的菌体及物料全部作为产品进行后续肥料的复配，固体发酵物料中菌体丰富的次级代谢产物得以保留，并且采用的发酵物料本身也是肥料中常用的碳、氮源来源，因此产品活性优于液体发酵工艺生产的菌剂；实现了对农副加工副产物及工业生产废弃物的高值化利用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
实施例1
一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌4h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源4.5份：具体为豆面2 、玉米面1 、花生粕1 、葡萄糖0.5；
长效碳源8份：具体为蘑菇渣3、糠醛渣2、鸡粪2、稻壳1；
氮源4份 ：具体为玉米浆1、酵母粉1、酒糟2；
磷酸氢二钾0.5%
磷酸二氢钾0.3% 硫酸镁0.1％
硫酸锰0.008% 水50%
调节物料的pH7.0；
灭菌完成后，物料置于杀菌机中不动，降温至40℃左右。
（2）将芽孢杆菌菌种接种到步骤（1）中装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；
芽孢杆菌菌种为纳豆芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌时，纳豆芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的种子液体积比为1:1；
发酵条件：培养温度37℃， 通气量240升/小时，杀菌机旋转转数30转/小时， pH值为6.5，旋转培养40个小时；活菌含量可达到50-300亿；
（3）将发酵物料于50℃下烘干至含水量低于35%。
实施例2
一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌3.5h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源为2.5份葡萄糖
长效碳源为8份，具体为重量比是2：1的糠醛渣和棉柴；
氮源3份 ，具体为重量比为1：1的玉米浆：硫酸铵；
磷酸氢二钾0.6%
磷酸二氢钾0.4% 硫酸镁0.08％
硫酸锰0.009% 水55%
调节物料的pH6.8-7.2；
灭菌完成后，物料置于杀菌机中不动，降温至35℃。
（2）将芽孢杆菌菌种接种到步骤（1）中装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；
上述的芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：3：1：4：3；
发酵条件：培养温度37℃， 通气量280升/小时，杀菌机旋转转数30转/小时， pH值不低于6.5，旋转培养40个小时；活菌含量可达到50-300亿；
（3）将发酵物料于55℃下烘干至含水量低于35%。
实施例3
（1）在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌2h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源1份，具体为豆面0.5份，葡萄糖0.5份；
长效碳源1份，具体为蘑菇渣0.5份，稻壳0.5份；
氮源1份，具体为蛋白胨0.5份，花生饼粉0.5份；
磷酸氢二钾0.2%
磷酸二氢钾0.1% 硫酸镁0.05％
硫酸锰0.006% 水40%
调节物料的pH值为6.8；
灭菌完成后，物料置于杀菌机中不动，降温至30℃。
（2）将芽孢杆菌菌种接种到步骤（1）中装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；
芽孢杆菌菌种为纳豆芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的种子液体积比为1:1；
发酵条件：培养温度35℃； 通气量200升/小时； 杀菌机旋转转数25转/小时，pH值不低于6.5，旋转培养45个小时。
（3）将发酵物料40℃烘干至含水量低于35%。
实施例4
（1）在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌4h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源5份 ，具体为氨基酸液2份，豆粕2份，花生粕1份；
长效碳源10份，具体为蘑菇渣3份，鸡粪2份，棉柴4份，稻壳1份；
氮源5份，具体为酵母粉2份，酒糟3份；
磷酸氢二钾0.8%
磷酸二氢钾0.5% 硫酸镁0.15％
硫酸锰0.012% 水65%
上述的速效碳源为豆面、玉米面、葡萄糖、氨基酸液、豆粕、花生粕中的至少一种；
上述的长效碳源蘑菇渣、糠醛渣、鸡粪、羊粪、秸秆、棉柴、稻壳中的至少两种；
上述的氮源为玉米浆、酵母粉、鱼粉、蛋白胨、花生饼粉、酒糟、尿素、硫酸铵、硝酸钾的至少两种；
调节物料的pH值为7.2；
灭菌完成后，物料置于杀菌机中不动，降温至45℃。
（2）将芽孢杆菌菌种接种到步骤（1）中装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；
芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：3：1：4：3；
发酵条件：培养温度45℃， 通气量300升/小时，杀菌机旋转转数40转/小时， pH值不低于6.5，旋转培养48个小时；活菌含量可达到300亿；
（3）将发酵物料于60℃下烘干至含水量低于35%。
实施例5
（1）在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌5h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源4份，具体为豆面1份、玉米面2份，花生粕1份；
长效碳源9份，具体为糠醛渣2份、鸡粪2份、棉柴2份、稻壳3份；
氮源4份，具体为酒糟2、尿素1、硫酸铵1份；
磷酸氢二钾0.5%
磷酸二氢钾0.3% 硫酸镁0.12％
硫酸锰0.009% 水55%
调节物料的pH值为7.0；
灭菌完成后，物料置于杀菌机中不动，降温至37℃；
（2）将芽孢杆菌菌种接种到步骤（1）中装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；
芽孢杆菌菌种为纳豆芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌时，纳豆芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的种子液的体积比为3：2：5；
发酵条件：培养温度37℃， 通气量240升/小时，杀菌机旋转转数25转/小时， pH值为6.5，旋转培养40个小时；活菌含量可达到280亿；
（3）将发酵物料于55℃下烘干至含水量低于35%。
实施例6
（1）在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌5h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源4份，具体为葡萄糖2份，氨其酸液1份，花生粕1份；
长效碳源6份，具体为羊粪2份，秸秆1份、棉柴1份、稻壳2份；
氮源4份，具体为酵母粉1份、鱼粉1份、蛋白胨1份，酒糟1份；
磷酸氢二钾0.5%
磷酸二氢钾0.3% 硫酸镁0.09％
硫酸锰0.008% 水55%
调节物料的pH值为7.0；
灭菌完成后，物料置于杀菌机中不动，降温至37℃。
（2）将芽孢杆菌菌种接种到步骤（1）中装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；
芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌时，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：3：1：4：3；
上述步骤（2）中的发酵条件：培养温度38℃； 通气量260升/小时； 杀菌机旋转转数25转/小时，pH值为7.0，旋转培养36个小时；
（3）将发酵物料40-60℃烘干至含水量低于35%。
实施例7
取糠醛渣5 份、硫酸铵5 份、磷酸氢二铵5 份、硫酸钾5 份、磷酸二氢钾5 份，将上述的原料混合均匀，90℃下 烘干，送入破碎机破碎成粉末状后，加入通过实施例1的方法制备得到的农用芽孢杆菌菌剂1 份混合，得花生菌肥。
对照实验1：取糠醛渣5 份、硫酸铵6份、磷酸氢二铵5 份、硫酸钾5 份、磷酸二氢钾5 份，将上述的原料混合均匀，90℃下 烘干，送入破碎机破碎成粉末状后，得花生复合肥。
对照实验2：取糠醛渣5 份、硫酸铵5份、磷酸氢二铵6份、硫酸钾5 份、磷酸二氢钾5份，将上述的原料混合均匀，90℃下 烘干，送入破碎机破碎成粉末状后，得花生复合肥。
对照实验3：取糠醛渣5 份、硫酸铵5份、磷酸氢二铵5份、硫酸钾6 份、磷酸二氢钾5份，将上述的原料混合均匀，90℃下 烘干，送入破碎机破碎成粉末状后，得花生复合肥。
在同一块地上播上同一花生种，将该土地划分成四等份，分别施用实施例7、对照例1-3中的肥料，并且保证上述四等分地中浇水锄草和施药等条件完全相同，结果表明，施用实施例7中的肥料的花生亩产分别高于对照例1、2、3为6.2%、6.15%、6.03%。
实施例8
取糠醛渣5 份、硫酸铵5 份、磷酸氢二铵5 份、硫酸钾5 份、磷酸二氢钾5 份，将上述的原料混合均匀，90℃下 烘干，送入破碎机破碎成粉末状后，加入通过实施例2的方法制备得到的农用芽孢杆菌菌剂1 份混合，得花生菌肥。
对照实验4：取糠醛渣5 份、硫酸铵5 份、磷酸氢二铵5 份、硫酸钾5 份、磷酸二氢钾5 份，将上述的原料混合均匀，90℃下 烘干，送入破碎机破碎成粉末状后，加入市售某微生物菌剂1 份混合，得花生菌肥。
实施例8的亩产高于对照例4为4.21%。
Claims (2)
1.一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料：
方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌4h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源4.5份：具体为豆面2份 、玉米面1份、花生粕1份、葡萄糖0.5份；
长效碳源8份：具体为蘑菇渣3份、糠醛渣2份、鸡粪2份、稻壳1份；
氮源4份 ：具体为玉米浆1份、酵母粉1份、酒糟2份；
磷酸氢二钾0.5%
磷酸二氢钾0.3% 硫酸镁0.1％
硫酸锰0.008% 水50%
调节物料的pH7.0；
灭菌完成后，物料置于杀菌机中不动，降温至40℃；
（2）将芽孢杆菌菌种接种到步骤（1）中装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；
芽孢杆菌菌种为纳豆芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的种子液体积比为1:1；
发酵条件：培养温度37℃， 通气量240升/小时，杀菌机旋转转数30转/小时， pH值为6.5，旋转培养40个小时；活菌含量达到50-300亿；
（3）将发酵物料于50℃下烘干至含水量低于35%。
2.一种农用芽孢杆菌菌剂的原位固体发酵方法，包括下述的步骤：
（1）在旋转式杀菌机中灭菌发酵物料：方式为湿热灭菌，温度121℃，灭菌3.5h；
上述的发酵物料的成分包括：
速效碳源为2.5份葡萄糖；
长效碳源为8份，具体为重量比是2：1的糠醛渣和棉柴；
氮源3份 ，具体为重量比为1：1的玉米浆：硫酸铵；
磷酸氢二钾0.6%
磷酸二氢钾0.4% 硫酸镁0.08％
硫酸锰0.009% 水55%
调节物料的pH6.8-7.2；
灭菌完成后，物料置于杀菌机中不动，降温至35℃；
（2）将芽孢杆菌菌种接种到步骤（1）中装有已灭菌物料的杀菌机中，进行原位固体发酵；
上述的芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌的种子液体积比例分别为：3：1：4：3；
发酵条件：培养温度37℃， 通气量280升/小时，杀菌机旋转转数30转/小时， pH值为6.5，旋转培养40个小时；活菌含量可达到50-300亿；
（3）将发酵物料于55℃下烘干至含水量低于35%。
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