CN104667257B - 应用生发胜肽的方法及医药组合物 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供一种使用胜肽的方法及医药组合物。具体而言，该医药组合物包含生发胜肽(HGP)，其中该生发胜肽(HGP)为氨基酸序列SEQ ID No:1的全部序列或部分序列。该方法包含将生发胜肽(HGP)施用于受体，其中该生发胜肽(HGP)为氨基酸序列SEQ ID No:1的全部序列或部分序列。
Description
技术领域
本发明涉及一种应用生发胜肽的方法及医药组合物。
背景技术
秃发(alopcia)是由处于头发周期(hair cycle)的生长期(anagen)的头发的数目减少及处于头发周期的退化期(catagen)或休止期(telogen)的头发的数目增加所引起的异常头发减少。虽然尚未明确揭露秃发的机制，但秃发一般可由以下原因引起：由内分泌系统紊乱(endocrine disorder)(例如激素失衡(hormone unbalance))、自主神经系统紊乱(autonomic nerves disorder)或循环系统紊乱(circular disorder)(诸如血液循环紊乱(abnormal blood circulation))所致的过量皮脂(sebum)产生、真菌所致的头皮功能退化、过敏症、遗传原因或老化(aging)。
秃发也是癌症治疗最严重的副作用之一，亦因投与各种化学治疗剂(chemotherapeutic agent)而引发。因为化学治疗剂影响细胞分裂(cytokinesis)，所以化学治疗剂会在诸如骨髓(bone marrow)、头发、指甲(fingernail)、脚趾甲(toenail)、皮肤或胃肠道(gastrointestinal tract)等细胞分裂旺盛的组织中引发副作用，并因此引发秃发。虽然80％或80％以上的接受化学疗法(chemotherapy)的患者视秃发为最大的痛苦，但尚未开发出有效预防或治疗化学疗法引发的秃头的方法。
秃发会在化学疗法之后约2至4周出现。头发在化学疗法结束后3至6个月后才会生长。秃发的程度随所使用的药物、药物的量以及投药时程而变化。引发高度秃发的药物包含环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿霉素(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)以及依托泊苷(etoposide)。上述药物即使当局部投与时亦会引发秃发。举例而言，化学治疗剂可影响毛囊的细胞分裂，从而引发毛囊细胞死亡，或可促进自生长期(anagen)转变为退化期(catagen)。
目前临床实用治疗秃发的方法为：外部涂抹药物、口服药物与自体头发移植(hairimplantation)，然而各有其局限与缺点。米诺地尔(Minoxidil)或菲那雄胺(Finasteride)是目前美国FDA核准的两种生发药物。患者使用外用敏诺西代与口服菲那雄胺药物需皆持续使用才有效，不可停药。此外，使用米诺地尔或菲那雄胺后，无法使头发变得浓密，仅可减轻落发现象，或只长出稀疏的头发，并会有性功能障碍、多毛症(hypertrichosis)、胎儿缺陷等副作用。因此不适合育龄期妇女使用。再者，自体毛囊移植手术(hair implantation)会在移发处留下疤痕，术后复原时间长，需多次手术、手术时间长、费用不少。
发明内容
本发明提供一种应用生发胜肽的方法，不用面临自体毛囊移植手术的各项问题(如疤痕，术后复原时间长，需多次手术…等)。
本发明提供一种使用胜肽(peptide)的方法。该胜肽选自生发胜肽(HGP)，该生发胜肽(HGP)为氨基酸序列SEQ ID No:1的全部序列或部分序列。
本发明另提供一种使用胜肽的方法。该胜肽选自生发胜肽(HGP)，该生发胜肽(HGP)氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID No:1间约90％至99％相似。本发明的相似性(similarity)是以岛津LCMS2010软件进行分析而得到的统计结果。
本发明另提供一种胜肽(peptide)应用于生发的用途。该胜肽选自生发胜肽(HGP)，该生发胜肽(HGP)为氨基酸序列SEQ ID No:1的全部序列或部分序列。
本发明另提供一种胜肽应用于生发的用途。该胜肽选自生发胜肽(HGP)，该生发胜肽(HGP)氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID No:1间约99％至90％相似。
本发明又提供一种用于治疗秃发的医药组合物。该医药组合物包含生发胜肽(HGP)以及磷酸盐。该生发胜肽(HGP)为氨基酸序列SEQ ID No:1的全部序列或部分序列。
本发明再提供一种用于治疗秃发的医药组合物。该医药组合物包含生发胜肽(HGP)以及磷酸盐。该生发胜肽(HGP)氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID No:1间约99％至90％相似。
本发明的其他目的，部分将在后续说明中陈述，而部分可由内容说明中轻易得知，或可由本发明的实施而得知。本发明的各方面将可利用权利要求中所特别指出的元件及组合而理解并达成。需了解，先述的一般说明及下列详细说明均仅作举例之用，并非用以限制本发明。
上文已相当广泛地概述本发明的技术特征及优点，俾使下文的本发明详细描述得以获得较佳了解。构成本发明的权利要求标的的其它技术特征及优点将描述于下文。本发明所属技术领域中具有通常知识者应了解，可相当容易地利用下文揭示的概念与特定实施例可作为修改或设计其它结构或制程而实现与本发明相同的目的。本发明所属技术领域中具有通常知识者亦应了解，这类等效建构无法脱离权利要求所界定的本发明的精神和范围。
附图说明
当并同各随附图式而阅览时，即可更佳了解本发明的前揭摘要以及上文详细说明。为达本发明的说明目的，各图式里图绘有现属较佳的各具体实施例。然应了解本发明并不限于所绘的精确排置方式及设备装置。
图1示出了根据本发明的一实施例的实验步骤的示意图；以及
图2示出了根据本发明的一实施例的鼠背部皮肤的六个区块的示意图。
图3显示根据本发明的一实施例的人类皮肤角质细胞(HaCaT)株的TCF报导基因试验(reporter assay)的示意图。TOP代表报导基因具有可供β-catenin键结的结合位(binding site)。FOP代表报导基因中供β-catenin键结的结合位已经突变而破坏，因此β-catenin无法键结，进而当成一种负面对照组(negative control)。CTL代表HaCaT细胞株并无受到任何刺激物或胜肽处理。iPept-2代表HaCaT细胞株经由氨基酸序列SEQ ID No:1胜肽所刺激。参照相对荧光素酶的活性，经由SEQ ID No:1胜肽所刺激或处理后的HaCaT细胞株可观察到其β-catenin的活性也提升了。
图4显示根据本发明的一实施例的人类毛囊角质细胞(HHFK)株的TCF报导基因试验(reporter assay)的示意图。TOP代表报导基因具有可供β-catenin键结的结合位(binding site)。FOP代表报导基因中供β-catenin键结的结合位已经突变而破坏，因此β-catenin无法键结，进而当成一种负面对照组(negative control)。CTL代表HHFK细胞株并无受到任何刺激物或胜肽处理。iPept-2代表HHFK细胞株经由氨基酸序列SEQ ID No:1胜肽所刺激。参照相对荧光素酶的活性，经由SEQ ID No:1胜肽所刺激或处理后的HHFK细胞株可观察到其β-catenin的活性也提升了。
具体实施方式
在下文中本发明的实施例配合所附图式以阐述细节。然而本发明的实施例不必然需要全部的技术特征才能实施。在其他实施例中，某些已知的方法、结构及技术将不会显示而造成误解。说明书所提及的“此实施例”及“其他实施例”等等，意指包含在本发明的该实施例所述有关的特殊特性、序列、或特征。说明书中各处出现的“在此实施例中”的片语，并不必然全部指相同的实施例。
本发明在此所探讨的方向为一种胜肽应用于生发的用途及用于治疗秃发的医药组合物。为了能彻底地了解本发明，将在下列的描述中提出详尽的步骤及序列。显然地，本发明的施行并未限定于相关领域的技艺者所熟习的特殊细节。另一方面，众所周知的序列或步骤并未描述于细节中，以避免造成本发明不必要的限制。本发明的较佳实施例会详细描述如下，然而除了这些详细描述的外，本发明还可以广泛地施行在其他实施例中，且本发明的范围不受限定，其以所附的权利要求为准。
本发明所揭露的胜肽、生发胜肽(Hair growth peptide,HGP)或医药组合物中的生发胜肽是但不限于利用质谱仪确认其特定分子量。具体而言，本案利用美商应用生命公司(Applied Biosystems)的质谱仪(Time-of-Flight mass spectrometry,Sciex QSTARPULSAR Quadrupole)进行分子量的确认。取适量的样本溶解于甲酸(formic acid)溶液中而形成样本溶液，在特殊情况下，亦可利用丝氨酸蛋白酶(Serine proteases)、苏氨酸蛋白酶(Threonine proteases)、半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteases)、天冬氨酸蛋白酶(Aspartate proteases)、谷氨酸蛋白酶(Glutamic proteases)及金属蛋白酶(Metalloproteases)等酶来处理样本后，再进行上述分子量的确认步骤。该样本溶液(约5μl)导入上述质谱仪内。当质谱仪测量样本溶液后，资料是利用电脑软体(例如岛津LCMS2010)分析所测量的质谱中特定胜肽的确定方式，例如当所测量的质谱中至少两峰值的质荷比的数值可对应于该特定胜肽或利用所测量的质谱中质荷比接近特定胜肽的质荷比的方式确认样本中具有特定胜肽。举例而言，氨基酸序列SEQ ID No:1的分子量为1258.42，当此胜肽带有两个电荷时，其质荷比约为603.21。质荷比(m/z)公式为(m/z)＝(质量M+电荷n)/电荷n。是故，当质谱中出现质荷比约为712.70的峰值(peak)时，可确认样本中具有氨基酸序列SEQ ID No:1。此外，其他氨基酸序列的分子量可参照表1。
同样地，医药组合物的样本亦可由上述生发胜肽的测量步骤来确认之。然而，医药组合物在某些情况下亦可先稀释后，再进行上述测量步骤。
本发明的医药组合物包含的磷酸盐选自磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二纳(Na2HPO4·2H2O)及其混合的盐类。
本发明的医药组合物的赋形剂(Excipients)是增加医药组合物的均匀性、稳定性与减少医药组合物的刺激性、不良气味的物质。本发明的赋形剂是无毒性、无刺激性、无抗原性、无致敏性、无突变性及无药理活性，且不妨碍药效的的发挥。
基于上述原则，本发明的赋形剂选自乳糖(Lactose)、干燥淀粉(Starch)、淀粉糊(Starch paste)、糊精(Dextrin)、环糊精(Cyclodexrtin)、预胶化淀粉(Pregelatinizedstarch)、羧甲基淀粉钠(Carboxymethyl Starch Sodium)、羧基淀粉丙酸酯(HydroXypropyStarch，简称HPS)、微晶性纤维素(Microcrystalline Celiulose)、羧甲基纤维素(CarboxyMethyl Cellutose。简称CMC)、交联羧甲基纤维素钠(Cross-linked CarboxymethyCeltuiose Sodium)、低取代轻丙基纤维素(Lowsubstitued Hydroxypropyl Cellulose)及上述至少两种赋形剂的混合。
上述赋形剂的确认方法选自层析方法(Chromatography Methods)、光谱分析法(Spectrophotometry Methods)、分光镜光谱分析法(Spectroscopy Methods)及滴定法。
本发明的胜肽、生发胜肽(Hair growth peptide,HGP)或医药组合物中的生发胜肽是但不限于利用固相多肽合成法(solid phase peptide synthesis)亦称为美利费尔法(Merrifield method)。在其他实施例中，胜肽、生发胜肽(Hair growth peptide,HGP)或医药组合物中的生发胜肽亦可由蛋白质表现的方式生成。由于固相多肽合成法或蛋白质表现方法皆与目前习知的方法一致，在此不再赘述。此外，本发明的生发胜肽亦可由业界科罗耐国际科技有限公司(Kelowna)所合成或表现，因此该项领域中的通常知识者可藉由上述协助轻易地制备本发明的生发胜肽。是故，本发明无须清楚说明本发明的生发胜肽实际的制备步骤及制备条件。
本发明的医药组合物是但不限于溶液剂型，生发胜肽溶解于磷酸盐缓冲液(PBSsolution)4毫升，而使生发胜肽浓度为2mM，之后再以2mM稀释为8毫升而至0.2mM。因此，生发胜肽浓度的范围介于0.2至2mM，而制备成本发明的医药组合物。
本发明的实验模式是应用南加大锺正明院士所开发的毛发再生(hairregeneration)老鼠动物实验模式(mouse model)。
此老鼠动物实验模式所采用的老鼠：C57BL/6八周大的母鼠。
根据文献(Muller-Rover et al.,2001；Plikus et al.,2009)报导，全部拔除或用腊去除母鼠背部皮肤的毛发后，毛囊将于第七天后进入生长期(anagen)。此时母鼠背部皮肤的毛发将重新生长出来。生长期约14天。上述步骤将全部的毛囊的生长期同步化(synchronization)。
母鼠背部皮肤的毛囊经过生长期后将进入绝对不反应休止期(refractorytelogen)。绝对不反应休止期(refractory telogen)约有28天。本发明利用药物处理于绝对不反应休止期的毛囊来观察药物是否有助于毛发生长。
如图1所示，将母鼠背部皮肤的毛囊全部拔除后，于第21天进将母鼠背部皮肤的毛发剔除。如图2所示，将剔除毛发的背部皮肤分成六个区块，每个区块的距离至少有3公分以上，以避免互相干扰。每个区块将连续施加药物10天。施加的方式包含但不限于注射(50微升)及涂抹(10微升)。此外，每天施加药物的剂量包含但不限于两种剂量，分别为高剂量(2,000μM)与低剂量(200μM)。
为了确保实验的可信度并避免人为操作上的误差，如图2所示，第一区块1连续施加环孢灵(cyclosporine)10次(每天1次)，其中本发明以环孢灵(cyclosporine)作为正对照组(positive control)，正对照组的浓度为重量百分比0.5％(以100％酒精配制)，每次涂抹10微升；第二区块2连续涂抹高剂量的生发胜肽或医药组合物10次(每天1次)；第三区块3连续涂抹低剂量的生发胜肽或医药组合物10次(每天1次)；第四区块4连续涂抹100％酒精10次(每天1次，每次涂抹10微升)，此组作为负对照组(negative control)；第五区块5连续注射高剂量的生发胜肽或医药组合物10次(每天1次)；以及第六区块6连续注射低剂量的生发胜肽或医药组合物10次(每天1次)。上述生发胜肽皆为相同的胜肽序列。
基于文献(Maurer et al.,1997)报导，若在老鼠背的皮肤连续涂抹10天的环孢灵，其皮肤的毛发将被诱发而再生。因此全部欲筛选的生发胜肽或医药组合物将利用上述实验模式进行实验并每天记录毛发再生的情形。由于小鼠的绝对不反应休止期(refractory telogen)大约为28天，因此开始施加药物30天后若无任何毛发再生的现象被观察到时，此生发胜肽或医药组合物则视为不具有促进毛发生长的能力。换言之，开始施加药物30天内有任何毛发再生的现象被观察到时，则此实验组的生发胜肽或医药组合物视为具有促进毛发生长的能力。
Wnt基因家族对于许多发育阶段，包含毛囊生长及分化，皆扮演重要的角色。一般的Wnt讯号将造成β-catenin蛋白质稳定并使β-catenin聚集，进而造成LEF/TCF转录因子的核转位(nuclear translocation)及活化而调控基因表现。学术期刊已推论Wnt/β-catenin在毛发型态及分化中具有重要的功能(Kishimoto et al.2000；Fuchs et al.2001；Millar2002)。
此外，毛发生长与Wnt/β-索烃素(β-catenin)及骨形态发生蛋白2/4(BMP2/4)讯号传递路径相关，因此本发明的生发胜肽或药物组合物似乎有可能经由此讯号传递路径进行调控毛发生长。换言之，本发明的生发胜肽或药物组合物可能经由作用于毛囊而影响Wnt/β-索烃素(β-catenin)及骨形态发生蛋白2/4(BMP2/4)讯号传递路径。
本案进一步将相关氨基酸序列应用于人类的皮肤角质细胞株(HaCaT)、毛囊角质细胞株(HHFK)，验证该些氨基酸序列胜肽诱发毛发生长情形。
在本发明中，HaCaT、HHFK被用来作为细胞模式，以供研究相关机制。报导基因试验(reporter assay)系用来作为生物活性试验，以供分析氨基酸序列SEQ ID No:1胜肽如何增进毛发生长。
如图3及4所示的报导基因试验中，Wnt3a的剂量50ng/ml为正向控制组。根据结果可知，200μM的SEQ ID No:1胜肽在HaCaT细胞及HHFK细胞中能提升β-catenin的活性。
表1显示本发明的序列表的编号与氨基酸序列的对照关系。
表1
表2显示本发明的生发胜肽及其医药组合物的实验组编号与序列表编号的对照关系。本发明序列的相似性是以岛津LCMS2010软体进行分析而得到的统计结果。
表2
| 实验组编号 | 序列表编号 |
| P1 | SEQ ID No:1 |
| P2 | SEQ ID No:2 |
| P3 | SEQ ID No:3 |
| P4 | SEQ ID No:4 |
| P5 | SEQ ID No:5 |
| P6 | SEQ ID No:6 |
| P7 | SEQ ID No:7 |
| P8 | SEQ ID No:8 |
| P9 | SEQ ID No:9 |
| P10 | SEQ ID No:10 |
| P11 | SEQ ID No:11 |
| P12 | SEQ ID No:12 |
| P13 | SEQ ID No:13 |
| P14 | SEQ ID No:14 |
| P15 | SEQ ID No:15 |
| P16 | SEQ ID No:16 |
| P17 | SEQ ID No:17 |
| P18 | SEQ ID No:18 |
| P19 | SEQ ID No:19 |
| P20 | SEQ ID No:20 |
| P21 | SEQ ID No:21 |
| P22 | SEQ ID No:22 |
| P23 | SEQ ID No:23 |
| P24 | SEQ ID No:24 |
| P25 | SEQ ID No:25 |
| P26 | SEQ ID No:26 |
| P27 | SEQ ID No:27 |
| P28 | SEQ ID No:28 |
| P29 | SEQ ID No:29 |
| P30 | SEQ ID No:30 |
| P31 | SEQ ID No:31 |
| P32 | SEQ ID No:32 |
| P33 | SEQ ID No:33 |
| P34 | SEQ ID No:34 |
| P35 | SEQ ID No:35 |
| P36 | SEQ ID No:36 |
| P37 | SEQ ID No:37 |
将上述实验组P1至P37各组别采用如前述图1及图2的步骤进行实验，并观察到结果如下表3，表3中的数字X代表第X天观察到毛发再生的现象(例如，X＝5代表第5天观察到毛发再生的现象)。而NA代表尚未分析，尚待进一步实验。此外，表3中的实验结果中，正对照组皆于30天内观察到毛发再生的现象，因此实验结果应可采信。此外，“无”代表经由胜肽处理后30天内仍无毛发生长。
表3
| 实验组编号 | 注射或涂抹(高剂量) |
| P1 | 22 |
| P2 | 无 |
| P3 | 22 |
| P4 | 22 |
| P5 | 22 |
| P6 | 无 |
| P7 | 22 |
| P8 | 无 |
| P9 | 19 |
| P10 | 22 |
| P11 | 22 |
| P12 | 22 |
| P13 | 22 |
| P14 | 22 |
| P15 | 无 |
| P16 | 无 |
| P17 | 无 |
| P18 | 无 |
| P19 | 无 |
| P20 | 无 |
| P21 | 无 |
| P22 | 无 |
| P23 | 无 |
| P24 | 无 |
| P25 | 无 |
| P26 | 无 |
| P27 | 22 |
| P28 | 无 |
| P29 | 22 |
| P30 | 无 |
| P31 | 22 |
| P32 | 无 |
| P33 | 无 |
| P34 | 无 |
| P35 | 无 |
| P36 | 无 |
| P37 | 22 |
本发明的技术内容及技术特点已揭示如上，然而本发明所属技术领域中具有通常知识者应了解，在不背离权利要求所界定的本发明精神和范围内，本发明的教示及揭示可作种种的替换及修饰。例如，上文揭示的许多元件可以不同的实施或以其它相同功能的序列予以取代，或者采用上述二种方式的组合。
此外，本案的权利范围并不局限于上文揭示的特定实施例的序列。本发明所属技术领域中具有通常知识者应了解，基于本发明教示及揭示序列，无论现在已存在或日后开发者，其与本案实施例揭示者系以实质相同的方式执行实质相同的功能，而达到实质相同的结果，亦可使用于本发明。因此，所附的权利要求用以涵盖此类序列。
符号说明
1 第一区块
2 第二区块
3 第三区块
4 第四区块
5 第五区块
6 第六区块
Claims (12)
1.一种胜肽用于制备生发药物的用途，其中所述胜肽是选自由SEQ ID No:1,SEQ IDNo:3,SEQ ID No:4,SEQ ID No:7,SEQ ID No:9,SEQ ID No:10和SEQ ID No:11组成的组群。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述胜肽为SEQ ID No:1。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述胜肽为SEQ ID No:3。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述胜肽为SEQ ID No:4。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述胜肽的剂量介于200μM至2000μM间。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述胜肽作用于毛囊。
7.一种组合物用于制备生发药物的用途，其中所述组合物包含：
生发胜肽(HGP)，其中所述生发胜肽是选自由SEQ ID No:1,SEQ ID No:3,SEQ ID No:4,SEQ ID No:7,SEQ ID No:9,SEQ ID No:10和SEQ ID No:11组成的组群；以及
磷酸盐。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述生发胜肽为SEQ ID No:1。
9.根据权利要求7所述的用途，其中所述生发胜肽为SEQ ID No:3。
10.根据权利要求7所述的用途，其中所述生发胜肽为SEQ ID No:4。
11.根据权利要求7所述的用途，其中所述生发胜肽的剂量介于200μM至2000μM间。
12.根据权利要求7所述的用途，其中所述生发胜肽作用于毛囊。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
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| GR01 | Patent grant | ||
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