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CN104650112B - 他克莫司8-丙基类似物的制备方法 - Google Patents

他克莫司8-丙基类似物的制备方法 Download PDF

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CN104650112B CN201310577069.6A CN201310577069A CN104650112B CN 104650112 B CN104650112 B CN 104650112B CN 201310577069 A CN201310577069 A CN 201310577069A CN 104650112 B CN104650112 B CN 104650112B
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tacrolimus
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acetonitrile
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Abstract

本发明公开了他克莫司8‑丙基类似物的制备方法，用于他克莫司杂质的分离制备，包括以下步骤：A、溶解过滤：将他克莫司原料用有机溶剂和水溶解，过滤，配制成样品溶液，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或几种；B、分离制备：根据杂质的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述保留时间相对应的杂质；C、干燥：将步骤B中收集到的组分用减压蒸馏和冻干法干燥，干燥后的杂质进行HPLC检测；D、将步骤C中得到的杂质产品进行LC‑MS检测。

Description

他克莫司8-丙基类似物的制备方法
技术领域
本发明涉及药物杂质制备方法领域，具体涉及他克莫司8-丙基类似物的制备方法。
背景技术
他克莫司(Tacrolimus)又名FK-506，是由日本藤泽制药公司于1984年从土壤放线菌中提取的一种大环内酯类抗生素，是一种强力的新型免疫抑制剂，主要通过抑制白介素-2(IL-2)的释放，全面抑制T淋巴细胞的作用，较常用的环孢素(CsA)强100倍，因此大大降低了临床使用剂量和治疗费用。此外用本品的患者，细菌和病毒感染率也较环孢菌素治疗者低，尤其是该药品有较强的亲肝性。FK-506和环孢菌素合用具有明显的协同作用，效果更好。他克莫司不仅可用于防止免疫反应的发生，还可用于治疗已发生的免疫反应及自身免疫性疾病，对防止器官移植的免疫反应和自身免疫性疾病的治疗具有重要意义。
为了保证用药安全，在仿制药的研制和生产中，应当对药物杂质进行检测研究，从而提高药品质量，减少药物不良反应。由于他克莫司的主要生产方法是发酵，故而在其产品中存在较多的杂质，他克莫司8-丙基类似物是他克莫司的主要杂质之一，其化学式为C44H71NO12，结构式为：
美国药典USP35中阐述了他克莫司各杂质的分布情况，见附图1，保留时间在35.457min 处为杂质他克莫司8-丙基类似物，但其没有涉及具体杂质的分离制备方法；文献Evaluation,synthesis and characterization of tacrolimus impurities（PatriziaFerraboschi,Diego Colombo,Maria De Mieri and Paride Grisenti,The Journal ofAntibiotics(2012)65,349–354）依据USP35记载的杂质分布情况对他克莫司8-丙基类似物进行了化学合成，但化学合成法得到的杂质产品纯度较低，进行检测研究的样品量在克级以上，而且合成所用设备较多，操作繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备色谱方法，分离制备他克莫司8-丙基类似物。
在制备色谱法中，色谱条件的选择非常重要，它对样品溶液中各物质的出峰顺序、峰形、分离效果等起着决定性的作用；色谱条件主要包括色谱柱(包括填料、内径等)、流动相(包括组成和配比等)、柱温、检测波长等，各色谱条件的选择及其组合至关重要。
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验，最终获得如下技术方案：
他克莫司杂质的制备方法，采用制备色谱法，包括以下步骤：
A、溶解过滤：将他克莫司原料用有机溶剂和水溶解，过滤，配制成样品溶液，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或几种；
B、分离制备：根据杂质的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述保留时间相对应的杂质；
C、干燥：将步骤B中收集到的组分用减压蒸馏和冻干法干燥，干燥后的杂质进行HPLC检测；
D、将步骤C中得到的杂质产品进行LC-MS检测。
步骤A中所述的有机溶剂与水的体积比优选为40～60:60～40，所述的样品溶液的浓度优选为15～25mg/mL。
步骤B中制备色谱法的条件为：流动相：A-纯化水（乙酸调节pH至4.0），B-甲醇或乙醇或乙腈；流速：70mL/min；检测波长：220nm；柱温：50℃；制备柱内径：50～300mm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5～10μm；进样量：30mL；流动相梯度洗脱设置如下：
时间/min A% B% 波长/nm
0 35～60 65～40 220
30 10～35 90～65 220
35 35～60 65～40 220
40 35～60 65～40 220
收集相应保留时间处的被分离杂质。
步骤C中所述的HPLC条件为：
色谱柱：Agilent polaris3C18-A柱（4.6×150mm,3μm）
流动相A：60mM磷酸水溶液，B：乙腈/叔丁基甲醚=81/19
C：流动相A/流动相B=4/1D：流动相A/流动相B=1/4
梯度洗脱设置为：
时间/min C% D%
0 72 28
30 72 28
53 15 85
54 72 28
60 72 28
检测波长：220nm
进样量：100μL
流速：1.5mL/min
柱温：60.0℃
步骤D中所述的LC-MS检测方法所采用的液相色谱条件为：色谱柱：Sepax120-5-C184.6×250mm；波长：220nm；流速：1.5mL/min；柱温：50℃；收集杂质的溶解：用体积比为1:1的乙腈-水溶液溶解；流动相：A-超纯水（乙酸调pH至3.5），B-乙腈，梯度洗脱设置如下：
时间/min 0 40 45 60
A% 65 40 30 65
B% 35 60 70 35
与现有技术相比，本发明涉及的制备色谱方法，设备简单，操作方便，分离快速，所得目标产品纯度高（＞97%），用于检测研究的杂质样品量仅需毫克级，从而为杂质的后续研究提供基础，有利于他克莫司质量的提高。
附图说明
图1：USP35中他克莫司杂质分布的HPLC图谱。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
实施例1
A、溶解过滤：将他克莫司原料用体积比为1:1的乙腈和水的混合溶液溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，配制成他克莫司浓度为20mg/mL的样品溶液。
B、分离制备：制备色谱法的条件为：流动相：A-纯化水（乙酸调节pH至4.0），B-乙腈；流速：70mL/min；检测波长：220nm；柱温：50℃；制备柱内径：50mm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm；进样量：30mL；流动相梯度洗脱设置如下：
时间/min A% B% 波长/nm
0 50 50 220
30 20 80 220
35 50 50 220
40 50 50 220
收集保留时间为28.71min处的被分离杂质。
C、干燥：将步骤B中收集到的组分用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，将浓缩后样品冻干，干燥后的杂质样品进行HPLC检测，其主成分含量为98.3%，所述HPLC条件为：
色谱柱：Agilent polaris3C18-A柱（4.6×150mm,3μm）
流动相A：60mM磷酸水溶液，B：乙腈/叔丁基甲醚=81/19
C：流动相A/流动相B=4/1D：流动相A/流动相B=1/4
梯度洗脱设置为：
时间/min C% D%
0 72 28
30 72 28
53 15 85
54 72 28
60 72 28
检测波长：220nm，进样量：100μL，流速：1.5mL/min，柱温：60.0℃。
D、将步骤C中得到的杂质产品进行LC-MS检测，其[M+K]+质荷比为844.5，化学式为C44H71NO12，为USP中所述的他克莫司8-丙基类似物。所述的LC-MS检测方法所采用的液相色谱条件为：色谱柱：Sepax120-5-C184.6×250mm；波长：220nm；流速：1.5mL/min；柱温：50℃；收集杂质的溶解：用体积比为1:1的乙腈-水溶液溶解；流动相：A-超纯水（乙酸调pH至3.5），B-乙腈，梯度洗脱设置如下：
时间/min 0 40 45 60
A% 65 40 30 65
B% 35 60 70 35
高分辨率质谱条件为电喷雾电离源正离子(ESI+)。
实施例2
A、溶解过滤：将他克莫司原料用体积比为40:60的乙腈和水的混合溶液溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，配制成他克莫司浓度为15mg/mL的样品溶液。
B、分离制备：制备色谱法的条件为：流动相：A-纯化水（乙酸调节pH至4.0），B-乙腈；流速：70mL/min；检测波长：220nm；柱温：50℃；制备柱内径：150mm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，粒径8μm；进样量：30mL；流动相梯度洗脱设置如下：
时间/min A% B% 波长/nm
0 35 65 220
30 10 90 220
35 35 65 220
40 35 65 220
收集保留时间为26.51min处的被分离杂质。
C、干燥：将步骤B中收集到的组分用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，将浓缩后样品冻干，干燥后的杂质样品进行HPLC检测，其主成分含量为97.8%，所述HPLC条件与实施例1中的相同。
D、将步骤C中得到的杂质产品进行LC-MS检测，其[M+K]+质荷比为844.5，化学式为C44H71NO12，为USP中所述的他克莫司8-丙基类似物。所述的LC-MS检测方法所采用的条件与实施例1中的相同。
实施例3
A、溶解过滤：将他克莫司原料用体积比为60:40的乙腈和水的混合溶液溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，配制成他克莫司浓度为25mg/mL的样品溶液。
B、分离制备：制备色谱法的条件为：流动相：A-纯化水（乙酸调节pH至4.0），B- 乙腈；流速：70mL/min；检测波长：220nm；柱温：50℃；制备柱内径：300mm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，粒径10μm；进样量：30mL；流动相梯度洗脱设置如下：
时间/min A% B% 波长/nm
0 60 40 220
30 35 65 220
35 60 40 220
40 60 40 220
收集保留时间为30.34min处的被分离杂质。
C、干燥：将步骤B中收集到的组分用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，将浓缩后样品冻干，干燥后的杂质样品进行HPLC检测，其主成分含量为97.6%，所述HPLC条件与实施例1中的相同。
D、将步骤C中得到的杂质产品进行LC-MS检测，其[M+K]+质荷比为844.5，化学式为C44H71NO12，为USP中所述的他克莫司8-丙基类似物。所述的LC-MS检测方法所采用的条件与实施例1中的相同。
实施例4
A、溶解过滤：将他克莫司原料用体积比为40:60的甲醇和水的混合溶液溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，配制成他克莫司浓度为20mg/mL的样品溶液。
B、分离制备：制备色谱法的条件为：流动相：A-纯化水（乙酸调节pH至4.0），B-甲醇；流速：70mL/min；检测波长：220nm；柱温：50℃；制备柱内径：50mm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，粒径8μm；进样量：30mL；流动相梯度洗脱设置如下：
时间/min A% B% 波长/nm
0 45 55 220
30 15 85 220
35 45 55 220
40 45 55 220
收集保留时间为31.16min处的被分离杂质。
C、干燥：将步骤B中收集到的组分用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，将浓缩后样品冻干，干燥后的杂质样品进行HPLC检测，其主成分含量为97.5%，所述HPLC条件与实施例1中的相同。
D、将步骤C中得到的杂质产品进行LC-MS检测，其[M+K]+质荷比为844.5，化学式为C44H71NO12，为USP中所述的他克莫司8-丙基类似物。所述的LC-MS检测方法所采用的条件与实施例1中的相同。
实施例5
A、溶解过滤：将他克莫司原料用体积比为60:40的乙醇和水的混合溶液溶解，用0.45μm微孔滤膜过滤，配制成他克莫司浓度为20mg/mL的样品溶液。
B、分离制备：制备色谱法的条件为：流动相：A-纯化水（乙酸调节pH至4.0），B-乙醇；流速：70mL/min；检测波长：220nm；柱温：50℃；制备柱内径：50mm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5μm；进样量：30mL；流动相梯度洗脱设置如下：
时间/min A% B% 波长/nm
0 55 45 220
30 35 65 220
35 55 45 220
40 55 45 220
收集保留时间为33.65min处的被分离杂质。
C、干燥：将步骤B中收集到的组分用旋转蒸发仪减压蒸馏浓缩，将浓缩后样品冻干，干燥后的杂质样品进行HPLC检测，其主成分含量为97.3%，所述HPLC条件与实施例1中的相同。
D、将步骤C中得到的杂质产品进行LC-MS检测，其[M+K]+质荷比为844.5，化学式为C44H71NO12，为USP中所述的他克莫司8-丙基类似物。所述的LC-MS检测方法所采用的条件与实施例1中的相同。

Claims (1)

1.他克莫司8-丙基类似物的制备方法，采用制备色谱法，其特征在于包括以下步骤：
A、溶解过滤：将他克莫司原料用有机溶剂与水的体积比为40～60:60～40的溶液溶解，过滤，配制成浓度为15～25mg/mL的样品溶液，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种；
B、分离制备：流动相：A-纯化水，乙酸调节pH至4.0，B-甲醇或乙醇或乙腈；流速：70mL/min；检测波长：220nm；柱温：50℃；制备柱内径：50～300mm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，粒径5～10μm；进样量：30mL；流动相梯度洗脱设置如下：
时间/min A％ B％ 波长/nm 0 35～60 65～40 220 30 10～35 90～65 220 35 35～60 65～40 220 40 35～60 65～40 220
收集相应保留时间处的被分离杂质；
C、干燥：将步骤B中收集到的组分用减压蒸馏和冻干法干燥，干燥后的杂质进行HPLC检测；
D、将步骤C中得到的杂质产品进行LC-MS检测，所采用的液相色谱条件为：色谱柱：Sepax 120-5-C18,4.6×250mm；波长：220nm；流速：1.5mL/min；柱温：50℃；收集杂质的溶解：用体积比为1:1的乙腈-水溶液溶解；流动相：A-超纯水，乙酸调pH至3.5，B-乙腈，梯度洗脱设置如下：
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