CN104630058A - 一种串联多酶蛋白质微酶解反应器及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种串联多酶蛋白质微酶解反应器，其特征在于，将两种单一酶的微反应器通过膜接口串联成多酶反应器。本发明的串联多酶蛋白质微酶反应器两种酶的固定和酶解都是独立进行，互不干扰；该酶反应器的膜接口可以通过溶液交换满足不同蛋白酶的酶解条件；根据样品需要，选择合适的蛋白酶，不受不同酶间酶解条件差异的限制，且可方便调节不同蛋白酶的酶解顺序，操作容易；特别适用于膜蛋白等复杂样品的酶解；该酶反应器膜实现酶解、富集、鉴定的一体化，降低样品的离线损失，从而大大提高蛋白质分析鉴定的效率。
Description
【技术领域】
本发明涉及酶解反应器技术领域，具体地说，是一种串联多酶蛋白质微酶解反应器及其使用方法。
【背景技术】
近年来，质谱鉴定因为具有高的精确度、可靠性以及良好的重复性等优点，在蛋白组学分析的bottom-up策略中越来越受到关注。在该蛋白质分析策略中，蛋白质样品首先要经过酶解，进而通过质谱鉴定出所含的肽段以及匹配的蛋白。因而，如何实现快速高效的酶解成为基于质谱鉴定的蛋白组学分析策略的关键步骤之一，特别是对于膜蛋白这类溶解度差，蛋白丰度低，缺少胰蛋白酶酶切位点的蛋白质，实现高效的酶解则更加困难。
研究表明，在高通量的蛋白质分析中，利用多酶酶切技术，可以有效地提高酶解效率，有助于质谱检测到更多的肽段，提高蛋白质的序列覆盖度，从而增强蛋白质鉴定的准确性。这种多酶酶解的策略在自由溶液的串联酶解中，有着较为成功的应用。Glatter等在自由溶液酶解中实现胞内蛋白酶和胰蛋白酶对酵母提取物蛋白的串联酶解，其结果表明，这种双酶串联酶解的方式所得的蛋白质序列覆盖度大大地超过了胰蛋白酶的单酶酶解的结果。(Glatter，T.；Ludwig，C.；Ahrne，E.Journal of Proteome Research 2012，11，(11)，5145-5156.)然而自由溶液中的多酶串联酶解不仅有传统的自由溶液酶解的缺点，如酶的自降解，低的酶底物比，耗时等，另外由于串联的形式使得酶解的时间大大地增加，阻碍了蛋白质高通量的分析鉴定，从而限制了该方法的发展。
固定化酶反应器因具有高的酶底物比，少的酶解时间，良好的重复性等优点，而受到极大的关注。然而，大多数的酶反应器都为单酶反应器，其中以胰蛋白酶反应器为主，但对于缺少胰蛋白酶酶切位点的蛋白质以及复杂的蛋白质实际样品，这种单酶反应器的酶解效率依然较低。因而，将多酶酶解方式应用于固定化酶反应器，对于实现快速高效完全的蛋白质酶解具有重大意义。Zhou等将胰蛋白酶和糜蛋白酶同时固定到PVDF膜上，得到了一种双酶酶反应器，该酶反应器对标准蛋白、疏水性蛋白以及疏水性的跨膜蛋白都具有良好的酶解效果。(Zhou Y.；Yi T.；Park S.-S.；Journal of Proteomics 2011，74，(7)，1030-1035.)本课题组也做过胰蛋白酶和糜蛋白酶的并联酶解，即将这两种蛋白酶通过两步法分别固定到有机整体材料和无机纳米材料上，制备得到一种双酶反应器，其在实际的鼠肝蛋白和鼠肝膜蛋白中，都有较好的酶解效果。然而在将多种酶固定到一种载体上实现多酶并联酶解的酶解策略中，所选用的酶必须是酶解条件相符的，如pH范围。胰蛋白酶是最常用的酶，它的酶解pH范围为8.0左右，并联酶解中，要选用与其酶解条件相近的酶，如糜蛋白酶和Lys-C，而像在酸性条件下处于高活性的胃蛋白酶等酶就无法与胰蛋白酶进行组合实现并联酶解。此外，研究也证明，难溶性蛋白质如膜蛋白的溶解度在酸性和有机溶剂条件下能显著增加，更加有利于酶解，而酸性和高浓度有机溶剂的酶解环境会抑制胰蛋白酶的酶解活性，降低蛋白酶解的效率。因而，发展一种适应条件更广，更加多样化的固定化酶多酶反应器具有重要意义。
中空纤维膜具有良好的体积排阻特性，分子量大于其排阻限的物质不能通过该膜，而小分子可以自由通过，其在样品的浓缩、脱盐以及二维CE中buffer的切换等方面已得到广泛地应用。Yang等(Yang，C.，H.Liu，Q.Yang，L.Zhang，W. Zhang，Y. Zhang.Analytical Chemistry.2002，75(2)：215-218.)用中空纤维膜为接口，串联CIEF和CGE，利用膜的半渗透性在接口处将第一维buffer切换成第二维buffer，建立了二维等电聚焦-凝胶电泳系统；Sun等(Sun，L.，J.Ma，X.Qiao，Y. Liang，G. Zhu，Y. Shan，Z.Liang，L. Zhang，Y. Zhang.AnalyticalChemistry.2010，82(6)：2574-2579.)设计了一种中空纤维膜连接酶解柱的样品在线buffer交换、富集和酶解装置，RPLC流分进入装置后从膜内通过与膜外的交换buffer进行交换，膜外交换buffer以相反方向在膜外流动促进交换的进行，成功实现了pH调节、蛋白富集及在线酶解的功能。1997年，Kostel等(Kostel，K.L.，S.M.Lunte.Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences andApplications.1997，695(1)：27-38.)在普通间隙式反应器的接口上固定一段聚丙烯腈微透析膜，用以减少样品在经过接口处时产生的损失，虽然其使用的微透析膜截止分子量为29000，大于样品分子量，仍大大降低了样品的损失。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种串联多酶蛋白质微酶解反应器及其使用方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种串联多酶蛋白质微酶解反应器，其特征在于，
一单酶酶解柱的制备
酶反应器装置中的酶通过吸附法、包埋法、共价键合法、交联法中的任意一种方式固载在毛细管中，微酶解柱的长度为2-10厘米，内径为50-200微米的毛细管。
将酶固载在毛细管中的方式可以是通过共价键合法把酶固载在整体材料中；通过溶胶凝胶法把蛋白酶包埋在整体材料上；通过吸附法以静电力作用将酶固载在毛细管内壁上；通过交联剂将酶固载在毛细管中或是其他的固酶方法。
所述的酶为胰蛋白酶trypsin、胃蛋白酶pepsin、蛋白内切酶Glu-C、胞内蛋白酶Lys-C、蛋白酶K proteinase K、糜蛋白酶chymotrypsin、弹性蛋白酶elastase中的任意一种。
二酶反应器的串联
将两根固定有不同蛋白酶的单酶反应器末端约5mm长的涂层去除，并用硅橡胶密封，浸入含体积分数40％的HF溶液中刻蚀2小时左右，然后用清水洗去吸附的HF，此时去涂层的酶反应器外径小于中空纤维膜的内径。
取一段中空纤维膜，将酶反应器被刻蚀的末端穿入中空纤维膜中，然后用环氧胶将酶反应器与中空纤维膜固定；待胶完全凝固后将此接口固定于用透明塑料管制备的容器中，容器上部开两孔作为缓冲溶液的出、入口；由此得到串联多酶蛋白质微酶解反应器。
根据两根酶解柱酶解条件的差异来选择膜接口蓄液容器中需要的缓冲溶液的离子强度和pH值等条件，若第二根酶解柱酶解条件较第一根酶解柱酶解条件偏酸性，则选用醋酸-醋酸铵缓冲溶液、甘氨酸-盐酸缓冲溶液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲溶液中的一种；反之，则选用磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl、硼酸-硼砂缓冲溶液中的一种。
两支酶反应柱采用由一段置于充满缓冲液的容器中的中空纤维膜构成的膜接口连接；基于中空纤维膜的体积排阻特性，膜内的一次酶解的产物多肽和未被酶解的蛋白质被保留，而膜内外的离子可自由交换，使得在经过第一根酶解柱酶解后的蛋白质溶液能够适应其在第二根酶解柱中的酶解。
可以通过在膜外施加一定压力1-100pa或者适当提高接口处温度(至25℃～40℃)，加速离子交换，从而使得第二根酶解柱的酶解环境(pH值、离子强度)快速达到最佳状态。
可根据需要选择样品被两种微酶酶解柱酶解的先后顺序，也可与色谱及质谱方法联用，实现在线的酶解和鉴定。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
该串联多酶蛋白质微酶反应器两种酶的固定和酶解都是独立进行，互不干扰；该酶反应器的膜接口可以通过溶液交换满足各种蛋白酶的酶解条件；可以根据样品需要，选择合适的蛋白酶，而不受不同酶间酶解条件差异的限制，且可方便调节不同蛋白酶的酶解顺序，操作容易；特别适用于膜蛋白等复杂样品的酶解；该酶反应器膜接口还可用于蛋白质样品的除盐、富集，利于该酶反应器与液质的在线联用，实现酶解、富集、鉴定的一体化，降低样品的离线损失，从而大大提高蛋白质分析鉴定的效率。
【附图说明】
图1串联多酶蛋白质微酶反应器装置示意图；
图2鼠肝膜蛋白经串联多酶蛋白质微酶反应器酶解后，产物经LC-MS分离检测的色谱图。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种串联多酶蛋白质微酶解反应器及其使用方法的具体实施方式。
实施例1
取8.0mg CTAB于离心管中，依次向管中加入112μL TEOS，118μL ATPES，215μL无水乙醇，32μL水，震荡超声各1min混匀；将100μL上述溶液加入到含有2.5mg修饰有氨基的SBA-15纳米材料的离心管中，分散均匀后快速地引入到毛细管中，用硅橡胶两端封口后，在40℃的水浴锅中反应24h；无水乙醇、水和磷酸盐缓冲溶液冲洗，而后连续6h泵入含5％(v/v)戊二醛的磷酸盐溶液，得到修饰醛基的有机-无机整体材料复合基质。
制备胃蛋白酶单酶反应器：用醋酸-醋酸铵缓冲溶液(pH 4.0)冲洗上述修饰后的有机-无机整体材料复合基质，后连续泵入含有2mg/mL胃蛋白酶、0.05mol/L苯甲脒、5mg/mL氰基-磞氢化钠的醋酸-醋酸铵缓冲溶液在4℃下反应24h，依次用含10％ACN的醋酸-醋酸铵缓冲溶液和1M Tris-HCL冲洗酶解柱4h，从而制备得到胃蛋白酶单酶反应器。
制备胰蛋白酶单酶反应器：用磷酸盐缓冲溶液(pH 8.0)冲洗上述修饰后的有机-无机整体材料复合基质，后连续泵入含有2mg/mL胰蛋白酶、0.05mol/L苯甲脒、5mg/mL氰基-磞氢化钠的磷酸盐溶液在4℃下反应24h，依次用含10％ACN的磷酸盐缓冲溶液和1M Tris-HCL冲洗酶解柱4h，从而制备得到胰蛋白酶单酶反应器。
将上述得到的胃蛋白酶单酶反应器和胰蛋白酶单酶反应器末端经刻蚀后用膜接口连接起来，置于充满磷酸缓冲液的微型容器中，形成胃蛋白酶-胰蛋白酶串联的双酶反应器装置。用制备的胃蛋白酶-胰蛋白酶串联双酶反应器装置在37℃条件下对1mg/mL的鼠肝膜蛋白进行酶解，选用先经过胃蛋白酶酶解，再经过胰蛋白酶酶解的模式。先用醋酸-醋酸铵缓冲溶液冲洗酶反应器，再将溶解在醋酸-醋酸铵缓冲溶液中的鼠肝膜蛋白溶液通入胃蛋白酶单酶反应器进行酶解，被酶解的产物经过膜接口处发生缓冲液交换，然后进入胰蛋白酶酶解柱进行第二步酶解。经质谱鉴定，得到620种蛋白和2891条肽段，相比于固定一种胰蛋白酶的酶解柱，该串联多酶酶反应器酶解得到更多的肽段，从而鉴定出更多的蛋白，且提高了蛋白的序列覆盖度，增强了质谱鉴定可信度。
实验结果表明，本发明通过酶反应器膜接口，实现了两种不同酶解条件的酶的串联酶解，提高了酶解效率，增强了蛋白质鉴定的可信度，且容易操作。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种串联多酶蛋白质微酶解反应器，其特征在于，
一 单酶酶解柱的制备
酶反应器装置中的酶通过吸附法、包埋法、共价键合法、交联法中的任意一种方式固载在毛细管中，毛细管微酶解柱的长度为2-10厘米，内径为50-200微米；
二 酶反应器的串联
将两根固定有不同蛋白酶的单酶反应器末端约5mm长的涂层去除，并用硅橡胶密封，浸入HF溶液中刻蚀2小时，然后用清水洗去吸附的HF，此时去涂层的酶反应器外径小于中空纤维膜的内径；
取一段中空纤维膜，将酶反应器被刻蚀的末端穿人中空纤维膜中，然后用环氧胶将酶反应器与中空纤维膜固定；待胶完全凝固后将此接口固定于用透明塑料管制备的容器中，容器上部开两孔作为缓冲溶液的出、入口；由此得到串联多酶蛋白质微酶解反应器。
2.如权利要求1所述的一种串联多酶蛋白质微酶解反应器，其特征在于，将酶固载在毛细管中的方式是：通过共价键合法把酶固载在整体材料中；通过溶胶凝胶法把蛋白酶包埋在整体材料上；通过吸附法以静电力作用将酶固载在毛细管内壁上；通过交联剂将酶固载在毛细管中。
3.如权利要求1所述的一种串联多酶蛋白质微酶解反应器，其特征在于，所述的酶为胰蛋白酶trypsin，胃蛋白酶pepsin，蛋白内切酶Glu-C，胞内蛋白酶Lys-C，蛋白酶K proteinase K，糜蛋白酶chymotrypsin，弹性蛋白酶elastase中的任意一种。
4.如权利要求1所述的一种串联多酶蛋白质微酶解反应器，其特征在于，两支酶反应柱采用由一段置于充满缓冲液的容器中的中空纤维膜构成的膜接口连接；基于中空纤维膜的体积排阻特性，膜内的一次酶解产物多肽和未被酶解的蛋白质被保留，而膜内外的离子可自由交换，使得在经过第一根酶解柱酶解后的蛋白质溶液能够适应其在第二根酶解柱中的酶解。
5.如权利要求1所述的一种串联多酶蛋白质微酶解反应器，其特征在于，根据两根酶解柱酶解条件的差异来选择膜接口蓄液容器中需要的缓冲溶液的离子强度和pH值条件，若第二根酶解柱酶解条件较第一根酶解柱酶解条件偏酸性，则选用醋酸-醋酸铵缓冲溶液、甘氨酸-盐酸缓冲溶液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲溶液中的一种；反之，则选用磷酸盐缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Tris-HCl、硼酸-硼砂缓冲溶液中的一种。
6.一种串联多酶蛋白质微酶反应器的使用方法，其特征在于，可以通过在膜外施加压力1-100pa或者适当提高接口处温度，温度范围为25℃～40℃，加速缓冲溶液的交换，从而使得第二根酶解柱的酶解环境(pH值、离子强度、有机调节剂含量)快速达到最佳状态。
7.一种串联多酶蛋白质微酶反应器的使用方法，其特征在于，根据需要选择样品被两种微酶酶解柱酶解的先后顺序，也与色谱及质谱方法联用，实现在线的酶解和鉴定。
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