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CN104620113A - 检测装置及检测方法 - Google Patents

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CN104620113A CN201380044560.0A CN201380044560A CN104620113A CN 104620113 A CN104620113 A CN 104620113A CN 201380044560 A CN201380044560 A CN 201380044560A CN 104620113 A CN104620113 A CN 104620113A
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德田崇
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Abstract

本发明提供一种以高灵敏度检测生物样本的检测装置及检测方法。该检测装置包括：微腔阵列(4)，其具有多个容纳部(8)，在所述容纳部(8)内填充含有生物样本的亲水性溶剂；图像传感器(2)，在所述图像传感器(2)上与所述容纳部(8)对应地设置有像素(5)；其中，所述微腔阵列(4)包括：流路(54)，其与所述容纳部(8)的开口部连通；疏水性溶剂供给部(56)，其与所述流路(54)连续地设置；贯通孔(58)，所述亲水性溶剂(42)通过所述贯通孔(58)能够进出于所述流路(54)，并且，所述疏水性溶剂供给部(56)通过从外部施加的力使疏水性溶剂(44)流入到所述流路(54)中。

Description

检测装置及检测方法
技术领域
本发明涉及检测装置及检测方法，特别是涉及可检测生物样本的装置。
背景技术
自从用光学显微镜可直接观察活生生(具有活性)的蛋白质、核酸等各种生物样本的运动以来，主要使用的方法是通过利用光学显微镜的测量，检测生物样本的分子水平的功能或活性。为了识别作为各个对象物的分子，在这些分子上添加荧光素、金胶体或者微小粒子(聚苯乙烯微球，磁微球等)等试剂，由此能够对通过光学显微镜的分辨率是看不到的大小的分子的存在进行可视化。
然而，所述方法需要大型且昂贵的光学显微镜，并且需用光学显微镜直接观察以及对生物样本的存在进行计数，因此存在无法快速容易地检测生物样本的问题。
对此，例如，在非专利文献1中公开有包括微腔阵列和CMOS图像传感器的生物样本检测装置，所述微腔阵列具有多个可容纳生物样本的容纳部，所述CMOS图像传感器具有与每个容纳部对应而设置的像素。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Complementary Metal-Oxide-Semiconductor ImageSensor with Microchamber Array for Fluorescent Bead Counting,KiyotakaSasagawa,et al.,JAPANESE JOURNAL OF APPLIED PHYSICS,51(2012)02BL01
发明内容
但是，在所述非专利文献1中，由于所有的容纳部的开口部都与流路连通，因此存在容纳于容纳部的生物样本或试剂的浓度会下降而导致测量灵敏度下降的问题。
因此，本发明的目的在于提供一种能够以高灵敏度检测生物样本的检测装置及检测方法。
根据本发明的检测装置，包括：微腔阵列，所述微腔阵列具有多个容纳部，在所述容纳部内填充含有生物样本的亲水性溶剂；图像传感器，在所述图像传感器上与所述容纳部对应设置有像素，其中，所述微腔阵列包括：流路，所述流路与所述容纳部的开口部连通；疏水性溶剂供给部，所述疏水性溶剂供给部与所述流路连续地设置；贯通孔，所述亲水性溶剂通过所述贯通孔能够进出于所述流路，所述疏水性溶剂供给部通过从外部施加的力使疏水性溶剂流入到所述流路中。
根据本发明的检测方法，包括：在多个容纳部内填充含有生物样本的亲水性溶剂的工序；向所述容纳部照射激励光的工序；对于每个所述容纳部，用图像传感器检测所述样本的荧光反应的工序；其中，填充所述亲水性溶剂的工序包括：从所述容纳部的开口部流入所述亲水性溶剂的工序；用疏水性溶剂堵塞所述开口部的工序。
根据本发明，用疏水性溶剂密封容纳部的开口部，含有生物样本的亲水性溶剂被封在容纳部内，因此，能够防止容纳于容纳部内的生物样本或试剂的浓度下降，从而能够提高检测灵敏度。
附图说明
图1是示出根据第一实施方式的检测装置的整体结构的分解立体图；
图2是示出根据第一实施方式的检测装置的图像传感器和微腔阵列的结构的俯视图，图2A是图像传感器的俯视图，图2B是微腔阵列的俯视图，图2C是将微腔阵列叠在图像传感器上的状态的俯视图；
图3是按步骤示出根据第一实施方式的检测装置的制造方法的立体图，图3A是示出将Si基板固定于图像传感器上的步骤的图，图3B是示出在Si基板上形成Al膜和抗蚀层的步骤的图，图3C是示出在抗蚀层上形成图案的步骤的图，图3D是示出在Al膜上形成贯通孔的步骤的图，图3E是示出在Si基板上形成贯通孔的步骤的图，图3F是示出去除抗蚀层和Al膜的步骤的图；
图4是按步骤示出根据第一实施方式的检测装置的制造方法的立体图，图4A是示出在图像传感器的背面形成Al图案的步骤的图，图4B是示出加工外形的步骤的图，图4C是示出在聚酰亚胺基板上固定检测装置的步骤的图，图4D是示出用树脂覆盖检测装置的步骤的图；
图5是示出根据第一实施方式的检测装置的使用状态的剖视图，图5A是示出将亲水性溶剂导入至微腔阵列的步骤的图，图5B是示出在容纳部内填充亲水性溶剂的步骤的图，图5B是示出用疏水性溶剂密封开口部的步骤的图；
图6是示出根据第一实施方式的检测装置的使用状态的图；
图7是示出根据第一实施方式的检测装置的激励光的入射角度和图像传感器的检测图像的图，图7A是入射角度为0度时的图，图7B是入射角度为45度时的图；
图8是示出根据第一实施方式的检测装置的激励光的入射角度和图像传感器的检测强度的关系的图表；
图9是示出通过根据第一实施方式的检测装置检测出的结果的图，图9A是用显微镜从上方观察微腔阵列的图像，图9B是经过10分钟后的图像传感器的检测结果，图9C是经过30分钟后的图像传感器的检测结果，图9D是经过60分钟后的图像传感器的检测结果；
图10是示出根据第一实施方式的检测装置的检测时间和检测结果的关系的图表，图10A是通过检测装置测量检测强度的结果，图10B是用现有的光学显微镜检测荧光素的浓度的结果；
图11是示出根据第二实施方式的检测装置的剖视图，图11A是示出使用前的状态的图，图11B是示出使用状态(1)的图，图11C是示出使用状态(2)的图。
附图标号说明
1：检测装置
2：图像传感器
4：微腔阵列
5：像素
8：容纳部
10：开口部
42：亲水性溶剂
44：疏水性溶剂
54：流路
56：疏水性溶剂供给部
58：贯通孔
62：变形部
具体实施方式
(第一实施方式)
下面，参照附图对本发明的实施方式进行详细说明。
图1中示出的检测装置1包括图像传感器2、干涉滤光片3、微腔阵列4。检测装置1在微腔阵列4上容纳含有生物样本的亲水性溶剂42，并用图像传感器2检测该生物样本的荧光反应。
在本实施方式中，所谓生物样本是例如蛋白质、抗体，核酸等生物分子或病毒粒子等，所述生物样本与试剂反应。作为试剂可以使用例如FDG(氟脱氧葡萄糖)或者珠粒。
珠粒的平均粒子直径优选为1μm～4μm。通过将珠粒的平均粒子直径变小，不仅能够将珠粒有效地封入到微腔阵列4，而且还能够实现微腔阵列4的高密度化。此外，在这里“平均粒子直径”是表示用电子显微镜观察的数值或者用动态光散射法测量的数值。
在本实施方式中，检测装置1是在图像传感器2上通过干涉滤光片3装载有微腔阵列4。图像传感器2可以使用例如CMOS传感器。图像传感器2上形成有多个规定大小的像素5，并且设置有结合片7。干涉滤光片3被粘结剂粘结在图像传感器2的像素5上，防止照射至微腔阵列4的激励光入射到图像传感器2的像素5上。
微腔阵列4包括：腔室主体6，其由板状部件构成，所述板状部件由例如玻璃、硅、高分子树脂等形成；多个容纳部8，其形成在所述腔室主体6上。腔室主体6的表面优选为具有疏水性。所谓疏水性为与亲油性相同的意思，指与疏水性溶剂44的亲合性高于与亲水性溶剂42的亲合性。此时，在腔室主体6的外表面可以使用例如斥水性树脂、氟类高分子树脂等。作为氟类高分子树脂，可以优选使用具有高疏水性且对于生物样本的毒性低的非晶型氟树脂等。作为非晶性氟树脂，例如可以从CYTOP(注册商标)、TEFLON(注册商标)AF2400和TEFLON(注册商标)AF1600中选择。
容纳部8是从腔室主体6的外表面沿厚度方向穿设的贯通孔。为了使试剂和生物样本有效进行反应，需将生物样本和试剂的浓度变得很高，为此容纳部8的容积优选为毫微微升级别。
如图2A所示，在图像传感器2上连续地设置有多个具有规定大小的像素5。在本实施方式中，图像传感器2具有多个单边长度为7.5μm的正方形的像素5。
如图2B所示，在微腔阵列4上连续地设置有容纳部8，并且各容纳部8之间隔开规定间隔。将所述间隔设定为能够遮挡入射的激励光的长度。在本实施方式中，微腔阵列4具有多个隔开15μm间隔而形成的容纳部8。
如图2C所示，微腔阵列4以一个容纳部8对应于一个像素5的方式固定在图像传感器2上。
此外，虽然未图示，但是干涉滤光片3和微腔阵列4及图像传感器2之间的侧壁上优选涂布含有黑色染料的遮挡材料。由此，能够防止激励光从干涉滤光片3和微腔阵列4及图像传感器2之间的间隙入射至图像传感器2的像素5。
接着，说明根据本实施方式的检测装置1的制造方法。首先，在厚度为150μm的图像传感器11的像素5上涂布2μm厚度的粘结剂(在本实施方式中，使用CYTOP(注册商标))14。接着，在180℃的温度下进行加热的同时，将在一个面上设置厚度为3μm的干涉滤光片3的厚度为60μm的Si基板12以干涉滤光片3的外表面叠在所述粘结剂14上的方式通过干涉滤光片3将Si基板12和图像传感器11进行固定。
接着，通过沉积法在Si基板12上形成厚度为200nm的Al膜16，并在所述Al膜16上设置抗蚀层18(图3B)。
接着，在抗蚀层18上形成图案，并穿设贯通孔20(图3C)。在形成保护结合片部7的厚膜抗蚀层22后，通过湿式蚀刻在Al膜16上形成贯通孔24(图3D)。
进一步，通过深度反应离子刻蚀(Deep Reactive Ion Etching:DRIE)在Si基板12上形成贯通孔26(图3E)。接着，用混合酸(醋酸、磷酸、硝酸、纯净水(体积比4:4:1:1))去除抗蚀层18和Al膜16(图3F)。
接着，形成放置于玻璃基板28上的保护结合片部7的厚膜抗蚀层30，然后在图像传感器11的背面上形成Al的图案32(图4A)，并进一步通过DRIE实施外形加工，由此得到检测装置(图4B)。
将已形成的检测装置1固定在聚酰亚胺基板34上，并在结合片部7中引线键合(图4C)。
结合线36和结合片部7被环氧树脂40覆盖。此外，干涉滤光片3和微腔阵列4及图像传感器2之间设置含有黑色染料的遮挡材料38(图4D)。
接着，对具有上述结构的检测装置1的工作及效果进行说明。首先，将含有生物样本和试剂的亲水性溶剂42导入至微腔阵列4的容纳部8内(图5A)。亲水性溶剂42可以使用例如从由水、亲水性醇、亲水性醚、酮、腈类溶剂、二甲基亚砜(DMSO)、及N，N-二甲基甲酰胺(DMF)组成的组中选择的至少一种或者含有所述物质的混合物等。
接着，将检测装置1放在减压环境下进行脱气。由此，能够去除容纳部8内的空气，并将含有生物样本的亲水性溶剂42能够有效地导入至容纳部8内(图5B)。
接着，将疏水性溶剂44导入至容纳部8的开口部10的周边(图5C)。疏水性溶剂44是只要不与亲水性溶剂42混合的溶剂即可，例如，疏水性溶剂44可以优选使用从由饱和烃、不饱和烃、芳香族烃、硅油、全氟碳化合物、卤素类溶剂、及疏水性离子液体组成的组中选择的至少一种或者含有这些物质的混合物等。
通过将疏水性溶剂44导入至容纳部8的开口部10的周边，在各容纳部8上形成被疏水性溶剂44覆盖的液滴，并能够将生物样本封入于容纳部8内。由此，能够将生物样本封入到毫微微升级别的容纳部8内。
接着，对于检测装置1的微腔阵列4，从光源46照射激励光(图6)。通过结合在生物样本的规定酶，荧光基质被分解而荧光物质游离出。将该荧光物质用通过干涉滤光片3与各容纳部8对应的像素5A进行检测。另一方面，在没有填充亲水性溶剂的容纳部和与各容纳部之间对应的像素5B、5C上没有检测出荧光物质。
由此，在检测装置1中，由于容纳部8的开口部10被疏水性溶剂44密封，并且具有含有生物样本的亲水性溶剂42被封在容纳部8内，因此，能够防止容纳于容纳部8内的生物样本或者试剂的浓度下降，从而能够提高测量灵敏度。
此外，检测装置1检测容纳有试剂的容纳部8的数量和容纳有捕获生物样本的试剂的容纳部8的数量，并能够计算出捕获目标分子的试剂数量占全部试剂数量的比例。由此，能够将目标分子的浓度进行定量化。
并且，在本实施方式中，图像传感器2能够检测在与各容纳部8对应的像素5中有没有各容纳部8的试剂以及是否容纳有捕获生物样本的试剂，因此不像现有的检测装置一样需要光学显微镜，因此能够实现检测系统的小型化，并且还能够实现检测作业的高速化。
接着，说明利用实际制造的检测装置1进行的评价。所制造的检测装置1形成为，微腔阵列4的厚度为60μm，容纳部8的有效长度为4μm，各容纳部8之间的间隔为15μm。图像传感器2使用芯片尺寸为1.2mm×3.6mm的CMOS传感器，像素5的边长为7.5μm，阵列大小为120×268。
首先，确认激励光的合适的入射角度。激励光使用将水银灯的白色光通过蓝色干涉滤光片(透射中心波长469nm，波长宽度35nm)进行选择的蓝色光。如图7所示，优选从容纳部8的开口部10的斜上方向微腔阵列4照射激励光。也就是说，对于容纳部8的开口部10，如果向垂直方向照射激励光，则激励光会直接入射至图像传感器2的像素5。对此，如图7B所示，从容纳部8的开口部10的斜上方照射激励光时，图像传感器2将不检测所述激励光，因此能够更加可靠地检测出荧光物质。
图8是示出激励光的入射角度和图像传感器2的检测强度的关系的图表。●是有微腔阵列4的结果，□是没有微腔阵列4的结果。入射角度是表示将垂直方向作为0度时所述垂直方向的延伸轴与平行于激励光入射方向的轴之间形成的角。从结果可知，通过改变入射角度，微腔阵列4能够遮挡激励光。
图9是示出通过根据本实施方式的检测装置1检测的结果的图。此外，作为亲水性溶剂42使用磷酸缓冲液，作为生物样本使用β-半乳糖苷酶(β-gal，β-galactosidase：10nM)，作为试剂使用FDG(4mM)。
图9A是用显微镜从上方观察微腔阵列的图像。从各容纳部8都发亮的情况可确认各容纳部8容纳有与试剂反应的生物样本。
图9B～图9D示出图9A中的A部分的检测装置1的检测结果。从结果可确认，随时间的经过荧光反应也在进行，伴随该反应，检测荧光反应的像素5也增加。
图10A是示出检测装置1的检测时间和检测强度的关系的图表。从结果可确认，根据本实施方式的检测装置1能够得到不逊于现有光学显微镜的结果(图10B)的检测结果。
(第二实施方式)
接着，参照图11说明根据本发明的第二实施方式的检测装置1。与所述第一实施方式相同的构成用相同的符号表示，为了简便省略其说明。
在本图中示出的检测装置50包括图像传感器2、干涉滤光片3(在本图中未示出)、主体52、微腔阵列4。
主体52由底面开口、顶面闭塞的筒状的部件构成。以堵住主体52的底面的方式设置图像传感器2。在图像传感器2上设置的微腔阵列4上形成有流路54。流路54通过各开口部10与微腔阵列4的各容纳部8连通。流路54和所有容纳部8被亲水性溶剂42填满。
在流路54的一端设置有疏水性溶剂共给部56。疏水性溶剂44容纳于疏水性溶剂供给部56内。在疏水性溶剂供给部56的主体52顶面设置有通过外力可弹性变形的变形部62。
在主体52的顶面上可装卸地设置有一对贯通孔58和盖部60，其中，所述一对贯通孔58使流路54和外部连通，所述盖部用于堵塞所述贯通孔58。主体52内部的高度A优选为疏水性溶剂44的油滴的大小以下。当内部高度A为油滴大小以下时，疏水性溶剂44和亲水性溶剂42不会混合并能够保持如本图所示的分离的状态。因此，不需要区分流路54和疏水性溶剂供给部56边界的部件。通常，在水中稳定的油滴大小约为100μm，因此内部高度A优选为100μm以下。
接着，说明具有上述结构的检测装置50的工作及效果。首先，如图11B所示，卸下盖部60，从一侧的贯通孔58向流路54内导入含有生物样本和试剂65的亲水性溶剂42。由此，试剂65容纳于各容纳部8内。
接着，从外部对疏水性溶剂供给部56的变形部62施加力，使变形部62弹性变形。通过该力，容纳于疏水性溶剂供给部56的疏水性溶剂44流入至流路54内，在各容纳部8形成被疏水性溶剂44覆盖的液滴，由此能够将生物样本封入到容纳部8内。
根据本实施方式的检测装置50，在导入含有生物样本和试剂65的亲水性溶剂42后，可通过一次性操作将生物样本封入到容纳部8内。因此，能够省略流入疏水性溶剂44的准备工作，从而能够更加简化检测作业。
此外，在本实施方式中，对不存在将流路54和疏水性溶剂供给部56的边界进行区分的部件的情况进行说明，但是本发明并不限定于此。例如，还可以在流路54和疏水性溶剂供给部56的边界设置隔壁。所述隔壁通过施加于变形部62的力可破裂。
由此，在流路54内导入含有生物样本和试剂65的亲水性溶剂42的步骤中，疏水性溶剂44通过隔壁可靠地容纳于疏水性溶剂供给部56内。并且，通过向变形部62施加力，所述施加力通过容纳于疏水性溶剂供给部56内的疏水性溶剂44传递至隔壁。在通过所传递的力隔壁发生破裂时，容纳于疏水性溶剂供给部56内的疏水性溶剂44流入至流路54内，在各容纳部8内形成被疏水性溶剂44覆盖的液滴，从而能够将生物样本封入到容纳部8内。
如此，通过在流路54和疏水性溶剂供给部56的边界设置隔壁，在向流路54内导入含有生物样本和试剂65的亲水性溶剂42的步骤中，也就是说，在试剂65容纳于各容纳部8的步骤中，能够可靠地防止疏水性溶剂44进入到流路54内，从而能够提高作业的可靠性。
(变形例)
本发明并不限定于上述实施方式，在本发明宗旨范围内，能够进行适当变更。
在所述第二实施方式中，对设置一对贯通孔58的情况进行说明，但是本发明并不限定于此，可以只设置一个贯通孔58。

Claims (7)

1.一种检测装置，包括：
微腔阵列，所述微腔阵列具有多个容纳部，在所述容纳部内填充含有生物样本的亲水性溶剂；
图像传感器，在所述图像传感器上与所述容纳部对应设置有像素，
其中，所述微腔阵列包括：
流路，所述流路与所述容纳部的开口部连通；
疏水性溶剂供给部，所述疏水性溶剂供给部与所述流路连续地设置；
贯通孔，所述亲水性溶剂通过所述贯通孔能够进出于所述流路，
所述疏水性溶剂供给部通过从外部施加的力使疏水性溶剂流入到所述流路中。
2.根据权利要求1所述的检测装置，其特征在于，在所述疏水性溶剂供给部和所述流路之间设置有通过所述力能够破裂的隔壁。
3.根据权利要求1或2所述的检测装置，其特征在于，所述疏水性溶剂供给部包括通过从外部施加的力能够弹性变形的变形部。
4.根据权利要求1至3中的任一项所述的检测装置，其特征在于，在所述流路内填充有不含所述样本的所述亲水性溶剂。
5.根据权利要求1至4中的任一项所述的检测装置，其特征在于，设置有能够开启和关闭的盖部，所述盖部堵塞所述贯通孔。
6.一种检测方法，包括：
在多个容纳部内填充含有生物样本的亲水性溶剂的工序；
向所述容纳部照射激励光的工序；
对于每个所述容纳部，用图像传感器检测所述样本的荧光反应的工序，
其中，填充所述亲水性溶剂的工序包括：
从所述容纳部的开口部流入所述亲水性溶剂的工序；
用疏水性溶剂堵塞所述开口部的工序。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，从所述开口部的斜上方照射所述激励光。
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