CN104606197A

CN104606197A - 一种化合物的抗肿瘤用途

Info

Publication number: CN104606197A
Application number: CN201410853312.7A
Authority: CN
Inventors: 程智
Original assignee: WUHU YANGYAN PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: WUHU YANGYAN PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2015-05-13

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种具有式(I)所示结构的化合物在制备用于预防或治疗与细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)有关的恶性肿瘤的药物中的用途。研究表明，本发明的化合物及其药学上可接受的盐对CDK2具有良好的抑制活性，具有显著抑制人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549和人肝癌细胞SMMC-7721生长的活性，能够阻断肿瘤细胞细胞周期并促进其凋亡，可以用于多种恶性肿瘤的治疗。

Description

一种化合物的抗肿瘤用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种化合物在制备用于预防或治疗与CDK2有关的恶性肿瘤的药物中的用途。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的顽疾之一，如何预防和治疗肿瘤已成为生物科学领域内主要研究的重大课题之一。传统的抗肿瘤药物在杀死肿瘤细胞的同时会杀死正常组织细胞，常常导致严重的副作用。近年来随着分子生物学、分子肿瘤学和分子药理学的发展，抗肿瘤药物的研究已由传统细胞毒药物向分子靶向抗肿瘤药物的方向发展。

研究发现多数恶性肿瘤的发生、发展均与细胞周期调控功能紊乱有关，而细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)的过度活化是导致紊乱的一个重要原因。

CDKs是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，其相对分子量在35kD到45KD之间(包含200到400个氨基酸)。人体中已经确认的CDK家族成员有13个(CDK1～13)，目前对CDKs的结构研究中，以CDK2的研究最为广泛。与其他激酶不同的是，单独的CDKs催化亚单位并无活性，只有与细胞周期蛋白(cyclins)结合后形成的复合物才能够表现出蛋白激酶的活性。具有活性的CDK/cyclin复合物根据不同的cyclin催化亚基催化不同的底物磷酸化，从而驱动细胞完成由G1-S-G2-M各期的转换过程，依序完成DNA的合成和有丝分裂，促进细胞的生长和增殖。同时，CDKs也能与CDKs抑制因子(CDI)结合发挥负调节作用，抑制细胞周期进程，阻止细胞分裂。

据报道，超过90％的人类肿瘤细胞中存在Rb蛋白激酶通路的变异。这些变异和表达失调与CDK2、CDK4、CDK6、cyclin D、Rb蛋白和p16基因家族等的表达水平变化有关。在食管鳞状细胞癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、口腔癌、乳腺癌等癌细胞中，CDK1的表达明显高于正常组织细胞，且多数与Cyclin B1的表达成正相关。CDK2和CDK4在肝癌、胰腺癌、卵巢癌等癌细胞中都有高表达。CDK6基因染色体易位及基因扩增均可导致CDK6过度表达，淋巴瘤、神经胶质瘤及鳞癌被认为与此相关。由于CDKs在调节肿瘤细胞的增殖与凋亡中起关键作用，通过选择性地抑制肿瘤组织中CDKs的活性，可以对肿瘤等恶性增生性疾病的治疗起到积极的作用，所以对CDKs小分子抑制剂的筛选与研究已成为肿瘤治疗和开发新型化疗药物的热点领域之一。近两年来，CDKs抑制剂在临床研究上取得了突破性的进展。2013年4月，由于在乳腺癌的临床试验中的良好表现，辉瑞公司研发的CDK4/6抑制剂PD-0332991获得FDA重大突破药物认定，目前已进入III期临床，有望在2015年获批上市。因此，开发新型的CDKs小分子抑制剂具有广阔的前景。

发明内容

本发明的目的在于，提供具有式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐的医疗用途，尤其是在预防或治疗CDK2参与介导的疾病，特别是恶性肿瘤的药物中的用途。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

本发明提供了一种具有式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗与CDK2有关的恶性肿瘤的药物中的用途，

其中R¹、R²各自独立地表示氢、烷基、氰基、卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基；

Ar选自苯基，其中苯基可任选被一个或多个R³取代，R³可以是氢、烷基、氰基、卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基；

烷基为具有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃基；或为具有3-6个碳原子的环状饱和烃基；或为连接具有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃基的具有3-6个碳原子的环状饱和烃基；

卤素为选自氟、氯、溴或碘的取代基；

卤代烷基为具有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃基，或为具有3-6个碳原子的环状饱和烃基，或为连接具有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃基的具有3-6个碳原子的环状饱和烃基；其中一个或多个碳原子被一个或多个卤原子取代；

烷氧基为具有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃基；或为具有3-6个碳原子的环状饱和烃基；或为连接具有1-6个碳原子的直链或支链饱和烃基的具有3-6个碳原子的环状饱和烃基；其中各碳原子任选被氧取代。

优选的，本发明提供的化合物为：

N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-苯甲酰胺(I-1)

N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-4-氯苯甲酰胺(I-2)

N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-4-氟苯甲酰胺(I-3)

N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-4-甲氧基苯甲酰胺(I-4)

N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-4-三氟甲基苯甲酰胺(I-5)

N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-2,6-二氯苯甲酰胺(I-6)

N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-2,6-二氟苯甲酰胺(I-7)

N-(3-(6-(2-5-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-2,6-二氯苯甲酰胺(I-8)

N-(3-(6-(2-6-甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-2,6-二氯苯甲酰胺(I-9)。

上述化合物药学上可接受的盐是化合物与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸或琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸、杏仁酸等形成的酸加成盐。

本发明利用上述化合物(I-1)～化合物(I-9)及其药学上可接受的盐作为活性成分，单独或组合使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的用于恶性肿瘤治疗的药物。

在治疗恶性肿瘤中，用本发明的化合物，以常规的制剂工艺，单独使用或与其他药物配合制备成在临床上可以使用的各种不同剂型的药物。如：注射剂、散剂、丸剂、胶囊剂、片剂、微囊剂、软胶囊剂、膜剂、栓剂、膏剂、酊剂、冲剂、气雾剂等各种制剂。

体外激酶测试结果表明，本发明的化合物及其药学上可接受的盐对CDK2具有良好的抑制活性。因此，本发明的化合物及其药学上可接受的盐可以用于治疗与CDK2有关的恶性肿瘤。所述恶性肿瘤是黑色素瘤、肝癌、肾癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、胃肠道癌或间皮瘤。

体外肿瘤细胞测试结果表明，本发明的化合物及其药学上可接受的盐具有显著抑制人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549和人肝癌细胞SMMC-7721生长的活性，能够阻断肿瘤细胞细胞周期并促进其凋亡，可以用于多种恶性肿瘤的治疗。

具体实施方式

通过以下实施例进一步说明本发明，以下实施例仅用于更具体说明本发明的优选实施方式，不用于对本发明的技术方案进行限定。

实施例1

N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)苯甲酰胺(I-1)的制备

(1)2-((2-5-硝基吡啶基)氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶的制备

在500ml三颈瓶中加入2-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶15.3g(100mmol)、2-羟基-5-硝基吡啶15.4g(110mmol)、碳酸铯65.2g(200mmol)、碘化亚铜0.2g和无水DMF200ml。升温至75℃搅拌3h后冷却至室温，将反应液缓慢倒入1000ml水中，析出大量灰色固体。静置，抽滤，滤饼用50ml水洗涤，60℃真空干燥得2-((2-5-硝基吡啶基)氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶22g，收率86％。MS[M+H]+258.1。

(2)2-((2-5-氨基吡啶基)氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶的制备

在装有氢气袋的500ml单颈瓶中加入2-((2-5-硝基吡啶基)氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶22g、10％钯碳2.2g和甲醇350ml。氢气抽排三次，室温反应。TLC监测原料消失，过滤，滤液减压浓缩得到2-((2-5-氨基吡啶基)氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶粗品20g，收率91％。MS[M+H]+228.1。

(3)N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)苯甲酰胺的制备

在50ml单颈瓶中加入2-((2-5-氨基吡啶基)氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶91mg(0.4mmol)、苯甲酸61mg(0.5mmol)、1-羟基苯并三唑(HOBt)54mg(0.4mmol)、、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)96mg(0.5mmol)和无水DMF10ml。室温反应，TLC监测原料消失，将反应液倒入50ml水中，析出白色固体。静置，抽滤，滤饼粗品经柱层析(流动相：甲醇/二氯甲烷＝1/20)得化合物(I-1)95mg，收率72％。MS[M+H]+332.1。

1H-NMR[300MHz,DMSO-d6]:δ6.5(1H,d,J＝7.4Hz,Pyridine),6.7(1H,s,Pyridine),6.9(2H,d,ArH),7.1(1H,d,J＝7.4Hz,Pyridine),7.5(3H,m,ArH),7.6(1H,s,ArH),8.1(2H,d,ArH),9.0(1H,s,ArH),9.2(1H,s,-NHCO-)

化合物(I-2)～化合物(I-9)的制备方法类似于化合物(I-1)。

实施例2

化合物(I-1)～化合物(I-9)对CDK2的抑制活性测试

采用荧光共振能量转移(FRET)法测试本发明化合物对CDK2/cyclin A激酶的抑制活性，阳性对照药为AZD5438。

具体测试方法：CDK2/cyclin A用激酶稀释液稀释至合适浓度后使用。激酶反应混合物中含CDK2/cyclin A、peptide substrate、HEPES(pH7.5)、BRIJ-35、MgCl₂和EDTA。CDK2phospho-peptide substrate用作100％磷酸化对照，不加ATP用作0％磷酸化对照。室温下反应1h后，向反应体系中加入适度稀释的Development Reagent A。室温下继续反应1h，加入Stop Reagent中止反应。激发波长400nm，同时检测波长为445nm(coumarin)和520nm(fluorescein)的荧光强度。用如下公式计算受试化合物抑制率，抑制百分率％＝(1-测试组磷酸化率/对照组磷酸化率)×100％。用量效关系软件计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

测试结果如下表所示：

化合物	IC₅₀(μM)	化合物	IC₅₀(μM)
				I-1	0.85	I-6	0.12
I-2	0.46	I-7	0.15
				I-3	0.23	I-8	0.28
I-4	2.35	I-9	0.25
				I-5	1.58	AZD5438	0.06

实施例3

化合物(I-1)～化合物(I-9)体外肿瘤细胞抑制活性测试

采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法测试本发明化合物对体外肿瘤细胞增殖的抑制活性，所选细胞株为人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549和人肝癌细胞SMMC-7721，阳性对照药为AZD5438。

测试时，取处于指数生长期、状态良好的细胞一瓶，消化计数后调至所需密度接种于96孔细胞培养板中，培养24h后，加入不同浓度的待测化合物，同时设阳性对照药组及溶剂对照组，每个药物浓度设3平行孔。药物作用细胞72h后，弃去培养液，每孔加入MTT(0.5mg/ml)液100μl，继续培养4h，弃去MTT液，每孔加入DMSO150μl，混和振荡器振荡，于酶标仪570nm波长处测定吸光度值。用如下公式计算细胞的存活率，细胞抑制率％＝(阴性对照组OD值－化合物组OD值)/(阴性对照组OD值)×100％。用量效关系软件计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

测试结果如下表所示：

Claims

1.一种具有式(I)所示结构的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗与细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)有关的恶性肿瘤的药物中的用途，

卤素为选自氟、氯、溴或碘的取代基；

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，具有式(I)所示结构的化合物是如下化合物任一：

N-(3-(6-(2-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶基)氧基)吡啶基)-苯甲酰胺(I-1)

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其中药学上可接受的盐是化合物与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸或琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸、杏仁酸等形成的酸加成盐。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，与CDK2有关的恶性肿瘤是黑色素瘤、肝癌、肾癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、皮肤癌、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、胃肠道癌或间皮瘤。