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CN104603269A - 用于在丝状真菌菌株中共沉默基因表达的方法及其应用 - Google Patents

用于在丝状真菌菌株中共沉默基因表达的方法及其应用 Download PDF

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CN104603269A
CN104603269A CN201380043346.3A CN201380043346A CN104603269A CN 104603269 A CN104603269 A CN 104603269A CN 201380043346 A CN201380043346 A CN 201380043346A CN 104603269 A CN104603269 A CN 104603269A
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CN
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target gene
polynucleotide
transcribed
filamentous fungal
homology
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CN201380043346.3A
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H·布罗迪
E·里卡乔
寺本宽
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Novo Nordisk AS
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Novo Nordisk AS
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Abstract

本发明涉及通过转移性RNA干扰在丝状真菌菌株中共沉默基因表达的方法。本发明还涉及用于鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法。

Description

用于在丝状真菌菌株中共沉默基因表达的方法及其应用
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及用于在丝状真菌菌株中共沉默基因表达的方法。本发明还涉及使用此类共沉默方法在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法。
相关技术说明
丝状真菌菌株被广泛用于生产具有商业价值的生物物质。然而，具有令人希望的生物物质表达和分泌性状的丝状真菌菌株可能并不一定具有用于成功发酵的最令人希望的特征。生物物质的产生可能伴随其他物质(例如，降解生物物质或与生物物质共纯化的酶)的产生，这些其他物质可以复杂化该生物物质的使用。
这些问题的一种解决方案是使参与生产不令人希望的物质的一个或多个基因失活。可以使用本领域熟知的方法通过缺失或破坏一个或多个基因来完成失活。然而，在一些情况下，由于对基因组同源区的靶向性差，基因失活可能是困难的。也可以通过随机诱变完成失活，随机诱变并不总是特异性地针对预期的靶基因并且其他突变经常被引入进宿主生物中。在其他情况下，该基因及其产物可以是该丝状真菌菌株的存活所必需的。在多基因有待通过缺失或破坏来失活的情况下，任务就变得相当麻烦且耗时。此外，当存在高度同源的基因家族成员时，所有成员的缺失或破坏就显得非常烦琐与困难。
近年来，已经描述了不同形式的表观遗传基因调节(塞尔克(Selker)，1997，遗传学趋势(Trends Genet.)13:296-301；马特兹科(Matzke)和马特兹科，1998，细胞与分子生命科学(Cell.Mol.Life.Sci.)54:94-103)。这些方法经由微RNA(莫雷尔(Morel)等人，2000，当代生物学(Curr.Biol.)10:1591-1594；拜里斯(Bailis)和福斯伯格(Forsburg)，2002，基因组生物学(Genome Biol.)3，综述1035；格雷瓦尔(Grewal)和莫埃塞德(Moazed)，2003，科学(Science)301:798-802)调节信使RNA的水平来影响基因表达(哈蒙德(Hammond)和鲍尔库姆比(Baulcombe)，1996，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)32:79-88；Xi-song Ke(习松柯)等人，2003，化学生物学当前观点(Current Opinion in Chemical Biology)7:516-523)。
基于黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫的遗传研究，RNA干扰(RNAi)，(在植物中)也称为转录后基因沉默，被理解为通过组装靶向同源RNA导致其降解的蛋白-RNA效应核酸酶复合物而参与基因的沉默表达(汉农(Hannon)，2002，自然(Nature)418:244-251)。双链RNA(dsRNA)变为小干扰RNA(siRNA)的加工是由称为切酶(Dicer)的酶家族完成的(伯恩斯坦(Bernstein)等人，2001，自然(Nature)409:363)。切酶是特异性切割dsRNA的核酸内切酶RNase III家族成员，负责将dsRNA消化成范围从20-25个核苷酸的siRNA(巴希尔(Elbashir)等人，2001，自然(Nature)411:494)。这些siRNA然后与RNA诱导性沉默复合物(RISC)结合(巴希尔(Elbashir)等人，2001，基因与发育(Genes and Dev.)15:188；尼坎宁(NyKanen)等人，2001，细胞(Cell)197:300；哈蒙德(Hammond)等人，2001，科学(Science)293:1146)。尽管尚未很好理解，RISC靶向mRNA(反义片段来源于其)，随后对mRNA进行内切和外切核酸酶消化，从而有效地沉默该基因的表达。已经在植物、线虫、昆虫、哺乳动物以及丝状真菌中展示了RNAi(马特兹科(Matzke)和马特兹科，1998，同上；肯尼德尔(Kennerdell)等人，2000，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)18:896-8；鲍施尔(Bosher)等人，1999，遗传学(Genetics)153:1245-56；福尔胡弗(Voorhoeve)和阿加米(Agami)，2003，生物技术趋势(Trends Biotechnol.)21:2-4；麦卡弗里(McCaffrey)等人，2003，自然生物技术21:639-44；WO 03/050288；WO 01/49844；WO 98/53083；以及WO 05/056772)。
转移性RNAi(transitive RNAi)是指沉默信号运动超过一个具体基因。在植物中，已经发现转移性沉默(transitive silencing)发生于被双链RNA靶向基因沉默的mRNA的上游和下游两者(费比安(Fabian)等人，2002，植物细胞(Plant Cell)14:857-867；加西亚-佩雷斯(Garcia-Perez)等人，2004，植物杂志(The Plant Journal)38:594-602；维斯蒂姆(Vaistij)等人，2002，植物细胞(The Plant Cell)14:857-867；范胡特(Van Houdt)等人，2003，植物生理学(Plant Physiol.)131:245-253)。在秀丽隐杆线虫中，已经将转移性RNAi描述为沉默dsRNA诱导物的上游转录本(阿尔德(Alder)等人，2003，RNA杂志(RNA J.)9:25-32；汉农(Hannon)，2002，自然(Nature)418:244-251；斯珍(Sijen)等人，2001，细胞(Cell)107:465-476)。在秀丽隐杆线虫中，转移性RNAi的描述指示除来源于dsRNA诱导物的siRNA之外，还产生了与5'侧翼序列享有同源性的次级RNA，大概是RNA依赖型RNA聚合酶(RdRP)和切酶活性的结果(布雷(Bleys)等人，2006，RNA杂志(RNA J.)12:1633-1639；彼得森(Petersen)等人，2005，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)58:575-583)。转移性RNAi并不遍在于昆虫和哺乳动物之间(齐(Chi)等人，2003，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)100:6343-6346；华(Hoa)等人，2003，昆虫生物化学与分子生物学(Insect Biochemistry andMolecular Biology)33:949-957；罗伊格那米特(Roignamt)等人，2003，RNA杂志(RNA J.)9:299-308)。
转移性RNAi不同于常规RNAi。尽管双链RNA作为RNAi和转移性RNAi两者的诱导物，转移性RNAi似乎需要RdRP，而单独的RNAi不需要RdRP。因此，在展示出转移性RNAi的生物中，基因沉默并不受限于双链RNA的边界，并且基因沉默可以延伸进侧翼序列中。然而，在缺乏转移性RNAi的生物中，基因沉默被约束在双链区内。常规和转移机制两者的RNA干扰都可以产生其中的靶基因的表达被部分或完全抑制的菌株(布洛迪(Brody)和买玉兰(Maiyuran)，2009，工业生物技术(Industr.Biotechnol.)5:53-60；费尔南德斯(Fernandez)等人，2012，真菌遗传学与生物学(Fungal Genet.Biol.)49:294-301)。
给出针对丝状真菌菌株的菌株改良与改进、功能基因组学和途径工程而沉默多于一个基因的表达的替代方法在本领域中将是一种优势。克服先前的丝状真菌RNAi方法的一种局限性，即如何鉴定其中的基因沉默最有效的菌株/转化体，在本领域中也将是一种优势。
本发明涉及用于在丝状真菌菌株中沉默多于一个基因的表达的方法以及使用表型标记的沉默来鉴定其中的靶基因沉默是最有效的转化体的方法。
发明概述
本发明涉及用于在丝状真菌菌株中共沉默编码生物物质的基因的表达的方法，包括：
(a)向该丝状真菌菌株的基因组中插入一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；并且其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且
(b)通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达。
本发明还涉及丝状真菌菌株，这些丝状真菌菌株包括一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达。
本发明还涉及用于产生感兴趣的生物物质的方法，包括：
(a)在有助于产生该感兴趣的生物物质的条件下培养一种丝状真菌菌株，其中该丝状真菌菌株包括一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；其中通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为包括有待被沉默的靶基因的序列的siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达；并且其中该丝状真菌菌株包括一个编码该感兴趣的生物物质的第四多核苷酸；并且任选地
(b)从培养基中回收该感兴趣的生物物质。
本发明还涉及用于在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法，包括：
(a)用一个双链可转录核酸构建体转化一个群体的丝状真菌宿主细胞，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中该双链可转录核酸构建体插入该丝状真菌宿主细胞的基因组中；
(b)通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌宿主细胞的转化群体在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌宿主细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达；
(c)从该转化的丝状真菌宿主细胞群体中选择展现出表型改变的转化体；
(d)通过测量相对于由该丝状真菌宿主细胞产生的该生物物质的水平的由每个转化体产生的该生物物质的水平，对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选，该表型改变针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默；并且任选地
(e)分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。
本发明还涉及用于在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法，包括：
(a)用一个来自该丝状真菌细胞的DNA文库转化该丝状真菌细胞的一个群体，其中将该DNA文库的每个成员都克隆进一个双链可转录核酸构建体中，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括该DNA文库的一个成员作为与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的一个第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中该双链可转录核酸构建体插入该丝状真菌细胞的基因组中；
(b)通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌细胞的转化群体在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达；
(c)从该转化的丝状真菌细胞群体中选择展现出表型改变的转化体；
(d)通过测量相对于由该丝状真菌细胞产生的该生物物质的水平的由每个转化体产生的该生物物质的水平，对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选，该表型改变针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默；并且任选地
(e)分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。
本发明还涉及以下双链可转录核酸构建体，这些构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。
本发明还涉及以下双链可转录核酸构建体，这些构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。
附图说明
图1示出了pEvFz34的限制性图谱。
图2示出了pEvFz35的限制性图谱。
图3示出了pEvFz36的限制性图谱。
图4示出了pHiTe48的限制性图谱。
图5A和5B示出了白色孢子黑曲霉转化体相对于野生型对照菌株黑曲霉C2111和黑曲霉M1137的淀粉葡糖苷酶活性。
图6示出了具有减少的淀粉葡糖苷酶活性的黑曲霉转化体的SDS-PAGE分析。
图7A和7B示出了由将对照质粒pEvFz36引入黑曲霉M1137中形成的10个白色孢子黑曲霉相对于黑曲霉菌株C2111的淀粉葡糖苷酶活性。
图8A和8B示出了与所选白色孢子转化体以及对照菌株黑曲霉C2111、黑曲霉M1137和黑曲霉C1650相比，黑曲霉转化体48-b2和E36-w9的淀粉葡糖苷酶活性和SDS-PAGE分析。
图9示出了pEvFz49的限制性图谱。
图10示出了pEvFz51的限制性图谱。
图11示出了pEvFz54的限制性图谱。
图12示出了pEvFz55的限制性图谱。
图13A和13B示出了从每种质粒形成的10个白色孢子米曲霉转化体相对于对照菌株米曲霉DSY10的漆酶活性。
图14示出了pHiTe43的限制性图谱。
图15示出了pHiTe49的限制性图谱。
图16A和16B示出了与对照菌株黑曲霉菌株JoanTc3相比，18个fcy1-抗性转化体的淀粉葡糖苷酶测定结果。
定义
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
基因共沉默：术语“基因的共沉默”意指减少(抑制)或消除(失活)两个或更多个(例如，若干个)基因的表达。在一个方面中，至少两个基因被沉默。在另一个方面中，至少三个基因被沉默。在另一个方面中，至少四个基因被沉默。在另一个方面中，至少五个基因被沉默。在另一个方面中，两个基因被沉默。在另一个方面中，三个基因被沉默。在另一个方面中，四个基因被沉默。在另一个方面中，五个基因被沉默。
DNA文库：术语“DNA文库”意指DNA分子的集合。DNA分子可以包括生物的全部或部分遗传材料。没有限制，DNA分子可以来源于基因组DNA、cDNA、合成DNA、PCR产物等，其可以被限制性内切酶消化或剪切。优选将DNA分子克隆进一个或多个载体中。表示整个基因组的集合被叫做基因组文库。表示随机突变体的集合被叫做随机突变体文库。由细胞产生的信使RNA的DNA拷贝的杂集被称为互补DNA(cDNA)文库。DNA文库还可以是随机的或特异的。随机DNA文库是一种具有等价概率的文库：大多数(如果不是全部)DNA片段可以插入克隆载体，这样使得完整表示大多数(如果不是全部)的包括起始材料的DNA序列。特异DNA文库包括编码相关功能(例如，转录因子、蛋白激酶、膜运输蛋白、次级代谢产物等)的DNA分子的子集。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种多肽的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹(Southern blotting)程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
同源性：术语“同源性”意指超过有义链和反向互补链上的对应核苷酸的最低数目，这些对应核苷酸可以经历这些链退火所必需的沃森-克里克碱基配对。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
杂合启动子：术语“杂合启动子”意指两个或更多个启动子的部分，这些部分融合在一起以生成该两个或更多个启动子部分的融合的序列，当可操作地连接至编码序列时，该杂合启动子介导将编码序列转录为mRNA。
分离的：术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其天然相关联的一种或多种(例如，若干种)或所有天然存在的成分中去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于在自然界中发现的那种物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多个拷贝；以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。
低严谨度条件：术语“低严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针来说，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终
中严谨度条件：术语“中严谨度条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切和变性的鲑精DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。
中-高严谨度条件：术语“高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。
突变启动子：术语“突变启动子”意指具有包括亲本启动子的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的取代、缺失和/或插入的核苷酸序列的启动子，其中该突变启动子具有比该对应的亲本启动子强或弱的启动子活性。术语“突变启动子”还涵盖天然突变体和使用本领域已知的方法(例如经典诱变、定点诱变和DNA改组)而在体外产生的突变体。
无有效同源性：术语“无有效同源性”意指少于有义链和反向互补链上的对应核苷酸的最低数目，这些对应核苷酸可以经历这些链退火所必需的沃森-克里克碱基配对并且包括优选小于20个、更优选小于15个、甚至更优选小于10个、最优选小于5个连续核苷酸，并且甚至最优选没有连续核苷酸与靶基因的序列相同。在一个方面中，有义链和反向互补序列上的对应核苷酸不具有与靶基因的序列相同的连续核苷酸。在另一个方面中，有义链和反向互补序列上的对应核苷酸具有小于20个核苷酸与靶基因的序列相同。在另一个方面中，有义链和反向互补序列上的对应核苷酸具有小于15个核苷酸与靶基因的序列相同。在另一个方面中，有义链和反向互补序列上的对应核苷酸具有小于10个核苷酸与靶基因的序列相同。在另一个方面中，有义链和反向互补序列上的对应核苷酸具有小于5个核苷酸与靶基因的序列相同。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链亦或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或者以一种否则将不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包括一个或多个(例如，若干个)控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。
表型标记：术语“表型标记”意指被沉默后基因为宿主细胞赋予可以容易地鉴定、筛选或选择的可观察到的特征或性状。换言之，表型标记包括选择性标记和筛选标记两者。选择性标记的非限制性实例包括对药物或有毒代谢产物的抗性或在特定营养素上生长或缺乏成长，而筛选标记的非限制性实例包括改变菌落或孢子颜色或菌落形态的基因。在此描述了其他标记。
表型改变：术语“表型改变”意指将其与亲本或参比菌株区分的菌株的可观察到的特征或性状的改变。表型改变由表型标记的沉默引起。
启动子：术语“启动子”意指结合RNA聚合酶并引导聚合酶至编码生物物质的核酸序列的正确下游转录起始位点，从而引发转录的DNA序列。RNA聚合酶有效地催化与适当的编码区DNA链互补的信使RNA的装配。术语“启动子”还将被理解为包括用于在转录为mRNA之后进行翻译的5'非编码区(在启动子和翻译起始之间)、顺式作用转录调控元件(例如增强子)以及能够与转录因子相互作用的其他核苷酸序列。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology OpenSoftware Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用–非简化(nobrief)选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长一致性”的尼德尔的输出(使用–非简化(nobrief)选项获得)被用作百分比一致性并且被计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
短干扰RNA：术语“短干扰RNA”或“siRNA”意指20-25个核苷酸长的双链RNA片段，双链RNA的切酶或切酶样介导的消化的产物。
沉默：术语“沉默”意指减少(抑制)或消除(失活)基因的表达。
串联启动子：术语“串联启动子”意指两个或更多个串联排列的启动子序列，这些启动子序列可操作地连接至编码序列用于介导编码序列转录为mRNA。
转移性RNA干扰：术语“转移性RNA干扰”或“转移性RNAi”意指沉默信号运动超过一个具体基因。在转移性RNAi中，双链RNA(dsRNA)可以作为用于合成新dsRNA的模板，由此与靶序列享有同源性的siRNA引起新序列沿着mRNA的沉默的延伸或扩展。
转移性沉默的靶序列：短语“转移性沉默的靶序列”意指用于基因沉默的指定dsRNA序列，其中该dsRNA序列是由邻接序列引起的siRNA延伸的结果。
两个在相反方向上彼此互补的区段：短语“两个在相反方向上彼此互补的区段”意指若干DNA延伸或片段之一，其与他者配合以构成一个整体并且能够经历沃森-克里克碱基配对，具有形成发夹DNA结构的潜力。
非常高严谨度条件：术语“非常高严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
非常低严谨度条件：术语“非常低严谨度条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.2X SSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。
发明详细说明
本发明涉及用于在丝状真菌菌株中共沉默编码生物物质的基因的表达的方法，包括：(a)向该丝状真菌菌株的基因组中插入一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；并且其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且(b)通过以下产生包括有待被沉默的靶基因的序列的短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达。
在一个方面中，该双链可转录核酸构建体进一步包括至少一个另外的多核苷酸，该至少一个另外的多核苷酸包括一个与编码另外的生物物质的另外的靶基因具有同源性的可转录区。该至少一个另外的多核苷酸也可操作地连接至该启动子并且位于该第三多核苷酸的3’的任何位置。在另一个方面中，该至少一个另外的多核苷酸是一个多核苷酸。在另一个方面中，该至少一个另外的多核苷酸是两个多核苷酸。在另一个方面中，该至少一个另外的多核苷酸是三个多核苷酸。在另一个方面中，该一个另外的多核苷酸是一个第一另外的多核苷酸，该第一另外的多核苷酸包括一个与编码第一另外的生物物质的第一另外的靶基因具有同源性的第一另外的可转录区。在另一个方面中，该一个另外的多核苷酸是一个第二另外的多核苷酸，该第二另外的多核苷酸包括一个与编码第二另外的生物物质的第二另外的靶基因具有同源性的第二另外的可转录区。在另一个方面中，该一个另外的多核苷酸是一个第三另外的多核苷酸，该第三另外的多核苷酸包括一个与编码第三另外的生物物质的第三另外的靶基因具有同源性的第三另外的可转录区。在另一个方面中，这些另外的多核苷酸中的一个或多个(例如，若干个)选自下组，该组由以下各项组成：一个第一另外的多核苷酸，包括一个与编码第一另外的生物物质的第一另外的靶基因具有同源性的第一另外的可转录区；一个第二另外的多核苷酸，包括一个与编码第二另外的生物物质的第二另外的靶基因具有同源性的第二另外的可转录区；以及一个第三另外的多核苷酸，包括一个与编码第三另外的生物物质的第三另外的靶基因具有同源性的第三另外的可转录区。
包括本发明的双链可转录核酸构建体的转化体产生以下转录产物，这些转录产物由3’侧翼为反向重复序列(IR)的靶标区段构成，该反向重复序列与靶基因无有效同源性。利用RNA依赖型RNA聚合酶(RdRP)，自5'IR边界的上游合成siRNA。使用尚未完全理解的机制完成靶序列的渗入。证据表明通过IR的折叠与退火产生的双链RNA(dsRNA)被切酶加工，从而产生与该IR具有共享同源性的siRNA。这些siRNA作为RdRP的引物用于邻接靶序列的继续延伸(梅瑟西亚德(Moissiard)等人，2007，RNA 13:1268-1278)。可替代地，RdRP被吸引或引导至dsRNA，从而起始自IR的上游从头合成siRNA(梅瑟西亚德(Moissiard)等人，2007，同上)。在此意识到的是，一个siRNA可以足以沉默两个靶基因，如果这两个靶基因直接彼此相邻或在彼此的10kb内，例如7.5kb内、5kb内、2.5kb内、1kb内或0.5kb内。另一方面，如果靶基因未在彼此的10kb内，则需要单独的siRNA沉默每个靶基因。
本发明的方法为丝状真菌菌株的菌株改良与改进、功能基因组学和途径工程提供了新的机会。例如，本发明方法可以通过基因操作和途径工程用作丝状真菌宿主菌株改良的工具，或本发明方法可以作为耗时且成功率并不稳定的基因敲除方法的替代方法。基因可以对通过本领域已知的标准方法(例如基因敲除)所产生的失活产生抗性。本发明的方法为沉默多基因的表达提供了一种解决方案。基因敲除依赖于位点特异性基因置换。在真菌中，此方法的效力受染色体基因座、由置换构建体和基因组共享的DNA序列和/或共享的同源性的长度影响。获得如在此描述的多基因的转移性基因沉默唯一依赖于将靶序列的部分克隆在包括反向重复序列的序列的上游。这些方法对用于在特定丝状真菌菌株中沉默高度表达的基因而言也是特别有用且有效的，这在例如作为生产宿主的生物的改良中可以是非常重要的。此能力展示了本发明的方法的强大。
这些方法对沉默高度相互同源的多个基因的表达也是有用的，尤其是同一家族的基因或生物合成或代谢途径中的同源基因。术语“高度同源的”意指同源基因之间的序列一致性程度为至少75％，例如至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。出于本发明的目的，如在此定义地确定两个核酸序列之间的序列一致性程度。
这些方法是进一步有用的，因为操作这些方法能可变地减少多种生物物质的表达。在编码生物物质的基因的完全敲除对于特定丝状真菌菌株将是致死的情况下，例如在流入感兴趣的生物合成途径的次级途径中，此可变性是尤其重要的。
在本发明的方法中，该第一多核苷酸包括一个与第一靶基因具有同源性的第一可转录区。该第二多核苷酸包括一个与第二靶基因具有同源性的第二可转录区。该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区，其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段。该第一另外的多核苷酸包括一个与第一另外的靶基因具有同源性的第一另外的可转录区。该第二另外的多核苷酸包括一个与第二另外的靶基因具有同源性的第二另外的可转录区。该第三另外的多核苷酸包括一个与第三另外的靶基因具有同源性的第三另外的可转录区。
以下多核苷酸可以被或可以不被多核苷酸间插序列隔开：该第一多核苷酸，包括一个与该第一靶基因具有同源性的第一可转录区；该第二多核苷酸，包括一个与该第二靶基因具有同源性的第二可转录区；和该第三多核苷酸，包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；以及这些另外的多核苷酸。该多核苷酸间插序列是一个与该双链可转录核酸构建体中的该第一、第二和第三多核苷酸无有效同源性的核苷酸序列。该双链可转录核酸构建体的这些多核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成源的多核苷酸序列，或其任何组合。
在一个方面中，该第一和第二多核苷酸被一个多核苷酸间插序列隔开。在另一个方面中，该第二和第三多核苷酸被一个多核苷酸间插序列隔开。在另一个方面中，该第一、第二和第三多核苷酸被多核苷酸间插序列隔开。以上方面的每个方面都可以进一步包括如以上所描述的一个或多个(例如，若干个)另外的多核苷酸的任何组合。该多核苷酸间插序列优选由少于150个核苷酸，例如少于100个核苷酸、少于60个核苷酸、少于40个核苷酸、少于20个核苷酸或少于10个核苷酸组成。
在另一个方面中，该第一和第二多核苷酸未被一个多核苷酸间插序列隔开。在另一个方面中，该第二和第三多核苷酸未被一个多核苷酸间插序列隔开。在另一个方面中，该第一、第二和第三多核苷酸未被多核苷酸间插序列隔开。以上方面的每个方面都可以进一步包括如以上所描述的一个或多个(例如，若干个)另外的多核苷酸的任何组合。
该多核苷酸间插序列可以是与该第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸、以及这些另外的多核苷酸中的一个或多个无有效同源性的任何核苷酸序列，并且优选与该丝状真菌菌株的基因组中的序列无有效同源性。
根据本发明的共沉默多个基因的能力提供了如下所述的若干用途，以将双链可转录核酸构建体用作选择系统在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因。该选择系统可以被用于筛选丝状真菌细胞的感兴趣的基因。该选择系统还可以被用于针对感兴趣的基因筛选对丝状真菌细胞天然的DNA文库。
本发明还涉及用于在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法，包括：(a)用一个双链可转录核酸构建体转化一个群体的丝状真菌宿主细胞，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中该双链可转录核酸构建体插入该丝状真菌宿主细胞的基因组中；(b)通过以下产生包括有待被沉默的靶基因的序列的短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌宿主细胞的转化群体在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌宿主细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达；(c)从该转化的丝状真菌宿主细胞群体中选择展现出表型改变的转化体；(d)通过测量相对于由该丝状真菌宿主细胞产生的该生物物质的水平的由转化体产生的该生物物质的水平，对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选，该表型改变针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默；并且任选地(e)分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。
在步骤(a)中，用一个双链可转录核酸构建体转化丝状真菌宿主细胞的一个群体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段。转化进该丝状真菌宿主细胞后，该双链可转录核酸构建体插入该丝状真菌宿主细胞的基因组中。转录后，将该第一、第二和第三可转录区转录为一个单链RNA分子。
在步骤(b)中，短干扰RNA(siRNA)(包括对应于有待被沉默的靶基因的部分双链RNA序列)的产生通过以下来完成:将该丝状真菌宿主细胞的转化群体在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA。这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌宿主细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达。如以上提及的，在此意识到的是，一个siRNA可以足以沉默两个靶基因，如果这两个靶基因直接彼此相邻或在彼此的10kb内，例如7.5kb内、5kb内、2.5kb内、1kb内或0.5kb内。另一方面，如果靶基因未在彼此的10kb内，则需要单独的siRNA沉默每个靶基因。
在步骤(c)中，基于表型改变，从该转化的丝状真菌宿主细胞群体中选择转化体。
在步骤(d)中，通过测量相对于由该丝状真菌宿主细胞产生的该生物物质的水平的由每个转化体产生的该生物物质的水平，对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选，该表型改变针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默。可以使用本领域已知的方法测量产生的该生物物质的水平。此类方法包括但不限于，特异性抗体、高效液相层析、毛细管层析、酶产物的形成、酶底物的消失、SDS-PAGE、荧光、RNA印迹杂交或RT-PCR。在该第二靶基因的沉默引起生长特征改变的情况下，可以使用本领域已知的替代方法，这些生长特征改变是例如改变的形态或对药物、抗代谢物、金属以及其他有毒化合物敏感性的增加/减少。
在步骤(e)中，任选地分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。可以从转化体或该丝状真菌宿主细胞中分离靶基因。用于分离或克隆基因的技术是本领域已知的并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备、或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)实现从此类基因组DNA中克隆基因。参见例如，英尼斯(Innis)等人，1990，PCR方案：方法与应用指南(PCR Protocols:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。用于进行该第二靶基因的PCR的寡核苷酸可以基于该第二可转录区的核苷酸序列。
本发明还涉及用于在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法，包括：(a)用一个来自该丝状真菌细胞的DNA文库转化该丝状真菌细胞的一个群体，其中将该DNA文库的每个成员都克隆进一个双链可转录核酸构建体中，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括该DNA文库的一个成员作为与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的一个第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中该双链可转录核酸构建体插入该丝状真菌细胞的基因组中；(b)通过以下产生包括对应于有待被沉默的靶基因的部分双链RNA序列的短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌细胞的转化群体在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达；(c)从该转化的丝状真菌细胞群体中选择展现出表型改变的转化体；(d)通过测量相对于由该丝状真菌细胞产生的该生物物质的水平的由每个转化体产生的该生物物质的水平，对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选，该表型改变针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默；并且任选地(e)分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。
在步骤(a)中，使用本领域已知的方法用DNA文库转化丝状真菌宿主细胞的一个群体。将该DNA文库的每个成员都克隆进一个双链可转录核酸构建体中，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括该DNA文库的一个成员作为与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的一个第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。
在步骤(b)中，短干扰RNA(siRNA)(包括对应于有待被沉默的靶基因的部分双链RNA序列)的产生通过以下来完成：将该丝状真菌宿主细胞的转化群体在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA。这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌宿主细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达。如以前所提及的，在此意识到的是，一个siRNA可以足以沉默两个靶基因，如果这两个靶基因直接彼此相邻或在彼此的10kb内，例如7.5kb内、5kb内、2.5kb内、1kb内或0.5kb内。另一方面，如果靶基因未在彼此的10kb内，则需要单独的siRNA沉默每个靶基因。
在步骤(c)中，基于表型改变，从该转化的丝状真菌宿主细胞群体中选择转化体。
在步骤(d)中，通过测量相对于由该丝状真菌细胞产生的该生物物质的水平的由每个转化体产生的该生物物质的水平，对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选，该表型改变针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默。可以使用如在此描述的本领域已知的方法测量产生的该生物物质的水平。
在步骤(e)中，任选地分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。可以从转化体或该丝状真菌细胞中分离靶基因。可以如在此描述地分离该靶基因。
本发明还涉及以下双链可转录核酸构建体，这些构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。
本发明还涉及以下双链可转录核酸构建体，这些构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。
在以上方面中，可以将该双链可转录核酸构建体包含在一个载体中。载体可以是用于传递来自细胞的一个或多个核酸构建体的双链环状DNA分子或直链DNA分子，其中该DNA分子被加入真菌宿主细胞中。此类载体可以整合进宿主细胞基因组中或可以自主复制。实例包括质粒载体、二元载体、克隆载体、穿梭载体、病毒载体以及线性载体。可替代地，将该双链可转录核酸构建体原样引入丝状真菌细胞中，即不作为载体的组件。
启动子
启动子对于第一同源可转录区、第二同源可转录区或第一和第二同源可转录区可以是天然的或外源的(异源的)并且对于丝状真菌菌株以是天然的或外源的。在本发明的方法中，启动子可以是天然启动子、异源启动子、突变启动子、杂合启动子或串联启动子。
可用于本发明的方法中的启动子的实例包括获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰刀菌胰蛋白酶–样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌达莉亚(Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌奎恩(Quinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶I、里氏木霉葡聚糖内切酶II、里氏木霉葡聚糖内切酶III、里氏木霉葡聚糖内切酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、里氏木霉翻译延长因子，连同NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中非翻译前导子已经用来自一种曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导子替换；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的修饰的启动子，其中非翻译前导子已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的非翻译前导子替换)；及其突变型、截短型、和杂交型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。
在一个方面中，该启动子是NA2-tpi启动子。在另一个方面中，该启动子是TAKA/NA2-tpi前导子杂合启动子。在另一个方面中，该启动子是TAKA启动子。在另一个方面中，该启动子是米曲霉tef-1启动子。在另一个方面中，该启动子是黑曲霉或泡盛曲霉glaA启动子。在另一个方面中，该启动子是黑曲霉或米曲霉niaD启动子。在另一个方面中，该启动子是酿酒酵母fcy1启动子。
同源可转录区
术语“与靶基因具有同源性的可转录区”意指与靶基因的开放阅读框或其部分同源并且被转录为RNA的核苷酸序列，该RNA是例如ncRNA(非编码RNA)、tRNA(转运RNA)、rRNA(核糖体RNA)、miRNA(微小RNA)或mRNA(信使RNA)，当在适当的调控序列控制之下时，该核苷酸序列可以被翻译或不被翻译为生物物质。可转录区的边界通常由恰好位于mRNA 5’端的开放阅读框上游的转录起始位点和恰好位于mRNA 3’端的开放阅读框下游的转录终止子序列确定。同源可转录区可以包括但不限于，基因组DNA、cDNA、半合成核酸序列、合成核酸序列以及重组核酸序列。
在本发明的方法中，与靶基因具有同源性的可转录区可以在顺序方面与该靶基因的对应区域相同(即，100％序列一致性)或可以是该靶基因的对应区域的同系物。
实现靶基因表达的沉默所需的可转录区与靶基因的对应区之间的序列一致性程度可能将取决于该靶基因。可转录区的核苷酸序列相对整个靶基因而言越小，这些序列之间的序列一致性程度应该优选是非常高的或相同的。可转录区的核苷酸序列相对整个靶基因而言越大，这些序列之间的序列一致性程度可能越低。
在本发明的方法中，可转录区的核苷酸序列与靶基因的对应区的序列一致性程度是至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。出于本发明的目的，如在此定义地确定两个核酸序列之间的序列一致性程度。
可替代地，可转录区与靶基因的对应区在不同严谨度条件下彼此杂交的能力也可以指示沉默靶基因的表达所需的相关性程度。然而，应该意识到的是，实现同系物与靶基因的对应区之间杂交所需的严谨度条件越低(例如严谨度条件)，沉默靶基因表达的效率将可能越低。
在一个方面中，可转录区与靶基因的对应区在低严谨度条件下杂交。在另一个方面中，可转录区与靶基因的对应区在中严谨度条件下杂交。在另一个方面中，可转录区与靶基因的对应区在中-高严谨度条件下杂交。在另一个方面中，可转录区与靶基因的对应区在高严谨度条件下杂交。在另一个方面中，可转录区与靶基因的对应区在非常高严谨度条件下杂交。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的探针而言，严谨度条件被定义为根据标准DNA印迹程序，在比使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国国家科学院院刊(Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA)48:1390)的计算而计算的Tm低约5℃至约10℃下，在0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt's solution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、以及每ml 0.2mg的酵母RNA中预杂交、杂交及杂交后洗涤持续最佳12至24小时。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的探针而言，将载体材料在比计算的Tm低5℃至10℃下，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤一次，持续15分钟并且使用6X SSC洗涤两次，每次15分钟。
该第一可转录区优选由至少19个核苷酸，例如至少40个核苷酸、至少60个核苷酸、至少80个核苷酸、至少100个核苷酸或至少200个核苷酸组成。该第一可转录区还可以由该第一靶基因的整个开放阅读框或其同系物组成。
该第二可转录区优选由至少19个核苷酸，例如至少40个核苷酸、至少60个核苷酸、至少80个核苷酸、至少100个核苷酸或至少200个核苷酸组成。该第二可转录区还可以由该第二靶基因的整个开放阅读框或其同系物组成。
与该第一个第二靶基因无有效同源性的第三可转录区可以与宿主基因组无同源性(如下所述)或可以与第三靶基因具有同源性。该第三可转录区优选由至少19个核苷酸，例如至少40个核苷酸、至少60个核苷酸、至少80个核苷酸、至少100个核苷酸、至少250个核苷酸、至少500个核苷酸、至少750个核苷酸或至少1000个核苷酸组成。该第三可转录区还可以由该第三靶基因的整个开放阅读框或其同系物组成。
非同源可转录区
该双链可转录核酸构建体还可以包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区，其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段。在本发明的此方面中，该第三可转录区与宿主基因组无有效同源性。
在一个方面中，该第三可转录区是任何基因的任何可转录部分，例如基因的5'-非翻译区、编码序列或3'-非翻译区，其与靶基因或宿主基因组无有效同源性。
在另一个方面中，该第三可转录区对应于与靶基因或宿主基因组无有效同源性的基因的编码序列。
在另一个方面中，该第三可转录区对应于与靶基因或宿主基因组无有效同源性的基因的5'-非翻译区。
在另一个方面中，该第三可转录区对应于与靶基因或宿主基因组无有效同源性的基因的3'-非翻译区。
在另一个方面中，该第三可转录区是一个与靶基因或宿主基因组无有效同源性的非内源基因的一部分，例如大肠杆菌的潮霉素抗性基因。
该第三可转录区优选由至少19个核苷酸，例如至少40个核苷酸、至少60个核苷酸、至少80个核苷酸、至少100个核苷酸、至少250个核苷酸、至少500个核苷酸、至少750个核苷酸或至少1000个核苷酸组成。
这两个在相反方向上彼此互补的区段可以被一个多核苷酸接头隔开。该接头优选由至少4个核苷酸，例如至少20个核苷酸、至少40个核苷酸、至少60个核苷酸、至少80个核苷酸、至少100个核苷酸、至少250个核苷酸或至少500个核苷酸组成。
靶基因
编码生物物质的靶基因可以是编码具有生物学活性的物质的任何基因或可以是代谢产物的生物合成中涉及的编码具有生物学活性的多肽的任何基因。该生物物质可以是RNA(例如，ncRNA、rRNA、tRNA、miRNA或mRNA)。该生物物质还可以是一种具有生物学活性的多肽。该生物物质还可以是一种代谢产物。该生物物质对于丝状真菌菌株而言可以是天然的或外源的。天然物质是一种来自同一丝状真菌菌株的物质。“外源物质”是对细胞而言非天然的物质；或已经对其进行结构修饰以改变其的天然物质。
在一个方面中，该生物物质是一种具有生物学活性的多肽。该多肽可以是具有生物学活性的任何多肽。术语“多肽”在此不意在是指特定长度的编码产物并且因此涵盖肽、寡肽、多肽以及蛋白。术语“多肽”还涵盖组合以形成编码产物的两个或更多个多肽。多肽还包括杂合多肽，这些杂合多肽包括部分或完整多肽序列的组合，这些序列获得自至少两个不同的多肽，其中一个或多个(例如，若干个)序列对于丝状真菌细胞可以是异源的。多肽进一步包括上述多肽和杂合多肽天然发生的等位基因变异和工程变异。
在另一个方面中，该多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂(immunodilator)、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白以及转录因子。
在另一个方面中，该多肽是一种酶。在另一个方面中，该酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在另一个方面中，该酶是乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、阿魏酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。
在另一个方面中，该多肽是白蛋白、胶原、弹性蛋白原、弹性蛋白或明胶；或其变体或杂交体。
该生物物质还可以是一种选择标记的产物。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、β-微管蛋白变体(赛普(Seip)等人，1990，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)56(12):3686-3692；扬(Yan)和迪克曼(Dickman)，1996，应用与环境微生物学62(8):3053-3056)、fcy1(胞嘧啶脱氨酶)、hemA(5-氨基乙酰丙酸合酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及tk(胸苷激酶)、连同其等效物。在此应该理解的是，以上选择性标记的一些(例如，pyrG)用于逆选择(counter-selection)。将逆选择定义为依赖于这样的一种选择性标记的靶向失活的生长。
在实践本发明的方法中，可以如在此描述地分离靶基因。
在一个方面中，靶基因的表达被减少20％，例如减少30％、减少40％、减少50％、减少60％、减少70％、减少80％、减少90％或100％。
当希望在5’非翻译区、编码区或3’非翻译区内使用靶序列时，在这些区域中的任一区域中构建有反向重复序列的基因沉默核酸构建体或载体可以另外地使得与存在于沉默载体中的编码序列同源的基因沉默。因此，当希望在生物体内沉默基因的同系物时，通过构建一种沉默载体(其含有在5’非翻译区、编码区或3’非翻译区内具有同源性的可转移表达的靶序列)，可以允许消除或减少与该构建体内的编码序列展现出序列同源性的一个或多个(例如，若干个)基因的表达。术语“同源性”或“同源的”通常是指那些具有一些共同祖先结构并且展现出活性区的较高程度的序列相似性或一致性的序列。
在一个方面中，干扰RNA与靶基因的一种或多种(例如，若干种)同系物的RNA转录本相互作用，以沉默该靶基因的这一种或多种同系物的表达。
在另一个方面中，该靶基因的一种或多种(例如，若干种)同系物的表达被减少至少20％，例如至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
表型标记
在实践本发明的方法中，将该双链可转录核酸构建体的RNA转录本转化为siRNA，这些siRNA可以与该第一靶基因的RNA转录本相互作用，从而引起该转化的丝状真菌宿主细胞的表型改变。当该第一靶基因被沉默时，该沉默为宿主细胞赋予了可以容易地鉴定、筛选或选择的特征或性状。该第一靶基因(即，表型标记)可以赋予一种可观察到的性状，该性状包括但不限于，凋亡、细胞死亡、细胞周期、菌落形态、菌落颜色、发育、基因下调、在特定营养素上生长/缺乏成长、基因上调、致病性、对药物或有毒代谢产物的抗性、孢子形成或孢子颜色。
该表型改变可以是将其与亲本或参比菌株区分的菌株的可观察到的特征的任何改变，例如上述性状之一的改变。
在一个方面中，该第一靶基因是wA(聚酮合酶；登录号XP_001393884)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是brlA(分生孢子发育的转录调控子；登录号XP_001389479)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是pepC(枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶；登录号XP_001391470)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是amyR(淀粉/麦芽糖利用的基因的转录调控子；登录号XP_001402052)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是xlnR(纤维素分解酶和木聚糖分解酶的转录调控子；登录号XP_001397110)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶；登录号X06626.1)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是bipA(内质网分子伴侣；登录号Y08868.1)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是tpa(凋亡诱导因子)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是rad1(细胞周期检查点蛋白)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是lae1(与次级代谢产物的调节相关的甲基转移酶；登录号XP_001402055)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是amdS(乙酰胺酶)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是bar(草丁膦乙酰转移酶)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是hph(潮霉素磷酸转移酶)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是niaD(硝酸还原酶)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是sC(硫酸腺苷基转移酶)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是trpC(邻氨基苯甲酸合酶)基因。在另一个方面中，该第一靶基因是fcy1(胞嘧啶脱氨酶)基因。
该第一靶基因还可以是adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、hemA(5-氨基乙酰丙酸合酶)、tk(胸苷激酶)或trp5(色氨酸合酶)、连同其等效物。
以上提及的登录号以其全部内容结合在此。
丝状真菌菌株
本发明还涉及丝状真菌菌株，这些丝状真菌菌株包括一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中通过以下产生包括有待被沉默的靶基因的序列的短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达。该双链可转录核酸构建体可以进一步包括至少一个另外的多核苷酸，该至少一个另外的多核苷酸包括一个与编码另外的生物物质的另外的靶基因具有同源性的可转录区，如在此所描述。
该丝状真菌菌株可以是在本发明的方法中有用的任何丝状真菌菌株。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
在一个方面中，该丝状真菌菌株是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属菌株。
在另一个方面中，该丝状真菌菌株是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛云芝菌、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、黄色镰刀菌、禾谷镰刀菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰刀菌、多枝镰孢、粉红镰孢菌、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰刀菌、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰刀菌、镶片镰孢菌、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢原毛平革菌、射纹革菌、杏鲍菇、太瑞斯梭孢壳霉、长绒毛栓菌、韩国白腐菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉菌株。
在另一个方面中，该丝状真菌菌株是米曲霉菌株。一方面最优选地，该米曲霉菌株是保藏号为IFO 4177的米曲霉菌株。
在另一个方面中，该丝状真菌菌株是镶片镰孢菌(Fusarium venenatum)菌株。在另一个方面中，该镶片镰孢菌菌株是镶片镰孢菌A3/5，该镶片镰孢菌A3/5最初被保藏为禾谷镰刀菌ATCC 20334并且最近由约德(Yoder)和克里斯蒂安松(Christianson)，1998，真菌遗传学与生物学(Fungal Genetics andBiology)23:62-80和奥唐奈(O'Donnell)等人，1998，真菌遗传学与生物学23:57-67重新分类为镶片镰孢菌；以及镶片镰孢菌的分类学等效物，不管其目前所知的是什么种名。在另一个方面中，该镶片镰孢菌是镶片镰孢菌A3/5或镶片镰孢菌ATCC 20334的形态突变体，如披露于WO 97/26330中。
在另一个方面中，该丝状真菌菌株是里氏木霉菌株。在另一个方面中，该里氏木霉菌株是里氏木霉ATCC 56765。在另一个方面中，该里氏木霉菌株是里氏木霉RutC30。在另一个方面中，该里氏木霉菌株是里氏木霉TV10。在另一个方面中，该里氏木霉菌株是里氏木霉RutC30的突变体。在另一个方面中，该里氏木霉菌株是里氏木霉TV10的突变体。在另一个方面中，该里氏木霉菌株是里氏木霉的形态突变体。参见例如WO 97/26330，将其通过引用以其全部内容结合在此。
在另一个方面中，该丝状真菌菌株是黑曲霉菌株。在另一个方面中，该黑曲霉菌株是黑曲霉Bo-1(DSM 12665)。在另一个方面中，该黑曲霉菌株是黑曲霉Bo-1(DSM 12665)的突变体，如披露于WO 2004/090155中。
可以将丝状真菌菌株通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP 238023、约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰刀菌属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述。
可以使用本领域已知的特异性针对被靶向生物物质的方法检测编码不令人希望的生物物质的靶基因的表达的沉默。这些检测方法可以包括使用特异性抗体、高效液相层析、毛细管电泳、酶产物的形成、酶底物的消失、SDS-PAGE、或表型(例如，孢子颜色)的失去或出现。例如，可以使用酶测定来确定酶活性。对于许多酶而言，用于确定酶活性的程序在本领域是已知的(参见例如，D.朔姆堡(D.Schomburg)和M.扎尔茨曼(M.Salzmann)(编辑)，酶手册(Enzyme Handbook)，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约，1990)。
产生方法
本发明还涉及产生感兴趣的生物物质的方法，包括：(a)在有助于产生该感兴趣的生物物质的条件下培养一种丝状真菌菌株，其中该丝状真菌菌株包括一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区，其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段并且该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子，其中通过以下产生包括有待被沉默的靶基因的序列的短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为包括有待被沉默的靶基因的序列的siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达；并且其中该丝状真菌菌株包括一个编码该感兴趣的生物物质的第四多核苷酸：并且任选地(b)从培养基中回收该感兴趣的生物物质。该双链可转录核酸构建体可以进一步包括至少一个另外的多核苷酸，该至少一个另外的多核苷酸包括一个与编码另外的生物物质的另外的靶基因具有同源性的可转录区，如在此所描述。
该感兴趣的生物物质可以是任何生物物质。在一个方面中，该感兴趣的生物物质是RNA(例如，ncRNA、rRNA、tRNA、miRNA或mRNA)。在另一个方面中，该感兴趣的生物物质是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫扩张剂、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白以及转录因子。在另一个方面中，该感兴趣的生物物质是一种酶。在另一个方面中，该酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在另一个方面中，该酶是乙酰木聚糖酯酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、阿魏酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。
该感兴趣的生物物质对于丝状真菌菌株而言可以是天然的或外源的。编码该第一和第二生物物质的靶基因表达的沉默可以引起另一种感兴趣的生物物质的表达增加。因此，该第一和第二生物物质的表达的沉默可以直接影响感兴趣的生物物质的产生或表达。例如，该第一和第二生物物质可以是降解该感兴趣的生物物质的蛋白酶，从而降低产生的该感兴趣的生物物质的量。通过沉默这些蛋白酶的表达，将表达和产生更多的感兴趣的生物物质。或者，该第一和第二生物物质可以与该感兴趣的生物物质分享一个或多个细胞处理过程(例如转录因子或分泌途径)，从而降低产生的该感兴趣的生物物质的量。通过沉默该第一和第二生物物质的表达，更多的该一个或多个细胞处理过程将可被该感兴趣的生物物质使用(例如，表达限制性转录元件)，从而增加表达和产生的该感兴趣的生物物质的量。此外，该第一和第二生物物质可以是毒素，这些毒素污染该感兴趣的生物物质，从而阻止该感兴趣的生物物质在特定应用中的用途，例如在食品加工中作为酶。
在本发明的生产方法中，使用本领域已知的方法，在适于产生该感兴趣的生物物质的营养培养基中培养丝状真菌菌株。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该生物物质的条件下，进行摇瓶培养，以及在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养菌株。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该生物物质被分泌进营养培养基中，则可以直接从培养基中回收该物质。如果该生物物质不被分泌，则可以从细胞裂解物中回收该物质。
可以使用本领域已知的特异性针对生物物质的方法检测感兴趣的生物物质。这些检测方法可以包括使用特异性抗体、高效液相层析、毛细管层析、酶产物的形成、醉底物的消失或SDS-PAGE。例如，可以使用酶测定来确定酶活性。对于许多酶而言，用于确定酶活性的程序在本领域是已知的(参见例如，D.朔姆堡(D.Schomburg)和M.扎尔茨曼(M.Salzmann)(编辑)，酶手册(Enzyme Handbook)，施普林格出版社(Springer-Verlag)，纽约，1990)。
可以使用本领域已知的方法分离所得感兴趣的生物物质。例如，可以通过常规程序，包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从培养基中分离感兴趣的多肽。然后，可以通过本领域已知的多种程序进一步纯化分离的多肽，这些程序包括但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水层析、聚焦层析和大小排阻层析)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦(IEF))、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、或萃取(参见，例如，蛋白纯化(Protein Purification)，编者J.-C.詹森(Janson)和拉尔斯赖登(LarsRyden)，VCH出版社，纽约，1989)。可以通过例如萃取、沉淀或差别溶解度或本领域已知的任何方法从培养基中分离感兴趣的代谢产物。然后，可以使用适于代谢产物的方法进一步纯化分离的代谢产物。
编码生物物质的多核苷酸
可以从任何原核、真核或其他来源获得编码感兴趣的生物物质的分离的多核苷酸序列。出于本发明的目的，如在此结合一种给定来源使用的术语“从...中获得”应意指该生物物质由该来源或由已经插入来自该来源的基因的细胞产生。
用来分离或克隆编码感兴趣的生物物质的多核苷酸的技术在本领域中是已知的并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)实现从此类基因组DNA中克隆多核苷酸。参见例如，英尼斯(Innis)等人，1990，PCR方案：方法与应用指南(PCRProtocols:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。克隆程序可以涉及包括编码生物物质的多核苷酸的所希望的核酸片段的切除与分离、片段至载体分子的插入以及重组载体并入突变丝状真菌细胞，在该细胞中核酸序列的多个拷贝或克隆将复制。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合。
核酸构建体
编码感兴趣的生物物质的分离的多核苷酸可以被包含在丝状真菌菌株的核酸构建体中。核酸构建体包括与至少一个以及一个或多个控制序列可操作性连接的编码感兴趣的生物物质的核苷酸序列，这些控制序列在与这些控制序列相容的条件下指导核苷酸序列在丝状真菌菌株中的表达。表达将被理解为包括感兴趣的生物物质产生所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
可以进一步以多种方式操作编码感兴趣的生物物质的分离的多核苷酸，以供该生物物质表达之用。取决于表达载体，在核苷酸序列插入载体之前对其进行操作是令人希望的或必要的。利用重组DNA方法修饰核苷酸序列的技术是本领域是熟知的。
该多核苷酸可以包括一个或多个天然控制序列，或这些天然控制序列中的一个或多个可以被一个或多个相对于该核苷酸序列外源的控制序列替换，以改进编码序列在宿主细胞中的表达。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码感兴趣的生物物质的核苷酸序列的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子。
该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子与编码多肽的多核苷酸的5’端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。
丝状真菌菌株的优选前导子是从以下各项的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、构巢曲霉磷酸丙糖异构酶、镶片镰孢菌胰蛋白酶以及镶片镰孢菌葡糖淀粉酶。
控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可以使用。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列也可以是编码与多肽的N端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可包含在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。或者，编码序列的5’端可含有对于该编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
当信号肽和前肽序列同时存在时，前肽序列的位置紧邻于多肽的N端，且信号肽序列的位置紧邻于前肽序列的N端。
还可以希望的是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调控序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调控序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
编码感兴趣的生物物质的多核苷酸可以被包含在重组表达载体中，该重组表达载体包括启动子、编码该生物物质的核苷酸序列以及转录和翻译终止信号。可以将在此描述的各种核酸和控制序列连接在一起以产生一个重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个(例如，若干个)方便的限制酶切位点，以允许在此类位点处插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可替代地，可以通过将该多核苷酸序列或包括该序列的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达该多核苷酸序列。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
载体优选地包含一个或多个(例如，若干个)允许方便地对转化的细胞、转染的细胞、转导的细胞等细胞进行选择的选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记的实例包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、β-微管蛋白变体(赛普(Seip)等人，1990，同上；扬(Yan)和迪克曼(Dickman)，1996，同上)、fcy1(胞嘧啶脱氨酶)、hemA(5-氨基乙酰丙酸合酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及tk(胸苷激酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。
选择性标记可以是在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另外，可以在一个选自下组的基因座中修饰该宿主细胞，该组由以下各项组成：ku70、ku80、rad50、mre11、xrs2、lig4以及sir4及其功能等效物，其中非同源重组的频率已经被降低。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
适用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO 00/24883中的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员所熟知的(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
菌株
黑曲霉菌株C2111包含引入在三个基因座(SP288、NA1和NA2)处的瓣环栓菌(Trametes cingulata)淀粉葡糖苷酶(葡糖淀粉酶)基因(WO2006/069289)的三个拷贝，并且衍生自于20世纪60年代从土壤中分离的黑曲霉菌株C40，其淀粉葡糖苷酶活性已经通过诱变而增强。
黑曲霉菌株M1137是一种衍生自黑曲霉菌株C2111的需尿苷(pyrG–)分离株。
黑曲霉菌株JoanTc3包含引入在三个基因座(SP288、NA1和NA2)处的瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶基因的三个拷贝，并且衍生自黑曲霉菌株Bo-1(DSM 12665)。黑曲霉菌株Bo-1衍生自黑曲霉菌株C40。
黑曲霉菌株JoanTc3ΔpyrG是一种衍生自黑曲霉菌株JoanTc3的需尿苷(pyrG–)分离株。
黑曲霉菌株EvFz5是一种表达RNA依赖型RNA聚合酶(RdRP)的需尿苷(pyrG–)分离株并且衍生自黑曲霉菌株JoanTc3ΔpyrG。
米曲霉HowB104(美国专利号5,770,418)是其中的天然TAKA淀粉酶基因已经被pyrG基因置换从而形成嘧啶原养型的菌株。
黑曲霉C1650是描述于WO 2012/160093中的黑曲霉NN059095的亲株。黑曲霉NN059095是一种衍生自黑曲霉菌株C1650的需尿苷(pyrG–)分离株并且被遗传修饰以破坏淀粉葡糖苷酶活性的表达。
米曲霉菌株DSY10(美国专利号5,770,418)包含长绒毛栓菌(异名：灵芝多孔菌(Polyporus pinsitus))漆酶基因的多个拷贝并且衍生自米曲霉HowB104。
米曲霉菌株DSY10ΔpyrG是一种衍生自米曲霉菌株DSY10的需尿苷(pyrG-)分离株。
培养基和溶液
AMG痕量金属溶液由以下构成：14.3g的ZnSO4·7H2O、2.5g的CuSO4·5H2O、0.5g的NiCl2·6H2O、13.8g的FeSO4·7H2O、8.5g的MnSO4·H2O、3.0g的柠檬酸、以及去离子水补足至1升。
COVE盐溶液由以下构成：26g的KCl、26g的MgSO4·7H2O、76g的KH2PO4、50ml的COVE痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。
COVE痕量金属溶液由以下构成：0.04g的NaB4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、0.7g的MnSO4·H2O、0.8g的Na2MoO2·2H2O、10g的ZnSO4·7H2O、以及去离子水补足至1升。
COVE-N-gly琼脂板由以下构成：50ml的COVE盐溶液、218g的山梨糖醇、10g的甘油、2.02g的KNO3、25g的琼脂诺布尔(Noble)、以及去离子水补足至1升。
COVE-N-JP顶层琼脂糖由以下构成：342.3g的蔗糖、3g的NaNO3、20ml的COVE盐溶液、15g的低熔点琼脂糖(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州，美国)、以及去离子水补足至1升。
COVE-N-JP转化琼脂板由以下构成：342.3g的蔗糖、3g的NaNO3、20ml的COVE盐溶液、30g的琼脂诺布尔、以及去离子水补足至1升。
LB琼脂由以下构成：10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl、15g的BACTOTM琼脂、以及去离子水补足至1升。
基本培养基转化板由以下构成：342.3g的蔗糖、50ml的20X基本培养基盐溶液、1ml的COVE痕量金属溶液、20ml的50％葡萄糖、20ml的0.02％生物素溶液、2.5ml的20％MgSO4-7H2O、20g的琼脂诺布尔、以及去离子水补足至1升。
基本培养基琼脂板由以下构成：6g的NaNO3、0.52g的KCl、1.52g的KH2PO4、1ml的COVE痕量金属溶液、20ml的50％葡萄糖、20ml的0.02％生物素溶液、2.5ml的20％MgSO4·7H2O、20g的琼脂诺布尔、以及去离子水补足至1升。
20X基本培养基盐溶液由以下构成：120g的NaNO3、10.4g的KCl、30.4g的KH2PO4、以及去离子水补足至1升。
MLC培养基由以下构成：40g的葡萄糖、50g的大豆粉、4g的柠檬酸、2滴消泡剂、以及去离子水补足至1升；pH 6.0。
MU-1培养基由以下构成：260g的麦芽糊精、3g的MgSO4·7H2O、6g的K2SO4、5g的KH2PO4、0.5ml的AMG痕量金属溶液、2滴消泡剂、以及去离子水补足至1升；pH 4.5。
MY25培养基由以下构成：25g的麦芽糊精、2g的MgSO4·7H2O、10g的KH2PO4、2g的无水柠檬酸、2g的K2SO4、2g的尿素、10g的酵母提取物、0.5ml的AMG痕量金属溶液、以及去离子水补足至1升。
PDA板由以下构成：39g的DIFCOTM马铃薯葡萄糖琼脂(碧迪公司(Becton Dickinson and Co.)，斯帕克斯，马里兰州，美国)以及去离子水补足至1升。
SPTC溶液由以下构成：40％聚乙二醇4000(PEG 4000；西格玛-奥德里奇化学公司(Sigma-Aldrich Chemical Co.,Inc.)圣路易斯，密苏里州，美国)、0.8M山梨糖醇、50mM CaCl2、以及50mM Tris-HCl；pH 8.0，过滤除菌。
STC溶液由以下构成：0.8M山梨糖醇、50mM CaCl2、以及50mMTris-HCl；pH 8.0，过滤除菌。
TAE缓冲液由以下构成：4.84g的Tris碱、1.14ml的冰乙酸、2ml的0.5M EDTA、以及去离子水补足至1升；pH 8.0。
2XYT琼脂由以下构成：16g的胰蛋白胨、10g的酵母提取物、5g的NaCl、15g的BACTOTM琼脂、以及去离子水补足至1升。
YP培养基由以下构成：10g的BACTOTM酵母提取物(碧迪公司，斯帕克斯，马里兰州，美国)、20g的BACTOTM蛋白胨(碧迪公司，斯帕克斯，马里兰州，美国)、以及去离子水补足至1升。
实例1：pEvFz34的构建
使用以下示出的引物通过PCR扩增一个730bp片段，该片段包括米曲霉tef-1启动区(北本(Kitamoto)等人，1998，应用微生物学与生物技术(AppliedMicrobiology and Biotechnology)50:85-92)，其中两个引物的5’端都被工程化为包含与线性载体pAlLo2(WO 2004/099228)的末端同源的20bp序列。
引物067500(正义)：
5’-GAGTCAGTGAGCGAGGAAGCACTGTGGACCAGACAGGCGCCA-3’(SEQ ID NO:1)
引物067501(反义)：
5’-CTGCGGCCGCGGGCCCATGGTGCTCAGATACTACGGCTGATC-3’(SEQ ID NO:2)
米曲霉tef-1启动子用加下划线的字母表示。
扩增反应由以下构成：1X THERMOPOLTM反应缓冲液(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利，马萨诸塞州，美国)、1mM dNTPs、20ng的pSaMF2049004(SEQ ID NO:3)、50皮摩尔的正义引物067500、50皮摩尔的反义引物067501、以及2.5各单位的Taq DNA聚合酶(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)，总体积为50μl。在 5333(艾本德股份公司(Eppendorf AG)，汉堡，德国)中孵育反应，其被编程为：1个循环，在94℃下持续3分钟；30个循环，每个循环在94℃下持续30秒、56℃下持续30秒、以及72℃下持续45秒；最终延长，在72℃下持续7分钟；并且保存于10℃下。使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化PCR产物，其中从凝胶上切取730bp条带并根据制造商的方案使用凝胶提取试剂盒(凯杰公司(QIAGEN Inc.)，巴伦西亚，加州，美国)进一步纯化。
将质粒pAlLo2用Sap I和Nco I消化并使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并且根据制造商的方案使用凝胶提取试剂盒(凯杰公司，巴伦西亚，加州，美国)进一步纯化。
使用IN-FUSIONTM优越PCR克隆试剂盒(IN-FUSIONTM Advantage PCRCloning Kit)(克罗泰克公司(Clontech)，山景城，加州，美国)将730bp PCR产物克隆进Sap I/Nco I消化的pAlLo2中。克隆反应由以下构成：1XIN-FUSIONTM反应缓冲液(克罗泰克公司，山景城，加州，美国)、1X BSA(克罗泰克公司，山景城，加州，美国)、88ng的Sap I/Nco I消化的pAlLo2载体、100ng的730bp PCR产物、以及20个单位的IN-FUSIONTM酶(克罗泰克公司，山景城，加州，美国)，总体积为20μl。将混合物在37℃下孵育15分钟，在50℃下孵育15分钟，并且放置在冰上。
根据制造商的方案，将一微升的克隆反应转化进ONETOP10化学感受态大肠杆菌细胞(英杰公司(Invitrogen Corp.)，卡尔斯巴德，加州，美国)中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA样品使用9600(凯杰公司，巴伦西亚，加州，美国)纯化并使用3130xl遗传分析仪(应用生物系统(AppliedBiosystems)，福斯特市，加州，美国)通过DNA测序进行分析，以鉴定包含希望的tef-1启动子插入片段的质粒。将一个具有正确DNA序列的质粒指定为pEvFz34(图1)。
实例2：质粒pEvFz35的构建
将质粒pEvFz35构建为包含米曲霉tef-1启动子、来源于大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因(hph)(卡斯特(Kaster)等人，1983，核酸研究(Nucleic AcidsRes.)11:6895-6911；WO 2008/080017)的一部分的反向重复序列(hph-IR)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)终止子(哈塔(Hata)等人，1991，农业、生物学与化学(Agric.Biol.Chem.)55:941-949)、以及作为选择性标记的构巢曲霉乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(pyrG)基因(奥克利(Oakley)等人，1987，基因(Gene)61:385-399)。
通过从pDM266(WO 2008/080017))中克隆hph反向重复序列(hph-IR)产生质粒pEvFz35。将描述于实例1中的质粒pEvFz34和pDM266用Not I和Pac I在37℃下消化过夜。将所得4923bp线性pEvFz34载体片段和来自pDM266的505bp hph-IR插入片段使用TAE缓冲液通过0.7％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒进一步纯化。
使用QUICK LIGATIONTM试剂盒(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)将505bp hph-IR插入片段连接至Not I/Pac I消化的pEvFz34片段。连接反应由以下构成：1X QUICK LIGATIONTM反应缓冲液(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)、50ng的Not I/Pac I消化的pEvFz34载体、44ng的516bp Not I/Pac I消化的hph-IR插入片段、以及1μl的T4DNA连接酶(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)，总体积为20μl。将连接混合物在37℃下孵育15分钟，在50℃下孵育15分钟，并且放置在冰上。
根据制造商的说明书，将一微升的连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌细胞(Stratagene公司，拉荷亚，加州，美国)中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。使用9600从若干转化体中纯化质粒DNA并且通过用Not I和Pac I消化进行分析，以鉴定包含希望的hph-IR插入片段的质粒。使用EZ:TNTM<TET-1>插入试剂盒(中心生物技术公司(Epicentre Biotechnologies)，麦迪逊，威斯康星州，美国)对鉴定为具有正确限制图谱的一个推定克隆测序，该试剂盒被设计为随机插入用引物结合位点标记的转座子，用于重组DNA的双向测序。转座子插入反应由以下构成：1X EZ-Tn5TM反应缓冲液(中心生物技术公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)、0.2μg的pEvFz35、0.1μl的EZ:TNTM<TET-1>转座子(中心生物技术公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)、以及1μl的EZ-Tn5转座酶(中心生物技术公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)，总体积为10μl。将反应混合物在37℃下孵育2小时。通过添加1X终止液(中心生物技术公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)并在70℃下加热10分钟终止插入反应。
根据制造商的方案，用1μl的转座子靶向的DNA混合物转化ONETOP10ElectrocompTM大肠杆菌细胞(英杰公司，卡尔斯巴德，加州，美国)。在包含10μg的四环素/ml的LB琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA样品用9600纯化并使用两者均为1.6pmol的TET-1FP-1正向引物和TET-1RP-1反向引物(中心生物技术公司，麦迪逊，威斯康星州，美国)以及3130xl遗传分析仪进行双向测序。将具有正确DNA序列的所得质粒指定为pEvFz35(图2)。
实例3：质粒pEvFz36的构建
构建转移性RNAi载体，用于抑制黑曲霉ATCC 1015聚酮合酶基因(cDNA序列为SEQ ID NO:4并且推导的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；登录号XM_001393847.2)的表达。
将质粒pEvFz36构建为包含米曲霉tef-1启动子、黑曲霉聚酮合酶基因的开放阅读框的一个片段、大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶反向重复序列(hph-IR)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)终止子以及作为选择性标记的全长构巢曲霉乳清苷-5’-磷酸(pyrG)基因。将黑曲霉聚酮合酶基因选作沉默靶标，是因为其与丝状真菌中的分生孢子色素生物合成中涉及的其他聚酮合酶的序列一致性。
根据制造商的说明书，将来自pAmFs031(WO 2008/080017)的502bp片段用Nco I和Not I消化，使用QUICK LIGATIONTM试剂盒连接至Nco I/NotI消化的pEvFz35，并将其转化进化学感受态大肠杆菌细胞中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA样品使用9600纯化并使用3130xl遗传分析仪通过DNA测序分析，以鉴定包含希望的聚酮合酶插入片段的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pEvFz36(图3)。
实例4：质粒pHiTe48的构建
构建转移性RNAi载体，用于共抑制描述于实例3中的黑曲霉ATCC 1015聚酮合酶基因和瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶(AMG)基因(cDNA序列为SEQ IDNO:6并且推导的氨基酸序列为SEQ ID NO:7)的表达。
将质粒pHiTe48构建为包含米曲霉tef-1启动子、黑曲霉聚酮合酶基因的开放阅读框的一个片段、瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶(AMG)基因开放阅读框的一个片段、大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶反向重复序列(hph-IR)，黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)终止子以及作为选择性标记的全长构巢曲霉乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(pyrG)基因。
使用以下示出的引物通过PCR扩增包含于pHiTe08(SEQ ID NO:8)中的瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶开放阅读框的200bp片段，其中两个引物的5’端都被工程化为包含线性载体pEvFz36(实例3)的末端的20bp的同源序列。
引物069733(正义)：
5’-GAACCTTACGCGGCCATGCGTTTCACGCTCCTCAC-3’(SEQ ID NO:9)
引物069734(反义)：
5’-GAACATCGCGCGGCCGCTTCGGGTTGGATGTGCTCG-3’(SEQ IDNO:10)
淀粉葡糖苷酶编码序列由加下划线的字母表示。
扩增反应由以下构成：1XPCR缓冲液II(应用生物系统公司(Applied Biosystems,Inc.)，福斯特市，加州，美国)、0.2mM dNTPs、20ng的pHiTe08、50皮摩尔的正义引物069733、50皮摩尔的反义引物069734、以及5个单位的AMPLITAQDNA聚合酶(应用生物系统公司，福斯特市，加州，美国)，总体积为50μl。在5333中孵育反应，其被编程为：1个循环，在95℃下持续9分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续30秒；最终延长，在72℃下持续30秒；并且保存于10℃下。将200bp的所得PCR产物使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒进一步纯化。
将质粒pEvFz36用Not I消化并使用TAE缓冲液通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒进一步纯化。
根据制造商的说明书，使用IN-FUSIONTM优越PCR克隆试剂盒将200bpPCR产物连接至Not I消化的pEvFz36质粒并将连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌细胞中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA使用9600纯化并使用3130xl遗传分析仪通过DNA测序分析，以鉴定包含希望的淀粉葡糖苷酶插入片段的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pHiTe48(图4)。
实例5：原生质体制备与黑曲霉转化
根据宾替拉(Penttila)等人，1987，基因(Gene)61:155-164的方案进行原生质体制备与转化。简言之，将分生孢子在100ml补充有2％(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的YP培养中，伴随110rpm下的搅拌在30℃下培养18小时。使用真空驱动一次性过滤系统(Vacuum Driven Disposable FiltrationSystem)(密理博公式(Millipore)，贝德福德，马萨诸塞州，美国)通过过滤收集未成熟幼殖体并用20mM CaCl2-0.7M KCl洗涤两次。通过将洗涤的幼殖体悬浮于10ml包含20mg的200G(诺维信瑞士股份公司(Novozymes Switzerland AG)，Neumatt，瑞士)/ml的20mM CaCl2-0.7M KCl中在37℃下持续50-60分钟(伴随100rpm混合)产生原生质体。将原生质体混合物通过无菌(卡尔生化公司(Calbiochem)，圣地亚哥，加州，美国)过滤，并且将用20mM CaCl2-0.7M洗涤，以释放陷于中的任何原生质体。通过在537x g下离心10分钟并将沉淀再悬浮于20ml的STC溶液中收集原生质体。将原生质体第二次重复洗涤。使用血球计数器对原生质体计数并再悬浮至终浓度为1x 107个原生质体/STC溶液。将过量的原生质体在-80℃下储存于Cryo 1℃冷冻容器(耐洁公司(Nalgene)，罗契斯特，纽约，美国)中。
用于选择构巢曲霉乳清苷-5’-磷酸脱羧酶(pyrG)标记，将大约5μg的质粒DNA添加至100μl的原生质体溶液中并轻轻混合。添加一毫升的SPTC溶液，混合，并在室温下孵育30分钟。孵育后，然后将45ml的COVE-N-JP顶层琼脂糖添加至DNA转化混合物中并涂在三个COVE-N-JP转化琼脂板上。将这些板在30℃下孵育7-10天。将转化体在COVE-N-gly琼脂板上继代培养并在30℃下生长7-10天。
实例6：转化体的培养
将来自实例5的所选转化体的分生孢子接种在包含4ml的MU-1/MLC培养基(将1000ml的MU-1培养基与200ml的MLC培养基和40ml的50％尿素合并)的无菌14ml FALCONTM培养管(BD生物科学(BD Biosciences)，圣何塞，加州，美国)中，并在30℃和200rpm下孵育7天。通过在1643xg下离心15分钟收集来自培养物的上清液并测定淀粉葡糖苷酶(AMG)活性，如描述于实例7中。
对于摇瓶，将来自所选转化体的2-5x 107个分生孢子接种在包含25ml的MU-1/MLC培养基的125ml摇瓶中，并在30℃和200rpm下孵育7天。通过在1643x g下离心15分钟收集来自每个培养物的四毫升上清液样品并测定淀粉葡糖苷酶(AMG)活性，如描述于实例7中。
实例7：淀粉葡糖苷酶(AMG)测定
根据以下方法，使用3000和NX(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter,Inc.)，富勒顿，加州，美国)测定培养物上清液的淀粉葡糖苷酶(AMG)活性。将培养物上清液在0.1M乙酸钠-0.01％X-100pH 5.0(样品缓冲液)中从0倍稀释至1/3倍至1/9倍。使用2倍步骤在样品缓冲液中稀释酶标准品(诺维信公司(Novozymes A/S)，鲍斯韦，丹麦)，起始于8AGU/ml浓度并且结束于1AGU/ml浓度。将每个稀释的20μl等分部分转移至96孔平底板中。向每个孔中添加一百微升的对硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷底物溶液(1mg/ml，0.1M乙酸钠(pH 5.0)中)，并且将板在环境温度下孵育45分钟。完成孵育后，将反应用100μl的0.06N NaOH淬灭。在405nm下测量反应的终点。通过从标准曲线外推确定酶浓度。
实例8：培养物上清液的SDS-PAGE分析
将十微升的来自每个转化体的上清液10μl与补充有0.5％(v/v)β-巯基乙醇的10μl Laemmli样品缓冲液(伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories,Inc.)，赫拉克勒斯，加州，美国)混合。在95℃下加热5分钟后，将20μl的每个样品和15μl的PRECISION PLUS PROTEINTM未染色分子量标准物(伯乐实验室公司，赫拉克勒斯，加州，美国)装载在CRITERION STAINFREETM凝胶(伯乐实验室公司，赫拉克勒斯，加州，美国)上并在Tris/Glycine/SDS缓冲液(伯乐实验室公司，赫拉克勒斯，加州，美国)中于150V下电泳1.5小时。使用CRITERION STAIN FREETM成像系统(伯乐实验室公司，赫拉克勒斯，加州，美国)将蛋白带可视化。
实例9：基于形态学的转移性RNAi筛选促进插入的瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶(AMG)靶标的共沉默
质粒pHiTe48包含一个来源于瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶(AMG)基因的200bp片段，该片段被插入在黑曲霉聚酮合酶基因的502bp片段的下游和505bp大肠杆菌hph-IR的上游。使用四微克的pHiTe48转化如描述于实例5中而制备的黑曲霉菌株M1137的原生质体，并且在COVE-N-JP转化琼脂板上于30℃下进行选择，持续7-10天。通过在COVE-N-gly琼脂板上于30℃下再划线、持续7-10天而将五十个白色孢子转化体(48-w1至48-w50)和10个黑色孢子转化体(48-b1至48-b10)纯化两次。收集来自纯化的转化体的分生孢子并用于接种包含4ml的MU-1/MLC培养基的双份FALCONTM培养管并在30℃和200rpm下孵育7天(实例6)。培养7天后，将来自每个培养物的双份样品在1643x g下离心15分钟，以产生用于淀粉葡糖苷酶活性测定(实例7)和SDS-PAGE分析(实例8)的上清液。
所有10个黑色孢子转化体(48-b1至48-b10)的淀粉葡糖苷酶活性与野生型对照菌株黑曲霉C2111和黑曲霉M1137(一种衍生自黑曲霉C2111的pyrG-分离株)一致。相比之下，白色孢子转化体的淀粉葡糖苷酶活性显著低于宿主菌株黑曲霉M1137及其亲本黑曲霉C2111。淀粉葡糖苷酶活性测定揭示，当与野生型对照菌株黑曲霉C2111和黑曲霉M1137相比时，50个白色孢子转化体中有49个产生了显著较低的淀粉葡糖苷酶活性，其中平均减少为93％(图5A和5B)。根据韦尔奇t检验(Welch’s t-test)，t(10.62)＝1.18，p>0.2，对照菌株未转化的黑曲霉C2111和10个黑色孢子转化体(48-b1至48-b10)没有显著不同，而与50个白色孢子转化体(48-w1至48-w50)相比，黑曲霉C2111的淀粉葡糖苷酶活性显著不同，t检验的结果是t(123.44)＝47.80，p<0.001。这些结果展示了孢子颜色与淀粉葡糖苷酶活性之间的直接对应关系。
如描述于实例8中，还通过SDS-PAGE对来自具有减少的淀粉葡糖苷酶(AMG)活性的所选转化体的上清液进行了分析。结果示于图6中。如在酶测定结果中所见，分泌的淀粉葡糖苷酶蛋白的产量的下降平行于较低的淀粉葡糖苷酶活性。
为了证实孢子颜色不影响酶活性，用pEvFz36(黑曲霉聚酮合酶转移性RNAi载体)转化的黑曲霉菌株M1137产生了黑色和白色两种转化体，从中分离10个白色孢子转化体(E36-w1至E36-w10)并在COVE-N-gly琼脂板上纯化两次。如描述于实例6中地制备所选转化体的试管培养物。当根据实例7测定淀粉葡糖苷酶(AMG)活性时，所有10个白色孢子转化体都展示出于黑曲霉菌株M1137可比较的活性，如示于如7A和7B中。如描述于实例8中，经由SDS-PAGE分析转化体E36-w9显示出淀粉葡糖苷酶(AMG)蛋白产量类似于黑曲霉M1137，如示于图8A和8B中。这些结果证明，插入在活跃地经历基因沉默的序列的下游的靶序列可以被有效共抑制。
实例10：质粒pEvFz49的构建
出于抑制米曲霉RIB40分生孢子黄色色素生物合成聚酮合酶wA基因(cDNA序列为SEQ ID NO:11并且推导的氨基酸序列为SEQ ID NO:12；登录号XP_001822700.1)的表达的目的，构建转移性RNAi构建体。
将质粒pEvFz49构建为包含米曲霉tef-1启动子(实例1)、米曲霉wA基因的开放阅读框的一个PCR扩增片段、大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶反向重复序列(hph-IR)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)终止子以及作为选择性标记的全长构巢曲霉pyrG基因。将米曲霉wA基因选作沉默靶标，是因为其与真菌中的分生孢子色素生物合成中涉及的其他聚酮合酶的序列一致性。
根据制造商的说明书，将来自pDM266(WO 2008/080017)的500bp片段用Nco I和Not I消化，使用QUICK LIGATIONTM试剂盒连接至Nco I/Not I消化的pEvFz35(实例2)，并将其转化进化学感受态大肠杆菌细胞中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA样品使用9600纯化并使用3130xl遗传分析仪通过DNA测序分析，以鉴定包含希望的wA插入片段的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pEvFz49(图9)。
实例11：用于共抑制米曲霉wA基因和灵芝多孔菌漆酶基因的转移性RNAi载体的构建
使用用于确定沉默效率是否受影响的不同长度的漆酶靶标，构建用于共抑制描述于实例10中的米曲霉RIB40分生孢子黄色色素生物合成聚酮合酶wA基因和灵芝多孔菌(长绒毛栓菌)漆酶基因(cDNA序列为SEQ ID NO:13并且推导的氨基酸序列为SEQ ID NO:14)的表达的转移性RNAi构建体。
在此实例中描述的所有质粒都被构建为包含米曲霉tef-1启动子(位于米曲霉wA基因的开放阅读框的500bp片段的上游)、灵芝多孔菌漆酶基因的开放阅读框内的不同长度片段、来自大肠杆菌的507bp大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶反向重复序列(hph-IR)、黑曲霉淀粉葡糖苷酶(AMG)终止子、以及作为选择性标记的构巢曲霉pyrG基因。
质粒pEvFz51的构建。根据制造商的说明书，使用植物全型试剂盒(Plant Maxi Kit)(凯杰公司，巴伦西亚，加州，美国)制备米曲霉DSY10的基因组DNA。使用以下示出的引物自米曲霉DSY10基因组DNAPCR扩增来自灵芝多孔菌漆酶基因的开放阅读框的5’端的200bp片段，其中两个引物的5’端都被工程化为包含描述于实例10中的线性载体pEvFz49的末端的20bp的同源序列。
(正义)：
5’-CCTGCGTTCGTTCTGCGGCCATGATGTCGAGGTTTCACTCTC-3’(SEQ ID NO:15)
(反义)：
5’-TCCCCGAACATCGCGCGGCCTGGAAGCGATCCCCCATGTTACCG G-3’(SEQ ID NO:16)
漆酶编码序列由加下划线的字母表示。
扩增反应由以下构成：1X反应缓冲液(安捷伦科技(Agilent Technologies)，拉荷亚，加州，美国)、0.2mM dNTPs、200ng的米曲霉DSY10基因组DNA、50皮摩尔的正义引物0612662、50皮摩尔的反义引物0612663、以及2.5单位的Hotstart DNA聚合酶(安捷伦科技，拉荷亚，加州，美国)，总体积为50μl。在 5333中孵育反应，其被编程为：1个循环，在92℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在92℃下持续30秒、63℃下持续30秒、以及72℃下持续30秒；最终延长，在72℃下持续10分钟；并且保存于10℃下。将240bp的所得PCR产物使用TAE缓冲液通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒进一步纯化。
将质粒pEvFz49用Not I消化并根据制造商的方案，使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司，巴伦西亚，加州，美国)纯化。根据制造商的说明书，使用IN-FUSIONTM优越PCR克隆试剂盒将240bp PCR产物连接至Not I消化的pEvFz49并将连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌细胞中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA使用9600纯化并使用3130xl遗传分析仪通过DNA测序分析，以鉴定包含希望的灵芝多孔菌漆酶插入片段的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pEvFz51(图10)。
质粒pEvFz54的构建。使用以下示出的引物自米曲霉DSY10基因组DNAPCR扩增来自灵芝多孔菌漆酶基因的开放阅读框的中间区域的500bp片段，其中两个引物的5’端都被工程化为包含描述于实例10中的线性载体pEvFz49的末端的20bp的同源序列。
引物0612666(正义)：
5’-CCTGCGTTCGTTCTGCGGCCCGCATTCCCTCTCGGCGCCGACGC CACCCTCATCA-3’(SEQ ID NO:17)
引物0612667(反义)：
5’-TCCCCGAACATCGCGCGGCCTGATGGCCAGGTCGACACCAC-3’(SEQ ID NO:18)
漆酶编码序列由加下划线的字母表示。
扩增反应由以下构成：1X反应缓冲液、0.2mM dNTPs、200ng的米曲霉DSY10基因组DNA、50皮摩尔的正义引物0612666、50皮摩尔的反义引物0612667、以及2.5单位的Hotstart DNA聚合酶，总体积为50μl。在5333中孵育反应，其被编程为：1个循环，在92℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在92℃下持续30秒、65℃下持续30秒、以及72℃下持续30秒；最终延长，在72℃下持续10分钟；并且保存于10℃下。将540bp的所得PCR产物使用TAE缓冲液通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒进一步纯化。
将质粒pEvFz49用Not I消化并根据制造商的方案，使用PCR纯化试剂盒纯化。
根据制造商的说明书，使用IN-FUSIONTM优越PCR克隆试剂盒将540bpPCR产物连接至Not I消化的pEvFz49并将连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌细胞中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA使用9600纯化并使用3130xl遗传分析仪通过DNA测序分析，以鉴定包含希望的灵芝多孔菌漆酶插入片段的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pEvFz54(图11)。
质粒pEvFz55的构建。使用以下示出的引物自米曲霉DSY10基因组DNAPCR扩增来自灵芝多孔菌漆酶基因的开放阅读框的3’端的500bp片段，其中两个引物的5’端都被工程化为包含描述于实例10中的线性载体pEvFz49的末端的20bp的同源序列。
引物0612668(正义)：
5’-CCTGCGTTCGTTCTGCGGCCGCACCAACTTCTTCATCAACGGCG CGTCTTTCAC-3’(SEQ ID NO:19)
引物0612669(反义)：
5’-TCCCCGAACATCGCGCGGCCTTACTGGTCGCTCGGGTCGA-3’(SEQ ID NO:20)
漆酶编码序列由加下划线的字母表示。
扩增反应由以下构成：1X反应缓冲液、0.2mM dNTPs、200ng的米曲霉DSY10基因组DNA、50皮摩尔的正义引物0612668、50皮摩尔的反义引物0612669、以及2.5单位的Hotstart DNA聚合酶，总体积为50μl。在5333中孵育反应，其被编程为：1个循环，在92℃下持续2分钟；30个循环，每个循环在92℃下持续30秒、67℃下持续30秒、以及72℃下持续30秒；最终延长，在72℃下持续10分钟；并且保存于10℃下。将540bp的所得PCR产物使用TAE缓冲液通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒进一步纯化。
将质粒pEvFz49用Not I消化并根据制造商的方案，使用PCR纯化试剂盒纯化。
根据制造商的说明书，使用IN-FUSIONTM优越PCR克隆试剂盒将540bpPCR产物连接至Not I消化的pEvFz49并将连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌细胞中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA使用9600纯化并使用3130xl遗传分析仪通过DNA测序分析，以鉴定包含希望的灵芝多孔菌漆酶插入片段的质粒。将一个具有预期的DNA序列的质粒指定为pEvFz55(图12)。
实例12：原生质体制备与米曲霉转化
使米曲霉菌株DSY10ΔpyrG在补充有10mM尿苷的PDA板上于34℃下生长7天。根据宾替拉(Penttila)等人，1987，基因(Gene)61:155-164的方案进行原生质体制备与转化。简言之，将分生孢子在100ml补充有2％(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的YP培养基中，伴随110rpm下的搅拌在28℃下培养16-18小时。通过使用衬有无菌的无菌漏斗进行过滤来收集未成熟幼殖体并用补充有20mM CaCl2的0.7M KCl洗涤两次。通过将洗涤的幼殖体悬浮于补充有20mM CaCl2、包含20mg的200G/ml和0.2mg的几丁质酶(西格玛-奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)/ml的10ml的0.7M KCl中在37℃下持续30-90分钟(伴随在80rpm下的混合)产生原生质体。将原生质体混合物通过衬有无菌的无菌漏斗过滤，并用补充有20mM CaCl2的0.7M KCl洗涤以释放陷于中的任何原生质体。通过在1,303x g下离心10分钟并将沉淀再悬浮于20ml的STC溶液中收集原生质体。将原生质体第二次重复洗涤。使用血球计数器对原生质体计数并再悬浮至终浓度为2x 107个原生质体/STC溶液。将过量的原生质体在-80℃下储存于Cryo 1℃冷冻容器中。
将大约3μg的质粒DNA添加至100μl的原生质体溶液中并轻轻混合。添加三百毫升的60％PEG-4000溶液，混合，并在室温下孵育30分钟。孵育后，然后将45ml的pyrG选择顶层琼脂糖添加至DNA转化混合物中并涂在三个基本培养基转化板上。将这些板在34℃下孵育5-7天。使用尼康(Nikon)SMZ1500立体显微镜(尼康，梅尔维尔，纽约，美国)可视地检查初生转化体的孢子着色的消失。将转化体在基本培养基琼脂板上孢子纯化三次并在34℃下生长5-7天。
实例13：转化体的培养
将来自实例12的所选转化体的孢子悬浮液收集在溶液0.01％20中。用来自每个转化体的0.2ml孢子悬浮液接种包含25ml的MY25培养基(补充有1mM Cu2SO4)的双份摇瓶，并在34℃和200rpm下孵育5天。通过在1643x g下离心10分钟收集培养物上清液并测定漆酶活性，如描述于实例14中。
实例14：漆酶测定
根据以下方法，使用3000和NX测定培养物上清液的漆酶活性。将培养物上清液1/10稀释于0.1M乙酸钠0.01％X-100pH 5.0(样品缓冲液)中，随后将稀释的样品从0倍连续稀释至1/3倍至1/9倍。使用2倍步骤在样品缓冲液中稀释来自嗜热毁丝霉的纯化的漆酶标准品(诺维信公司，鲍斯韦，丹麦)，起始于0.0865LACCU/ml浓度并且结束于0.01LACCU/ml浓度。将包括标准品的每个稀释的共20μl转移至96孔平底板中。向每个孔中添加二百微升的ABTS(2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))底物溶液(0.1M乙酸钠pH 5.0+0.275mg/ml ABTS+0.01％X-100)并且然后在环境温度下孵育30分钟。在孵育过程中，针对96孔板在光密度为405nm下测量反应速率。通过从生成的标准曲线外推确定样品浓度。
实例15：插入转录RNAi揭示在米曲霉中实质性共抑制孢子颜色和漆酶活性两者
衍生自pEvFz49的质粒pEvFz51、pEvFz54和pEvFz55是相似的，因为所有灵芝多孔菌漆酶衍生的片段都被插入在pEvFz49的Not I限制酶切位点处，该限制酶切位点直接在500bp米曲霉wA片段的下游并且直接在507bphph反向重复序列的上游。质粒pEvFz51包含一个来源于灵芝多孔菌漆酶基因的5’端的200bp片段，pEvFz54包含一个来源于中心区的500bp片段，并且pEvFz55包含一个来源于灵芝多孔菌漆酶基因的3’端的500bp片段。
使用三微克的来自每个质粒的DNA转化如描述于实例12中而制备的米曲霉菌株DSY10ΔpyrG的原生质体，并且基本培养基转化板上于34℃下进行选择，持续5-7天。将十个显示出孢子着色消失的转化体和两个代表野生型表型的绿色孢子转化体(每转化的质粒)在基本培养基琼脂板上于34℃下孢子纯化两次，持续5-7天。收集来自纯化的转化体的分生孢子并用于接种包含25ml的MY25培养基(补充有1mM Cu2SO4)的双份摇瓶，并在34℃和200rpm下孵育7天(实例13)。米曲霉菌株DSY10和HowB104分别作为漆酶活性的阳性对照和阴性对照而被包括。培养5天后，通过在1643x g下离心10分钟收获培养物样品，以产生用于漆酶活性测定的上清液(实例14)。
漆酶测定结果显示与对照菌株米曲霉DSY10相比，所有分离自用pEvFz51进行转化的白色孢子转化体(EvFz51-w1至EvFz51-w10)的酶活性都至少降低两倍。用转化体EvFz54-w1至EvFz54-w10和EvFz55-w1至EvFz55-w10展示出了类似结果(图13A和13B)。当与野生型对照相比时，评估的所有白色孢子转化体的漆酶活性都显著低于对照菌株米曲霉DSY10，其中平均减少为50％。还获得了六个具有绿色(野生型)孢子颜色的转化体(EvFz51-g1、EvFz51-g2、EvFz54-g1、EvFz54-g2、EvFz55-g1以及EvFz55-g2)并且展现出与米曲霉DSY10的酶水平可比较的酶水平，表明用三个插入转移性RNAi构建体单独进行转化既不影响孢子着色又不影响漆酶生产力。此外，两个基因的表达的减少紧密相关。
为了证实孢子颜色不影响酶活性，用对照质粒pEvFz49转化米曲霉菌株DSY10ΔpyrG，该对照质粒仅包含507bp hph-IR上游的米曲霉聚酮合酶基因的500bp片段，该转化产生了孢子颜色在绿色(野生型)至白色范围内变化的转化体，并且从这些转化体中分离两个绿色孢子转化体(EvFz49-g1和EvFz49-g2)和10个白色孢子转化体(EvFz49-w1至EvFz49-w10)并在基本培养基琼脂板上纯化两次。如描述于实例13中地制备所选转化体的摇瓶。当根据实例14测定漆酶活性时，正如所料，所有10个白色孢子转化体都展示出与米曲霉菌株DSY10可比较的活性(图13A和13B)，这归因于不存在灵芝多孔菌漆酶靶标。这些结果证明，孢子着色的变异对漆酶活性没有影响。
这些结果还揭示，200bp或500bp的靶序列有效于沉默感兴趣的基因，并且靶标长度对于在群体内诱导基因沉默事件而言不是决定性的。此实验清楚地证明在米曲霉中成功地共抑制了两个靶标。
实例16：质粒pHiTe43的构建
先前，通过在包含胞嘧啶类似物5-氟胞嘧啶(5-FC)的固体培养基上进行基因突变逆选择生长而在酿酒酵母中鉴定了编码胞嘧啶脱氨酶的酵母fcy1基因(纪灵(Hartzog)等人，2005，酵母(Yeast)22:789-798)。在功能性fcy1标记的存在下，将5-FC转化为有毒化合物5-氟脲嘧啶(5-FU)(纪灵(Hartzog)等人，2005，同上)。
用于构建pHiTe43，使用来自黑曲霉菌株M1137的基因组DNA作为模板通过PCR获得黑曲霉fcy1(cDNA序列为SEQ ID NO:21并且推导的氨基酸序列为SEQ ID NO:22；EMBL:am269962)基因片段。使用植物迷你试剂盒(Plant Mini Kit)(凯杰公司，巴伦西亚，加州，美国)制备黑曲霉菌株M1137的基因组DNA。使用以下引物通过PCR获得具有引入在末端处的Nco I和Not I位点的fcy1基因的266bp片段：
引物HTCA-28(正义)：
5'-CATGGCCATGGGCTGAGATGTCCGCGCT-3'(SEQ ID NO:23)
引物HTCA-29(反义)：
5'-ATAAGAATGCGGCCGCCAAAGCTCCGGCTTCTCCT-3'(SEQ ID NO:24)。
扩增反应由以下构成：1XPCR缓冲液II、0.2mM dNTPs、100ng的黑曲霉M1137基因组、50皮摩尔的正义引物HTCA-28、50皮摩尔的反义引物HTCA-29、以及5个单位的AMPLITAQDNA聚合酶，总体积为50μl。在5333中孵育反应，其被编程为：1个循环，在95℃下持续9分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续30秒；最终延长，在72℃下持续30秒；并且保存于10℃下。将266bp的所得PCR产物使用TAE缓冲液通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒进一步纯化。
将质粒pEvFz36(实例3)用Nco I和Not I消化并根据制造商的方案，使用PCR纯化试剂盒纯化。
根据制造商的说明书，使用QUICK LIGATIONTM试剂盒将266bp PCR产物连接至Nco I/Not I消化的pEvFz36质粒并将连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌细胞中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA使用9600纯化并使用3130xl遗传分析仪通过DNA测序分析，以鉴定包含希望的黑曲霉fcy1插入片段的质粒。将一个具有正确序列的质粒指定为pHiTe43(图14)。
实例17：质粒pHiTe49的构建
使用以下示出的引物自pHiTe08(SEQ ID NO:8)扩增瓣环栓菌淀粉葡糖苷酶(AMG)开放阅读框的200bp片段，其中两个引物的5’端都被工程化为包含描述于实例16中的线性载体pHiTe43的末端的15-17bp的同源序列。
引物HTCA-40(正义)：
5’-GGAGCTTTGGCGGCCATGCGTTTCACGCTCCTCAC-3’(SEQ IDNO:25)
引物HTCA-41(反义)：
5’-GAACATCGCGCGGCCGCTTCGGGTGGATGTGCTCG-3’(SEQ IDNO:26)
扩增反应由以下构成：1XPCR缓冲液II、0.2mM dNTPs、20ng的pHiTe08质粒DNA、50皮摩尔的正义引物HTCA-40、50皮摩尔的反义引物HTCA-41、以及5个单位的AMPLITAQDNA聚合酶，总体积为50μl。在5333中孵育反应，其被编程为：1个循环，在95℃下持续9分钟；30个循环，每个循环在95℃下持续30秒、55℃下持续30秒、以及72℃下持续30秒；最终延长，在72℃下持续30秒；并且保存于10℃下。将200bp的所得PCR产物使用TAE缓冲液通过0.8％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切离，并使用凝胶提取试剂盒进一步纯化。
将质粒pHiTe43用Not I消化并且然后用南极磷酸酶(纽英伦生物技术有限公司(New England Biolabs,Inc.)，伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)脱磷酸化。脱磷酸反应由以下构成：1X南极磷酸酶反应缓冲液和添加至先前Not I消化中的5个单位的南极磷酸酶。将反应在37℃下孵育15分钟，随后在70℃下热失活5分钟。将脱磷酸反应物直接用于连接。
根据制造商的说明书，使用IN-FUSIONTM优越PCR克隆试剂盒将200bpPCR产物连接至Not I消化的pHiTe43并将连接混合物转化进化学感受态大肠杆菌细胞中。在包含100μg的氨比西林/ml的2XYT琼脂板上选择转化体。将来自若干转化体的质粒DNA使用9600纯化并使用3130xl遗传分析仪通过DNA测序分析，以鉴定包含希望的灵芝多孔菌漆酶插入片段的质粒。将一个具有正确序列的质粒指定为pHiTe49(图15)。
实例18：使用插入转移性沉默对fcy1进行逆选择揭示了瓣环栓菌AMG靶标在黑曲霉中的有效共抑制
如描述于实例5中，使用质粒pHiTe49转化制备自黑曲霉菌株EvFz5的原生质体。将转化的原生质体涂布在缺乏尿苷和5-氟胞嘧啶(西格玛-奥德里奇，圣路易斯，密苏里州，美国)的COVE-N-JP转化琼脂板上。允许乳清苷-5’-磷酸羧化酶(pyrG)原养型在30℃下再生4天，此时将包含1μg/ml 5-氟胞嘧啶(5-FC)的15ml COVE-N-JP顶层琼脂糖覆盖在转化板上并再于30℃下孵育6-10天。将1μg/ml 5-FC上再生的共18个转化体在包含1μg/ml 5-FC的COVE-N-gly琼脂板上继代培养两次。用于试管培养物分析，将来自能够在5-FC上生长的转化体的分生孢子接种在包含4ml的MU-1/MLC培养基的14ml FALCONTM培养管中并在30℃和200rpm下孵育7天(实例6)。通过在1643x g下离心15分钟收集四毫升的来自每个培养物的培养液。如描述于实例7中，测定收集的培养液的淀粉葡糖苷酶(AMG)活性。与表达于未转化的宿主菌株黑曲霉JoanTc3中的13AGU相比，所有18个转化体表达的淀粉葡糖苷酶活性的中位酶活性为1.4AGU。总体上，这18个转化体显示出平均为89.5％的酶降低(图16A和16B)。这些实验证实(1)RNA干扰的效力足以刺激fcy1的遗传营养缺陷型并且(2)黑曲霉fcy1和瓣环栓菌AMG两者的同时共抑制表明RNAi诱导物的上游的基因沉默的等价性。
通过以下编号的段落进一步描述本发明：
[1]一种用于在丝状真菌菌株中共沉默编码生物物质的基因的表达的方法，包括：(a)向该丝状真菌菌株的基因组中插入一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；并且其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且(b)通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达。
[2]如段落1所述的方法，其中与该第一靶基因具有同源性的该第一可转录区包括该第一靶基因的至少19个核苷酸。
[3]如段落1或2所述的方法，其中与该第二靶基因具有同源性的该第二可转录区包括该第二靶基因的至少19个核苷酸。
[4]如段落1-3中任一项所述的方法，其中与该第一和第二靶基因无有效同源性的该第三可转录区包括至少19个核苷酸。
[5]如段落4所述的方法，其中该第三可转录区与该丝状真菌菌株的基因组无有效同源性。
[6]如段落4所述的方法，其中该第三可转录区与一个第三靶基因具有同源性。
[7]如段落1-6中任一项所述的方法，其中该第一靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[8]如段落1-7中任一项所述的方法，其中该第二靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[9]如段落6-8所述的方法，其中该第三靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[10]如段落1-9中任一项所述的方法，其中这些短干扰RNA与这些靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默这些靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[11]如段落10所述的方法，其中这些靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[12]如段落1-11中任一项所述的方法，其中该双链可转录核酸构建体进一步包括至少一个另外的多核苷酸，该至少一个另外的多核苷酸包括一个与编码另外的生物物质的另外的靶基因具有同源性的另外的可转录区。
[13]如段落12所述的方法，其中与该另外的靶基因具有同源性的该另外的可转录区包括该另外的靶基因的至少19个核苷酸。
[14]如段落12或13所述的方法，其中该另外的靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[15]如段落12-14中任一项所述的方法，其中这些短干扰RNA与该另外的靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[16]如段落15所述的方法，其中该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[17]一种丝状真菌菌株，该丝状真菌菌株包括一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达。
[18]如段落17所述的丝状真菌菌株，其中该第一同源区包括该第一靶基因的至少19个核苷酸。
[19]如段落17或18所述的丝状真菌菌株，其中该第二同源区包括该第二靶基因的至少19个核苷酸。
[20]如段落17-19中任一项所述的丝状真菌菌株，其中与该第一和第二靶基因无有效同源性的该第三可转录区包括至少19个核苷酸。
[21]如段落20所述的丝状真菌菌株，其中该第三可转录区与该丝状真菌菌株的基因组无有效同源性。
[22]如段落20所述的丝状真菌菌株，其中该第三可转录区与一个第三靶基因具有同源性。
[23]如段落17-20中任一项所述的丝状真菌菌株，其中该第一靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[24]如段落17-23中任一项所述的丝状真菌菌株，其中该第二靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[25]如段落22-24所述的丝状真菌菌株，其中该第三靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[26]如段落17-25中任一项所述的丝状真菌菌株，其中这些短干扰RNA与这些靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默这些靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[27]如段落26所述的丝状真菌菌株，其中这些靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[28]如段落17-27中任一项所述的丝状真菌菌株，其中该双链可转录核酸构建体进一步包括至少一个另外的多核苷酸，该至少一个另外的多核苷酸包括一个与编码另外的生物物质的另外的靶基因具有同源性的另外的可转录区。
[29]如段落28所述的丝状真菌菌株，其中与该另外的靶基因具有同源性的该另外的可转录区包括该另外的靶基因的至少19个核苷酸。
[30]如段落28或29所述的丝状真菌菌株，其中该另外的靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[31]如段落28-30中任一项所述的丝状真菌菌株，其中这些短干扰RNA与该另外的靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[32]如段落31所述的丝状真菌菌株，其中该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[33]一种用于产生感兴趣的生物物质的方法，包括在有助于产生该感兴趣的生物物质的条件下培养一种丝状真菌菌株，其中该丝状真菌菌株包括一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；其中通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为包括有待被沉默的靶基因的序列的siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达；并且其中该丝状真菌菌株包括一个编码该感兴趣的生物物质的第四多核苷酸。
[34]如段落33所述的方法，进一步包括从培养基中回收该感兴趣的生物物质。
[35]如段落33或34所述的方法，其中与该第一靶基因具有同源性的该第一可转录区包括该第一靶基因的至少19个核苷酸。
[36]如段落33-35中任一项所述的方法，其中与该第二靶基因具有同源性的该第二可转录区包括该第二靶基因的至少19个核苷酸。
[37]如段落33-36中任一项所述的方法，其中与该第一和第二靶基因无有效同源性的该第三可转录区包括至少19个核苷酸。
[38]如段落37所述的方法，其中该第三可转录区与该丝状真菌菌株的基因组无有效同源性。
[39]如段落37所述的方法，其中该第三可转录区与一个第三靶基因具有同源性。
[40]如段落33-39中任一项所述的方法，其中该第一靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[41]如段落33-40中任一项所述的方法，其中该第二靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[42]如段落39-41所述的方法，其中该第三靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[43]如段落33-42中任一项所述的方法，其中这些短干扰RNA与这些靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默这些靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[44]如段落43所述的方法，其中这些靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[45]如段落33-44中任一项所述的方法，其中该双链可转录核酸构建体进一步包括至少一个另外的多核苷酸，该至少一个另外的多核苷酸包括一个与编码另外的生物物质的另外的靶基因具有同源性的另外的可转录区。
[46]如段落45所述的方法，其中与该另外的靶基因具有同源性的该另外的可转录区包括该另外的靶基因的至少19个核苷酸。
[47]如段落45或46所述的方法，其中该另外的靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[48]如段落45-47中任一项所述的方法，其中这些短干扰RNA与该另外的靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[49]如段落48所述的方法，其中该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[50]一种用于在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法，包括：(a)用一个双链可转录核酸构建体转化一个群体的丝状真菌宿主细胞，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中该双链可转录核酸构建体插入该丝状真菌宿主细胞的基因组中；(b)通过以下产生包括有待被沉默的靶基因的序列的短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌宿主细胞在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌宿主细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达；(c)从该转化的丝状真菌宿主细胞群体中选择展现出表型改变的转化体；并且(d)通过测量相对于由该丝状真菌宿主细胞产生的该生物物质的水平的由每个转化体产生的该生物物质的水平，针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默而对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选。
[51]如段落50所述的方法，进一步包括分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。
[52]如段落50或51所述的方法，其中与该第一靶基因具有同源性的该第一可转录区包括该第一靶基因的至少19个核苷酸。
[53]如段落50-52中任一项所述的方法，其中与该第二靶基因具有同源性的该第二可转录区包括该第二靶基因的至少19个核苷酸。
[54]如段落50-53中任一项所述的方法，其中与该第一和第二靶基因无有效同源性的该第三可转录区包括至少19个核苷酸。
[55]如段落50-54中任一项所述的方法，其中该第一靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[56]如段落50-55中任一项所述的方法，其中该第二靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[57]如段落50-56中任一项所述的方法，其中这些短干扰RNA与该第一和第二靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默该第一和第二靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[58]如段落57所述的方法，其中这些靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[59]如段落50-58中任一项所述的方法，其中该双链可转录核酸构建体进一步包括至少一个另外的多核苷酸，该至少一个另外的多核苷酸包括一个与编码另外的生物物质的另外的靶基因具有同源性的另外的可转录区。
[60]如段落59所述的方法，其中与该另外的靶基因具有同源性的该另外的可转录区包括该另外的靶基因的至少19个核苷酸。
[61]如段落59或60所述的方法，其中该另外的靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[62]如段落59-61中任一项所述的方法，其中这些短干扰RNA与该另外的靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[63]如段落62所述的方法，其中该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[64]一种用于在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法，包括：(a)用一个来自该丝状真菌细胞的DNA文库转化该丝状真菌细胞的一个群体，其中将该DNA文库的每个成员都克隆进一个双链可转录核酸构建体中，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括该DNA文库的一个成员作为与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中该双链可转录核酸构建体插入该丝状真菌细胞的基因组中；(b)通过以下产生包括有待被沉默的靶基因的序列的短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌细胞的转化群体在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达；(c)从该转化的丝状真菌细胞群体中选择展现出表型改变的转化体；并且(d)通过测量相对于由该丝状真菌细胞产生的该生物物质的水平的由每个转化体产生的该生物物质的水平，针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默而对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选。
[65]如段落64所述的方法，进一步包括分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。
[66]如段落64或65所述的方法，其中与该第一靶基因具有同源性的该第一可转录区包括该第一靶基因的至少19个核苷酸。
[67]如段落64-66中任一项所述的方法，其中与该第二靶基因具有同源性的该第二可转录区包括该第二靶基因的至少19个核苷酸。
[68]如段落64-67中任一项所述的方法，其中与该第一和第二靶基因无有效同源性的该第三可转录区包括至少19个核苷酸。
[69]如段落64-68中任一项所述的方法，其中该第一靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[70]如段落64-69中任一项所述的方法，其中该第二靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[71]如段落64-70中任一项所述的方法，其中这些短干扰RNA与该第一和第二靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默该第一和第二靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[72]如段落71所述的方法，其中这些靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[73]如段落64-72中任一项所述的方法，其中该双链可转录核酸构建体进一步包括至少一个另外的多核苷酸，该至少一个另外的多核苷酸包括一个与编码另外的生物物质的另外的靶基因具有同源性的另外的可转录区。
[74]如段落73所述的方法，其中与该另外的靶基因具有同源性的该另外的可转录区包括该另外的靶基因的至少19个核苷酸。
[75]如段落73或74所述的方法，其中该另外的靶基因的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[76]如段落73-75中任一项所述的方法，其中这些短干扰RNA与该另外的靶基因的一种或多种同系物的RNA转录本相互作用，以沉默该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达。
[77]如段落76所述的方法，其中该另外的靶基因的该一种或多种同系物的表达被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
[78]一种双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。
[79]一种双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括DNA文库的一个成员作为与编码感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的一个第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。
[80]一种载体，包括如段落78或79所述的双链可转录核酸构建体。
在此描述和要求的本发明不由在此披露的具体实施例限制范围，这是因为这些实施例旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等价的实施例都旨在处于本发明的范围之内。事实上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得显而易见的。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
在此引用了不同的参考，其披露通过引用以其全部内部结合在此。

Claims (18)

1.一种用于在丝状真菌菌株中共沉默编码生物物质的基因的表达的方法，包括：
(a)向该丝状真菌菌株的基因组中插入一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；并且其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且
(b)通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中该第三可转录区与一个第三靶基因具有同源性。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中这些靶基因的每一个的表达都被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
4.一种丝状真菌菌株，该丝状真菌菌株包括一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达。
5.如权利要求4所述的丝状真菌菌株，其中该第三可转录区与一个第三靶基因具有同源性。
6.如权利要求4或5所述的丝状真菌菌株，其中这些靶基因的每一个的表达都被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
7.一种用于产生感兴趣的生物物质的方法，包括在有助于产生该感兴趣的生物物质的条件下培养一种丝状真菌菌株，其中该丝状真菌菌株包括一个双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；其中通过以下产生短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌菌株在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为包括有待被沉默的靶基因的序列的siRNA，这些siRNA与这些靶基因的RNA转录本相互作用，以沉默编码该第一和第二生物物质的靶基因的表达；并且其中该丝状真菌菌株包括一个编码该感兴趣的生物物质的第四多核苷酸。
8.如权利要求7所述的方法，进一步包括从培养基中回收该感兴趣的生物物质。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中该第三可转录区与一个第三靶基因具有同源性。
10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中这些靶基因的每一个的表达都被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
11.一种用于在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法，包括：
(a)用一个双链可转录核酸构建体转化该丝状真菌宿主细胞的一个群体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中该双链可转录核酸构建体插入该丝状真菌宿主细胞的基因组中；
(b)通过以下产生包括有待被沉默的靶基因的序列的短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌宿主细胞在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌宿主细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达；
(c)从该转化的丝状真菌宿主细胞群体中选择展现出表型改变的转化体；并且
(d)通过测量相对于由该丝状真菌宿主细胞产生的该生物物质的水平的由每个转化体产生的该生物物质的水平，对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选，该表型改变针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包括分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中这些靶基因的每一个的表达都被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
14.一种用于在丝状真菌细胞中鉴定编码感兴趣的生物物质的基因的方法，包括：
(a)用一个来自该丝状真菌细胞的DNA文库转化该丝状真菌细胞的一个群体，其中将该DNA文库的每个成员都克隆进一个双链可转录核酸构建体中，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括该DNA文库的一个成员作为与编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区；其中该第三可转录区包括两个在相反方向上彼此互补的区段；其中该第一、第二和第三可转录区被转录为一个单链RNA分子；并且其中该双链可转录核酸构建体插入该丝状真菌细胞的基因组中；
(b)通过以下产生包括有待被沉默的靶基因的序列的短干扰RNA(siRNA)：将该丝状真菌细胞的转化群体在一定条件下培养，以产生该双链可转录核酸构建体的RNA转录本，这些RNA转录本然后被转化为siRNA，这些siRNA与该第一靶基因的RNA转录本相互作用从而引起该转化的丝状真菌细胞的表型改变并且与该第二靶基因的RNA转录本相互作用从而沉默该感兴趣的生物物质的表达；
(c)从该转化的丝状真菌细胞群体中选择展现出表型改变的转化体；并且
(d)通过测量相对于由该丝状真菌细胞产生的该生物物质的水平的由每个转化体产生的该生物物质的水平，对每个展现出表型改变的所选转化体进行筛选，该表型改变针对编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因的沉默。
15.如权利要求14所述的方法，进一步包括分离编码该感兴趣的生物物质的第二靶基因。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中这些靶基因的每一个的表达都被减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或100％。
17.一种双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码第一生物物质的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括一个与编码第二生物物质的第二靶基因具有同源性的第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。
18.一种双链可转录核酸构建体，该构建体包括一个可操作地连接至一个第一多核苷酸的启动子，该第一多核苷酸包括一个与编码表型标记的第一靶基因具有同源性的第一可转录区，一个第二多核苷酸，该第二多核苷酸包括DNA文库的一个成员作为与编码感兴趣的生物物质的第二靶基因具有同源性的一个第二可转录区，以及一个第三多核苷酸，该第三多核苷酸包括一个与该第一和第二靶基因无有效同源性的第三可转录区。
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CN115125260A (zh) * 2022-05-27 2022-09-30 北京大学现代农业研究院 一种匍柄霉聚酮合成酶基因pks1及应用
CN115125260B (zh) * 2022-05-27 2023-05-26 北京大学现代农业研究院 一种匍柄霉聚酮合成酶基因pks1及应用

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