CN104593330A - 含有a型流感特异性启动子的重组293t细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有A型流感特异性启动子的重组293T细胞及其应用。本发明所提供的重组细胞为向293T细胞中转入重组质粒后得到的重组细胞；所述重组质粒含有融合基因；所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2顺次连接构成的融合基因；所述片段1的核苷酸序列为序列表中序列1的第14-58位；所述片段2的核苷酸序列为序列表中序列1的第1712-1734位。本发明所提供的重组细胞可以通过检查报告基因的表达水平研究相关蛋白及化合物与流感病毒vRNP的相互作用、监测流感病毒的繁殖程度，同时可用于有效筛选抗流感病毒药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种含有A型流感特异性启动子的重组293T细胞及其应用。
背景技术
流感病毒属于正黏病毒科，是球形负链RNA病毒，其基因组包含8个RNA片段。流感病毒聚合酶PA、PB1、PB2蛋白组成流感病毒的聚合酶复合体。该聚合酶复合体与流感病毒RNA片段以及NP蛋白共同组成病毒核糖核蛋白复合体(vRNP)。每一段病毒RNA都由编码区和两端的非编码区(UTR)组成，非编码区3’端的12个碱基和5’端的13个碱基在八个片段中是高度保守的，这两段保守碱基部分互补，形成一个部分配对的结构，对于病毒的转录和复制都是必须的，称为流感病毒的启动子。
293T细胞由293细胞衍生而出，293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，同时表达SV40大T抗原。瞬时转染293T细胞是过表达蛋白并获得细胞内及细胞外蛋白的便捷方式。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有A型流感特异性启动子的重组293T细胞及其应用。
本发明所提供的重组细胞，具体为向293T细胞中转入重组质粒后得到的重组细胞；所述重组质粒含有融合基因；所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2顺次连接构成的融合基因(即所述报告基因位于所述片段1和所述片段2之间)；所述片段1的核苷酸序列为序列表中序列1的第14-58位；所述片段2的核苷酸序列为序列表中序列1的第1712-1734位。
其中，所述报告基因可为萤火虫荧光素酶编码基因。
所述萤火虫荧光素酶编码基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1的第59-1711位。
进一步，所述融合基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1的第14-1734位。
在本发明中，所述出发表达载体具体为pREP4载体。
相应的，所述重组质粒具体是按照如下方法制备得到的：(1)用限制性内切酶BsmBI酶切序列表中序列1所示的DNA片段，回收酶切片段后与经过同样酶切的pHH21载体的骨架大片段正向相连，得到中间质粒(命名为pHH21-IAV-Luc质粒)；(2)将所述中间质粒以NheI和PciI内切酶酶切，回收酶切所得小片段，补平末端后正向连入经PvuII内切酶消化的pREP4载体，即获得所述重组质粒(命名为pREP4-IAV-Luc)。
所述重组细胞在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(1)制备检测流感病毒的试剂盒；
(2)制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒；
(3)制备检测蛋白与流感病毒vRNP互作的试剂盒；
(4)制备检测化合物与流感病毒vRNP互作的试剂盒。
本发明还提供了一种试剂盒。
本发明所提供的试剂盒具体为具有如下功能中至少一种的试剂盒，所述试剂盒含有所述重组细胞：
(a1)检测流感病毒；
(a2)筛选抗流感病毒药物；
(a3)检测蛋白与流感病毒vRNP互作；
(a4)检测化合物与流感病毒vRNP互作。
以上所述的流感病毒可为A型流感病毒。
所述A型流感病毒进一步可为H1N1亚型流感病毒。
在本发明中，所述流感病毒具体为H1N1亚型流感病毒——A/WSN/33流感病毒。
在本发明中，所述蛋白为热休克蛋白70或其片段，具体为由热休克蛋白70的自N端起第1-385个氨基酸残基组成的蛋白，或由热休克蛋白70的自N端起第386-641个氨基酸残基组成的蛋白。所述化合物为利巴韦林或金刚烷胺。
在本发明中，进行所述检测流感病毒的方法，具体包括如下步骤：
(a)进行如下实验组和对照组；
实验组：将待测样本加到培养有所述重组细胞的培养液中，8-14h(如12h)后收细胞检测荧光素酶发光量；
对照组：与所述实验组相比，差别仅在于以对照样本替代所述待测样本，其余操作均与所述实验组相同；所述对照样本为所述实验组中采用的所述待测样本的溶解液；
(b)根据步骤(a)的检测结果，确定所述待测样本中是否含有流感病毒：若所述实验组检测到的荧光素酶发光量显著高于所述对照组检测到的荧光素酶发光量(P<0.05)，则所述待测样本中含有或候选含有流感病毒；反之，则所述待测样本中不含有或候选不含有流感病毒。
在本发明中，进行所述筛选抗流感病毒药物的方法，具体包括如下步骤：
(a)进行如下实验组和对照组；
实验组：将所述重组细胞感染所述流感病毒同时加入待测药物，8-14h(如12h)后收细胞检测荧光素酶发光量；
对照组：与所述实验组相比，差别仅在于以对照样本替代所述待测药物，其余操作均与所述实验组相同；所述对照样本为所述实验组中采用的所述待测药物的溶解液(如DMSO)；
(b)根据步骤(a)的检测结果，确定所述待测药物是否为抗流感病毒药物：若所述实验组检测到的荧光素酶发光量显著低于所述对照组检测到的荧光素酶发光量(P<0.05)，则所述待测药物为或候选为抗流感病毒药物；反之，则所述待测药物不为或候选不为抗流感病毒药物。
在本发明中，进行所述检测蛋白与流感病毒vRNP互作的方法，具体包括如下步骤：
(a)进行如下实验组和对照组；
实验组：将表达待测蛋白的重组质粒转染所述重组细胞，24h后再共转染所述流感病毒的PB1、PB2、PA、NP蛋白表达质粒，以及Renilla(海肾荧光素酶报告基因质粒)，24-48h(如24h)后收细胞检测荧光素酶发光量；
对照组：与所述实验组相比，差别仅在于以构建所述表达待测蛋白的重组质粒时所用的空载体替代所述表达待测蛋白的重组质粒，其余操作均与所述实验组相同；
(b)根据步骤(a)的检测结果，确定所述待测蛋白是否与所述流感病毒vRNP互作：若所述实验组检测到的荧光素酶发光量与所述对照组检测到的荧光素酶发光量有显著差异(P<0.05)，则所述待测蛋白能或候选能与所述流感病毒vRNP互作；反之，则所述待测蛋白不能或候选不能与所述流感病毒vRNP互作。
在本发明中，进行所述检测化合物与流感病毒vRNP互作的方法，具体包括如下步骤：
(a)进行如下实验组和对照组；
实验组：将待测化合物加到培养有所述重组细胞的培养液中，1h后将所述流感病毒的PB1、PB2、PA、NP蛋白表达质粒共转染所述重组细胞，转染24-48h(如24h)后收细胞检测荧光素酶发光量；
对照组：与所述实验组相比，差别仅在于以对照样本替代所述待测化合物，其余操作均与所述实验组相同；所述对照样本为所述实验组中采用的所述待测化合物的溶解液(如DMSO)；
(b)根据步骤(a)的检测结果，确定所述待测化合物是否与所述流感病毒vRNP互作：若所述实验组检测到的荧光素酶发光量与所述对照组检测到的荧光素酶发光量有显著差异(P<0.05)，则所述待测化合物能或候选能与所述流感病毒vRNP互作；反之，则所述待测化合物不能或候选不能与所述流感病毒vRNP互作。
本发明所用的重组质粒pREP4-IAV-Luc以pREP4为载体，同时含有萤火虫荧光素酶编码基因以及流感病毒核蛋白(NP)基因的启动子。在流感病毒存在的情况下，能够启动荧光素酶基因的表达，从而通过荧光素酶的表达量变化可以推断A型流感病毒的复制情况。此外，通过共转流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒可以检测相关蛋白以及化合物与流感病毒vRNP的互作情况。
附图说明
图1检测已知抗病毒药物利巴韦林(Ribavirin)的抗病毒效果。A：没有流感病毒感染、且未加入利巴韦林的情况(以DMSO作为阴性对照)；B：流感病毒感染、且未加入利巴韦林的情况(以DMSO作为阴性对照)；C：流感病毒感染、且加入利巴韦林的情况(利巴韦林溶于DMSO，浓度为10μg/ml)。
图2为293T-IAV-Luc以及HeLa-IAV-Luc重组细胞转染表达流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒后荧光素酶活性测量结果。A：293T-IAV-Luc及对照；B：HeLa-IAV-Luc及对照。
图3为检测热休克蛋白70与流感病毒vRNP互作的结果图。
图4为检测已知抗病毒药物利巴韦林(Ribavirin)与金刚烷胺(Amantadine)与流感病毒vRNP互作的结果图。A：利巴韦林与流感病毒vRNP互作的结果图；B：金刚烷胺与流感病毒vRNP互作的结果图。图中，“对照”即表示空白对照组；“vRNP”即表示vRNP对照组。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
293T细胞(人肾上皮细胞)：购自ATCC，细胞系编号为CRL-11268。
Hela细胞(子宫颈癌细胞)：购自ATCC，细胞系编号为：CCL-2。
DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)：购自Gibco公司。
转染试剂PEI：购自Polyscience公司。
荧光素酶活性测量试剂盒：购自Promega公司。
三氮唑核苷病毒唑(利巴韦林)：购自Sigma公司；
金刚烷胺：购自Sigma公司。
潮霉素(Hygromycin)：购自Roche公司。
A/WSN/33流感病毒毒株：为A型流感病毒H1N1亚型毒株，该毒株记载于“NeumannG1,Watanabe T,Ito H,et al.Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.PNAS,1999(16):9345-9350”一文，公众可从中国科学院微生物学研究所获得。
pREP4载体：记载于“李云芳,张幼怡,侯嵘等.质粒转染对HEK293和DDT1—MF2细胞天然β2—肾上腺素受体表达的影响.北京大学学报：医学版,2001年底5期”一文，公众可从中国科学院微生物学研究所获得。
表达流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒：记载于“Zhang J,Liu T,Tong X,et al.Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell basedscreening.Antiviral Ras,2012(1):48-54”一文，公众可从中国科学院微生物学研究所获得。
实施例1、含有A型流感特异性启动子的重组293T细胞的构建
一、pREP4-IAV-Luc质粒的构建及转染293T细胞
1、pREP4-IAV-Luc质粒的构建
人工合成序列表中序列1所示DNA片段。序列1共由1748个核苷酸组成，第14-58位记为片段1，第59-1711位为萤火虫荧光素酶编码基因(报告基因)，第1712-1734位记为片段2，两端为BsmB I的识别位点序列。其中，片段1和片段2均为流感病毒NP蛋白的启动子，在流感病毒存在的情况下，位于该融合质粒上的该启动子可被启动，萤火虫荧光素酶才能够表达。
用限制性内切酶BsmBI酶切序列表中序列1所示的DNA片段，回收酶切片段后与经过同样酶切的pHH21载体的骨架大片段正向相连，将测序验证正确的中间质粒命名为pHH21-IAV-Luc质粒。将pHH21-IAV-Luc质粒以NheI和PciI内切酶(Takara)酶切，回收酶切片段，以Klenow酶(购自Takara公司)补平末端后连入PvuII内切酶消化的pREP4载体，将测序验证正确的重组质粒命名为pREP4-IAV-Luc。
2、pREP4-IAV-Luc质粒转染293T细胞
pREP4-IAV-Luc质粒扩增后，测量质粒浓度，用转染试剂PEI转染3μgpREP4-IAV-Luc质粒至3.5cm培养皿中的293T细胞。用含10％(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基培养细胞。
二、筛选稳定表达流感特异启动子报告基因的单克隆细胞
转染36h之后，将细胞按1:384的比例传代至10cm细胞培养皿，24小时后更换新鲜培养基，并加入250μg/ml的潮霉素进行筛选，每隔2-3天换新鲜培养基，同时维持潮霉素的筛选压力，两周后从10cm细胞培养皿中挑取单克隆细胞至24孔板，扩大培养，最终获得稳定表达流感特异启动子报告基因的单克隆细胞系，命名为293T-IAV-Luc。从所得的若干单克隆细胞系中随机选取3个，编号为1-3，进行如下功能研究。
三、293T-IAV-Luc细胞的增殖
在获得293T-IAV-Luc细胞系后，增殖细胞时潮霉素浓度改为100μg/ml，并对细胞进行冻存。
四、293T-IAV-Luc细胞的鉴定
将293T-IAV-Luc细胞传代至24孔板中，过夜培养后，吸弃培养基，以PBS溶液洗涤后，不接种或接种A/WSN/33病毒(MOI＝1)，12h后收集细胞测量荧光酶活性，具体为通过荧光素酶活性测量试剂盒在glomax仪(Promega公司产品)读取荧光素酶发光量(荧光素酶发光量与样品中荧光素酶活性成正比)，实验重复测定三次，结果取平均值。
编号为1的293T-IAV-Luc的研究结果显示，在不接种病毒(对照组)时，只能检测到本底的酶活性，而在接种病毒后酶活性高达2.2×105，极显著高于对照组(P<0.01)。另外，其余编号为2、3的两个293T-IAV-Luc的研究结果也显示接种病毒后酶活性极显著高于相应的对照组。此结果说明以上所得的293T-IAV-Luc细胞系能够反应流感病毒在细胞中的转录活性。
实施例2、含有pREP4-IAV-Luc重组质粒的293T-IAV-Luc重组细胞系的应用
一、检测已知抗病毒药物利巴韦林(Ribavirin)的抗病毒效果
293T-IAV-Luc细胞接种14h后分别进行三种处理：未感染病毒(组1)，感染A/WSN/33流感病毒(MOI＝1)(组2，不加入利巴韦林，但加入DMSO)，感染A/WSN/33流感病毒(MOI＝1)的同时加入10mg/L的利巴韦林(组3，利巴韦林溶于DMSO中)。12h后收集细胞，采用实施例1的方法测量荧光素酶发光量。
编号为1的293T-IAV-Luc的研究结果如图1所示，在没有流感病毒感染的情况下(图1中A)，几乎检测不到荧光素酶发光量(组1)；而在流感病毒感染后(图1中B)，荧光素酶发光量极大地提高(组2)；而再加入一种抗病毒药物利巴韦林后(图1中C)，荧光素酶发光量处于非常低的水平(组3)，显著低于组2(P<0.05)。另外，其余编号为2、3的两个293T-IAV-Luc的研究结果也显示组3的荧光素酶发光量显著高于相应的组2。这说明293T-IAV-Luc细胞系适用于抗流感病毒药物的筛选。
MOI＝病毒粒子个数与细胞个数的比值。
二、293T-IAV-Luc以及HeLa-IAV-Luc重组细胞转染表达流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒后荧光素酶活性测量结果比较
HeLa-IAV-Luc重组细胞：参照实施例1的方法，仅将其中的293T细胞替换为HeLa，构建得到HeLa-IAV-Luc重组细胞。
293T-IAV-Luc以及HeLa-IAV-Luc重组细胞24孔板接种15小时后，PEI共转表达流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒各0.4μg，转染6小时后换液，24小时后收细胞，采用实施例1的方法测量荧光素酶发光量。实验同时设置未经转染的293T-IAV-Luc以及HeLa-IAV-Luc重组细胞作为对照组。
编号为1的293T-IAV-Luc的研究结果如图2所示。293T-IAV-Luc重组细胞转染流感病毒表达质粒后荧光素酶发光量由对照组的40上升到2.1×105(图2中A，P<0.01)，而HeLa-IAV-Luc重组细胞转染流感病毒表达质粒后荧光素酶发光量仅由对照组的30上升到4000(图2中B，P>0.05)。以上结果表明，293T-IAV-Luc重组细胞相对于HeLa-IAV-Luc重组细胞而言，还可以用于流感病毒vRNP活性的检测。
三、热休克蛋白70与流感病毒vRNP的互作
热休克蛋白70是一种在宿主细胞中广泛存在的应激蛋白，其氨基端1-385为ATPase结合域，羧基端386-641为肽段结合区，两者之间有一段不保守的序列相连。现有技术公知由热休克蛋白70的第1-385位氨基酸残基表达的蛋白可与流感病毒vRNP互作，降低其活性；而由热休克蛋白70的第386-641位氨基酸残基表达的蛋白不能与流感病毒vRNP互作(具体参见“Li G1,Zhang J,Tong X,et al.Heat shock protein70inhibits the activity of Influenza A virus ribonucleoprotein and blocks the replication ofvirus in vitro and in vivo.PLoS One.2011Feb 24；6(2):e16546.doi:10.1371/journal.pone.0016546.”一文)。
1、构建热休克蛋白70(1-385aa)及(386-641aa)段的表达质粒
采用的骨架载体为pCMV-Myc，酶切位点为BglII和XhoI。具体构建方法如下：
(1)根据如下两个靶基因分别设计两对引物，并在两个上游引物的5’端引入酶切位点BglII的识别序列，在两个下游引物的5’端引入酶切位点XhoI的识别序列。其中，两个靶基因分别为编码热休克蛋白70(1-385aa)的编码基因(序列2的第1-1155位)，以及编码热休克蛋白70(386-641aa)的编码基因(序列2的第1156-1926位)。分别以两个靶基因作为模板，采用两个引物对(在用于扩增第一个靶基因的引物对的下游引物酶切位点XhoI的识别序列后已加上终止密码子的反向互补序列CTA，在用于扩增第二个靶基因的引物对的上游引物酶切位点BglII的识别序列后已加上起始密码子ATG)分别进行PCR扩增，得到两个DNA片段。
(2)将(1)得到的两个DNA片段分别经BglII和XhoI双酶切后，连接到经BglII和XhoI酶切的pCMV-Myc载体(购自clonetech公司)上，得到重组质粒。将重组质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证。将经测序表明在pCMV-Myc载体的酶切位点BglII和XhoI之间插入了“序列表中序列2的第1-1155位+TAG”的重组质粒命名为pCMV-Myc-Hsp70(1-385)；将经测序表明在pCMV-Myc载体的酶切位点BglII和XhoI之间插入了“ATG+序列表中序列2的的第1156-1926位”的重组质粒命名为pCMV-Myc-Hsp70(386-641)。
2、转染并测定荧光素酶发光量
293T-IAV-Luc重组细胞24孔板接种15小时后，分别将步骤1构建得到的热休克蛋白70(1-385aa)段的表达质粒和热休克蛋白70(386-641aa)段的表达质粒转染293T-IAV-Luc重组细胞，24h后将表达流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒和海肾荧光素酶表达质粒(该质粒购自Promega)各0.4μg共转293T-IAV-Luc重组细胞，转染6小时后换液，24小时后收细胞，采用实施例1的方法检测荧光素酶发光量。实验同时设置以pCMV-Myc空载体替代pCMV-Myc-Hsp70(1-385)或pCMV-Myc-Hsp70(386-641)的对照。
编号为1的293T-IAV-Luc的研究结果如图3所示。与对照组相比，转染热休克蛋白70(1-385aa)能将流感病毒vRNP活性降低90％(P<0.01)；而热休克蛋白70(386-641aa)与对照组相比无显著差异(P>0.05)。以上结果与现有报道一致，说明293T-IAV-Luc重组细胞可用于相关蛋白与流感病毒vRNP互作的研究。
四、已知抗病毒药物利巴韦林(Ribavirin)与金刚烷胺(Amantadine)与流感病毒vRNP互作的结果
293T-IAV-Luc重组细胞24孔板接种15小时后，PEI共转表达流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因质粒各0.4μg，转染前1小时换液，分别换正常含10μg/ml利巴韦林或20μg/ml金刚烷胺(药物溶于DMSO)的培养基。转染6小时后换液，24小时后收细胞，采用实施例1的方法检测荧光素酶发光量。实验同时设置转染前未添加利巴韦林和金刚烷胺(以等量DMSO替代药物)的293T-IAV-Luc重组细胞作为vRNP对照，设置未转染且未添加利巴韦林和金刚烷胺(以等量DMSO替代药物)的293T-IAV-Luc重组细胞作为空白对照。实验重复两次，每次3个平行。
编号为1的293T-IAV-Luc的研究结果如图4所示。利巴韦林作为已知的抗病毒药物，主要作用机制是抑制流感病毒的聚合酶的活性，本发明的检测结果恰恰显示，与未加入利巴韦林(以等量DMSO替代药物)的vRNP对照相比，加入利巴韦林后流感病毒聚合酶活性降低(图4中A，P<0.05)。金刚烷胺作为已知的抗流感病毒药物，主要是抑制M2离子通道的活性，本发明的检测结果恰恰显示，与未加入金刚烷胺(以等量DMSO替代药物)的vRNP对照相比，加入金刚烷胺后对流感病毒vRNP活性没有显著抑制作用(图4中B，P>0.05)。以上结果充分说明293T-IAV-Luc重组细胞可用于相关化合物与流感病毒vRNP互作的研究。
Claims (10)
1.一种重组细胞，为向293T细胞中转入重组质粒后得到的重组细胞；
所述重组质粒含有融合基因；
所述融合基因，是由片段1、报告基因和片段2顺次连接构成的融合基因；所述片段1的核苷酸序列为序列表中序列1的第14-58位；所述片段2的核苷酸序列为序列表中序列1的第1712-1734位。
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于：所述报告基因是萤火虫荧光素酶编码基因。
3.根据权利要求1或2所述的重组细胞，其特征在于：所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列1的第14-1734位。
4.根据权利要求1-3中任一所述的重组细胞，其特征在于：所述重组质粒为在出发表达载体的多克隆位点间插入所述融合基因后得到的重组质粒；所述出发表达载体为pREP4载体。
5.权利要求1-4中任一所述的重组细胞在如下任一中的应用：
(1)制备检测流感病毒的试剂盒；
(2)制备筛选抗流感病毒药物的试剂盒；
(3)制备检测蛋白与流感病毒vRNP互作的试剂盒；
(4)制备检测化合物与流感病毒vRNP互作的试剂盒。
6.具有如下功能中至少一种的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1-4中任一所述的重组细胞：
(a1)检测流感病毒；
(a2)筛选抗流感病毒药物；
(a3)检测蛋白与流感病毒vRNP互作；
(a4)检测化合物与流感病毒vRNP互作。
7.根据权利要求5所述的应用或权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述流感病毒为A型流感病毒。
8.根据权利要求7所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述A型流感病毒为H1N1亚型流感病毒。
9.根据权利要求8所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述H1N1亚型流感病毒为A/WSN/33流感病毒。
10.根据权利要求5-9中任一所述的应用或试剂盒，其特征在于：所述蛋白为热休克蛋白70或其片段；或
所述化合物为利巴韦林或金刚烷胺。
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| CN (1) | CN104593330A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106701806A (zh) * | 2017-02-22 | 2017-05-24 | 中国中医科学院医学实验中心 | 评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用 |
| CN115927468A (zh) * | 2022-08-18 | 2023-04-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 含有u6启动子的流感病毒报告质粒及其构建方法和应用 |
| CN115927461A (zh) * | 2022-08-18 | 2023-04-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用 |
| WO2024139647A1 (zh) * | 2022-12-26 | 2024-07-04 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种人乳头瘤病毒16型dna疫苗及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1091000A1 (en) * | 1994-09-30 | 2001-04-11 | Hobom, Gerd, Prof. Dr. Dr. | An attenuated vaccination and gene-transfer virus, a method to make the virus and a pharmaceutical composition comprising the virus |
| US20070172489A1 (en) * | 2003-03-26 | 2007-07-26 | Stefan Ludwig | Caspase inhibitors, especially caspase 3 inhibitors, for the treatment of influenza |
-
2015
- 2015-01-19 CN CN201510025839.5A patent/CN104593330A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1091000A1 (en) * | 1994-09-30 | 2001-04-11 | Hobom, Gerd, Prof. Dr. Dr. | An attenuated vaccination and gene-transfer virus, a method to make the virus and a pharmaceutical composition comprising the virus |
| US20070172489A1 (en) * | 2003-03-26 | 2007-07-26 | Stefan Ludwig | Caspase inhibitors, especially caspase 3 inhibitors, for the treatment of influenza |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ANDREW LUTZ，ET AL: "Virus-inducible reporter genes as a tool for detecting and quantifying influenza A virus replication", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》 * |
| GANG LI，ET AL: "Heat Shock Protein 70 Inhibits the Activity of Influenza A Virus Ribonucleoprotein and Blocks the Replication of Virus In Vitro and In Vivo", 《PLOS ONE》 * |
| WIIIEM LUYTJES,ET AL: "Amplification, Expression, and Packaging of a Foreign Gene by Influenza Virus", 《CELL》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106701806A (zh) * | 2017-02-22 | 2017-05-24 | 中国中医科学院医学实验中心 | 评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用 |
| CN106701806B (zh) * | 2017-02-22 | 2019-11-26 | 中国中医科学院医学实验中心 | 评估中药和/或天然药物效能的系列转录因子报告基因系统及其应用 |
| CN115927468A (zh) * | 2022-08-18 | 2023-04-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 含有u6启动子的流感病毒报告质粒及其构建方法和应用 |
| CN115927461A (zh) * | 2022-08-18 | 2023-04-07 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种流感病毒诱导表达的eGFP/Gluc报告质粒及其构建方法和应用 |
| WO2024139647A1 (zh) * | 2022-12-26 | 2024-07-04 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 一种人乳头瘤病毒16型dna疫苗及其应用 |
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