CN104593316A - 昆虫细胞无血清培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种昆虫细胞无血清培养基及其应用。该培养基包含氨基酸、无机盐、维生素和碳水化合物等；进一步的，还包含0.5～15mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱和/或0.1～10mg/L二硬脂酰磷脂酰胆碱；尤其是，还可包含0.001～0.1mg/L二水氯化钡、0.005～0.02mg/L氯化锂、0.05～7mg/L氯化镍。本发明的昆虫细胞无血清培养基组分简单明确，易于制备，成本低廉，且可大幅提升昆虫细胞培养效率和重组蛋白表达效率，利于实现昆虫细胞的大规模培养和重组蛋白的大规模制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种无血清培养基，特别是一种适于生物反应器大规模培养制备重组蛋白的昆虫细胞无血清培养基。
背景技术
为满足基础研究和应用生物医学领域如细胞生物学、生理学、药理学和毒理学日益广泛的应用需求，细胞培养技术应运而生。概括的讲，细胞培养技术系模拟细胞生长的体内环境，包括温度、pH值、渗透压和氧气供应，以使细胞能很好地生长和繁殖。其中最关键的因素是培养基。
传统细胞培养基主要是通过在基础培养基中添加相应量的血清或组织提取物而形成，其中因动物血清提取的局限，使其应用于培养基的价格格外昂贵，而且也给细胞培养的标准化带来困难，同时也存在细胞培养表达产品分离纯化难的问题，具有潜在的细胞毒性作用，给规模化培养细胞增加了难度。
由于传统血清细胞培养基存在的诸多问题，促使研究人员又发展出了无血清培养基。与传统的培养基相比，无血清培养基不含动物血清或其他生物提取液，具有组成成分相对清楚，制备过程简单等优点，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖，并可避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染等不利影响，有利于体外培养细胞的分化，可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。当然，现有的无血清培养基也还存在一些缺陷，例如保存和应用不如传统的合成培养基方便，成本较高，针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养等。
另一方面，在基因工程领域，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视，常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。其中昆虫细胞表达系统，特别是杆状病毒表达系统由于其操作安全，表达量高，目前倍受青睐，并已被广泛应用于生产外源蛋白质。
迄今为止，如L.Ikonomou.,etal(Appl Microbiol Biotechnol,2003,62:1-20),Michael S.,etal(Biotechnol.Prog.,1988,14,573-579)、R·H·齐尔瑞洛(CN1498267A)等已经开发出多种用于培养昆虫细胞的无血清培养基，但这些培养基普遍存在成本过高，昆虫细胞培养效率低，蛋白表达效率有待提升等问题，不利于大规模的昆虫细胞培养和重组蛋白的制备。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种适于生物反应器大规模培养制备重组蛋白的昆虫细胞无血清培养基，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
一种昆虫细胞无血清培养基，包含氨基酸、无机盐、维生素和碳水化合物，其特征在于它还包含0.6～25mg/L磷脂酰胆碱，所述磷脂酰胆碱包括二亚油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱。
作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含11200～29170mg/L氨基酸、5500.71～9510.33mg/L无机盐、11.354～820.4mg/L维生素、3000～11000mg/L蛋白水解物和6042～14222mg/L碳水化合物。
作为尤为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含0.5～15mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱(Dilineoyl-phosphatidylcholin)以及0.1～10mg/L二硬脂酰磷脂酰胆碱(Distearoyl-phosphatidylcholin)中的至少一者，优选同时采用该两者。
作为更为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基还包含0.001～0.1mg/L二水氯化钡、0.005～0.02mg/L氯化锂、0.05～7mg/L氯化镍。
作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含β-丙氨酸300～800mg/L、L-盐酸精氨酸800～2400mg/L、L-天冬酰胺900～1700mg/L、L-天冬氨酸钠盐1000～1600mg/L、L-胱氨酸盐酸盐150～300mg/L、L-谷氨酸盐酸盐1400～2700mg/L、L-谷氨酰胺1000～5000mg/L、甘氨酸300～800mg/L、L-组氨酸400～900mg/L、L-羟脯氨酸500～1500mg/L、L-异亮氨酸500～1200mg/L、L-亮氨酸200～600mg/L、L-盐酸赖氨酸500～1500mg/L、L-蛋氨酸700～1600mg/L、L-苯丙氨酸800～1700mg/L、L-脯氨酸400～950mg/L、L-丝氨酸300～1000mg/L、L-苏氨酸300～820mg/L、L-色氨酸100～300mg/L、L-酪氨酸二钠盐300～850mg/L、L-缬氨酸350～950mg/L。
作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含四水钼酸铵0.03～0.2mg/L、六水氯化钴0.03～0.35mg/L、二水氯化铜0.1～1.5mg/L、七水硫酸亚铁0.5～4.6mg/L、无水硫酸镁500～1500mg/L、四水氯化锰0.01～0.18mg/L、氯化钾1000～1500mg/L、氯化钠3000～5000mg/L、一水磷酸二氢钠1000～1500mg/L、氯化锌0.04～3.5mg/L。
作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含生物素0.1～0.5mg/L、D-泛酸钙0.004～0.2mg/L、氯化胆碱10～400mg/L、VB12氰钴胺0.2～1.6mg/L、VB9叶酸0.05～0.5mg/L、i-肌醇0.2～400mg/L、VB3烟酸0.1～1.9mg/L、对氨基苯甲酸0.3～2.7mg/L、VB6盐酸吡哆醇0.3～4mg/L、VB2核黄素0.05～5mg/L、VB1盐酸硫胺0.05～4mg/L。
作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基包含无水葡萄糖2500～5000mg/L、反丁烯二酸2～8mg/L、2-酮戊二酸10～40mg/L、L-苹果酸10～100mg/L、一水麦芽糖(超纯)500～3000mg/L、丁二酸4～14mg/L、Twen8010～1000mg/L、胆固醇硫酸酯钠盐5～50mg/L、VE钠1～10mg/L、D-蔗糖3000～5000mg/L。
作为较为优选的实施方案之一，所述昆虫细胞培养基还包含蛋白水解物，例如可优选包含大麦水解物1000～5000mg/L、大米水解物2000～6000mg/L。
在本发明的一更为具体的实施方案之中，所述昆虫细胞培养基可包含如下表1所示组分。
表1 本发明中一典型昆虫细胞无血清培养基的配方
本发明还提供了所述昆虫细胞培养基于培养昆虫细胞或制备重组蛋白中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优点：该昆虫细胞无血清培养基组分简单明确，易于制备，成本低廉，且可大幅提升昆虫细胞培养效率和重组蛋白表达效率，利于实现昆虫细胞的大规模培养和重组蛋白的大规模制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为以实施例1中昆虫细胞无血清培养基于3L摇瓶中培养Sf9细胞的培养密度和存活率曲线图；
图2为以实施例1中昆虫细胞无血清培养基于3L摇瓶中培养S2细胞的培养密度和存活率曲线图；
图3为分别以实施例1、对照例1中昆虫细胞无血清培养基于1L摇瓶中培养Sf9细胞的培养效果图；
图4为分别以实施例1、对照例2中昆虫细胞无血清培养基于1L摇瓶中培养Sf9细胞并进行外源蛋白表达的电泳照片；
图5为以实施例1中昆虫细胞无血清培养基培养High5细胞的培养密度和存活率曲线图；
图6为以实施例1中昆虫细胞无血清培养基培养棉铃虫细胞的培养密度和存活率曲线图；
图7为以实施例1中昆虫细胞无血清培养基培养斜纹夜蛾卵巢细胞的培养密度和存活率曲线图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明系提供了一种改良的昆虫细胞无血清培养基，其含有基本的氨基酸、无机盐、维生素、蛋白水解物等物质，可以支持昆虫细胞的生长和重组蛋白的表达。
其中，葡萄糖、蔗糖或麦芽糖等碳水化合物系作为昆虫细胞生长的主要碳源与能源。本发明的培养基中所含碳水化合物含量在6042～14222mg/L，有利于在发酵过程中将渗透压控制在380～410mOsm/Kg，从而满足昆虫细胞的生长。
其中，氨基酸亦是昆虫细胞生长必须的，一般来说，有14种氨基酸必须由培养基提供。在本发明中，通过将培养基中的氨基酸浓度控制在11200～29170mg/L，较之现有的无血清昆虫培养基，氨基酸用量降低，但能达到基本相当甚至更佳的培养效果。
其中，维生素对促进昆虫细胞存活和增殖以及细胞贴附有积极作用。在本发明中，通过将培养基中的维生素浓度控制在11.354～820.4mg/L。其中氯化胆碱和肌醇对细胞生长过程中的脂类物质代谢合成有重要影响，可以促进细胞生长，并维持细胞处于良好状态。其他维生素大多作为辅酶或者辅基参与细胞代谢。在昆虫细胞胞内代谢不同于其他哺乳动物细胞的胞内代谢，昆虫细胞糖代谢以三羧酸循环为主，代谢过程中需要大量的维生素参与，并且昆虫细胞增殖较一般哺乳动物细胞快，从而加大了对维生素的需求。本发明中根据对昆虫细胞中酶类物质定量并综合小分子物质组学研究对维生素进行定量，取得了较好的细胞培养效果。
其中，无机盐的一个重要作用系提供利于昆虫细胞生长的渗透压，同时还有利于促进细胞贴附和增加产量，以及在某些情况下促进病毒的感染和复制大。在本发明中，系将培养基中的无机盐的浓度控制在5500.71～9510.33mg/L，以及将二水氯化钡、氯化锂、氯化镍分别控制在0.001～0.1mg/L、0.005～0.02mg/L、0.05～7mg/L范围内，其中大量应用的无机盐有助于维持离子平衡，帮助细胞为此正常的代谢和离子通道用于物质运输。其中添加的氯化钡、氯化锂和氯化镍虽然在很多无血清培养基中是用来促进细胞生长的，但本案发明人还非常意外的发现，当在本发明的无血清昆虫培养基中添加少量的氯化钡、氯化锂、氯化镍后，其对细胞的生长并没有明显的促进作用，但可以大幅度增加昆虫细胞中包涵体病毒和游离病毒，进而可以显著增强外源蛋白的表达。优选的，这些物质在无血清昆虫培养基中的用量可以为：二水氯化钡0.001～0.1mg/L、氯化锂0.005～0.02mg/L、氯化镍0.05～7mg/L。
其中，蛋白水解物的作用是促进细胞在无血清情况下的生长。本发明中添加的蛋白水解物来源为植物，用物质蛋白水解物替代了其他来源的水解物，尤其是酵母水解物可以大大降低培养基中的内毒素含量。在本发明中，通过将培养基中的蛋白水解物的浓度控制在3000mg/L～11000mg/L，在该浓度范围内，完全可以支持细胞的生长，并且在该范围内可以支持重组外源蛋白的表达和杆状病毒高滴度扩增。而在现有的无血清培养基中大多使用酵母水解物，且只是利用其可以促进细胞生长的功能，本发明中不仅考虑细胞生长，并将外源重组蛋白表达和杆状病毒滴度作为培养基筛选的主要指标。
当然，本发明的无血清完全培养基还可包含其它成分，例如作为溶剂的水等。
而需要重点说明的是，本案发明人在长期研究和大量实践中发现，当在无血清昆虫培养基中添加适量的磷酸酯类物质，特别是添加少量的二亚油酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱后，可以显著提高蛋白表达量，这是非常令人惊喜的。优选的，该两种物质在无血清昆虫培养基中的用量可以为：二亚油酰磷脂酰胆碱0.5～15mg/L、二硬脂酰磷脂酰胆碱0.1～10mg/L。
本发明的无血清昆虫培养基所含成分种类少，含量低，配制简单，成本低廉，且能够达到和商业化培养基同样的效果，具有良好的商业化前景。
本发明的无血清昆虫培养基可以通过业界所知的任何合适方式制得。例如，可以将组成该培养基的各成分先以各自的合适浓度溶解于水，再混合过滤除去其中的有害物质，例如某些不溶性的颗粒物等而制得无菌培养基。
又及，在利用本发明的培养基培养细胞时，也可采用业界所知的任何合适条件，例如与常规培养基大约相同的条件，其可依据所要培养的细胞体系的种类等而定。
以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案作更为详细的说明。
实施例1该昆虫细胞无血清培养基的配方如表2所示。
表2 实施例1中一种昆虫细胞无血清培养基的配方
而本实施例的该培养基的制备过程可以包括：
首先，按照表3称取或量取原料物质；
其次，配置浓缩液，包括：
制备1000×浓缩液1：
将四水钼酸铵8mg，六水氯化钴10mg，二水氯化铜75mg，七水硫酸亚铁50mg，四水氯化锰8mg，氯化锌10mg溶解于100ml水中。
制备1000×浓缩液2：
生物素10mg，D-泛酸钙20mg，VB12氰钴胺20mg，VB9叶酸20mg，i-肌醇50mg溶解于100ml水中。
制备1000×浓缩液3：
二水氯化钡5mg，氯化锂1mg溶解于100ml水中。
最后，取前述浓缩液及表3所列的其它物质称量于10L容器中，制备10L液体培养基。其过程可以为：向该容器中添加9.5L水，搅拌30min溶解，添加上述制备的浓缩液1，浓缩液2，浓缩液3，各10ml，搅拌，使用10M NaOH溶液调整pH值至6.2，定容至10L，过滤除菌，避光冷藏待用。
表3 实施例1中昆虫细胞无血清培养基主要组分的用量
对照例1：除不添加二亚油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱之外，按照与实施例1基本相同的组分和方式配置无血清培养基。
对照例2：除不添加氯化钡、氯化锂、氯化镍之外，按照与实施例1基本相同的组分和方式配置无血清培养基。
分别取实施例1、对照例1的培养基置入1L摇瓶中悬浮培养Sf9细胞，其培养效果分别如图1、图3所示。可以发现二亚油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱虽然对培养基中最大细胞生长密度影响不显著但是对细胞活性维持有重大影响。当缺少二亚油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱时，细胞最大细胞密度虽然没有显著变化，但是在细胞达到最大细胞密度后细胞活性会迅速降低。
可以发现，使用该实施例1的培养基培养Sf9细胞，最大活细胞密度超过1.3×107cells/ml，与商业化培养基培养相当甚至优于商业化培养基。
分别取实施例1、对照例2的培养基置入1L摇瓶中悬浮培养Sf9细胞，并在细胞密度达到1.5×106细胞/毫升时接种病毒(重组病毒，表达相应外源蛋白)，培养72h，取细胞悬液进行Western-blot检测，其结果如图4所示，其中1号泳道为对比例2培养基，2号泳道为对照例1培养基，3号泳道为实施例1培养基，M为MarKer(标记物)。从图中可以看出，添加氯化钡、氯化锂、氯化镍可以极大的提高外源蛋白表达量。
另外，本案发明人还利用该实施例1的培养基对其余多种昆虫细胞进行了无血清悬浮培养试验，包括S2、High5、Sf21细胞株等，其典型的试验结果如图2、图5所示。
此外，本案发明人还发现，该实施例1的培养基还可以支持多种国内自行建立的昆虫细胞系的无血清悬浮培养，如上海复旦大学建立的棉铃虫细胞系(参阅图6)，苏州大学建立的斜纹夜蛾卵巢细胞系(参阅图7)。
实施例2：细胞培养：在3升摇瓶中接种1000毫升细胞悬液(选用实施例1的培养基，其中含有细胞0.5×106细胞/毫升)，置于生化培养箱中的摇床上，27℃，转速100转/分钟，当细胞密度达到5×106细胞/毫升，将其稀释传代，细胞其实密度为0.5×106细胞/毫升。将3升密度达到5×106细胞/毫升的细胞悬液转移到42L生物反应器中，然后补加新鲜的实施例1培养基27升，搅拌转速为50转/分钟，温度27℃，溶氧控制40％，pH值控制在6.2。当细胞密度达到5×106细胞/毫升时，将其转移至1000升生物反应器中，并补加新鲜的实施例1培养基至300升，控制搅拌转速20转/分钟，温度27℃，溶氧40％，pH值在6.2，当细胞密度达到3.75×106细胞/毫升，补加新鲜的实施例1培养基至750升，同时按照千分之一的比例加入重组病毒，控制环境条件不变，培养72小时，用ELISA检测外源重组蛋白表达量，重组蛋白表达量为150毫克/升，实现了昆虫细胞无血清培养基高水平表达外源蛋白。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1. 一种昆虫细胞无血清培养基，包含氨基酸、无机盐、维生素和碳水化合物，其特征在于它还包含0.6～25mg/L磷脂酰胆碱，所述磷脂酰胆碱包括二亚油酰磷脂酰胆碱和/或二硬脂酰磷脂酰胆碱。
2. 根据权利要求1所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含11200～29170mg/L氨基酸、5500.71～9510.33mg/L无机盐、11.354～820.4mg/L维生素、3000～11000mg/L蛋白水解物和6042～14222mg/L碳水化合物。
3. 根据权利要求1所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含0.5～15mg/L二亚油酰磷脂酰胆碱和/或0.1～10mg/L二硬脂酰磷脂酰胆碱。
4. 根据权利要求1所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它还包含0.001～0.1mg/L二水氯化钡、0.005～0.02mg/L氯化锂、0.05～7mg/L氯化镍。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含β-丙氨酸300～800 mg/L、L-盐酸精氨酸800～2400 mg/L、L-天冬酰胺 900～1700 mg/L、L-天冬氨酸钠盐1000～1600 mg/L、L-胱氨酸盐酸盐150～300 mg/L、L-谷氨酸盐酸盐1400～2700 mg/L、L-谷氨酰胺 1000～5000 mg/L、甘氨酸 300～800 mg/L、L-组氨酸400～900 mg/L、L-羟脯氨酸500～1500 mg/L、L-异亮氨酸500～1200 mg/L、L-亮氨酸200～600 mg/L、L-盐酸赖氨酸500～1500 mg/L、L-蛋氨酸700～1600 mg/L、L-苯丙氨酸800～1700 mg/L、L-脯氨酸400～950 mg/L、L-丝氨酸300～1000 mg/L、L-苏氨酸300～820 mg/L、L-色氨酸100～300 mg/L、L-酪氨酸二钠盐300～850 mg/L、L-缬氨酸350～950 mg/L。
6. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含四水钼酸铵 0.03～0.2 mg/L、六水氯化钴 0.03～0.35 mg/L、二水氯化铜 0.1～1.5 mg/L、七水硫酸亚铁 0.5～4.6 mg/L、无水硫酸镁 500～1500 mg/L、四水氯化锰 0.01～0.18 mg/L、氯化钾 1000～1500 mg/L、氯化钠3000～5000 mg/L、一水磷酸二氢钠 1000～1500 mg/L、氯化锌 0.04～3.5 mg/L。
7. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含生物素0.1～0.5 mg/L、D-泛酸钙0.004～0.2 mg/L、氯化胆碱10～400 mg/L、VB12氰钴胺0.2～1.6 mg/L、VB9叶酸0.05～0.5 mg/L、i-肌醇0.2～400 mg/L、VB3烟酸0.1～1.9 mg/L、对氨基苯甲酸0.3～2.7 mg/L、VB6 盐酸吡哆醇0.3～4 mg/L、VB2 核黄素0.05～5 mg/L、VB1 盐酸硫胺0.05～4 mg/L。
8. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它包含无水葡萄糖 2500～5000mg/L、反丁烯二酸 2～8mg/L、2-酮戊二酸 10～40mg/L、L-苹果酸10～100mg/L、一水麦芽糖(超纯) 500～3000mg/L、丁二酸 4～14mg/L、Twen80 10～1000mg/L、胆固醇硫酸酯钠盐 5～50mg/L、VE钠 1～10mg/L、D-蔗糖 3000～5000mg/L。
9. 根据权利要求1-4中任一项所述的昆虫细胞无血清培养基，其特征在于它还包含蛋白水解物，所述蛋白水解物包含大麦水解物1000～5000mg/L、大米水解物2000～6000mg/L。
10. 权利要求1-9中任一项所述昆虫细胞无血清培养基于培养昆虫细胞或制备重组蛋白中的应用。
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