CN104592395B

CN104592395B - Vegfr2单链抗体与mica融合蛋白的制备方法及用途

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Publication number: CN104592395B
Application number: CN201510038297.5A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 王旻; 戴斯蒙德·奥马内·阿奇姆彭; 唐铭英; 王佑富; 赵欣; 袁锡彬
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2035-01-27
Also published as: CN104592395A

Abstract

本发明属基因工程抗体技术领域，具体地公开了一种抗人血管内皮细胞生长因子受体2的单链抗体(AK404R)与MICA连接的融合抗体的制备方法及用途。本发明公开了融合抗体表达质粒的构建，重组质粒的转染。本发明还提供表达和纯化融合抗体的方法，通过真核细胞分泌表达、亲和层析纯化获得融合抗体。本发明的融合抗体AK404R‑MICA可特异性结合于人血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)，可以显著抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移、细胞侵袭和小管形成。本发明的融合抗体AK404R‑MICA还可以显著抑制肿瘤细胞K562的生长，可应用于制备诊断剂和治疗剂。

Description

VEGFR2单链抗体与MICA融合蛋白的制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种新的可与人血管内皮细胞生长因子受体2特异结合的高亲和力的与MICA连接的融合抗体(AK404R-MICA)，可以抑制内皮细胞的增殖、迁移、细胞侵袭和小管形成，还可以显著抑制肿瘤细胞K562的生长，是一种具有抗肿瘤活性的基因工程融合抗体。

背景技术

肿瘤细胞能够渗入淋巴管和血管并通过血流循环侵入正常的组织中，使癌症成为潜在威胁生命的疾病。肿瘤细胞的转移的一个必备条件就是血管的新生。然而，新生血管的形成的关键之一就是血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族和相关受体，它通过与血管内皮生长因子受体(VEGFR)结合激活细胞内信号通路，刺激血管内皮细胞增殖、迁移，促进新生血管的生成，与机体多种常见肿瘤的发病及肿瘤的转移有着密切的关系。VEGFR-2，在人体内又称为KDR(Kinase Insert Domain Receptor)，与VEGF具有较高的亲和力，它在介导VEGF刺激内皮细胞增殖及血管通透性等生物学活性中起重要作用。。KDR属酪氨酸激酶受体(Receptor protein-tyrosine kinase)，2～3区和VEGF的结合有关，2和4区主要影响其与VEGF的分离，1区主要负责调节受体与配体的结合，4～7区中可能存在抑制与VEGF结合的位点，其中3区(即KDR3，含有97个氨基酸)对VEGF的结合贡献最为突出。

主要组织相容性复合物工链分子A(Major Histocompatibility Complex classI-related chain molecules A，MICA)，是一种高度糖基化的由MHC基因编码的跨膜糖蛋白，在免疫监视中起重要作用，MICA为天然杀伤(NK)细胞活化受体NKG2D的配体，研究表明，表达MICA的肿瘤细胞普遍对NK细胞杀伤较为敏感。自然杀伤细胞表面受体2D(NKG2D)，是C型凝集素超家族中的一员，不仅表达于所有的NK细胞，且表达于CD8+T细胞、活化的巨噬细胞表面。NKG2D与其配体的交联可触发NK细胞的细胞毒活性，在肿瘤免疫监视中起着非常重要的作用，靶细胞上NKG2D配体的表达水平几乎决定了机体NK细胞免疫应答的强弱。

之前本实验室利用噬菌体展示技术获得了以KDR胞外3区为抗原的单链抗体AK404R，但是考虑到单链抗体的相对较小的分子量(30KDa)并且缺失Fc片段，我们构建表达了一个融合抗体AK404R-MICA去增强其肿瘤治疗的有效性。

贝伐单抗(Bevacizumab，商品名Avastin)是目前市场上最常用于针对VEGF-VEGFR2信号通路的抗体药物。是重组的人源化单克隆抗体，2004年获得FDA的批准，是美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药。通过体内外检测系统证实IgGl抗体能与人血管内皮生长因子(VEGF)结合并阻断其生物活性。而阿瓦斯汀包含了人源抗体的结构区和可结合VEGF的鼠源单抗的互补决定区。

发明内容

发明目的

本发明提供一种具有潜在医学和药学价值的融合抗体AK404R-MICA。本发明的融合抗体的特征是VEGFR2的单链抗体与MICA连接，在体外能够抑制人白血病细胞K562的增殖。

技术方案

一种VEGFR2的单链抗体与MICA连接融合抗体的制备，其特征在于：

VEGFR2的单链抗体与MICA连接的融合抗体包括以KDR胞外3区为抗原的单链抗体AK404R和MICA，通过一个Linker(G4S)连接。

一种分离的核酸，其特征在于该核酸编码上述的抗体。

一种表达载体，含有上述的核酸。

一种重组宿主细胞，含上述的表达载体。

一种毕赤酵母分泌表达法，用于分泌表达的融合抗体。

上述任一项的融合抗体或融合抗体片段的应用，选择性地与KDR3结合或NKG2D结合。

上述任一项的融合抗体片段，选自单链抗体、Fab、单链Fv、双抗体和三抗体。

上述任一项的融合抗体或融合抗体片段的偶联物。

所述的偶联物，含有抗肿瘤药物、靶组成部分或报告组成部分。

发明进一步说明：

本发明中融合抗体基因序列全长1596个核苷酸，其中单链抗体735个核苷酸，MICA828个核苷酸，通过一个Linker(G₄S)连接。

含有本发明人血管内皮生长因子受体单链抗体基因的表达载体和宿主菌，MICA基因的表达载体和宿主菌以及融合抗体的表达载体和宿主细胞均属于本发明的保护范围。扩增本发明融合抗体基因的任意片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供一种可以表达和纯化上述融合抗体AK404R-MICA的方法。

本发明通过一个G₄S连接单链抗体和MICA并导入到毕赤酵母中筛选发酵得到能特异性结合KDR3和NKG2D的融合抗体。培养5天后，低温离心去除细胞碎片，将上清过镍亲和层析柱进行分离纯化；Western Blot鉴定分离纯化得到的AK404R-MICA；ELISA分析融合抗体与KDR3和NKG2D的结合作用；利用表面等离子体共振分析融合蛋白与KDR3和NKG2D的亲和力；检验融合蛋白对人白血病细胞K562的抑制作用。

本发明得到的融合抗体AK404R-MICA与人白血病细胞K562和人脐静脉内皮细胞HUVEC具有高特异性结合，体外抑制肿瘤细胞生长实验结果表明，本发明得到的融合抗体可以明显抑制肿瘤细胞的生长。本发明为治疗和诊断以人内皮血管生长因子受体的表达，特别是过量表达为特征的疾病提供了基于抗体的疗法，相关疾病包括但不限于自身免疫病和癌症。

附图说明

图1。图1A是表达质粒的构建。L1：linker1，L2：linker2，限制酶切位点：EcoR1和XbaI。图1B是MICA和AKA404R的PCR后的产物图。图1C是AK404R-MICA经PCR后的产物图。

图2。图2A显示SDS-PAGE蛋白质电泳图，描述发酵表达的融合抗体通过镍柱进行分离纯化的结果，泳道1～9不同浓度咪唑缓冲液洗涤镍柱结果，泳道2～9为含100mM咪唑缓冲液洗脱镍柱获得的目的蛋白(70KD)图2B显示的是融合蛋白的示意图；图2C显示SDS-PAGE经纯化复性后的MICA，泳道1为非还原性MICA，泳道2为还原性MICA。图2D显示SDS-PAGE经纯化复性后的NKG2D，泳道1为非还原性NKG2D，泳道2为还原性NKG2D。图2E显示利用WesternBlot融合抗体与重组KDR3的结合。图2F显示利用Western Blot融合抗体与重组NKG2D的结合。

图3。图3A展示的是等面等离子体共振分析融合抗体与重组NKG2D之间的亲和力常数，Ka＝ka＝6.77×10⁹/MS，k_d＝267.4/S和K_D＝3.95×10^-8M。图3B展示的是等面等离子体共振分析融合抗体与重组KDR3之间的亲和力常数，Ka＝4.26×10⁶/MS，kd＝261/S和K_D＝6.13×10^-7M。图3C展示的是融合抗体与重组NKG2D的ELISA结合活性。图3D展示的是融合抗体与重组KDR3的ELISA结合活性。

图4。图4A、D流式细胞术检测融合抗体、AK404R与HUVEC细胞的结合，结合率分别为62.7％和67.0％，对照组MICA和PBS分别为2.1％和1.5％。图B、D流式细胞术检测融合抗体、MICA与U937的结合，结合率分别为69.7％和58.0％，对照组AK404R和PBS与U937无显著性结合。图C、D流式细胞术检测融合抗体、AK404R、MICA和PBS均与HEK293(人胚肾细胞)细胞无显著结合。

图5。图5A展示融合抗体对HUVEC细胞的抑制作用呈现剂量和时间依赖性。图5B展示的是融合抗体对HUVEC细胞的抑制增殖作用，48小时的半数抑制率IC₅₀：～333.186nM，HEK293作为阴性细胞。

图6。图6A展示是Transwell侵袭实验，融合抗体能够有效抑制内皮细胞的侵袭。图6B定量分析Transwell侵袭实验，融合抗体能够以剂量依赖性抑制内皮细胞的侵袭。

图7。图7A展示K562的细胞毒实验，随着效应细胞/靶细胞的比例升高而升高。图7B展示MDA-MB-435的细胞毒实验，随着效应细胞/靶细胞的比例升高而升高。图7C展示的B16F1细胞毒实验，随着效应细胞/靶细胞的比例升高而升高。图7D展示3T3-L1(control)的细胞毒实验。

以下借助非限制性实施例举详细描述本发明。对本领域技术人员而言，在不背离本发明精神的前提下对它所做的任何显而易见的改动，特别是对若干部件的等同替换，都构成对本发明专利权的侵犯，将承担相应的法律责任。

具体实施方式

实施例中涉及的百分比，其中固定试剂为重量体积百分比，液体试剂为体积百分比。

实施例1AK404R-MICA质粒的构建和转染

抗人血管内皮生长因子受体2的单链抗体基因用pHEN2-AKA404R(实验室保存)扩增获得，据此设计了一对引物，上游引物P1：5’-GGAATTCGAGGTGCAGCTGGTG-3’和下游引物P2：5’-GGTTCTGAACCACCACCACCACCTAGGACGGTCAG-3’，MICA基因用pET28a-MICA扩增获得，上游引物P3：5’-TAGGTGGTGGTGGTGGTTCAGAACCTCACAGCCTG-3’和下游引物：5’-GCTCTAGAGCTCAATGATGATGATGATGATGCTTGCCGCTTGGGAC3’。下端划线的碱基对是EcoR1和Xba1的限制性酶切位点。单链抗体的C末端与MICA使用一个链接物(linker)G₄S(G-甘氨酸，S-丝氨酸)通过overlap PCR进行融合，使用的是上游引物P1和下游引物P4。扩增好的目的基因(AK404R-MICA)和载体pPICZα用限制性内切酶EcoR1和Xba1进行连接并转入到DH5α。阳性克隆在含有25μg/ml博来霉素的LB平板中挑取出来并测序。

获得的重组载体pPICZα-AK404R-MICA使用电穿孔方法进行电转入毕赤酵母(X-33)，阳性克隆在含有100μg/ml博来霉素的酵母浸出粉胨葡萄糖培养平板(YPD)筛选出来，示意图与结果如图1所示。

实施例2融合抗体的表达和纯化

从50个阳性克隆使用SDS-PAGE和western blot挑选出高表达的克隆进行发酵。高表达克隆在10mlYPD液体培养基(含有100μg/ml博来霉素)30℃、220rpm过夜培养至OD₆₀₀：2-4，以1∶1000接种到200ml的BMGY(2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5生物素，1％甘油)30℃、220rpm过夜培养至OD₆₀₀：1-2，3000g离心5min去除上清后用200ml的BMMY(2％蛋白胨，1％酵母提取物，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10^-5生物素)并加入0.5％的甲醇30℃、220rpm培养，每隔24小时加入0.5％的甲醇发酵4天。第六天，收集上清得到分泌的融合抗体用镍柱进行纯化。纯化后如图2A所示。

实施例3融合抗体的的Western Blot鉴定

纯化得到的KDR3和NKG2D与AK404R(作为control)进行变性SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为15％；4℃，20mA恒流转印1.5h，将蛋白转印到PVDF膜(购自Millipore)；转印结束，将膜在5％MTBS(含有5％脱脂牛奶的TBS)中37℃封闭2h；用5％MTBS稀释融合抗体，4℃过夜孵育，TBST(TBS中含有0.05％Tween-20)洗涤3遍，每次10min；用anti-MICA的抗体37℃进行2h孵育后，用5％MTBS按1∶5000稀释HRP-anti-Mouse二抗(购自Millipore)，37℃孵育1.5h，TBS洗涤3遍，每次10min；用ECL溶液曝光，结果如图2E，2F所示。

实施例4表面等离子体共振分析配体和受体间相互作用

采用BiacoreX100(GE)来对KDR3、NKG2D和融合抗体的动力学进行研究，融合抗体螯合在检测芯片GM5(GE Healthcare，BR-1000-12)，KDR3(250，125，62.5，31.5，15.6，7.8nM)和NKG2D(250，125，62.5，31.5，15.6，7.8nM)上样检测获得结合与解离曲线，BIA评估软件分析，计算获得动力学常数。实验结果如图3A，3B所示。

实施例5酶联免疫吸附试验(ELISA)

每孔加入100μ1NKG2D或KDR3(10000nm，溶解在CBS)4℃过夜包被。清洗后每孔加入200μl 5％的脱脂牛奶37℃封闭2h。每孔加入250μl TPBS(PBS containing 0.05％Tween20)微量震荡仪清洗5min，重复3次，用不同浓度的融合抗体(0.5，1，2，3.9，7.8，15.6，31.3，62.5，125，，250，500，，1000nM)室温包被1.5h，TPBS和PBS各洗三次，再加入anti-MICAmonoclonal antibody室温孵育1.5h，用5％MTBS按1∶5000稀释HRP-anti-Mouse二抗(购自Millipore)室温孵育1.5h，TBS洗涤3遍，每次10min。每孔加入100μl显色液(0.03％H₂O₂和2mg/ml TMB溶解于0.1M NaAc buffer，pH 6.0，现配现用)，37℃孵育15min。每孔加入50μl终止液(1M H₂SO4)，酶标仪检测OD₄₅₀-OD₆₅₀nm吸光值。结果如图3C，3D所示。

实施例6流式细胞术检测融合抗体与HUVEC，U937和HEK293的结合率

调节HUVEC，U937和HEK293细胞浓度至2×10⁶个/mL，每个1.5mL EP管中各加250μL单细胞悬液。阴性对照组：先用5％脱脂牛奶封闭，2％FBS-PBS洗涤3遍后，只加入500μLFITC标记的荧光二抗冰浴孵育1h；样品组：先用5％脱脂牛奶封闭，2％FBS-PBS洗涤3遍后，2000nM的融合抗体冰浴孵育1h，2％FBS-PBS洗涤3遍后，再加入500μL FITC标记的荧光二抗冰浴孵育1h；最后将各组样品用2％FBS-PBS洗涤3遍后，用500μL PBS溶液重悬细胞，BDFACS流式细胞仪检测。实验结果如图4A，4B，4C，4D所示。

实施例7细胞增殖实验

4x10³个HUVEC，U937和HEK293细胞接种到96孔板上在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h，不同浓度梯度(0nM，3.9nM，7.8nM，15.6nM，31.2nM，62.5nM，125nM，250nM，500nM，1000nM)的融合抗体加入培养24，48和72小时，AK404R，MICA和PBS作为对照组。每孔加入11μl MTT，37℃培养箱孵育4h。弃去含有MTT的培养基，加入DMSO，酶标仪(Thermo)在570nm和630nm检测吸光度，分析实验结果，计算IC₅₀值。实验结果如图5A，5B所示。

实施例8Transwell侵袭实验

1×10⁴个HUVEC细胞和不同浓度梯度的融合蛋白(20nM，100nM和500nM)用无血清ECM培养基重悬细胞并铺于按1∶2稀释的Matrigel基质(购于Millipore)胶上。AK404R(20nM，100nM和500nM)，MICA(500nM)和PBS(500nM)作为对照。于37℃、5％C02培养箱中孵育30min后，在下室中每孔加入600μL含5％FBS和20ng/mLECGS的ECM完全培养基，最后，将transwell小室转移至含培养液的下室中，然后置于37℃、5％C02培养箱中培养作用12h。培养后用4℃预冷的4％多聚甲醛600μL/孔固定20分钟后染色拍照。实验结果如图6A，6B所示。

实施例9细胞毒实验

CytoTox 96 Nonradioactive Cytotoxicity assay(购于Promega)，靶细胞分别为K562，MDA-MB-435，B16F10和3T3-L1(对照组)。白细胞从健康人中分离得到作为效应细胞。效应细胞和靶细胞以5∶1，30∶1和100∶1共同培养并加入融合蛋白，AK404R和MICA在37℃培养5h。吸取50μL上清按照试剂盒指示进行LDH活性检测。杀伤活性(％)＝[(OD实验组-OD总自然释放)/(OD最大释放组-OD总自然释放)]×100％。实验结果如图7所示。

Claims

1.一种VEGFR2的单链抗体与MICA的融合蛋白，其特征在于所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ NO.1。

2.一种核酸，其特征在于其编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.一种表达载体，含有权利要求2所述的核酸。

4.一种重组宿主细胞，含权利要求3所述的表达载体。

5.权利要求1所述的融合蛋白的应用，其特征在于所述的融合蛋白与KDR3结合或与NKG2D结合。

6.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用。