CN104592364B

CN104592364B - 定点突变和定点修饰的腺相关病毒、其制备方法及应用

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Publication number: CN104592364B
Application number: CN201310524527.XA
Authority: CN
Inventors: 周德敏; 张传领; 肖苏龙; 郑永祥; 俞飞; 司龙龙; 张礼和
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2018-05-01
Anticipated expiration: 2033-10-30
Also published as: CN104592364A; US20160297855A1; WO2015062516A1; EP3070095B1; US10087217B2; EP3070095A4; EP3070095A1

Abstract

本发明涉及定点突变和定点修饰的腺相关病毒、其制备方法及应用。具体地，本发明利用遗传密码扩展技术，将非天然氨基酸引入腺相关病毒衣壳蛋白VP1，进而得到利用非天然氨基酸定点修饰的腺相关病毒。该定点修饰的腺相关病毒在生产、转染和移动能力等方面与野生型病毒相当，为腺相关病毒的进一步研究奠定了基础。

Description

定点突变和定点修饰的腺相关病毒、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及定点突变和定点修饰的腺相关病毒，具体地，本发明涉及利用非天然氨基酸定点突变和定点修饰的腺相关病毒以及腺相关病毒衣壳蛋白VP1。本发明还涉及所述定点突变和定点修饰的腺相关病毒的制备方法和用途。

背景技术

腺相关病毒（AAVs）属微小病毒科^[1]、依赖病毒属的家庭成员之一，无包膜，属于单链DNA病毒。至今未报道AAV与任何人类已知疾病相关，因此是很有潜力的基因转移载体^[2]。AAV必须依赖于与辅助病毒例如腺病毒、疱疹病毒或乳头瘤病毒共转染才能完成生命周期^[3]。由于AAV能感染分裂细胞和非分裂细胞，在体内能够建立长期表达且不会引起已知的病理性感染后果，因此一直以来被认为是有希望的人类基因治疗载体^[4-7]。Ⅱ型AAV（AAV2）纳米粒是最早克隆的腺相关病毒，将这种纳米载体用于囊性纤维化^[8]、视网膜退行性紊乱^[9-11]和B型血友病^[12,13]的临床基因转移治疗，取得了很好的效果。

近年来，许多实验室致力于通过修饰这些粒子的细胞结合特性来制备靶向AAV。最基本的策略是将能够靶向特异细胞类型的多肽基序通过基因修饰的方法插入AAV的衣壳蛋白。这种方法已成功地用于使AAV靶向动脉内皮细胞^[14]、横纹肌^[15]和脑血管系统^[16]。但是，这种操作最重要的技术问题包括产量低、病毒滴度大幅下降或者DNA包装效率明显降低^[17]。对病毒衣壳蛋白的大范围遗传修饰可能使病毒的感染性消失，甚至改变病毒和宿主细胞的相互作用。因此，需要开发出新的具有位点特异性且不具有破坏性的技术来修饰腺相关病毒。

经过数年的研究，人们对原核生物核糖体的翻译机制已有较全面的理解，多种核糖体不同功能状态的晶体和电镜结构已得到解析，大多数氨酰tRNA合成酶的结构也已获得。基于这些研究成果，近年来发展起来了遗传密码扩展的技术—利用琥珀终止密码子（TAG）来编码多种非天然氨基酸并在生物活体内将其定点插入。到目前为止，这一技术已经将几十种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，赋予了这些蛋白质新颖的物理、化学和生理性质。使用这一方法，可以将非天然氨基酸（包括亲和标记和光致异构化的氨基酸、羰基氨基酸和糖基化氨基酸）引入蛋白质中（L.Wang等人，（2001），SCIENCE292:498-500;J.W.Chin等，2002，Journal of the American Chemical Society124:9026-9027;J.W.Chin,＆P.G.Schultz,2002,ChemBioChem11:1135-1137）。这些研究表明，有可能且有选择性且常规地引入化学官能基团到蛋白质中，例如，羰基、炔基、和叠氮基团等特殊化学基团，这些基团一般能够有效且选择性地形成稳定的共价键，更加有利于蛋白质的定点特异修饰，改善蛋白质的性质。

但目前尚没有研究将该技术应用于腺相关病毒的定点修饰中。

发明内容

发明人经过大量实验研究和反复摸索，令人惊奇地发现，利用密码子扩展技术，可以将非天然氨基酸引入腺相关病毒衣壳蛋白VP1的一些特定位点，进而表达在腺相关病毒上，由此完成了本发明。

在本发明的一个实施方案中，根据对腺相关病毒衣壳蛋白VP1的结构分析，选取了14个突变位点，将这14个位点所对应氨基酸的密码子突变为TAG，并构建了14个VP1蛋白表达载体。

在本发明的一个实施方案中，分别将这14个载体与编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体共转染细胞，并在细胞培养基中加入非天然氨基酸NAEK，实验证明在位点R447，G453,S578,N587，N587+1和S662，可分别插入非天然氨基酸NAEK，但在其它位点不能插入非天然氨基酸NAEK。在本发明的另一个实施方案中，通过实验证明了在位点N587可以插入非天然氨基酸DiZPK。

该突变系统的原理在于：突变型的tRNA^Pyl，PylRS满足下列关系：（1）：tRNA^Pyl不能利用宿主细胞的赖氨酰tRNA酶，只能被突变型的PylRS酰化；（2）：突变型的PylRS只能酰化tRNAPyl，不能酰化其它tRNA，因此，突变性tRNAPyl和PylRS之间的关系是正交性的。这种正交性的酶并且是只有这种酶可以把非天然氨基酸酰化到这种正交的tRNA上，并且只能酰化这种tRNA，而不能酰化其它的tRNA。获得的正交赖氨酰tRNA合酶/tRNA系统，使非20种常见氨基酸的NAEK或DiZPK等与琥珀密码子TAG相对应，从而将非天然氨基酸定点引入到腺病毒衣壳蛋白中。

在本发明的一个实施方案中，获得了在特定位点插入非天然氨基酸的腺相关病毒。

在本发明的实施方案中，定点突变的腺相关病毒在病毒生产和对细胞的转染能力方面，与野生型病毒相当。

在本发明的实施方案中，将定点突变的腺相关病毒与荧光标记分子共孵育，通过click反应将非天然氨基酸与荧光标记分子偶联起来。

在本发明的一个实施方案中，通过与定点突变的腺相关病毒偶联的荧光标记分子可以在共聚焦显微镜下观察单个病毒的移动轨迹。

更为具体地，本发明涉及以下几个方面：

本发明第一方面涉及定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1，其在野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的特定位点的一个氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述特定位点选自VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位中的一个位点。

在本发明的实施方案中，所述VP1的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，VP1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

根据本发明第一方面任一项的腺相关病毒衣壳蛋白VP1，其中所述非天然氨基酸为含有叠氮基团的非天然氨基酸，例如为Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(NAEK)、或或者所述非天然氨基酸为与上述含有叠氮基团的非天然氨基酸结构相似的非天然氨基酸，例如DiZPK。

在本发明的一个实施方案中，其在野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的特定位点的一个氨基酸被突变为NAEK，所述特定位点选自VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位中的一个位点。

在本发明的另一个实施方案中，其在野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的特定位点的一个氨基酸被突变为DiZPK，所述特定位点为VP1的第N587位。

根据本发明第一方面任一项的腺相关病毒衣壳蛋白VP1，其中所述NAEK与VP1氨基酸序列的连接方式如式Ⅰ所示：

由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第R447位、G453位、S578位、N587位、N587+1位、S662位氨基酸中的一个，R1为VP1蛋白氨基酸序列的第1至第N-1位氨基酸残基，R2为VP1蛋白氨基酸序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基。

根据本发明第一方面任一项的腺相关病毒衣壳蛋白VP1，其中所述DiZPK与VP1氨基酸序列的连接方式如式Ⅱ所示：

由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸为第N587位氨基酸，R1为VP1蛋白氨基酸序列的第1至第N-1位氨基酸残基，R2为VP1蛋白氨基酸序列的第N＋1位至C末端的氨基酸残基，

R3为

根据本发明第一方面任一项的腺相关病毒衣壳蛋白VP1，其中所述腺相关病毒为腺相关病毒II型(AAV2)。

本发明第二方面涉及定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白，其含有本发明第一方面任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白VP1。

本发明第三方面涉及定点突变的腺相关病毒，其含有本发明第一方面任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白VP1或者第二方面任一项的腺相关病毒衣壳蛋白。

根据本发明第三方面任一项的腺相关病毒，其中所述非天然氨基酸上还连接有标记基团，例如为荧光标记基团，或者例如为能与叠氮基团发生click化学反应的标记基团。

在本发明的实施方案中，所述标记基团为Alexa荧光基团，例如为Alexa488或者Alexa555。在本发明的具体实施方案中，所述标记基团为DIBO-Alexa488或DIBO-Alexa555。

在本发明的实施方案中，通过click化学反应，特别是无铜的click化学反应将含有DIBO基团的标记分子与含有叠氮基团的非天然氨基酸相连接。

本发明第四方面涉及编码本发明第一方面任一项的腺相关病毒衣壳蛋白VP1的核酸分子，所述核酸分子与编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的核酸分子的区别在于，其中编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。

在本发明的一个实施方案中，其中编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。

在本发明的另一个实施方案中，其中编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第N587位氨基酸的密码子被突变为TAG。

本发明第五方面涉及核酸载体，其可操作地连接有本发明第四方面任一项的核酸分子。

根据本发明第五方面任一项的核酸载体，其为载体pAAV-RC中编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。

在本发明的一个实施方案中，其为载体pAAV-RC中编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。

在本发明的另一个实施方案中，其为载体pAAV-RC中编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第N587位氨基酸的密码子被突变为TAG。

本发明还涉及宿主细胞，其中含有本发明第五方面任一项的核酸载体。

根据本发明任一项所述的宿主细胞，其中还含有编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体。

在本发明的实施方案中，所述编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体为质粒pACYC-tRNA/PylRS，其从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取。

根据本发明任一项所述的宿主细胞，其中还含有pHelper载体和pAAV-GFP载体。

在本发明的实施方案中，所述宿主细胞为AAV-293细胞。

在本发明的另外的实施中，所述宿主细胞为HeLa细胞。

本发明还涉及制备定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1的方法，其包括以下步骤：

(1)在野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的氨基酸序列中选择期望突变的一个或多个特定氨基酸位点，优选地，所述特定氨基酸位点选自VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位中的一个位点；

(2)将编码对应于步骤(1)中选择位点的VP1蛋白的氨基酸的密码子用基因工程方法突变为密码子TAG，得到定点突变的VP1的编码序列；

(3)将步骤(2)获得的定点突变的VP1编码序列与合适的载体可操作地连接，得到突变序列表达载体；

(4)将步骤(3)获得的突变序列表达载体与编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体共同转染合适的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有非天然氨基酸的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达，得到定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1。

在本发明的一个实施方案中，所述特定氨基酸位点选自VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位中的一个位点。

在本发明的另一个实施方案中，所述特定氨基酸位点为VP1的第N587位。

在本发明的实施方案中，所述合适的载体为pAAV-RC。

在本发明的实施方案中，所述突变序列表达载体为pAAV-RC-R447，pAAV-RC-G453，pAAV-RC-S578，pAAV-RC-N587，pAAV-RC-N587+1或pAAV-RC-S662。

在本发明的实施方案中，步骤（4）中同时共转染的载体还包括载体pHelper和pAAV-GFP。

在本发明的实施方案中，步骤(4)中所述合适的宿主细胞是AAV-293包装细胞。

在本发明的实施方案中，所述非天然氨基酸为含有叠氮基团的非天然氨基酸，例如为Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(NAEK)，或者所述非天然氨基酸为与上述含有叠氮基团的非天然氨基酸结构相似的非天然氨基酸，例如DiZPK。

在本发明的实施方案中，将转染成功后的宿主细胞在含有1mM的非天然氨基酸的培养基中培养72小时。

本发明还涉及制备定点突变的腺相关病毒的方法，其包括以下步骤：

(4)将步骤(3)获得的突变序列表达载体与编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体共同转染合适的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有非天然氨基酸的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达，得到定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1；

(5)收集病毒，即得到定点突变的腺相关病毒。

在本发明的实施方案中，所述合适的载体为pAAV-RC。

在本发明的实施方案中，所述非天然氨基酸为NAEK或DiZPK。

本发明还涉及组合物或试剂盒，其中含有本发明第三方面任一项的腺相关病毒或第四方面任一项的核酸分子或第五方面任一项的核酸载体。

本发明还涉及本发明第三方面任一项的腺相关病毒或第四方面任一项的核酸分子或第五方面任一项的核酸载体在制备用于获得结合蛋白的制剂或基因治疗的药物中的用途。

本发明还涉及本发明第三方面任一项的腺相关病毒作为工具腺相关病毒的用途。

在本发明中，所述腺相关病毒可以为各种类型的腺相关病毒，例如可以为AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9。在本发明的实施方案中，所述腺相关病毒为AAV2。当选用其它类型的腺相关病毒时，本领域技术人员知晓可以根据病毒衣壳蛋白的不同选择含有相应衣壳蛋白编码序列的质粒。

在本发明中，所述VP1上突变氨基酸的位置都是以AAV2型腺病毒的VP1为基准；如果采用其它类型的腺病毒，本领域技术人员可以根据其它类型腺病毒VP1的氨基酸序列得出与本发明突变位点对应的位点。

在本发明中，所述腺相关病毒衣壳蛋白由腺相关病毒cap基因编码，分别编码三个结构蛋白VP1、VP2和VP3，分子量分别为87、73、61kDa。

在本发明中，所述N587+1是指在N587和R588之间插入非天然氨基酸；在构建该表达质粒时，在N587和R588的密码子之间插入TAG。

本发明获得了经过非天然氨基酸定点突变和修饰的腺相关病毒，其在生产、转染和移动运输能力上与野生型腺相关病毒相当，其可以作为工具腺相关病毒，在寻找腺相关病毒结合蛋白或制备靶向基因治疗载体等与腺相关病毒相关的各个方面得到应用。

附图说明

图1显示了以click化学反应为基础的腺相关病毒修饰流程；

A表示AAV2粒子可以被遗传编码的含有叠氮的氨基酸NAEK进行定点修饰，B表示接下来可以通过生物正交反应标记上荧光分子。

图2显示了AAV2粒子可以被遗传编码的叠氮标签定点修饰；

A为根据谢等的原子结构(来自蛋白数据库)得到的AAV2主要衣壳蛋白和病毒衣壳的模型图，其中标出了插入的Arg447位点(红色)，B为转染HT-1080细胞后加入(+)或不加(-)NAEK培养的AAV-293包装细胞中的病毒提取物，病毒转染后48小时检测的GFP表达情况，比例尺相当于100μm，C为转染有系列稀释的rAAVr HT-1080细胞，然后计算病毒滴度，误差线表示三次实验平均的标准差，纵坐标为功能滴度（×10⁷病毒颗粒/ml）。

图3显示了AAV2衣壳的不同位点上成功地插入了NAEK；

依赖NAEK生产的突变病毒与HT-1080细胞共培养48小时，如果突变病毒成功转入HT-1080细胞，则报告基因GFP表达，结果表明R447-AAV2和S568-AAV2与野生型病毒的病毒感染性基本相当。

图4显示了在某些位点不能将NAEK插入AAV2衣壳。

图5显示了Alexa488成功地标记在病毒表面；

A为荧光标记的叠氮；野生型病毒(WT AAV2)和叠氮标记的病毒(R447-AAV2)粒子与加入或不加入DIBO-Alexa488(绿色)的Hela细胞37℃共培养30min，然后固定，透化，并用针对完整AAV2的鼠单克隆抗体(A20克隆)免疫染色(红色)。标记的叠氮标签(绿色)与R447-AAV2粒子(红色)共定位。重叠的绿色和红色信号显示为融合影像的黄色。第一行的AAV2没有与A20抗体共培养，作为阴性对照。比例尺相当于10μm。

B，C为用SDS-PAGE检测与DIBO-Alexa488反应或未反应的AAV，其中利用488nm透射光检测Alexa488（C），然后凝胶用考马斯亮蓝染色（B）。

图6显示了对细胞内Alexa488标记的AAV2病毒的移动的定量分析。

A，B，C代表了Alexa488标记的AAV2在Hela细胞中移动的典型轨迹；Hela细胞与Alexa488标记的AAV24℃共培养30min，然后记录共聚焦实时成像。其中A是荧光图，B是白光图，C是AB叠加后照片，D是选取其中典型运动，放大显示。

D为Alexa488标记的AAV2的典型轨迹，其中1为快速且定向的，2为快速且无定向的，3为慢速且无定向的，E，F，G为病毒速度的时间轨迹。

H为Alexa488-AAV2的轨迹被分类为“slow undirected”,“fast undirected”,和“fast directed”，其中slow undirected表示慢速且无定向的，fast undirected表示快速且无定向的，fast directed表示快速且定向的。误差线表示三次实验平均的标准差(共195个轨迹)。比例尺相当于10μm。

图7显示了通过click反应，S578位点NAEK标记的AAV2成功地与Alexa488偶联的共聚焦显微镜结果。

图8显示了在衣壳蛋白的R447和S578，Alexa555也通过NAEK成功地与AAV2连接的共聚焦显微镜结果。

图9显示了在AAV2衣壳的不同位点插入DiZPK的成像结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实验材料和方法：

细胞株，抗体和试剂

AAV-293、HT-1080和Hela细胞的培养基为含有10%胎牛血清(PAA，奥地利)和2mML-谷氨酰胺(中科迈晨北京科技有限公司)的DMEM培养基(中科迈晨北京科技有限公司)，在5%CO₂条件下培养。抗完整AAV2的鼠单克隆抗体(A20克隆)获自ARP公司(AmericanResearch Products，Belmont,MA)。DIBO-Alexa488、DIBO-Alexa555染料购自Invitrogen。

Nε-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine(Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸，NAEK) 的合成：

将2-溴乙醇(8g,64mmol)和叠氮钠(6.24g,96mmol)室温下加入丙酮(60ml)和水(30ml)中。反应混合液60℃回流10h，冷却至室温，真空蒸发除去丙酮。残留物用二乙基乙醚提取。有机层用盐水洗两次，然后用Na₂SO₄干燥，过滤，蒸发，得到2-叠氮乙醇(化合物2)，产率99%(5.5g,63.2mmol)，不用进一步纯化。

化合物2(5.5g,63.2mmol)溶于二氯甲烷(120ml)得到的溶液在-3℃条件下缓慢加入溶于二氯甲烷(55ml)的N,N’-羰基二咪唑(15.36g,94.8mmol)悬浮液中。搅拌条件下反应12小时。然后加入200mL水，有机层用盐水先后洗两次，然后用Na₂SO₄干燥，过滤并在真空条件下浓缩。残留物进一步用二氧化硅凝胶层析纯化，PE/EtOAc(1:1)洗脱，得到呈无色油状物的化合物3(10.7g,59mmol)，产率93%。

化合物3(10.7g,59mmol)溶于二氯甲烷(100ml)得到的溶液在室温下加入溶于1MNaOH(50ml)水溶液的Boc-Lys-OH(12.2g,49.2mmol)溶液中。接着加入TBAB(0.16g,0.01eq)。反应混合液在搅拌条件下反应12小时，冷却至0℃，然后用冰浴的1M HCl水溶液调pH值至2-3。水相用DCM提取，有机层用盐水先后洗两次。然后有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并在真空条件下浓缩。残留物进一步用二氧化硅凝胶层析纯化，PE/EtOAc/HAc（100:100:1）洗脱，得到呈无色油状物的化合物4(15.1g,41.94mmol)，产率85%。

化合物4(15.1g,41.94mmol)溶于二氯甲烷(80ml)中，然后缓慢加入三氟乙酸(20ml)。反应液在室温下搅拌反应0.5小时，然后在真空条件下蒸发除去溶剂。残留物重溶于甲醇(5ml)中，并在乙醚中沉淀。收集沉淀物在真空条件下干燥，得到呈白色固体的化合物5(6.63g,25.58mmol)，即NAEK，产率61%。

非天然氨基酸DiZPK的合成和鉴定：

非天然氨基酸DiZPK的化学合成反应式如下：

如上式所示，将原料1（5-羟基-2-戊酮）15mL与液氨40mL在-40℃下搅拌反应5h，之后降温至-60℃，缓慢滴加NH₂OSO₃H（20g）的甲醇溶液，加毕升至室温，反应过夜。滤除沉淀，向上清液中加入三乙胺，冰浴条件下缓慢加入I₂，至反应液颜色变深，不再产生气泡为止。反应完全后蒸除溶剂，经乙醚萃取后干燥。蒸除乙醚，剩余液体减压蒸馏获得25.4g无色粘稠液体产物2。

将上述产物2用吡啶溶解，0℃搅拌下加入11g TsCl，反应过夜。待反应完全后将反应液倒入浓盐酸与冰水的混合液中，乙醚萃取，醚层分别用1N盐酸和1N NaOH洗涤。有机相干燥柱分得到11.8g无色粘稠液体产物3。

将上述产物3用DMF溶解，加入NaN₃室温反应隔夜至反应完全，加入大量水，乙醚萃取。蒸除乙醚，剩余产物用THF:水(9:1)混溶，加入三苯基磷，室温反应。反应完后加1N HCl混匀，旋干THF，二氯甲烷把未反应的原料，PPh₃和O=PPh₃洗掉，液相加1N NaOH调pH到12，二氯甲烷萃取出4.0g产物4。

将5.2g原料5（Boc-Lys-OMe）与羰基二咪唑反应，制备出5.9g化合物6。之后化合物6与上述产物4（4.0g）偶联得到化合物7，最后经过两步脱保护，将Boc和甲酯脱除，得到目标4.5g产物8，即DiZPK。经谱学验证，结果为：

¹H NMR(400MHz,D₂O):δ3.10(1H,t,J=6.3Hz),2.96(4H,m),1.25(10H,m),0.90(3H,s);¹³C NMR(100MHz,D₂O):183.63,160.66,56.00,39.80,39.30,34.49,30.84,29.20,26.75,23.92,22.43,18.80;HREIMS m/z308.16937[M+1]⁺(calcd for C₁₂H₂₂N₅NaO₃,308.16931)，证明所得到的DiZPK结构正确。

包装细胞培养

用AAV-293细胞(stratagene)生产重组感染性AAV颗粒。本发明中仅制备并使用AAV2血清型。AAV-293细胞代表稳定转染有5型腺病毒DNA的人胚胎肾细胞，并且具有rAAV体外制备所需的腺病毒e1基因。为了制备rAAV，AAV-293细胞在DMEM培养基中培养，并添加10%胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖，培养条件为37℃、5%CO₂。细胞培养至铺满60-70%，然后开始AAV质粒的三重共转染步骤。

质粒构建

表达质粒载体pAAV-RC,pHelper和pAAV-GFP(安捷伦公司，SantaClara,CA)用于本实验。构建体含有AAV和制备感染性AAV颗粒所需要的腺病毒基因。pAAV-RC提供分别编码AAV复制和衣壳蛋白的rep和cap基因。pHelper载体含有腺病毒E2A,E4和VA基因，pAAV-GFP含有GFP报告基因。该报告载体代表含有ITR的质粒，该质粒带有cmv启动子。pAAV-RC-R447质粒利用Quik Change Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent)制备，其中AAV衣壳蛋白VP1447位精氨酸残基的遗传密码突变为TAG。

含有编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的pACYC-tRNA/PylRS载体由北京大学化学院陈鹏教授惠赠(Duy P.Nguyen,Hrvoje Lusic,HeinzNeumann,Prashant B.Kapadnis,Alexander Deiters,and Jason W.Chin.GeneticEncoding and Labeling of Aliphatic Azides and Alkynes in Recombinant Proteinsvia a Pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNA_CUAPair and Click Chemistry.J.AM.CHEM.SOC.2009,131,8720–8721)。

从保藏地：中国普通微生物菌种保藏管理中心菌种保藏地址：地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）的含有质粒pACYC-tRNA/PylRS的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS（由北京大学化学院陈鹏教授馈赠）中获取质粒pACYC-tRNA/PylRS，该质粒可以表达特异识别非天然氨基酸DiZPK和NAEK的tRNA和tRNA合成酶，该保藏信息已在公开号为CN102838663A的专利申请中公开。

AAV的制备和纯化

在AAV Helper-Free System中制备叠氮标记的AAV2感染颗粒(R447-AAV2载体)，感染时没有使用辅助腺病毒或疱疹病毒。用磷酸钙沉淀法将AAV2质粒载体pAAV-RC，pHelper，pAAV-GFP和载体pACYC-tRNA/PylRS(摩尔比1:1:1:2)瞬时共转染AAV-293包装细胞。转染后6小时，将细胞培养基替换为含有1mM NAEK的新鲜培养基。72小时后收集感染细胞。为了释放rAAV病毒粒子，感染细胞用冻融法裂解。分离和纯化步骤参照Ping Guo等的操作(Guo P,El-Gohary Y,Prasadan K,Shiota C,Xiao X,Wiersch J,Paredes J,TulachanS,Gittes GK:Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associatedvirus.J Virol Methods,183(2):139-146)。

病毒滴度测定

在六孔组织培养板中培养AAV-HT1080细胞，每孔2ml DMEM培养基，细胞密度为3×10⁵/孔。37℃过夜培养。细胞需要培养至铺满约50%。10倍稀释病毒储存液。在10倍稀释的基础上，在5ml体积中进行5倍系列稀释，浓度范围从2×10^-2至8×10^-4。在六孔板的每孔中各加入1ml各稀释液，每个滴度各加三孔。同时以未加病毒储存液的孔做为阴性对照。37℃孵育1-2小时。孵育时每隔30min轻轻涡旋振荡培养板。然后在每孔中加入1ml事先预温的H-DMEM，37℃培养40-48小时。利用FACS检测pAAV-hrGFPAAV感染细胞。

连接荧光探针

为了荧光标记AAV2-叠氮，取纯化的病毒粒子与Alexa488-DIBO(500μM)在pH7.0条件下室温孵育2小时。利用100kD Millipore Amicon Ultra-100除去未反应的染料。

共聚焦成像

Alexa488标记的AAV2与Hela细胞在玻璃底培养皿中37℃共培养30min，然后细胞用含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液(pH7.0)(PBS)固定15min。接着细胞在含有0.5%Triton X-100的PBS溶液中透化10min，并用含3%牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭60min。接下来细胞与抗完整AAV2的鼠单克隆抗体(A20)4℃孵育过夜，继而在室温下与连接有Alexa594的第二抗体(life tecnology)孵育1小时。细胞核用DAPI(Sigma)染色。共聚焦激光-扫描显微镜(SP8Series,Leica,Germany)下成像。

活细胞成像

为了实时观察Alexa488-AAV2的移动，Hela细胞接种在玻璃底培养皿中，37℃培养过夜。接着Alexa488标记的AAV2与Hela细胞4℃共培养30min，然后利用活细胞成像系统(PerkinElmer,MA,USA)记录共聚焦实时成像。

实施例1腺相关病毒衣壳蛋白突变位点的选择和表达质粒的构建

(1)突变位点的选择

在腺相关病毒衣壳蛋白VP1上选择了如表1所示的突变位点。

其中VP1蛋白的氨基酸序列为：

MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL（SEQ ID NO：1）；

VP1蛋白的核苷酸序列为：

ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACACTCTCTCTGAAGGAATAAGACAGTGGTGGAAGCTCAAACCTGGCCCACCACCACCAAAGCCCGCAGAGCGGCATAAGGACGACAGCAGGGGTCTTGTGCTTCCTGGGTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGAGAGCCGGTCAACGAGGCAGACGCCGCGGCCCTCGAGCACGACAAAGCCTACGACCGGCAGCTCGACAGCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCGGAGTTTCAGGAGCGCCTTAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGACGAGCAGTCTTCCAGGCGAAAAAGAGGGTTCTTGAACCTCTGGGCCTGGTTGAGGAACCTGTTAAGACGGCTCCGGGAAAAAAGAGGCCGGTAGAGCACTCTCCTGTGGAGCCAGACTCCTCCTCGGGAACCGGAAAGGCGGGCCAGCAGCCTGCAAGAAAAAGATTGAATTTTGGTCAGACTGGAGACGCAGACTCAGTACCTGACCCCCAGCCTCTCGGACAGCCACCAGCAGCCCCCTCTGGTCTGGGAACTAATACGATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAACGAGGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGATGGGCGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAACAAATTTCCAGCCAATCAGGAGCCTCGAACGACAATCACTACTTTGGCTACAGCACCCCTTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAAAGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGACCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTTAACATTCAAGTCAAAGAGGTCACGCAGAATGACGGTACGACGACGATTGCCAATAACCTTACCAGCACGGTTCAGGTGTTTACTGACTCGGAGTACCAGCTCCCGTACGTCCTCGGCTCGGCGCATCAAGGATGCCTCCCGCCGTTCCCAGCAGACGTCTTCATGGTGCCACAGTATGGATACCTCACCCTGAACAACGGGAGTCAGGCAGTAGGACGCTCTTCATTTTACTGCCTGGAGTACTTTCCTTCTCAGATGCTGCGTACCGGAAACAACTTTACCTTCAGCTACACTTTTGAGGACGTTCCTTTCCACAGCAGCTACGCTCACAGCCAGAGTCTGGACCGTCTCATGAATCCTCTCATCGACCAGTACCTGTATTACTTGAGCAGAACAAACACTCCAAGTGGAACCACCACGCAGTCAAGGCTTCAGTTTTCTCAGGCCGGAGCGAGTGACATTCGGGACCAGTCTAGGAACTGGCTTCCTGGACCCTGTTACCGCCAGCAGCGAGTATCAAAGACATCTGCGGATAACAACAACAGTGAATACTCGTGGACTGGAGCTACCAAGTACCACCTCAATGGCAGAGACTCTCTGGTGAATCCGGGCCCGGCCATGGCAAGCCACAAGGACGATGAAGAAAAGTTTTTTCCTCAGAGCGGGGTTCTCATCTTTGGGAAGCAAGGCTCAGAGAAAACAAATGTGGACATTGAAAAGGTCATGATTACAGACGAAGAGGAAATCAGGACAACCAATCCCGTGGCTACGGAGCAGTATGGTTCTGTATCTACCAACCTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAAGGCGTTCTTCCAGGCATGGTCTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTTCAGGGGCCCATCTGGGCAAAGATTCCACACACGGACGGACATTTTCACCCCTCTCCCCTCATGGGTGGATTCGGACTTAAACACCCTCCTCCACAGATTCTCATCAAGAACACCCCGGTACCTGCGAATCCTTCGACCACCTTCAGTGCGGCAAAGTTTGCTTCCTTCATCACACAGTACTCCACGGGACAGGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCCGAAATTCAGTACACTTCCAACTACAACAAGTCTGTTAATGTGGACTTTACTGTGGACACTAATGGCGTGTATTCAGAGCCTCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA（SEQ ID NO：2）。

表1突变位点

表1中所述的位置是在VP1蛋白中的位置。

(2)突变引物设计

为了定点突变表1中所述的位点，设计了表2所示的突变引物(同时可以用作测序引物)。

表2突变引物列表

表2中#1为正向引物，#2为反向引物。

587+1表示在587位点后插入非天然氨基酸，即在587位点和588位点之间插入非天然氨基酸。

(3)表达质粒的构建

利用Quik Change Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent)，根据其使用说明，以pAAV-RC质粒做为模板，使用表2所列突变引物，完成各突变，测序结果表明，已成功引入了各突变。对于R447位点突变后获得的质粒命名为pAAV-RC-R447，其表示将AAV衣壳蛋白VP1447位精氨酸残基的遗传密码突变为TAG，其它突变后获得的质粒命名和含义以此类推。

实施例2腺相关病毒VP1突变蛋白的表达与检测

本发明利用遗传密码扩展技术，通过将含有叠氮的氨基酸NAEK引入病毒衣壳来对AAV2进行定点修饰。并且通过无铜的click化学反应，叠氮标签可以用于病毒粒子表面的选择性荧光修饰(见图1)。

无铜click化学反应是通过引入环辛炔来维持细胞活性而实现的click反应，其中八元环的张力允许在没有催化剂的条件下与叠氮发生反应。这些试剂中的一种由所谓的DIBO化合物组成^[18]。叠氮修饰的大分子现在可以在没有金属催化剂的条件下进行标记，这样不仅可用于活细胞的研究，而且阻止了对蛋白的损伤。

如图2A所示，本发明利用遗传学方法，在cap基因位于VP1/VP2/VP3区的第447氨基酸位点插入叠氮非天然氨基酸。相应地，AAV2衣壳蛋白编码质粒pAAV-RC的遗传密码进行了突变，将其突变为琥珀终止密码子TAG。然后，在NAEK存在的情况下，通过在AAV-293包装细胞中共表达NAEK特异的正交tRNA/aaRS对（pACYC-tRNA/PylRS载体）、pHelper载体和pAAV-GFP载体，突变的质粒pAAV-RC-R447用于带有叠氮的AAV2(R447-AAV2)粒子的传代(具体参见材料和方法部分)。72小时后，收集细胞裂解物，经过10倍稀释后加入HT-1080细胞中，利用荧光显微镜检测突变的病毒是否已生产。

利用突变质粒转染后得到的含有NAEK的细胞裂解物转染HT-1080细胞，在转染HT-1080细胞48小时后，我们在HT-1080细胞中发现了很强的绿色荧光，几乎与野生型相当，但是与没有NAEK的显著不同(参见图2B)。

具体实验方法参照材料和方法部分的“AAV的制备和纯化”。

不仅在R447位点，并且在其它位点，G453,S578,N587,N587+1、S662都可以插入NAEK(参见图3)。但是，位点S261,N381,Y444，S458,S492,Y500,F534,T573不能用NAEK标记(参见图4)。具体实验方法同上。

这表明，由于NAEK的存在，利用突变的AAV2衣壳包装AAV确实是成功的。而且，携带有GFP报告基因的经过修饰或未经修饰的AAV2都用于感染HT-1080细胞，来检测病毒滴度。R447-AAV2的功能滴度大小(转染单位/mL)与WT-AAV2相同(参见图2C)，表明叠氮标签的引入对于AAV2粒子的生产和转染能力的影响很小。

实施例3带有叠氮标记的AAV2的荧光标记

为了确定叠氮标签是否能在方便且温和的条件下(25℃，2h)与Alexa488发生正交反应，制备了纯化的野生型AAV2(WT-AAV2)和叠氮标记的AAV2(R447-AAV2)颗粒，并且在室温下与DIBO-Alexa488反应2h，利用100kD Millipore Amicon Ultra-100将反应缓冲液替换为PBS。接着，将含有病毒颗粒的溶液加在HeLa细胞上，并用特异性针对完整AAV2颗粒的抗体进行免疫染色。具体实验方法参见实验材料和方法部分的“连接荧光探针”和“共聚焦成像”。

大部分肼信号与AAV2信号共定位(参见图5A，底端)，而没有叠氮标签的病毒颗粒没有观察到明显的肼信号(参见图5A，顶端)，表明叠氮基团已有效地表达在AAV2表面。标记有绿色荧光的AAV2衣壳蛋白VP1/VP2/VP3进一步用SDS-PAGE成像得到了验证，而在WT-AAV2没有发现信号(参见图5B)。

显然，NAEK已位点特异性地展示在突变病毒上，荧光分子也确实通过NAEK连接到了突变病毒上。不仅R447-AAV2，而且S578-AAV2也成功地偶联了Alexa488(参见图7)。

进一步地，另一种荧光基团Alexa555也可以通过NAEK与AAV2相连(参见图8)，方法同上。上述结果表明，叠氮标签能够将荧光探针以位点特异的方式共价连接到AAV2颗粒上。

实施例4利用荧光标记的AAV2观察单个病毒的移动

在建立了用Alexa488定点标记AAV2方法的基础上，本发明验证了这种标记是否能够用在单个病毒示踪上。

携带有Alexa488的第447位突变的病毒加入Hela细胞中，4℃孵育30min，使结合同步，然后在共聚焦显微镜实时成像下监测这些病毒，具体实验方法参见实验材料和方法部分的“共聚焦成像”。成像中看到了病毒颗粒细胞内移动的多种形式，图6显示了Hela细胞中Alexa488标记的AAV2的代表性轨迹。

以三维AAV2颗粒运动的二维数据分析结果为基础，我们发现许多颗粒表现出相对较慢的运动(例如图6D、E中的粉色轨迹)，但是有一些颗粒表现出快速的和定向的运输(例如图6D、E中的橙色轨迹)^[19]。

根据我们的分析，轨迹的最高速度≥0.002μm/s，并且将在超过5个连续的框中具有单一方向的运动定义为定向运输，快速(≥0.002μm/s)但是无方向性的运动定义为快速非定向运输，慢速(≤0.002μm/s)且没有方向性的运动定义为慢速非定向运输。

利用这些定义，16.3%Alexa-AAV2的轨迹是快速且定向的，24.7%的Alexa-AAV2的轨迹是快速但非定向的，而其余的是慢速非定向的(参见图6F)。

实施例5光交联非天然氨基酸（DiZPK）定点标记的AAV2的制备

利用与上述相同的方法，将光交联非天然氨基酸（DiZPK）引入定点到AAV2衣壳表面，将会在病毒进入细胞的过程中，通过光照交联，捕捉新的相互作用蛋白，从而发现病毒新的受体。如图9所示，已经尝试过S261、R447、F534、T573、N587位点，目前发现在N587位点可以成功引入DiZPK。

从研究结果看，R447位点能够引入NAEK，但是不能插入DiZPK，而在N587位点这两个非天然氨基酸都能够插入。这可能是因为蛋白分子的每个氨基酸残基位点的空间结构不同，对能够引入的非天然氨基酸的结构要求也是不同的。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

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Claims

1.定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1，其在野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的特定位点的一个氨基酸被突变为Nε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(NAEK)，所述特定位点选自VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位中的一个位点；或者，其在野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第N587位的氨基酸被突变为DiZPK。

2.权利要求1所述的定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1，其中所述NAEK与VP1氨基酸序列的连接方式如式Ⅰ所示：

由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸选自第R447位、G453位、S578位、N587位、N587+1位、S662位氨基酸中的一个，R1为VP1蛋白氨基酸序列的第1至第N-1位氨基酸残基，R2为VP1蛋白氨基酸序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基；或者，

其中所述DiZPK与VP1氨基酸序列的连接方式如式Ⅱ所示：

由R1到R2的方向为氨基酸序列的N末端到C末端方向，其中第N位的氨基酸为第N587位氨基酸，R1为VP1蛋白氨基酸序列的第1至第N-1位氨基酸残基，R2为VP1蛋白氨基酸序列的第N+1位至C末端的氨基酸残基，

R3为

3.权利要求1所述的定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1，其中所述腺相关病毒为腺相关病毒Ⅱ型。

4.定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白，其含有权利要求1-3任一项所述的定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1。

5.定点突变的腺相关病毒，其含有权利要求1-3任一项所述的定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1或者权利要求4所述的定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白。

6.权利要求5所述的定点突变的腺相关病毒，其中所述非天然氨基酸上还连接有标记基团。

7.权利要求6所述的定点突变的腺相关病毒，其中所述标记基团为荧光标记基团，或者为能与叠氮基团发生click化学反应的标记基团。

8.编码权利要求1-3任一项所述的定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1的核酸分子，所述核酸分子与编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的核酸分子的区别在于，其中编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。

9.核酸载体，其可操作地连接有权利要求8所述的核酸分子。

10.权利要求9所述的核酸载体，其与载体pAAV-RC相比，编码野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位的氨基酸中的一个氨基酸的密码子被突变为TAG。

11.宿主细胞，其中含有权利要求9或10所述的核酸载体。

12.权利要求11所述的宿主细胞，其中还含有编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体。

13.权利要求12所述的宿主细胞，其中所述编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体为质粒pACYC-tRNA/PylRS。

14.制备定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1的方法，其包括以下步骤：

(1)在野生型腺相关病毒衣壳蛋白VP1的氨基酸序列中选择期望突变的特定氨基酸位点，所述特定氨基酸位点选自VP1的第R447、G453、S578、N587、N587+1、S662位中的一个位点；

(4)将步骤(3)获得的突变序列表达载体与编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体共同转染合适的宿主细胞，将转染成功后的宿主细胞在含有非天然氨基酸的培养基中培养，并在合适的条件下诱导表达，得到定点突变的腺相关病毒衣壳蛋白VP1；并且，

当步骤(1)中所述的特定氨基酸位点选自VP1的第R447、G453、S578、N587+1、S662位中的一个位点时，步骤(4)中所述的非天然氨基酸为NAEK；或者，

当步骤(1)中所述的特定氨基酸位点为VP1的第N587位时，步骤(4)中所述的非天然氨基酸选自NAEK和DiZPK。

15.权利要求14所述的方法，其中所述编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体为质粒pACYC-tRNA/PylRS，其从保藏日为2011年6月14日、保藏号为CGMCC No：4951的大肠埃希氏菌pACYC-tRNA/PylRS中获取。

16.制备定点突变的腺相关病毒的方法，其包括权利要求14中的步骤(1)-(4)，其中，

步骤(3)中所述合适的载体为pAAV-RC，

在步骤(4)中将步骤(3)获得的突变序列表达载体与编码正交琥珀突变型抑制子氨酰-tRNA合成酶/tRNA_CUA基因的载体同时与载体pHelper和pAAV-GFP共同转染合适的宿主细胞，且，步骤(4)中所述合适的宿主细胞是AAV-293包装细胞；并且，

所述方法还包括：

(5)收集病毒，即得到定点突变的腺相关病毒。

17.组合物或试剂盒，其中含有权利要求5-7任一项所述的定点突变的腺相关病毒或权利要求8所述的核酸分子或权利要求9或10所述的核酸载体。

18.权利要求5-7任一项所述的定点突变的腺相关病毒或权利要求8所述的核酸分子或权利要求9或10所述的核酸载体在制备用于获得结合蛋白的制剂或基因治疗的药物中的用途。

19.权利要求5-7任一项所述的定点突变的腺相关病毒作为工具腺相关病毒的用途。